Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980
UNIVERSIDAD DE ALICANTE
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
FAGULTAB DE glEKSWS-BIBUOTECA UNIVERSIDAD BE ALICANTE
N.o REGJSTíE-.„..£.£JL_ FHOHA^2;.£a.Dpro.....„„
OÜU, „ . _ SIGNATURA ¿ E & L ¿ = — 13
ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE TIROSINASA
INMOVILIZADA. PROPIEDADES Y APLICACIONES.
R. M
Memoria presentada para optar al grado de
Doctor en Ciencias, Sección de Quúnicas,
por
EUGENIO VILANOVA GISBERT
Alicante, Mayo 1980
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980
IDAD DE MURCIA
AD DE MEDICINA
RA D E B I O Q U Í M I C A
Los Doctores José Antonio Lozano Teruel, Catedrático
y Director del Departamento Interfacultativo de Bio
química de la Universidad de Murcia, y José Luis Ibo
rra Pastor, Profesor Adjunto de Bioquímica,
CERTIFICAN: Que los trabajos experimentales corres
pondientes a la Memoria titulada: "Actividad Tirosi-
na hidroxilasa de Tirosinasa inmovilizada. Propieda
des y Aplicaciones", han sido realizados por D. Euge
nio Vilanova Gisbert, bajo nuestra dirección, y a
nuestro juicio reúne las condiciones adecuadas para
ser presentada y juzgada por el Tribunal correspon
diente para aspirar al grado de Doctor en Ciencias,
Sección de Químicas.
Murcia, 9 de Junio de 1980
Fdo. José A. Lozano Teruel Fdo. José Luis Iborra Pastor
Catedrático de Bioquímica Profesor Adjunto de Bioquímica
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Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980
La presente Memoria, forma parte de la
línea general de investigación que en el Departamento de Bio
química de la Facultad de Ciencias y del Colegio Universita
rio de Medicina de Alicante, se viene desarrollando sobre Bio
química en fase sólida, y en concreto sobre la inmovilización
de enzimas en soportes sólidos, así como sus aplicaciones bio
químicas, industriales y analíticas.
Este trabajo está realizado bajo la codirec-
ción de los Drs. D. José Luis I borra Pastor y D. José Anto
nio Lozano Teruel, a quienes agradezco su orientación y ayu
da. Así mismo a los compañeros del Departamento por la a-
yuda prestada y el ambiente de trabajo, especialmente a Dña.
Ma. del Rosario Blanes Torreblanca por su eficaz colaboración
en los estudios con soportes de nylon.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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Pág.
LISTA DE ABREVIATURAS Vil
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO DEL TRABAJO. 1
2 ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE TIROSINASA SOLU
BLE. COMPARACIÓN CON DÓPA OXIDASA. 4
2.1. Características generales de la actividad tirosina hidroxilasa.
de tirosinasa. 5
2.2. Comportamiento frente a la extracción y purificación. 11
2.3. Cinética, perfil pH-actividad y estabilidad a la reacción. 16
2.3.1. Cinética. 16
2.3.2. Perfiles pH-actividad. 20
2.3.3. Estabilidad a la reacción. 21
3. CARACTERÍSTICAS DE LOS SOPORTES Y REACTORES
UTILIZADOS EN LA INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA. 23
3.1. Elección del método y soporte de inmovilización. 24
3.2. Enzacryl-AA. 26
3.3. Soporte CPG-AA. 28
3.4. Derivados de nylon. 30
3.5. Reactores y metodología de estudio de las enzimas 38
inmovilizadas.
3.5.1. Reactor de baño agitado (STR). 38
3.5.2. Reactor de baño agitado continuo (CSTR). 39
3.5.3. Reactor de columna con lecho empaquetado (PBCR). 40
3.5.4. Reactor tubular (TR). 41
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INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE
TIROSINASA EN ENZACRYL-AA Y EN CPG-AA. 41
4 .1 . Rendimiento de inmovilización en Enzacryl-AA 42
4.2. Inmovilización de tirosinasa en CPG-AA. Comparación
con tirosinasa de champiñón. 49
4.3. Estudio de las condiciones óptimas de ensayo de la acti
vidad tirosina hidroxilasa del Enzacryl-AA-IME. 52
4.4. Comportamiento cinético del Enzacryl-AA-IME. 56
4.5. Efecto del ascorbato y de la hidracina sobre las actividades
del SE y del IME. 58
4.5.1. Efecto del ascorbato y de la hidracina en la forma
ción de dopacromo. 59
4.5.2. Efecto del ascorbato y la hidracina sobre el consumo
de oxígeno. 61
4.5.3. Consumo de ascorbato en la reacción. 65
INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE
PROTIROSINASA EN ENZACRYL-AA 69
5.1. Activación de protirosinasa. 70
5.1.1. Efecto de la tripsina sobre la actividad tirosina
hidroxilasa de protirosinasa soluble. 72
5.1.2. Activación de protirosinasa por inmovilización.
Efecto de la tripsina sobre Enzacryl-AA-IMP. 74
5.2. Rendimientos de inmovilización de protirosinasa en
Enzacryl-AA. 76
5.3. Comportamiento cinético del Enzacryl-AA-IMP. 79
ESTABILIDAD DE LOS DERIVADOS ENZACRYL-AA-IME,
ENZACRYL-AA-IMP y CPG-AA-IME. 82
6.1. El fenómeno de la inactivación de la tirosinasa por la
actuación. 83
6.2. Estabilidad al almacenamiento. 86
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6.3. Actividad de los reactores con gel-IME y estabilidad de
de la reacción a largo tiempo. 87
6.4. Influencia de varios factores sobre la estabilidad y acti-
actividad del IME. 94
6.4.1. Efecto de la fuerza iónica y del pH. 94
6.4.2. Efecto de la temperatura. 96
6.4.3. Efecto del ascorbato y de la hidracina. 98
6.5. Factores que afectan especialmente a reactores de
columna empaquetada. 100
6.5.1. Efecto de la concentración de oxi'geno. 100
6.5.2. Efecto de la concentración de sustrato. 102
6.5.3. Efecto de la velocidad de flujo volumétrico y
de la velocidad lineal. 104
6.6. Comparación de los resultados obtenidos con otros
intentos de estabilización de tirosinasa por inmovilización. 107
7. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES DE TIROSINASA EN
GELES DE NYLON MODIFICADO. 110
7.1. Rendimientos de inmovilización. 110
7.2. Comportamiento de lod geles-ny Ion-I ME a tiempos
largos de reacción.. 113
7.3. Efecto de la cantidad de protei'na sobre la inmovilización 116
7.4 Estabilidad al almacenamiento. 117
7.5 Perfiles pH-actividad. 118
7.6. Propiedades cinéticas de los geles-nylon-IME. 119
8. APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA A
LA SÍNTESIS DE L-DOPA. 120
8.1. Criterios de comparación de la producción de distintos
reactores y soportes. 121
8.2. Producción de L-dopa en reactores con Enzacryl-AA-IME.
Efecto del tipo de reactor. 126
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8.2.1. Producción en reactores de baño agitado (STR). 126
8.2.2. Producción en reactor continuo de baño agitado
(CSTR). 127
8.2.3. Producción en reactor de columna empaquetada
(PBCR) 128
8.3. Producción de L-dopa con CPG-AA-IME. Efecto de la
porosidad del soporte. 130
8.4. Producción de L-dopa en reactores con geles-nylon-IME. 132
INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA EN TUBOS Y EN
MEMBRANAS DE NYLON. 137
9.1. Inmovilización en tubo de nylon 138
9.1.1. Rendimiento de inmovilización 138
9.1.2. Propiedades cinéticas del tubo-IME 139
9.1.3. Estabilidad al uso continuo e intermitente del
tubo-IME. Posibilidades anah'ticas. 140
9.2. Inmovilización en membranas de nylon. 143
9.2.1. Rendimiento de inmovilización en función de
la cantidad de protema. 143
9.2.2. Estabilidad al almacenamiento. 144
APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA EN
MEMBRANA DE NYLON A UN ELECTRODO DE ENZIMA. 146
10.1. Diseño de un electrodo de tirosinasa. 149
10.2. Respuesta ti'pica del electrodo de enzima y criterios de
medida. 149
10.3. Efecto de la agitación, de la presencia de ascorbato
y del t ipo de sustrato sobre la respuesta del electrodo. 150
10.4. Efecto del volumen y de la concentración sobre la
respuesta del electrodo de enzima. 152
10.5. Efecto de la actividad enzimática de la membrana
sobre la respuesta del electrodo de enzima. 154
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10.6. Interpretación de la respuesta del electrodo. 155
10.7. Fatiga del electrodo con el número de ensayos. 157
10.8. Dependencia de la respuesta del electrodo con la
concentración de sustrato. 161
10.9. Aplicación del electrodo a la determinación de
muestras de L-tirosina y L-dopa. 164
CONCLUSIONES. 166
MÉTODOS EXPERIMENTALES. 170
12.1. Obtención de enzima. 170
12.1.1. Extracción de protirosinasa. 170
12.1.2. Purificación de protirosinasa. 171
12.1.3. Activación de la protirosinasa. 172
12.1.4. Criterio de homogeneidad. Electroforesis en gel
de poliacrilamida a pH 4,3. 172
12.2. Preparación de soportes. 174
12.2.1. Enzacryl-AA y CPG-AA. 174
12.2.2. Preparación de polvo de nylon 174
12.2.3. Modificación de membrana y tubo de nylon. 174
12.2.4. Preparación de nylon alquilamina (NAQA). 175
12.2.5. Preparación de nylon parcialmente hidrolizado (NH). 175
12.2.6. Preparación de nylon-bencidina (NB) 176
12.2.7. Preparación de nylon poliisonitrilo (NPI). 176
12.2.8. Preparación de nylon poliarilamina (NPAA) 177
12.3. Inmovilización de tirosinasa. 177
12.3.1. Inmovilización a soportes con grupos arilamina
activados con ácido nitroso. 177
12.3.2. Inmovilización a soportes con grupos alquila-
mina activados con glutaraldehido. 178
12.3.3. Inmovilización sobre NPI activado con acetal-
dehido. 179
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12.4. Determinación de protema.
12.5. Determinación de ascorbato. 180
12.6. Determinación de oxigeno disuelto. 181
12.7. Determinación de L-dopa. 181
12.8. Determinación de la actividad enzimática. 182
12.8.1. Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa 18
soluble. 182
12.8.2. Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa
inmovilizada. 183
12.8.3. Actividad dopa oxidasa de tirosinasa. 184
12.8.4. Determinaciones con el electrodo de tirosinasa
inmovilizada. 184
13. BIBLIOGRAFÍA. 186
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ABREVIATURAS.
Act
Act
IME
R
A c t R o ActSTR- ActPBCR
Act. sust.
CM
CM/Phe
CPG-AA
CPG-AA-IME
C R
CSTR
Ef. acop.
L-dopa
E
Enzacryl-AA
Enzacryl-AA-IME
fP
gel-IME
gel-nylon-IME
H20/P¡
IME (IMP)
IME
m
Actividad estándar del derivado inmovilizado (U/mg gel-IME)
Actividad del IME en las condiciones reales de un determinado reactor (U/mg gel-IME).
Actp para condiciones iniciales.
Actp en el t ipo de reactor que se indica.
Fracción de actividad sustrai'da de la disolución de enzima que se aplica al proceso de inmovilización.
Disolucón de enzima purificada por cromatografía en CM-Se-phadex.
Disolución de enzima purificada por cromatografi'a en CM-Se-phadex y posteriormente en Phenyl-Sepharosa.
Soporte de vidrio de poro controlado con grupos arilamina.
Enzima inmovilizada en CPG-AA activado con ácido nitroso.
Capacidad de reacción del reactor.
Reactor continuo de baño agitado.
Eficacia de acoplamiento, fracción de actividad manifestada por el IME respecto a la sustrai'da de la disolución.
L-3,4-Dih¡drox¡fenilalanina.
Enzima
Soporte de poliacrilamida con grupos arilamina.
Enzima inmovilizada en Enzacryl-AA activado con ácido nitroso.
Factor de purificación.
Enzima inmovilizada en soporte con forma de gel.
Enzima inmovilizada en soporte de nylon con forma de gel.
Extracto estándar de enzima (ó proenzima) de epidermis de rana, obtenido de forma selectiva con tanpón fosfato, después de una extracción previa con agua (Método: 12.1.1)
Enzima (proenzima) inmovilizada.
Cantidad de enzima inmovilizada, en unidades estándares (U).
Masa de gel-IME (g ó mg), longitud de tubo-IME (cm) ó superficie.de membrana-IME (cm^).
membrana-IME Enzima inmovilizada en soporte con forma de membrana.
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NAQA
NAQA-IME
NB
NB-IME ó NB-glut-IME
NB-nitroso-IME
NH
NH-IME
NPAA
NPAA-IME
NPI
NPI-IME
NPI-acético-IME
P
P
PBCR
Phe
Pi
P ' T
Q
q
rglobal
rinm
rprot
rpur
S
SE (SP)
STR
Soporte de nylon con grupos alqilamina obtenido por ruptu-no hidroh'tica de grupos amida del nylon.
Enzima inmovilizada en NAQA activado con glutaraldehido.
Soporte de nylon-bencidina.
Enzima inmovilizada en NB activado con glutaraldehido.
Enzima inmovilizada en NB activado con ácido nitroso.
Soporte de nylon parcialmente hidrolizado.
Enzima inmovilizada en NH activado con glutaraldehido.
Soporte de nylon-poliarilamina.
Enzima inmovilizada en NPAA activado con ácido nitroso.
Soporte de nylon-poliisonitrilo.
Enzima inmovilizada en NPI activado con acetaldehido.
Enzima inmovilizada en NPI activado con acético/acetaldehido.
Producto de reacción.
Parámetro que indica las unidades estándar de IME utilizadas por litro de disolución sustrato procesado a lo largo de la vida de uso del reactor (U/1).
Reactor de columna con lecho empaquetado.
Enzima purificada por cromatografi'a en Phenyl-Sepharosa.
Extracto enzimético obtenido de epidermis de rana por extracción directa con tampón fosfato.
Producción específica total del reactor a lo largo de su vida de uso (mol ó g de dopa/Ude IME.
Velocidad de flujo volumétrico en reactores continuos (ml/h).
Parámetro que indica la masa de gel-IME (g ó mg) utilizada por litro de disolución sustrato procesado en el reactor a lo largo de su vida de uso.
Rendimiento del proceso global de purificación e inmovilización.
Rendimiento de inmovilización.
Rendimiento de unión de proteína en la inmovilización.
Rendimiento del proceso de purificación.
Sustrato.
Enzima (proenzima) soluble.
Reactor de baño agitado.
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Tiempo (min, h).
Tiempo de semiinactivación (h).
Reactor de tubo.
Tiempo de residencia normalizado (min/U).
Tiempo total o vida de uso del reactor (h).
Enzima inmovilizada en soporte con forma de tubo.
Velocidad lineal del fluido de un reactor continuo (cm/h)
Velocidad de consumo de oxígeno (°/Q de C^ /min) .
Volumen del reactor (mi, I).
Volumen de sustrato (mi, I).
Volumen total de sustrato procesado a lo largo de la vida de uso del reactor.
Factor de conversión; fracción de sustrato transformado en producto.
Factor de conversión medio del producto obtenido a lo lar go de la vida de uso del reactor.
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1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO DEL TRABAJO.
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1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO DEL TRABAJO.
La inmovilización de enzimas es una técnica que consiste en
la fijación física o química de las moléculas de protei'na a la estructura de un
soporte insoluble en agua. Este campo de la Biotecnología empezó a tomar auge
en la década de los sesenta y viene desarrollándose durante los últimos años (Mos
bach,1976), abriendo amplias posibilidades para el futuro de la tecnología de en
zimas (Thomas, 1979a; 1979b). Gracias a este desarrollo se ha conseguido aplicar
dicha tecnología a procesos industriales (Pitcher, 1975; Weetall, 1977; Tramper,
1979), y a sistemas analíticos (Guilbault, 1979; Hornby et al. 1977; Sundaram,
1979). También se vienen aplicando ampliamente para estudios bioquímicos, co
mo por ejemplo, sobre la naturaleza funcional de subunidades aisladas ( Chan,
1976), sobre cambios conformacionales (Gabel y Kasche, 1976), y especialmen
te la simulación in vitro de enzimas que en su estado natural se encuentran a-
sociadas a estructuras celulares particuladas, mediente la inmovilización a mem
branas artificiales reconstituidas (Broun, 1976; Vieth, 1979).
La tirosinasa es un sistema enzimático que presenta activida
des tirosina hidroxilasa y dopa oxidasa y cuya estructura y función se viene
estudiando en nuestro Departamento, en coordinación con el Departamento de
Bioquímica de la Universidad de Murcia. Este sistema enzimático presenta una
serie de problemas, tanto desde el punto de vista de la expresión de su activi
dad, como de su aplicación a la tecnología de inmovilización de enzimas. Así,
bajo el aspecto bioquímico, en epidermis de anfibios se extrae en forma de
proenzima que se activa por luz, temperatura y enzimas proteolíticas (Barisas y
McGuire, 1974; Mikkelsen et al., 1975), muestra histéresis (García Carmona.1980),
un equilibrio asociación-disociación y otras propiedades características (Ferragut,
1980 ). Desde el punto de vista biotécnológico, la tirosinasa es una enzima que
presenta limitaciones de transferencia de materia, debido entre otros factores a
la baja solubilidad de los sustratos y a su inestabilidad ocasionada por los pro
ductos y otros factores.
Hay una evidencia bibliográfica de inmovilización de tirosina-
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sa de champiñón, como intentos de estabilización de la enzima (Wykes et al.,
1971; Letts y Chance, 1974), sin llegar a conseguir la suficiente estabilidad que
permitiera su uso continuado. También Schiller y Liu (1976) y Schiller et al.(1978),
inmovilizaron tirosinasa de champiñón para la determinación potenciométrica de
fenoles en aguas residuales. Aunque este sistema resultó sensible desde el pun
to de vista anali'tico, perdía drásticamente la actividad, lo que impedía su uso
repetitivo.
En nuestro caso, la enzima objeto de estudio fué la de epi
dermis de rana. En nuestro Departamento se ha estudiado la interacción de esta
enzima con soportes sólidos para cromatografía de afinidad (Iborra et al. 1976;
Cortés, 1978) y mediante la técnica de inmovilización, se han analizado los e-
fectos microambientales de diferentes soportes en la actividad dopa oxidasa (I-
borra et al. 1977; Manjón, 1978), la activación por inmovilización de la activi
dad dopa oxidasa de la proenzima (Iborra et. al., 1979), la expresión de la
actividad de las subunidades y la estructura cuaternaria por entrecruzamiento
(Ferragut, 1980). Así mismo, se ha aplicado la técnica de fotooxidación con
colorantes inmovilizados para analizar propiedades estructurales y funcionales de
la actividad dopa oxidasa (Llorca, 1980)
Los objetivos del presente trabajo están centrados en la acti
vidad tirosina hidroxilasa de la enzima. En primer lugar se pretende el análi
sis de las características generales de la actividad tirosina hidroxilasa de la tiro
sinasa inmovilizada en diferentes soportes sólidos, en comparación con las
propiedades de la enzima soluble , con el fin de conseguir un sistema con
mayor estabilidad de la enzima. Por otra parte, al mejorar los procedimientos
de inmovilización y de estabilización de esta enzima suicida (García Carmona,
1980), se pretende ampliar las posibilidades de aplicación a la síntesis de L-do-
pa, por su interés farmacológico, así como la utilización del sistema inmoviliza
do para fines analíticos, entre ellos un electrodo de enzima.
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2. ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE TIROSINASA
SOLUBLE. COMPARACIÓN CON DOPA OXIDASA.
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ACTIVIPAD TIROSINA HIDROXILASA DE T1ROSINASA SOLUBLE.
COMPARACIÓN CON DOPA OXIDASA.
2 .1 . CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA ACTIVIDAD TIROSINA
HIDROXILASA DE TIROSINASA.
El sistema enzimático tirosinasa (E.C. 1.14.18.1), con el
nombre recomendado de monofenol monooxigenasa (Comission Biochemical No-
menclature, 1972), incluye a enzimas presentes en especies de toda la escala filo-
genética (Pomerantz, 1963 ; Horowitz et al., 1970; Miller et al., 1970; Burnet,
1971; Padrón et al., 1974; Pomerantz y Murphy, 1974; Mikkelsen y Triplett,
1975 ; Hughes y Pnce, 1975 ; Abramowitz y Chavin, 1978; Nishioka et al. 1978).
Tienen propiedades distintas según la fuente, siendo común en todos los casos
ser cuproproteínas no azules y catalizar la oxidación de monofenoles y/o difeno
les (Gunsalus, 1974). El proceso general, que en su función biológica se asigna
a la tirosinasa de origen animal es el siguiente (Pomerantz y L i , 1970).
°2 H2° HO 1 / 2 o 2 H2o O
HO-(Cg>-R > {. H 0 J g ^ . R \ ^ Q a > ~ ^ _ R AH2 (1) A ^ ' { 2 ) ^ ^
L t i r o s i n a L-dopa dopaquinona M- &
siendo A H 2 un cofactor dador de electrones. Le siguen reacciones no enzimáti-
cas que dan lugar a la formación de dopacromo (Nicolaus, 1968) y éste
lentamente, se emplea en la formación de pigmentos de melaninas. La reacción
(1) es la que propiamente define la actividad tirosina hidroxilasa y la (2) a la
actividad dopa oxidasa (Pomerantz, 1966). Las expresiones de acividad cresolasa
y catecolasa, que también se emplean para indicar ambas funciones de la enzima,
se refieren normalmente al proceso global, fácilmente observable, de formación
de dopacromo y consumo de oxígeno que tiene lugar cuando se parte de L-ti-
rosina o de L-dopa como sustratos, respectivamente.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980
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La enzima de epidermis de rana es una glicoproteína con
0,75 % de carbohidratos y con estructura oligomérica, que mantiene un equi
librio de asociación-disociación de monómero-tetrámero en la forma nativa de
proenzima y monómero-dimero en la forma activada con tripsina, siendo aproxi
madamente de 70.000 daltons el peso molecular del monómero (Ferragut, 1980),
La conversión de proenzima a enzima implica un desplegamiento de la cadena
polipepti'dica (Iborra et al. 1978, Ferragut, 1980) y alcanzar una conformación
más estable (Galindo,1976, Manjón,1978; García Carmona, 1980). La interacción
con soportes de afinidad hidrofóbica han demostrado el carácter hidrófobo de
la tirosinasa y ha permitido su purificación(Cortés, 1978).
En presencia de ascorbato, con L-dopa como sustrato, El- Ba-
youmi y Frieden (1957) observaron que no se formaba dopacromo y se produ
cía la oxidación de ascorbato, la cual Fling et al. (1963) observaron que se da
ba a dos veces la velocidad de formación de dopacromo en ausencia de ascor-
bato.Se interpretó por una rápida reducción de la dopaquinona formada, al
reaccionar con el ascorbato, según el siguiente esquema de reacciones:
no E
dehidroascorbato L>14'1 « W L-ascorbato
AH,
L-tirosina >
(1)
dopacromo
(4) I noE
leucodopacromo no E
(D,(2),(3),(4),(5)
En presencia de ascorbato las reacciones (4) y (5) no se dan
y el balance global con L-dopa como sustrato daría:
Oo •+" ascorbato -> dehidroascorbato (6)
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Mientras que con L-tirosina sen'a:
L-tirosina + ascorbato L-dopa -+- dehidroascorbato > (7)
-f- 3/2 0 2 + A H 2 + H 2 0 - I - A
Aunque el balance global de la reacción (7) es la conversión de L-tirosina a L-
dopa, no representa la reacción propia de la actividad hidroxilante de L-tirosina
sino el proceso conjunto de las reacciones (1), (2) y (3). Además,por otro lado
hay que tener en cuenta que el ciclo formado por las reacciones (2) y (3) de
termina la existencia de un cortocircuito que daría lugar a la oxidación neta
de ascorbato como consecuencia de la acumulación de L-dopa formada. Esto
último, es equivalente a considerar la reacción real en presencia de ascorbato
como la suma de la reacción (7) y n veces la reacción (6)
El estudio de la actividad tirosina hidroxilasa está condicio
nado a los métodos de medida que se pueden aplicar, de los cuales los más ca
racterísticos son los siguientes:
a) Medida espectrofotométrica del dopacromo formado. Dado que en este caso se
mide el producto final, para considerarlo como medida de la actividad tirosina hi
droxilasa es necesario que la hidroxilación de tirosina sea la etapa limitante del
mecanismo.
b) Medida polarográfica o manométríca del oxígeno consumido en la reacción. Co
mo en el caso anterior implica una medida del proceso global y no puede emplear
se correctamente en presencia de ascorbato, pues la existencia del cortocuito for
mado por las reacciones (2) y (3) implican un consumo de oxígeno no relaciona
do directamente con la actividad de hidroxilación de tirosina.
c) Medida radiométrica del 3 HOH formada a partir de L-tirosona-3,5-3H, según el
siguiente mecanismo aceptado (Pomerantz, 1966):
' H n n n u HO ^ ^ ,COOH
N H 2 + A + 3HOH j 0 f ^ N H 2 +AH2+02 >;§) r
H ° J, 3H (8)
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En este método se está midiendo solamente la etapa de hidroxilación de la L-
tirosina, independiente de las posteriores acciones de oxidación de la L-dopa
formada. Constituye pues, un método óptimo para distinguir la actividad tirosi-
na hidroxilasa de las demás reacciones, enzimáticas o no, que acompañan al sis
tema de reacción. Aunque es muy sensible, la laboriosidad del método pone li
mitaciones a su utilización.
d) Medida colorimétrica de la L-dopa acumulada en la reacción en presencia de
ascorbato. Este método fué el empleado a lo largo de este trabajo como métof
do estándar ( descrito en 12.7), en base al método original de Arnow (1937a),
modificado por nosotros. Su aplicación es sencilla, rápida, reproducible y lineal
con la concentración de enzima, y dado que parte de nuestro objetivo era la
síntesis de L-dopa, el método nos dio una medida apropiada. Las dificultades
de su uso para estudio de mecanismos de las reacciones de la tirosinasa, radi
can en que no se está midiendo simplemente la conversión de L-tirosina a L-
dopa, sino un conjunto de reacciones que incluirían las etapas de mecanismos
más complejos, como los de las reacciones (1), (2) y (3). Pomerantz (1966),
observó que con tirosinasa de mamíferos, la velocidad de hidroxilación de tiro-
sina, medida radiométricamente, era la misma en presencia que en ausencia de
ascorbato, e igual que la de acumulación de L-dopa en presencia de ascorbato
midiendo por el método de Arnow. Esto implicaba que la actividad tirosina hi
droxilasa no se afecta en si misma por la presencia de ascorbato, al menos en
términos de velocidad inicial.
Otra propiedad característica de la actividad hidroxilasa
de tirosinasas es la existencia de un periodo de retardo o también llamado de
inducción, que ha dificultado aún más el estudio de esta actividad. Ha sido en
contrado en tirosinasa de mamíferos (Pomerantz, 1964), de insectos (Seybold
et al., 1975) y de epidermis de rana (García Carmona, 1980).Los requerimientos,
de cofactores para la inducción de la enzima demamíferos ha sido estudiada por
Pomerantz y Warner (1967) y por Hearing et al. (1978 a), llegando a la conclu
sión de que el producto de hidroxilación de la L-tirosina, la L-dopa, es el más
eficaz cofactor, el cual actuando como dador de electrones (AH2) elimina el pe
ríodo de retardo. De acuerdo con esto la estequiometría de las reacciones (1) y
(2) quedaría como sigue(Pomerantz y Warner, 1967):
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L-tirosina
L-dopa Tirosinasa
-* L-dopa
HoO
-» dopaquinona (9)
La disminución del período de retardo con la concentración de L-dopa inicial
se aprecia tanto midiendo la actividad por la formación de dopacromo, como
por el método radiométrico, e igualmente lo hace el aumento de la concentra
ción de enzima. La concentración de sustrato L-tirosina aumenta los períodos
de retardo. Estos hechos y otros factores que afectan al período de retardo
sugieren a Garci'a Carmona que la enzima posee un comportamiento por el que
se le puede asignar la propiedad de histéresis en el sentido definido por Frieden
(1970), y lo interpreta en función de la existencia de un equilibrio de dimeri-
zación lento en que la forma dimérica de la enzima sería la forma funcional-
mente activa, la cual se formaría más rápidamente por la presencia de L-dopa
Con el esquema de reacciones (9), el proceso en presencia
de ascorbato, suponiendo que su efecto fuera simplemente la reducción de la
dopaquinona a L-dopa, sería el siguiente:
L-Tirosina
L-dopa
-* L-dopa
•+ H 2 0 ascorbato dehidroascorbato
t dopaquinona -"""" ^^~**>* L-dopa
(10) lo que daría una estequiometría global de:
L-tirosina + 0«-
ascorbato
L-dopa + H 2 0
-+- dehidroascorbato (11)
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Una característica d« la tirosinasa que afecta notablemente a
los objetivos del trabajo que se presenta en esta Memoria es la inactivación por
la actuación. La estabilidad de una enzima en su actuación catalítica puede cuan-
tificarse por los valores del tiempo de semiinactivación ( t j ,2 ) , definido como el
tiempo necesario para que a lo largo de su actuación, la actividad de la enzima
se redujera a la mitad de su valor inicial. La actividad dopa oxidasa, medida por
la formación de dopacromo por método espectrofotométrico, manifiesta valores
de t1 / 2 de 4 minutos (Manjón, 1978). La actividad tirosina hidroxilasa, seguida por
el método radiométrico, en ausencia de ascorbato y por lo tanto dándose la
formación de dopacromo, dio valores semejantes de t j , 2 , entre 4 y 5 minutos.
Sin embargo en presencia de ascorbato en el medio de reacción, no se observó
pérdida significativa de actividad durante 10 minutos de reacción (García Carmo-
na, 1980). De las características cinéticas del proceso de inactivación, García Car
mona dedujo que el proceso de inactivación partía de un intermediario Enzima—
-sustrato o Enzima—producto del mecanismo del proceso catalítico. Si el efecto
del ascorbato fuera simplemente la reducción de dopaquinona a L-dopa, la anu
lación de la inactivación por el ascorbato demostraría que la especie que se i-
nactiva es un complejo E-P, o de lo contrario habría que admitir que el ascor
bato puede unirse a algún centro de la enzima, desviando el proceso catalítico
por otro mecanismo; esto últ imo estaría en consonancia con el efecto de cofac-
tor que el ascorbato ejerce respecto al período de retardo. Por otro lado la in
movilización de la enzima a soportes sólidos, proporcionó un espectacular aumen
to de la estabilidad a la actuación de la actividad dopa oxidasa, llegando a va
lores de t j , 2 de 150 minutos pon el soporte Enzacryl-AA (Iborra et al. 1977,
Manjón, 1978). Esto sugiere que en el proceso de inactivación estaba implicado
algún cambio conformacional, y que la rigidez que confiere a la estructura de
la proteína la unión covalente al soporte, dificulta ese cambio conformacional.
La inmovilización de la enzima a soportes ¡nsolubles y su ac
tuación en presencia de ascorbato, se emplearán en este trabajo para intentar u-
na alta estabilización de la actividad hidroxilasa de la tirosinasa, a fin de permi
tir su aplicación a los fines indicados anteriormente como objetivos del trabajo.
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En las secciones siguientes del presente capítulo se analizarán
los resultados obtenidos en la purificación de la actividad tirosina hidroxilasa so
luble y de algunas propiedades cinéticas, en relación con la actividad dopa oxi
dasa de la misma proteína
2.2. COMPORTAMIENTO FRENTE A LA EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN.
El procedimiento general de obtención de la enzima consistió
en la extracción de la proteína de epidermis de rana por su solubilización en
presencia de una fuerza iónica apropiada. Posteriormente se purificó por croma
tografía de intercambio iónico en CM-Sephadex, seguido de cromatografía de in
teracción hidrofobica con Phenyl-Sepharosa. La enzima se obtuvo con este proce
dimiento en forma de proenzima, pasándola a la forma activa mediante trata
miento con tripsina (Método: 12.1.3.).
La extracción de tirosinasa se realizó por homogenl zación de
la epidermis de rana con disolución de tampón fosfato pH 7,0, de concentración
apropiada para proporcionar la fuerza iónica deseada. Cuando se empleó como
medio de extracción agua destilada, se extrajo proteína sin ninguna actividad t i
rosina hidroxilasa ni dopa oxidasa. El incremento de la concentración de fosfato
proporcionó un ligero aumento de la cantidad de proteína y actividad extraída,
pero con una menor actividad específica, siendo prácticamente idénticos los com
portamientos de la actividad hidroxilasa y dopa oxidasa (Fig. 1). Así pues, cuan
do se deseó una extracción lo más selectiva posible, resultó más apropiado el
tratamiento con agua y posterior extracción en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0.
Este sistema de extracción selectiva, fué el empleado como método estándar
(Método: 12.1.1.) y el extracto así obtenido se le denominó extracto H20/P¡.
La extracción directa con fosfato 0,1 M pH 7,0 (extracto P¡) proporcionó ma
yor concentración de proteínas propias del entorno natural de la enzima, aproxi
mación que se utilizó en algunas experiencias posteriores. En la Tabla 1 se
muestran los resultados obtenidos de una experiencia tipo, de los dos sistemas
de extracción, y como puede observarse existió un paralelismo entre el compor
tamiento a la extracción de la actividad tirosina hidroxilasa y la actividad dopa
oxidasa.
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F O t F A T O ( M |
Fig. 1. Extracción de tirosinasa de epidermis de rana a diversas con
centraciones de fosfato. Cada extracción se realizó por ho-
mogenización de 20 mg de epidermis liofilizadas por mi de
tampón fosfato, pH 7,0.
Tabla 1
Actividad tirosina hidroxiiasa y dopa oxidasa en una extracción a partir de
epidermis.
Sistema
de
extracción
P¡
H 2 0
H20/P¡
Protei'na
(mg/ml)
0,53
0,43
0,20
Tirosina
U/ml
0,23
0,00
0,17
hidroxiiasa
U/mg
0,43
—
0,86
fP
1.0
—
2,0
dopa
U/ml
2,2
0,0
1.7
oxidasa
U/mg
4,0
—
8,7
fP
1.0
—
2,2
fp: factor de purificación respecto al extracto P¡
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En las diversas extracciones llevadas a cabo con distintas
muestras de epidermis, se observó siempre una relación constante de 10 +0,6
unidades de dopa oxidasa extraída por unidad de tirosina hidroxilasa. Este he
cho apoya el supuesto de que la misma proteína fuera responsable de ambas
actividades enzimáticas. El valor de la relación dopa oxidasa/tirosina hidroxilasa
fué menor (alrededor de 6 ) en extractos almacenados durante 30 días a 5°C,
lo cual nos indicó que la inactivación por el almacenamiento afectó más a la
actividad dopa oxidasa que a la tirosina hidroxilasa.
La interacción de extractos de proenzima con el soporte car
gado negativamente CM-Sephadex dio un mismo perfil de elución para las activi
dades tirosina hidroxilasa y dopa oxidasa (Fig. 2). Los resultados obtenidos indi
caron que el método fué útil para la purificación de la proenzima. La igualdad
en el comportamiento de elución fué un dato más a favor de que la misma
proteína era responsable de las dos actividades enzimáticas.
En nuestro Departamento se había demostrado anteriormente
la afinidad de la proteína con actividad dopa oxidasa por los grupos fenilos del
Fig. 2. Cromatografía en CM-Sephadex de un extracto h^O/Pj de
proenzima. Para 250 mi de extracto H 20/Pi (0,61 U T.H./ml,
5,1 U D.O./mg) se empleó 1 g de CM-Sephadex. Columna de
3x30 cm. Q=30 ml/h.
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soporte hidrofóbico Phenyl-Sepharosa (Iborra et al., 1977; Cortés, 1978). En ba
se a ello, se aplicó la cromatografía en columna con dicho soporte a extractos
de protirosinasa y de tirosinasa activada en columna de tripsina-sepharosa, así
como a protirosinasa purificada previamente por intercambio iónico con CM-Se-
phadex. Los comportamientos de elución fueron muy semejantes en todos los
casos para las dos actividades ensayadas, tanto respecto a los volúmenes de elu
ción como en los factores de purificación obtenidos. Un perfil de elución carac
terístico de esta cromatografía de interacción hidrofóbica se muestra en Ja
Fig. 3. La cromatografía en Phenyl-Sepharosa resultó útil como técnica
de purificación en sí misma y como etapa de purificación concatenada con la
cromatografía de intercambio iónico en CM-Sephadex.
Fig. 3 Cromatografía de afinidad hidrofóbica en Phenyl-Sepha
rosa de proenzima purificada previamente por CM-Sepha
dex. Aplicadoa 10 mi de disolución de proenzima (3,2
U T.H./mg y 36 U D.O./mg). Columna con 3 mi de
Phenyl-Sepharosa. Q=12 ml/h.
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En la Tabla 2 se muestran los resultados de aplicar los mé
todos de purificación a un extracto de tirosinasa. Puede observarse que la puri
ficación de un extracto HoO/P¡ con CM-Sephadex dio semejantes factores de pu
rificación que con Phenyl-Sepharosa, aunque con mayor rendimiento en este últi
mo. El procedimiento global de purificación, consistente en una extracción selec
tiva h^O/Pj, seguido de interacción con CM-Sephadex y finalmente cromatogra
fía en Phenyl-Sepharosa, proporcionó una preparación que se le denominó como
protirosinasa purificada CM/Phe. Se consiguieron preparaciones con actividades es
pecíficas de 6-8 U T.H./mg, que representaron factores de purificación de 30-40
respecto al extracto P¡ y se obtuvieron con rendimientos de recuperación de ac
tividad del 60-80 % .
Tabla 2
Purificación de las actividades tirosina hidroxilasa y dopa oxidasa de protirosinasa
Etapa de
purificación
Extracto P¡
H20/P¡
CM-Sephadex (*)
Phenyl-Sepharosa
CM/Phe (**)
(*)
s
dopa
oxidasa
(U/mg)
2,6
6,5
34,0
35,1
70,0
tirosina
hidroxilasa
(U/mg)
0,23
0,60
3,59
3,45
7,36
fP
1.0
2,6
15,6
15,0
32,0
rpur
100
91
65
81
61
(*) Aplicado a extracto H20/P¡
(**) Proceso global de purificación: extracción
l-^O/Pj, cromatografía CM-Sephadex y cro
matografía Phenyl-Sepharosa.
fp factor de purificación referido a la
actividad tirosina hidroxilasa de ex
tracto P¡
r-yj/endimiento del proceso de purifica
ción respecto a tirosina hidroxilasa.
Una muestra de protirosinasa purificada se sometió a electrofo-
resis catiónica de pH 4,3 en gel de poliacriiamida (Método: 12.1.4.). La tinción de
las bandas de proteínas con azul Comassie dio un electroforetograma con una úni
ca banda de proteína (Rf 0,12) Los densitogramas indicaron una homogeneidad de
la preparación de un 95 % de pureza. Cuando se incubaron geles con L-dopa o
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con L-tirosina independientemente, en presencia de tripsina, se observó la tinción
de la banda de protei'na en cada uno de los geles, lo que demostró que tanto
la actividad dopa oxidasa como la tirosina hidroxilasa coincidi'an en la misma
banda.
Asi' pues, con los resultados expuestos, quedó confirmado que
la tirosinasa es responsable de las dos actividades tirosina hidroxilasa y dopa oxi
dasa.
2.3. CINÉTICA, PERFIL pH-ACTIVIDAD Y ESTABILIDAD A LA REACCIÓN
Con el fin de comparar las propiedades de la tirosinasa inmo
vilizada con las de la propia enzima soluble, se realizó un análisis de las propie
dades más significativas, relacionadas con la afinidad de la enzima por su sustra
to, pH óptimo e inactivación con la actuación.
2.3.1. CINÉTICA.
Se estudió la cinética de la reacción de hidroxilación de L-ti
rosina, catalizada por tirosinasa en presencia de ascorbato, midiendo la velocidad
de síntesis de L-dopa (Método: 12.8.1.). La concentración de L-dopa formada
fué lineal en un tiempo de reacción de 0-20 minutos (Fig. 4 ) . En las condicio
nes de trabajo empleadas, no se apreció la existencia del periodo de retardo men
cionado anteriormente. A concentraciones de ascorbato de 1,5 mM, García-Carme
na (1980) ha observado que en, extractos de tirosinasa de epidermis de rana, se
elimina casi completamente el período de retardo. En nuestro caso, con concen
traciones de ascorbato empleadas (2,5 mM) eliminaron prácticamente el periodo
de retardo en las condiciones de medida utilizadas. Sin embargo, Pomerantz (
1966) y Hearing et al. (1978) encontraron que con tirosinasa de mamíferos las
concentraciones elevadas de ascorbato no evitaban totalmente el período de re
tardo, al menos en las condiciones de ensayo empleadas por ellos. Además, la
concentración de ascorbato empleada evitó eficazmente la oxidación de L-dopa
a dopaquinona, lo que se comentará más adelante en relación con la enzima in
movilizada.
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5 10
TIEMPO ( min )
Fig. 4.
Actividad tirosina hi-
droxilasa de tirosinasa.
Concentración de L-dopa
formada con el tiempo
de reacción, para distin
tas concentraciones de
L-tirosina.
Asi' mismo la velocidad de reacción fué lineal con la cantidad
de enzima presente en el medio de reacción, como puede apreciarse en la Fig. 5,1o
que confirma el origen enzimático de la reacción y la validez del método de medi
da de actividad empleado.
Fig. 5.
Variación de la actividad
tirosina hidroxilasa con
la cantidad de enzima a-
plicada.
VOLUMEN DE EXTRACTO i/^X)
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Cuando se calcularon los valores de los parámetros cinéticos
K M y V de la enzima en distintos estados de purificación, por medio de la
representación de Lineweaver-Burk (Fig. 6-A), se obtuvieron unos valores de K M
de 1,95 mM cuando se empleó extracto H20/P¡, valor que se incrementó has
ta 2,85 mM cuando se utilizó enzima purificada CM/Phe. Este incremento del
valor de K M con la purificación sugiere que la tirosinasa pierde afinidad por la
L-tirosina al eliminar proteínas del medio. Por ello en los estudios posteriores
de inmovilización de tirosinasa en soportes sólidos se tuvo en cuenta el estado
de pureza de la tirosinasa empleada, como posible variable determinante de las
propiedades del sistema.
De los parámetros cinético K M y V m se dedujo la curva de
Michaelis teórica (Fig. 6-B). Si se compara esta curva teórica con los puntos ex-
%
(nwi
1
400
300
200
100
y -¿U
•
»
•
•
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^ ^
A
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< n M > 1
1
1/S ( mW1 )
Fig. 6. Cinética de la actividad tirosina hidroxilasa de extracto H20/P¡.
A) Representación de Lineweaver-Burk
B) Representación de la curva teórica de Michaelis (v frente a S), para
los valores de KM=1.95 mM y de Vm=0,031 mM/min, calculados de
la representación A. Con flechas se indican los valores de K M y so
lubilidad de la L-tirosina.
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perimentales obtenidos, se observa que es muy forzado deducir un comporta
miento de Michaelis con estos resultados, pues la solubilidad máxima de la L-tir-
rosina de 2,5 mM (Merck Index, 1968), está en la zona de valores de K^ cal
culados (1,96 y 2,5 mM). De hecho si los valores experimentales de v frente a
S, para concentraciones de L-tirosina de entre 0 y 1 mM, se ajustan a una rec
ta se obtienen coeficientes de correlación superiores a 0,99. Asi' pues, en la mi
tad del rango de trabajo, la actividad tirosina hidroxilasa responde a una cinéti
ca de seudoprimer orden.
De esta forma, la solubilidad de la L-tirosina es un factor li
mitante de la máxima actividad manifestable por la enzima. Como condiciones
estándar para medida de actividad tirosina hidroxilasa y para su utilización en la
síntesis de L-dopa, se ha empleado disolución saturada de L-tirosina (2,5 mM),
lo que significa respecto al sustrato condiciones no saturantes de la enzima.
El valor de K^ que se obtuvo en presencia de ascorbato, en
base a la medida de acumulación de L-dopa y con el empleo de tirosinasa no
purificada ( K ^ 1,96 mM), coincide aproximadamente con el obtenido por Gar
cía Carmona (1980), empleando el método radiométrico de Pomerantz. Esto es
as¿ tanto en presencia como en ausencia de ascorbato ( K ^ 1,9 mM). Además,
los valores obtenidos de V m a x y de velocidad de reacción medida por este mé
todo no variaron con la presencia de ascorbato, indicando que la velocidad de
conversión de L-tirosina a L-dopa no se vio afectada por la presencia de ascor
bato, al menos en términos de velocidad inicial.
Con el método espectrofotométrico basado en la medida del
dopacromo formado, en ausencia de ascorbato, García Carmona obtuvo un va
lor de K^ de 1,56 mM con sustrato L-tirosina y de 2,46 con sustrato L-dopa
y obteniendo una relación de recambio o turnover ( V m a x , j 0 p a / V m a x tir) ^ e
7,14. De estos datos puede deducirse que para las condiciones de concentracio
nes de sustratos empleadas en los métodos estándar de medida de actividad, la
velocidad ae reacción, para la actividad tirosina hidroxilasa con una concentra
ción de L-tirosina de 2,5 mM, sería:
v t i r - 2 - 5 v max. tir = 0,616 V m a x t i r
1,56+ 2,5
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y para la actividad dopa oxidasa con L-dopa 10,15 mM:
'dopa = 1 0 - 1 5 Vmax. dopa
2 , 4 6 + 10,15 ° - 8 0 5 Vmax dopa
teniendo en cuenta que Vmax dopa/V m a x t ¡ r =7,14, se deduce que:
vdopa _ °.805 V
"tir
maxdopa = 0.805
O-6 1 6 Vmax tir ° ' 6 1 6
9,33
Este valor de 9,33, representa la razón de actividad dopa oxidasa respecto a la
de tirosina hidroxilasa que se deducen de los datos cinéticos obtenidos por Gar
cía Carmona, valor cercano al de 10 —0,6 , obtenido en nuestro caso para la
relación de actividad dopa oxidasa respecto a tirosina hidroxilasa de diferentes
extractos recién obtenidos (Sección 2.2.), relación que como se ha indicado an
tes disminuyó con el almacenamiento. Esta similitud de resultados confirma la
validez de los diferentes métodos utilizados para medida de actividad enzimatica.
2.3.2. PERFILES pH-ACTIVIDAD.
Los perfiles pH-actividad de la actividad tiroxina hidroxilasa,
se desplazaron muy ligeramente hacia pH alcalino con la purificación, lo que in-
1.0 -
< >
O 0.5 < O > p u < • Purificado CM/Ph«
0 Extracto H20/P¡
_l
Eniayc* *n P¡-0,o6 M
I 1
• Purificado CM/Ph» o Extracto H20/Pj
Enwyot «n P¡ - 0,10 M
Fig. 7.
Perfiles pH-actividad.
Efecto de la purificación y
de la fuerza iónica.
pH PH
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dicó la existencia de efectos protefna-protefna en las propiedades de la enzima,
hecho que se habi'a observado también en las propiedades cinéticas. Sin embar
go la variación en la fuerza iónica apenas influyó en la forma de los perfiles
pH-actividad (Fig. 7).
2.3.3. ESTABILIDAD A LA REACCIÓN.
Para estudiar la estabilidad de la tirosinasa a la reacción con
sustrato L-tirosina, en presencia de ascorbato, se trató la enzima con sustrato y
se dejó reaccionar, midiéndose la concentración de L-dopa formada con el tiem
po ( Fig. 8-A). Las curvas derivadas (Fig. 8-B), expresan la disminución de la ve-
Fig. 8
Pérdida de actividad ti-
rosina hidroxilasa con
la actuación. Efecto del
estado de purificación.
A) Concentración de L-
-dopa formada con el
tiempo de reacción.
B) Disminución de la
velocidad de reacción
con el tiempo.(Derivada
de las curvas A).
<3> extracto Pi; o, extracto
h^O/Pi; purificado CM;
purificado Phe; pu
rificado CM/Phe.
20 40 60
T I E M P O { m m , )
80 100
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locidad de reacción con el tiempo, deducie'ndose de ellas unos valores de tiem
pos de semiinactivacion de t j , 2 = 35-40 minutos y no se apreciaron diferencias
significativas, en este sentido, para enzima en distintos estados de purificación.
Estos valores fueron notoriamente superiores a los encontrados para la actividad
tirosina hidroxilasa, en ausencia de ascorbato, cuando se midió la actividad por
la formación de dopacromo y para la actividad dopa oxidasa ( 4-5 minutos)
(Garci'a Carmona, 1980; Manjón, 1978), Este hecho indica que el proceso de
inactivación con la actuación puede estar relacionada con los productos de oxi
dación de la L-dopa.
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3. CARACTERÍSTICAS DE LOS SOPORTES Y REACTORES
UTILIZADOS EN LA INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA.
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3. CARACTERÍSTICAS D E L O S S O P O R T E S Y R E A C T O R E S E M P L E A D O S
EN LA INMOVILIZACIÓN DE T1ROSINASA.
El término Enzima Inmovilizada (IME), ha sido recomendado
(Commission Biochemical Nomenclatura, IUPAC-IUB, 1974) para describir todas
las preparaciones en las que la enzima es retenida de alguna forma dentro de
los confines limitados de un polímero que actúa como soporte. Una IME es con'
siderada como una forma de enzima modificada, en contraposición con la enzi
ma nativa. Por la forma de inmovilización se clasifican en dos grupos:
a) Ocluidas, que incluyen a las incluidas en una matriz de un polímero y a las
que han sido microencapsuladas.
b) Enlazadas, que incluyen a las adsorbidas y a las unidas covalentemente a ur
soporte insoluble en agua
Las enzimas unidas al soporte covalentemente, se consideran
inmovilizadas por métodos químicos y en los demás casos por métodos físicos.
3.1. ELECCIÓN DEL MÉTODO Y SOPORTE DE INMOVILIZACIÓN.
A la hora de elegir un soporte para la inmovilización de una
proteína hay que considerar una serie de factores dependientes de la naturaleza
del soporte y del método de unión. Así, en la inmovilización por adsorción la
enzima puede alterar sus propiedades por el microambiente eléctrico que le pro
porciona el soporte; en las ocluidas los reactivos para polimerizar el soporte ó
formar microcápsulas pueden afectar químicamente a la enzima, pero por lo ge
neral, la inmovilización por métodos físicos deja la enzima más intacta que los
métodos químicos. En éstos, la unión covalente de la enzima al soporte impli
ca una modificación química de la molécula proteica, que puede afectar drásti
camente a su estructura y actividad enzimática, especialmente si en la unión
intervienen grupos del centro activo o que sean importantes en el mantenimien
to de la conformación activa.
Sin embargo, la inmovilización covalente ofrece grandes ven-
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tajas por la estabilidad de la unión enzima-doporte. Gracias a ella, la conforma
ción de la estructura de la enzima se mantiene más ri'gida que en estado solu
ble por la unión a la estructura del soporte sólido. Asi' es frecuente que la inmo-
movilización covalente de enzimas, aumente la estabilidad de las mismas, tanto
en el almacenamiento como en su actuación (Iborra et al., 1977), aunque pue
de ir acompañado de pérdida notoria de actividad (Srere, 1976). Conseguir un
sistema de inmovilización de una enzima que le proporcione gran estabilidad con
mínimas pérdidas de actividad, es abrir un camino para la aplicación tecnológi
ca de dicha enzima.
En nuestro caso, para la inmovilización de tirosinasa, se op
tó por la unión covalente con el fin de aumentar la estabilidad de la enzima
y minimizar el problema de su inactivación por la actuación.
Actualmente, en la bibliografi'a pueden encontrarse una gran
variedad de métodos y soportes para la inmovilización covalente de enzimas.
(Mosbach, 1976). Los soportes pueden ser de formas fi'sicas diversas como: ge-
les, granulos, membranas, mallas, películas, tubos, etc. Pueden tener una estruc
tura más o menos porosa. Están constituidos químicamente por un esqueleto
covalente o matriz como agar, agarosa, celulosa, colágeno, sílice, alúmina, etc.
Normalmente los soportes se modifican químicamente para disponer de grupos
funcionales reactivos ( aldehidos, alquilaminas, arilaminas, imidoésteres, cianuro,
anhídrido, carboxilato, etc.). El acoplamiento de la enzima al soporte requiere
en primer lugar, la activación del soporte y a continuación el uso, o no, de un
reactivo de acoplamiento (carbodiimidas, dialdehidos, diimidoés'teres, etc.).
El soporte y método de unión más apropiado en cada caso,
dependerá de las características de la enzima y de la finalidad de su utilización.
La elección de un sistema de inmovilización está determinada por:
a) La naturaleza de la enzima: su fuente de obtención, estado de purificación,
forma funcional (monomérica u oligomérica, proenzima o enzima, etc), con
formación, cantidad y disposición de grupos funcionales para su unión al
soporte, etc.
b) La naturaleza del soporte: su estado físico, su porosidad, su resistencia me
cánica, su hidrofilicidad, su esqueleto estructural y el tipo y densidad de
grupos funcionales disponibles para el acoplamiento de la enzima, así como
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el microambiente que el soporte proporciona a las moléculas de enzima.
c) El método de unión: técnica de trabajo, reactivos de activación y/o de aco
plamiento, proporción relativa de cantidad de protema respecto al soporte,con
centración de protei'na, y condiciones generales de trabajo (temperatura, pH,
fuerza iónica, agitación, etc.).
Para la inmovilización de tirosinasa se optó por emplear co
mo soportes: Enzacryl-AA, CPG2¡rciacj-Arylam¡na (CPG-AA) y derivados de nylon.
El Enzacryl-AA se decidió utilizar porque este soporte había dado los mejo
res resultados, en nuestro Departamento, para la actividad dopa oxidasa de
la tirosinasa inmovilizada (Manjón, 1978). El soporte CPG-AA se empleó es
pecialmente por las ventajas mecánicas que ofrecía, entre las que cabe desta
car su mayor porosidad que implica menores problemas difusionales. La ra
zón principal de emplear derivados de nylon para inmovilizar tirosinasa fué
la gran versatilidad que ofrece tanto en la forma del soporte como en los
métodos de inmovilización, dado que puede encontrarse en diversas formas
físicas como: granza convertible en polvo o gel, tubos capilares, membranas,
etc. Además son de muy bajo costo en comparación con la mayor parte
de los soportes normalmente empleados, lo que facilita sus aplicaciones in
dustriales. Los derivados de nylon se prepararon buscando que fueran de fá
cil y sencilla preparación y utilización y en algunos casos para que fueran
soportes con un microambiente semejante al suministrado por los otros sopor
tes anteriormente citados y que habían dado buenos resultados.
A continuación se describen las características de estos so
portes empleados, las modificaciones químicas que se han realizado sobre e-
llos y los métodos de acoplamiento enzima-soporte empleados.
3.2. ENZACRYL-AA
El Enzacryl-AA es un derivado de poliacrilamida que po
see grupos funcionales arilamina (Fig. 9) (Mosbach et al. 1976). Se suministra
comercialmente por Koch Light Lab. Se sintetiza por copolimerización de
acrilamida y p-aminoacrilanilida, entrecruzando con N.N'-metilenbisacrilamida. El
copolímero formado es reducido por tratamiento con iones t i tanio(l l) , dando
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f H - C r V - C H - C U f - C H - C H ^ C H - C H f - C H — C H j CONHt |
NH-CO
I
NH-CO
CONH
CONHt
C H - C H r C H - C H r - C H - C H í - C H - C H r - CH—CH¿"
ÓONHt CONHi CONHi
CONH N H t :
Fig. 9. Esquema del esqueleto estructural de Enzacryl-AA.
Los grupos reactivos del soporte están encuadrados por líneas de puntos.
lugar a grupos arilamina (Barker et al., 1970), a través de los cuales puede rea
lizarse el acoplamiento de la enzima.
La activación del soporte puede realizarse: a) Por diazotación
con ácido nitroso para dar grupos diazo (Epton et al. 1976). b) A través
de la formación de un isotiocianato por tratamiento con tiofosgeno (Manecke,
1970; Epton et al., 1976). En esta Memoria se empleó Enzacryl-AA activado
por diazotación con ácido nitroso (Método: 12.3.1), con el cual el acoplamiento
de la proteína implica principalmente a los residuos de L-tirosina de la misma,
aunque también pueden participar en menor extensión el núcleo imidazol de la
histidina y el indol del triptófano. El esquema de las reacciones de acoplamien
to se indican en la Fig. 10.
El Enzacryl-AA es un soporte hidrofílico, que suministra un
microambiente de grupos hidrofóbicos aromáticos a la enzima, mediante los gru
pos arilamina libres que quedan después de unir a la enzima. Su forma física
es la de partículas finamente divididas y en las especificaciones del suministra
dor se indica que su uso más conveniente es en suspensiones con agitación, lo
que prevee de los problemas de flujo y de difusión que pueden darse por su
utilización en columnas de lecho empaquetado.
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Fig. 10. Esquema de la inmovilización de enzima sobre soportes
con grupos arilamina por diazotación con ácido nitroso.
Método de inmovilización aplicado a los soportes: Enza-
cryl-AA, CPG-AA, NB y NPAA.
3.3. SOPORTE CPG-AA
El soporte CPG-AA, que también se encuentra disponible co-
mercialmente (Corning-Pierce), es un derivado de vidrio de poro controlado (ta
maño de poro 550 A), que contiene grupos arilamina (Fig. 11) y cuya prin
cipal aplicación es la inmovilización de protei'nas (Weetall, 1976).
KO-Sí-ÍC^VNH-CO-^-NHt
Fig. 11. Grupo funcional del CPG-AA
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El vidrio poroso (CPG) se prepara a partir de borosilicato y
puede recubrirse con óxido de circonio (CPGz¡rciad) Para mejorar sus propieda
des mecánicas y su resistencia a pHs superiores a 7. A partir de él, se pueden
obtener una gran variedad de soportes. Asi', el vidrio poroso al tratarlo con ami-
nopropiltrietoxisilano conduce a un soporte con grupos propilamina (Filbert,
1975) que, por tratamiento posterior con cloruro de p-nitrobenzoilo y subsi
guiente reducción con hiposulfito sódico, da lugar a un soporte que contiene los
citados grupos arilamina.
Sobre este soporte se pueden inmovilizar enzimas aplicando
los mismos procedimientos descritos antes para el Enzacryl-AA. Asi', pueden unr-
se por activación del CPG-AA con tiofosgeno (Weetall, 1969a; Pierce, 1980) o
con ácido nitroso (Weetall, 1969a. 1969b; Weetall y Baun, 1970; Weibel y
Bright, 1971). En este trabajo se ha empleado la activación con ácido nitroso
para la inmovilización de tirosinasa al CPG-AA (Método: 12.3.1) y le correspon
de el mismo esquema de reacciones de la Fig. 10.
Los soportes derivados de vidrio poroso ofrecen las siguientes
ventajas en su utilización:
* Poseen alta resistencia mecánica, permitiendo altas presiones de
operación y altas velocidades de flujo (Filbert, 1975).
* Es co'modamente manejable y separable de las disoluciones
por simple decantación.
* Su volumen no se altera por los cambios del medio.
* Puede usarse en sistemas de operación continua durante largo
tiempo
* La porosidad del soporte minimiza los problemas difusionales
La inmovilización de tirosinasa en este soporte con los mismos
grupos funcionales que el Enzacryl-AA, pero con mejores propiedades mecánicas
y mayor porosidad, permitirá comparar el efecto del t ipo de soporte sobre las
propiedades de la tirosina inmovilizada, especialmente en su aplicación en colum
na en donde estos factores son más determinantes.
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-SO
S A DERIVADOS DE NYLON
La denominación de nylon se aplica a una serie de polímeros
lineales, consistentes unidades repetidas de grupos metileno unidos mediante en
laces amidas secundarias.Son pues, poliamidas, y los diferentes tipos son designa
dos de acuerdo con el número de átomos de carbono de sus unidades monomé-
ricas. Así, por ejemplo:
nylon-6 CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH
nylon-6,6 NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)4-CO- •
nylon-6,10 NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)8-CO
nylon-11 CO-(CH2)10-NH-CO-(CH2)10-CO
Los grupos amidas permiten la formación de enlaces de hidró
geno intercadenas. Estos enlaces pueden darse también con el agua del medio, lo
que le confiere un carácter hidrofíiico y es una característica idónea para la in
movilización de enzimas, ya que proporciona un microambiente en el cual la en
zima puede manifestar su actividad y permitir que sea estable (Hornby y Golds-
tein, 1976).
El nylon es un material termoplástico que se caracteriza por
su resistencia mecánica y dureza superficial. Puede estirarse y orientarse en frío,
lo que produce un gran aumento de la resistencia del material y la posibilidad
para la fabricaciónde diversas formas del mismo (Martínez, 1972). Así el nylon
puede obtenerse comercialmente en las siguientes formas físicas:
a) Granza. Es la forma en que se obtiene como materia prima (BASF, BAYER)
a partir de la cual se obtienen las diferentes formas comerciales de nylon.
b) Polvo o gel de nylon. Puede obtenerse fácilmente en el laboratorio a partir
de granza, por medio de formar suspensiones con CI2Ca/metanol y poste
rior precipitación en agua. (Método: 12.2.2). En nuestro caso hemos elegido
para este fin nylon-6 que, junto con el nylon-6,6, es el más hidrofílico y
además es el más utilizado para la inmovilización de enzimas (Goldstein et
al. 1974a).
c) Tubo capilar. En este trabajo se utilizó tubo de nylon-6 (nylon estándar),
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de diámetro interior de 1 mm, aunque también existen el mercado de nylon-11
ó 12 (nylon flexible), y diámetros variables de 0,25 a 8 mm (Portex, Hythe,
Kent, U.K.).
d) Membranas o mallas de nylon. Pueden encontrarse bajo una gran variedad
de tamaño de poro, grosor del hilo, o forma de estar tejido. En nuestro
caso , se utilizó membrana NY10HD, de 10 mieras de tamaño de poro
(ZBF, Switzerland).
e) Otras formas como películas, hilo, etc., no utilizadas en este trabajo.
El nylon tiene pocos grupos funcionales libres.de forma que
debe ser modificado qui'micamente para generar centros potencialmente reactivos
que puedan interaccionar covalentemente con las moléculas de enzima. Hornby
y Goldstein (1976) clasifican los tipos de modificaciones del nylon en tres gru
pos, que a continuación se describen:
1) MÉTODOS QUE IMPLICAN RUPTURA DEL ENLACE AMIDA DE LA
POLIAMIDA.
Los grupos alquilamina liberados en estos métodos, se uti l i
zan para el acoplamiento de las moléculas de enzima. La ruptura del enlace
puede realizarse, por ejemplo, con N,N-dimet¡l,l,3-propanod¡am¡na, que uniéndo
se al grupo carbonilo del enlace amida del nylon, lo desplaza y deja libreuun
grupo amina (Fig. 12), dando lugar a un derivado de nylon con grupos alquila-
mina (NAQA). También puede realizarse la liberación de grupos amino por una
hidrólisis controlada de enlaces amida con un tratamiento con CIH, con lo que
se obtiene un derivado de nylon parcialmente hidrolizado (NH).(Fig. 12). Tanto
el NAQA como el NH, han sido preparados en este trabajo (Métodos: 12.2.4 y
12.2.5) y ambos soportes se activaron por tratamiento con un reactivo bifuncio-
nal como el glutaraldehido (Método: 12.3.2.) que se une a los grupos aminos li
bres del soporte y por otro lado se enlaza posteriormente con los grupos amino:
de la molécula de enzima (Fig. 13).
En el caso del NH, el soporte proporciona a la enzima in
movilizada un microambiente con carga negativa debido a los grupos carboxilo
liberados en la hidrólisis de los grupos amida del nylon. El soporte NAQA su-
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N.N-dimetil,l,a-propanodiamina
H (nyion) C-N— n 0
r$l-—C=0
NH
(C 'H¿ ¿H+ (NAQA)
/ v CH, CH,
ClH/HaO
-C=0 r^N-
(NH)
Fig. 12. Métodos de preparación de derivados de nylon que implican ruptura del enlace amida. Esquema de las reacciones de preparación de los soportes NH y NAQA.
Nr< glutaraktehido N N CH
CHO
NHl
m
DE
N n
CH
i * CH N N L
Fig. 13. Esquema de la inmovilización de enzima (E) a soportes de nylon con grupos aminos libres por activación con glutar-aldehido. Aplicado a los soportes NH, NAQA y NB.
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ministra un microentorno cargado positivamente, proporcionado por la amina
terciaria del reactivo que provoca la ruptura no hidroh'tica. Ambos métodos son
sencillos en su aplicación y permitieron en este trabajo disponer de dos sopor
tes con microentornos de cargas opuestas.
También se han sugerido sistemas de inmovilización al NH,
a través del grupo carboxilo (Sundaram, 1977a), unos basados en la conversión
de un anhi'drido mixto y otros en la condensación con grupos amino mediante
carbodiimidas. Este último tiene el inconveniente de que provoca inactivación
de la enzima por reacciones de entrecruzamiento entre las propias moléculas de
enzima. Sin embargo este procedimiento ha sido empleado por Daka y Laidler
(1978) para unir bencidina a grupos carboxilo del NH (Fig.14). De esta forma
el soporte de nylon-bencidina (NB) así obtenido tiene dos grupos aminos distin
tos utilizables para la innovilización de enzima por activación con glutaraldehido
bajo el mismo esquema de reacciones de la Fig. 13. Otra característica del so
porte NB así obtenido es que a la enzima inmovilizada le proporciona un mi-
croambiente neutro, a diferencia de los anteriores. Este sistema de inmovilización
se ha aplicado en este trabajo a la tirosinasa, y además hemos derivado un pro
cedimiento de inmovilización por diazotación semejante al empleado con los so
portes con grupos arilamino como el Enzacryl-AA, CPG-AA y NPAA y que se
ajustaría al esquema de reacciones indicado en la F¡g.10
— « — — — — _ _ _ — _ _ _ — _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
CONH ( nylon )
HCl/H-0
COOH fi3N ( NJJ )
I Ibencidina
— C0NH-^¡H^>-NH3 rt-N ( N B )
Fig. 14. Preparación de NB
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2) MÉTODOS BASADOS EN O-ALQUILACIÓN
Estos métodos se basan en la activación del nylon por for
mación de una sal de imidato, por tratamiento con sulfato de dimetilo (Sunda
ram y Apps, 1977) o con tetrafluorborato de trietiloxonio en diclorometano
(Sundaram et al. 1979). A partir de esto se puede unir la enzima directamente
a través de sus grupos aminos, u obtener derivados alquilaminas o hidrazidas de
nylon (Sundaram e Igloi, 1979). No obstante no se han utilizado en este trabajo.
3) MÉTODOS BASADOS EN N-ALQUILACIÓN
Goldstein et al. (1974a) diseñaron un procedimiento de inmo
vilización en el cual, después de una hidrólisis parcial para generar pares de gru
pos carboxilo y amino sobre la superficie del nylon, provocaban una reacción
de cuatro componentes empleando 1,6-diisocianohexano y acetaldehido. Con esto,
daban lugar de nuevo a la formación del enlace amida, pero ahora N-sustitui'da
y con un grupo funcional isonitrilo. (Fig. 15-A)
El nylon poliisonitrilo (NPI), lo hemos empleado en este tra
bajo para la inmovilización de tirosinasa a través de los grupos aminos de la pro-
tei'na y también a través de la participación de los grupos carboxilos, según el
esquema de reacciones de la Fig. 15-B.
El NPI puede transformarse en un derivado poliarilamino por
tratamiento con p.p'-diaminodifenilmetano (Hornby y Goldstein, 1976) según el
esquema de reacciones de la Fig. 16.
El nylon-poliarilamina (NPAA), se ha empleado para la inmo
vilización de tirosinasa a través de residuos tirosina de la protema según el mis
mo esquema de reacción que se había aplicado para la inmovilización sobre
Enzacril-AA, CPG-AA y NB (Fig. 10).
Tanto el NPI como el NPAA aportan a la enzima inmoviliza
da un microambiente neutro, aunque de distinto carácter, alifático en el NPI y
aromático en el NPAA. Ambos se caracterizan por poseer un largo brazo entre
el esqueleto del soporte y los grupos reactivos de unión a la enzima, especial
mente el NPAA.
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•CONH (nylon)
CLry^ol
COÓ" r^N
l •CON-
I CH-CH, I
CO
NH
(NPIWCH^ N n c
B
n •CH5C00*
• CHjCHO
( N P I )
N
e
Fig. 15. Nylon poiiisonitrilo (NPI). A)Preparación. B)lnmov¡l¡zac¡ón de enzima.
Nr COO*
CHjCHO
NH 1
S° CH-CH,
N-CO
/ X
— f NPI)
¡J 'OOC-CH, C •
CH,CHO
NH
CO I F°
(NPAA)
C Hf C H - N - ^ - C H . - ^ N H ,
Fig. 16 Preparación de nylon poiiariiamina (NPAA) a partir de NPI.
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En la Tabla 3 se resumen los soportes y métodos que se han
aplicado en este trabajo para la inmovilización de tirosinasa. Se han utilizado sie
te soportes distintos, cinco de ellos derivados de nylon, preparados por nosotros
y de los cuales el NH y el NB se aplicaron tanto en forma de gel como en tu
bos y membranas, y los otros dos obtenidos comercialmente.
Los cuatro soportes que contenían grupos funcionales arilami-
na (Enzacryl-AA, CPG-AA, NPAA y NB) se activaron por diazotacion con ácido
nitroso formando una sal de diazonio, sobre la cual se acopló posteriormente la
enzima. La aplicación de estos sistemas de inmovilización venía sugerida por los
buenos resultados que para la actividad dopa oxidasa, había dado la inmoviliza
ción de tirosinasa en Enzacryl-AA. .La carga eléctrica que el soporte aporta al
microambiente es nula, excepto en el caso de NB, en que la inestabilidad de
las sales de diazonio alquílicas hace que, al menos parte de los grupos amino
se conserven aportando carga positiva.
El glutaraldehido se ha empleado como reactivo bifuncional
para la activación de los soportes con grupos alquilamina (NH, NAQA) y tam
bién con el NB que contiene grupos alquilamina y arilamina. En cada uno de
estos tres casos, el soporte aporta carga eléctrica distinta. Además hay que seña
lar que en este método de unión, se elimna la carga positiva de los grupos ami
no de la enzima que se unen al soporte a travás del glutaraldehido.
El acoplamiento de la enzima al NPI con acetaldehido en
presencia o no de acético, se caracteriza, a diferencia de los demás métodos em
pleados, en que no hay una activación previa del soporte, sino que los reactivos
de acoplamiento están presentes durante el tiempo de interacción del soporte
con la disolución de enzima. En los dos métodos de unión al NPI, el soporte
no aporta carga eléctrica y se bloquean grupos amino de la enzima, y en ausen
cia de acético también grupos carboxilo.
Así pues se han aplicado nueve sistemas de inmovilización
de tirosinasa sobre soportes en forma de gel y dos de ellos se han empleado
también con tubos y membranas. Con todo ello se han ensayado diferentes con-
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diciones respecto a varios parámetros determinantes del sistema de inmoviliza
ción como son: porosidad del soporte, carga eléctrica del microambiente, me
canismo de acoplamiento, grupo de unión de la enzima, estado físico del so
porte etc. También se han estudiado otras variables del sistema de inmoviliza
ción relacionadas con la naturaleza de la enzima como: forma funcional (pro
enzima o enzima), estado de purificación, cantidad de protei'na aplicada, fuen
te (champiñón, epidermis),etc, con lo que se han estudiado las principales va
riables que pueden afectar a la inmovilización de tirosinasa.
Tabla 3
Resumen de los soportes y métodos de unión aplicados a la inmovilización de
tirosinasa.
Soporte
Enzacryl-AA
CPG-AA
NPAA
NB
NB
NH
NAQA
NPI
NPI
Activación
nitroso
nitroso
nitroso
nitroso
glutaraldehido
glutaraldehido
glutaraldehido
acetaldehido/ acético
acetaldehido
Grupo de unión
de la enzima (*)
- A r - O H ,
- A r - O H ,
- A r - O H ,
- A r - O H ,
- N H 2 .
- N H 2 ,
- N H 2 .
- N H 2 ,
- N H 2 , -COOH,
Tir
Tir
Tir
Tir
Lis
Lis
Lis
Lis
Lis
Asp, Glu
Carga del
soporte
nula
nula
nula
nula
(+)
nula
—
+
nula
nula
Denominación
del IME
Enzacryl-AA-IME
CPG-AA-IME
NPAA-IME
NB-nitroso-IME
NB-IME
NH-IME
NAQA-IME
NPI-acético-IME
NPI-IME
(*) Grupo de unión preferente. No se excluye unión a otros grupos.
( +- ) Carga parcialmente positiva
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3.5. REACTORES Y METODOLOGÍA DE ESTUDIO DE LAS ENZIMAS
INMOVILIZADAS.
Tanto para el estudio de sus propiedades, como para aplicar
una enzima inmovilizada a fines industriales o analíticos, se requiere llevar a ca
bo la reacción enzimática propia de ella, para lo cual se ha de conseguir la in
teracción de la enzima con los sustratos. Con enzima inmovilizada en forma de
gel-IME, esta interacción puede hacerse con agitación de la disolución, de las
partículas de gel-IME, o de ambas a la vez; también por paso de la disolución
sustrato a través de un lecho de gel-IME estático; o por simple difusión de los
sustratos sin ninguna agitación. Según la técnica experimental utilizada, estamos
ante un tipo distinto de reactor.
Las propiedades del IME, especialmente la actividad manifes
tada, la estabilidad a la reacción, la aplicación a la síntesis del producto de re
acción, dependerán del proceso de transferencia de materia que será función del
tipo de reactor empleado y de las condiciones de trabajo de éste. Así pues, pa
ra determinar la actividad del IME, es necesario diseñar un reactor estándar, res
pecto al cual definir la unidad de actividad del derivado IME y su comparación
con las unidades de actividad de la enzima soluble.
El comportamiento cinético del IME puede variar respecto a
la enzima soluble, pero además la afinidad aparente por el sustrato se verá muy
afectada por los problemas de difusión externa (difusión desde la disolución a
las inmediaciones de la partícula), según el tipo y condiciones del reactor. En
reactores con fuerte agitación las limitaciones de difusión externa pueden elimi
narse, pero pueden permanecer las limitaciones de difusión interna (de la super
ficie de la partícula al centro activo de la enzima) y éstas ya no dependerán
tan claramente del tipo de reactor, sino que serán en gran medida intrínsecas
al sistema Soporte-Enzima (Goldstein, 1976). En presencia de limitaciones difu-
sionales, para una enzima michaeliana, la ley cinética se puede expresar de la
forma siguiente (Engasser y Horvath, 1973):
V ' = > ? - ( V m a x - S / ( K M + S ) ) (10)
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en donde: V es la velocidad real de reacción y
el factor efectividad definido como V 7 V c i n , en donde V d n sena
la velocidad de reacción en ausencia de limitaciones difusionales
De esta ecuación se pueden obtener varias formas linealizadas,
pero la representación de los valores experimentales no responde normalmente
a una linea recta debido a la dependencia de ^ con la concentración de sustra
to (Goldstein, 1976).
A continuación se describen los tipos de reactores, sus carac
terísticas y la metodología con que se han empleado en las operaciones experi-
mentales de esta Memoria.
3.5.1. REACTOR DE BAÑO AGITADO ( STR )
En este tipo de reactor, todo el volumen de sustrato a pro
cesar (VS) , se hace interaccionar con el IME, por medio de una fuerte agitación.
En la Fig. 17 puede observarse el esquema del montaje empleado para el STR.
aire
0
/
2
• •
• •
• •
R
o • • * * o
V •
• •
AM
1
í
r1 T
\
Fig. 17. Esquema de montaje del
reactor de baño agitado(STR).
AM Agitador magnético
BM Barra magnética
R Reactor T Fluido de termostatización
• Partículas de gel-IME o de membranas-I ME troceadas.
9 Burbujas de aire
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En el reactor STR, la IME se encuentra en las condiciones
más semejantes a la enzima en forma soluble (SE), por lo que es el idóneo
para el diseño de un reactor estándar de medida de actividad de la IME. Será
asi' mismo el más útil para el análisis de sus propiedades generales y la compa
ración con la SE (Vieth et al. 1976). Los problemas difusionales en este reactor
están minimizados por la agitación ( Lil ly et al. 1974; Lil ly y Dunnil, 1976).
Para la reacción catalizada por tirosinasa, se aseguró el sumi
nistro de oxigeno necesario por burbujeo de aire. Para seguir el curso de la re
acción se tomaron pequeñas alícuotas a distintos tiempos y se determinó en
ellas la concentración de producto (L-dopa) acumulado.
3.5.2. REACTOR DE BAÑO AGITADO CONTINUO (CSTR).
Un reactor de baño agitado en régimen continuo (CSTR), se
ha utilizado con un montaje como el de la Fig. 18Una característica del CSTR
atr«
°2
BP
JL fci
- • • «
D 0 CF O O
AM J Fig. 18. Esquema de reactor de baño agitado continuo (CSTR).
AM, a gitador magnético BP, bomba peristáltica. CF, colec
tor de fracciones. P, disolución producto R. reactor. S, di
solución sustrato. T, fluido de termostatización. • , partícu
las de gel-IME. o, burbujas de aire.
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es que el volumen del reactor es mucho menor que el del volumen procesado
a lo largo de la vida de uso de la IME ( V p > ^ V g ) . En este reactor hay mí-
nimos problemas difusionales gracias a la agitación, pero en él los fenómenos
de inhibición por el producto son más notables, dado que , una vez alcanzado
un régimen estacionario, la concentración de producto en contacto con la enzi
ma es en todo momento y en todo el volumen del reactor igual a la del fluido
de salida (Lil ly y Dunnil, 1976).
En nuestro caso, el suministro de oxigeno a la reacción estu
vo garantizado por un burbujeo constante del reactor. El curso de la reacción
se siguió recogiendo el eluido del reactor con un colector de fracciones y mi
diendo la concentración de L-dopa en cada una de las fracciones recogidas en
un determinado tiempo.
3.5.3. REACTOR DE COLUMNA CON LECHO EMPAQUETADO (PBCR)
En este caso la disolución sustrato se hace pasar a través de
una columna conteniendo gel-IME empaquetado. En la Fig 19 se muestra el es
quema del sistema empleado para un PBCR. Tiene la ventaja de ser un sistema
continuo y de que se evitan al máximo los fenómenos de inhibición por el pro
ducto, pero es el que presenta más problemas difusionales por el empaquetamien
to y por la mínima agitación (Pitcher, 1975). La posibilodad de funcionamiento
continuo y de automatización, hace que junto con otros reactores de flujo con
tinuo (lecho fluidificado, CSTR, etc), sea el más memcionado para aplicaciones
¡ndusyriales ( Vieth y Venkatasubramanian, 1974c, Weetall, 1975, Vieth et al.
1976). Es el sistema más característico para analozar la estabilidad de la IME
para la reacción a largo tiempo. Es el sistema que emplea menor volomen de
reactor por unidad de volumen de disolución procesada. Con soportes y condi
ciones de trabajo sin problemas difusionales es tan eficaz como el STR respec
to a su capacidad catalítica y tiene a su favor el que permite sistemas continuos
y automatizados, además normalmente en PBCR la vida de uso de la IME es
mayor. Sin embargo, con limitaciones difusionales o de baja solubilidad de algún
sustrato puede dar bajos rendimientos de cara a usus industriales; por ejemplo,
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1
s
o 1
p 1
aire
°2
Hffll II 0 o i
FO ] o (¡F o o
Fig. 19. Esquema de montaje para reactor en columna con
lecho empaquetado (PBCR) y para reactor tubular
(TR).
BP, bomba peristáltica. CF, colector de fracciones.
FO, frasco de oxigenación. P, disolución producto
R, reactor S, disolución sustrato. T, fluido de
termostatización.
una limitación para reacciones como la de la tirosinasa que requieren oxígeno,
es que sólo se suministra el oxígeno disuelto en la disolución de sustrato
Al igual que en CSTR, el curso de la reacción de la tirosi
nasa en este reactor, se siguió recogiendo fracciones a tiempos definidos en el
eluído del reactor y determinando la concentración de producto formado.
3.5.4. REACTOR TUBULAR (TR)
Con el mismo esquema de montaje que el del PBCR mos
trado en la Fig. 19, se ha empleado en este trabajo enzima inmovilizada sobre
la pared interior de tubo de nylon de 1 mm de diámetro. Ofrece respecto al
PBCR la facilidad de manejo y mínimos problemas de flujo y de difusión. En
la bibliogrfía viene mencionado especialmente para usos analíticos (Sundaram,
1977a) y para aplicaciones médicas (Sundaram 1977b).
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4. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE
TIROSINASA EN ENZACRYL-AA Y EN CPG-AA.
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4. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE TIROS1NASA EN
ENZACRYL-AA Y CPG-AA.
En el presente capítulo se estudiará la actividad tirosina hi-
droxilasa de tirosinasa inmovilizada en Enzacryl-AA y CPG-AA. Se analizarán
las propiedades generales, haciendo especial incapié en el estudio del rendimien
to del proceso de inmovilización y de las condiciones óptimas para la manifes
tación de la actividad, su comportamiento cinético y el efecto del ascorbato y
la hidracina sobre la reacción catalítica.
4.1. RENDIMIENTO DE INMOVILIZACIÓN EN ENZACRYL-AA
La estabilización por la inmovilización, de la actividad de un
sistema enzimático, suele ser una de las propiedades que se argumentan para
destacar la aplicación industrial de las enzimas inmovilizadas (Weetall, 1975a;
Chibata y Tosa, 1976). Sin embargo es frecuente que la enzima inmovilizada
manifieste una menor actividad que la enzima soluble (Ollis y Datta, 1976). En
este caso, sólo está justificada su aplicabilidad si el aumento de la estabilidad
supera con creces la pérdida de actividad, lo que llevaría consigo una disminu
ción de los costos de preparación de la enzima (Weetall, 1973).
Cuando se establece un nuevo método de inmovilización o
la aplicación de un método ya existente a una enzima, es habitual que en los
mismos se haga referencia tanto a la cantidad de proteína unida al soporte
(Axén et al., 1967, 1969; Weston y Avrameas, 1971) como a la actividad ma
nifestada por el derivado IME (Cho and Bailey, 1979; Caldwell et al., 1976a,
1976b). Además ha sido recomendada la especificación concreta de estos da
tos, así como el de la actividad específica de la enzima soluble y la cantidad
de ésta utilizada por gramo de soporte seco en la inmovilización (Comission
Biochemical Nomenclature, 1974). A partir de los datos anteriormente expues
tos, puede deducirse el porcentaje ó fracción de actividad recuperada en forma
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de derivado inmovilizado, lo que es una característica significativa del sistema
de inmovilización utilizado (Axén y Ernback, 1971; Goldstein et al., 1974; Sun-
daram y Apps, 1977; Brown et al. 1978; Drobnik et al., 1979).
Los parámetros que se han utilizado en el estudio del com
portamiento de la tirosinasa en el proceso de inmovilización son los siguientes:
1) Rendimiento de unión de proteína (rp r o t ) , obtenido a partir de la diferen
cia de protei'na existente en la disolución antes (prot¡) y después (protr) de la
inmovilización:
rprot = (P ro t¡ - P r o V P roti < 1 1 )
Esta determinación indirecta de la protei'na unida es muy u-
tilizada por su sencillez (Gabel y Axén, 1976). También se han aplicado méto
dos de determinación directa sobre el IME. Asi', se han empleado la determina
ción de aminoácidos después de hidrólisis del IME (Axén et al., 1967), medida
radiométrica de la enzima unida marcada radiométricamente (Lartigue, 1975) y
otros métodos, de los que Gabel y Axén (1976) hacen una recopilación.
2) Actividad sustraída de la disolución de enzima soluble como consecuencia
de la reacción de inmovilización, calculada según:
Actividad sustraída = (SE¡ — SEr) SE¡ (12)
siendo SE¡ y SEr la actividad de enzima soluble en unidades estándar (U) tota
les antes y después de la inmovilización.
3) Actividad estándar del IME (Act||^g), que se expresó en unidades de activi
dad manifestada por unidad de soporte seco cuando se ensayó según el método
estándar (Método: 12*8*2). Se calculó por:
ActjjñE r * M E / m (13)
siendo, IME la actividad total (U ó mU) manifestada por una cantidad m de so
porte con enzima inmovilizada; m se expresó en g ó mg de peso seco para
gel-IME, en cm £ para membrana-IME y en cm lineal para tubo-IME
4) Eficacia de acoplamiento (Ef. acop.), término definido por Pitcher (1975),
como la fracción de actividad que manifiesta el IME respecto a la sustraída de
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la disolución. Se calculó por:
Ef. acop. = IME /(SE¡ - SEr) (14)
5) Rendimiento de inmovilización (r¡n m ) . Parámetro que indica el rendimiento con
que la actividad enzimática de la enzima soluble utilizada es recuparada en forma
de derivado inmovilizado y que se calculó por la razón de la actividad mani
festada por el IME en relación a la de la enzima soluble según :
r inm = IME /SE j = " i -Act | M E / V E S -Act E S ¡ (15)
siendo: V E g el volumen de disolución de enzima soluble tratada con una cantidad
m de soporte, cuyo derivado IME dio una actividad estabdar Act|(^|E ; el térmi
no ActgE¡ representa la actividad de la disolución inicial de enzima soluble em
pleada por unidad de volumen.
La capacidad de un soporte para retener proteínas viene li
mitada por la densidad de grupos funcionales reactivos de éste y por factores
estéricos (Weetall, 1975b), factores determinados por la naturaleza del soporte
y de la protei'na. Así, cuando el Enzacryl-AA, activado por el método del áci
do nitroso, se trató con cantidades crecientes de tirosinasa activa, la actividad
tirosina hidroxilasa del IME aumento de forma lineal con la cantidad de proteí
na aplicada, hasta que alcanzó una saturación para cantidades superiores a 80
mg /g gel (Fig. 20). El r ¡ n m fué máximo mientras no se alcanzó dicha satura
ción del soporte ( r ¡n m=0,78), a partir de la cual descendió. En base a estos
resultados se puede concluir que existió una cantidad óptima de proteína en
la disolución a inmovilizar, que permitió obtener derivados inmovilizados con
alta actividad y conservando los valores máximos posibles del rendimiento de
inmovilización. Estas cantidades máximas de proteína empleadas, están incluso
por enzima de los valores establecidos por la firma suministradora ( 20-50 mg/
g gel; Koch-üght, 1977).
A continuación se analizó el efecto de la pureza de la tiro
sinasa en el rendimiento de inmovilización a Enzacryl-AA, con el f in de obser
var si la interacción con las proteínas presentes en el extracto afectaban a la
preparación del IME.
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50 100
P R O T E I N A T R A T A D A ( mg/j gel )
Fig. 20. Efecto de la cantidad de proteína sobre el rendimiento de inmo
vilización de tirosinasa en Enzacryl-AA. Cada ensayo de inmovi
lización consistió en el tratamiento de 20ml de extracto de t i -
rosinasa(0,85 U/mg) con concentraciones de ésta para conseguir
la cantidad de proteína indicada por las abeisas de los puntos
experimentales.
Los resultados obtenidos en las medidas de la actividad y
protema en las disoluciones antes y después de la inmovilización están expresa
dos en la Tabla 4. Se observa que en todos los casos ensayados, el porcentaje
de actividad sustraída de la disolución fué casi total y bastante mayor que el
de proteína unida al soporte. Este hecho paracía indicar una unión preferente
de la proteína con actividad tirosina hidroxilasa frente a las proteínas contami
nantes, lo que se pone de manifiesto por la relación actividad sustraída/rprot,
parámetro que proponemos como medida de la especificidad de unión de una
proteína al soporte. La causa de esta especificidad de unión podría justificarse
por la naturaleza y contenido de los residuos de aminoácidos de la tirosinasa.
Así, la inmovilización de proteínas sobre Enzacryl-AA por medio de la diazota-
ción de sus grupos arilamina, suele implicar fundamentalmente a los residuos
de tirosina de la proteína (Goldstein et al., 1970; Meirose, 1971); el contenido
de tirosina en la tirosinasa de epidermis de rana está dentro de los valores ñor-
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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Tabla 4
Inmovilización en Enzacryl-AA de tirosinasa en distintos estados de purificación.
Resultados obtenidos de las medidas de actividad y protei'na de las disoluciones
de enzima antes y después de la inmovilización. Se aplicaron 50 U de SE por
gramo de Enzacryl-AA liofilizado.
Estado
Etapa
P¡
H20/P¡
CM
Phe
CM/Phe
de purificación
Act. esp.
(U/mg)
0,23
0,50
2,02
1,84
3,46
SE rprot
0,45
0,41
0,65
0,60
0,59
Actividad
sustraída
0,98
0,98
0,99
0,95
0,98
Act. sust rprot
2,2
2,4
1,5
3,0
1,7
males de las proteínas globulares, alrededor del 4 % (Barisas y McGuire,1974;
Mikkelsen y Triplett, 1975). Por lo tanto, en base a la composición de tirosina
de la proteína, no se puede deducir una unión preferente de la tirosinasa al En
zacryl-AA con respecto a otras posibles proteínas presentes en la disolución.
Por otra parte, la pérdida de actividad de la disolución de enzima
por el tratamiento de inmovilización, se puede atribuir no sólo a su mayor o
menor unión al soporte, si no también a la posible desnaturalización por la in
teracción con el soporte.
Al medir la actividad de los derivados de Enzacryl-AA-IME obte
nidos de distintos estados de purificación, manifestaron entre un 73 y 88 %
de la actividad que se había sustraído de la disolución (Ef. acop, 0,73—0,88)
Tabla 5. Dado que la actividad sustraída de la disolución fué casi del 100 %
los rendimientos de inmovilización fueron valores sólo ligeramente inferiores a
los de eficacia de acoplamiento ( r ¡ n m = 0,72—0,86).
Cabe resaltar el hecho de que el IME manifestó on 72—86 ^o
de la actividad del SE tratado, cuando sólo el 32—65 % de proteína se unió
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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Tabla 5
Rendimiento de inmovilización (r¡n m) y eficacia de acoplamiento (Ef. acop.) de
tirosinasa a Enzacryl-AA para distintos estados de purificación. Se trataron 50 U
por gramo de Enzacryl-AA en iguales condiciones que los resultados expresados
en la Tabla 4.
Etapa de
purificación 'pur
A c t | M E
(U/g gel) Ef. acop. 'inm
'inm rprot
r¿obal (r r ) 1 pur ' inm'
0,86
0,62
0,43
0,55
0,35
H20/P¡
CM
Phe
CM/Phe
1,0
0,86
0,52
0,70
0,47
43
36
42
44
38
0,88 0,86 1,9
0,73 0,72 1,8
0,82 0,81 1,3
0,83 0,79 1,3
0,75 0,73 1,2
al soporte. Al calcular la actividad específica del IME, como U/mg de protei'na,
se observó que aumentó con respecto a la del SE en un factor superior a 1. Es
te factor es igual a la relación r ¡ n m / rp r o t calculada en la Tabla 5. Este hecho,
aparentemente sorprendente, hizo sugerir de nuevo la idea de una unión selecti
va, más preferente de la tirosinasa al soporte que de las demás proteínas pre
sentes en la disolución. Con esta interpretación, la relación citada debería ser
mínima para los estados más purificados. De hecho, para el más purificado fué
1,9, y 1,2 para la disolución de SE menos purificada.
Estos valores superiores a 1, también cabrían interpretarse en
función de una sobreactívación de la enzima por su unión al soporte. Efectiva
mente; la enzima utilizada para Ja inmovilización se preparó a partir de protiro-
sinasa que, después del proceso de purificación correspondiente, había sido acti
vada por paso a través de una columna de tripsina-sepharosa, lográndose prácti
camente la misma activación que la alcanzada con tripsina soluble; sin embargo,
dado que la actividad específica de la tirosinasa aumentó con la inmovilización,
se puede sugerir que la unión de la enzima al soporte provocó una sobreacti-
vación , como si el tratamiento con tripsina no hubiera logrado toda la activi-
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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dad potencial de la proenzima. La razón de esta sobreactivación podn'a basarse
en el hecho de que se está estabilizando una estructura más desplegada de la
enzima, al inducir a los restos de tirosina a ordenarse al exterior de la estruc
tura proteica, por la unión de los mismos a los grupos diazotados del soporte
y por la interacción de los residuos apolares con el microambiente hidrofóbico
y aromático que proporcionan los grupos arilamina del Enzacryl-AA. Esta inter
pretación está en la li'nea de lo establecido hasta ahora para la conversión de
proenzima a enzima activa. De hecho, en base a las propiedades termodinámicas
de la desnaturalización térmica, se ha sugerido que la tirosinasa activa está en un
estado más desordenado y más estable que la protirosinasa, tanto estudiando la
actividad dopa oxidasa (Galindo, 1976) como con la actividad tirosina hidroxila-
sa (García Carmona, 1980). Por otro lado, los cambios en los espectros de fluo
rescencia apoyan la sugerencia de que la enzima se encuentra en una conforma
ción más desplegada (Iborra et al. 1978) y que los restos de tirosina están or
denados más al exterior en la enzima que en la proenzima (Manjón, 1978). Ade
más estas interpretaciones serian coherentes con la mayor hidrofobicidad mani
festada por la enzima en la interacción con soportes hidrofóbicos (Iborra et al.,
1976; Cortés, 1978).
Tal como se observa en la Tabla 5, los rendimientos de in
movilización fueron similares para los distintos estados de purificación de la en
zima y las diferencias observadas no guardaron ninguna relación definida con el
grado de purificación. Por otro lado, el rendimiento global del conjunto de los
procesos de purificación e inmovilización (•'global = rpur ' rinm' fueron mayores
para los estados menos purificados, dependiendo su valor más del r_ur que del
rinrrr De estos resultados se deduce que para aplicaciones industriales de la t i
rosinasa inmovilizada no parece necesaria su previa purificación.
En la próxima Sección se compararán los resultados aquí'
expuestos con los obtenidos en la inmovilización de protirosinasa en Enzacryl-
-AA, enzima en CPG-AA, así como los obtenidos con tirosinasa de champiñón
y se compararán con los obtenidos por otros autores. Por otro lado, el efec
to del estado de purificación sobre la estabilidad a la actuación y en el com
portamiento en reactores a largo tiempo se analizará en el Cap. 6.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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4.2. INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA EN CPG-AA. COMPARACIÓN CON
TIROSINASA DE CHAMPIÑÓN.
El CPG-AA posee grupos funcionales arilamina, al igual que
el Enzacryl-AA, pero por su diferente esqueleto estructural y sus propiedades
físicas, cabría esperar algunas diferencias en las propiedades de la enzima inmo
vilizada sobre él. Así, cuando se aplicó a ambos soportes la misma cantidad de
enzima, con el Enzacryl-AA se obtuvieron derivados inmovilizados con Act||y|g
de 35-45 U/g gel, mientras que con CPG-AA de 15-25 U/g gel (Tabla 6). De
estos valores se deduce que los rendimientos de inmovilización fueron menores
para la obtención del CPG-AA, lo que se atribuyó a una menor densidad de
grupos funcionales del soporte. Sin embargo la modificación química provocada
a la enzima fué semejante que en la obtención de Enzacryl-AA-1 ME, pues los
valores de eficacia de acoplamiento obtenidas fueron semejantes. Así mismo, las
propiedades cinéticas y el perfil pH-actividad fueron similares. Así pues, el En-
zacryl-AA-IME y el CPG-AA-IME resultaron derivados de tirosinasa de propieda
des generales muy parecidas. Las principales diferencias entre ambos están rela
cionadas con las óptimas propiedades mecánicas del CPG-AA,que determinó no
tables diferencias en el comportamiento, en reactores con IME funcionando
durante largo tiempo, especialmente en reactores de columna empaquetada, lo
que se analizará más adelante en relación con su aplicación a la síntesis de L-
-dopa(Cap. 6 y 8).
La tirosinasa de champiñón, que es activa en su estado na
tivo, es tal vez la tirosinasa más estudiada y la única que se encuentra disponi
ble comercíalmente. Además es la fuente de enzima utilizada en los pocos in
tentos anteriores de inmovilización de tirosinasa (Wykes et al. 1971; Letts y
Chase, 1974; Schiller y Liu, 1976; Schiller et al. 1978), aparte de lo realizado
en nuestro Departamento con tirosinasa de epidermis de rana. En este trabajo, se
inmovilizó tirosinasa de champiñón en las mismas condiciones que con tirosinasa
de epidermis a f in de comparar. Para ello se trataron 50 mU de enzima con
CPG-AA en las condiciones indicadas en la Tabla 6. La tirosinasa de champí-
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980
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Tabla 6
Comparación de los resultados de inmovilización de tirosinasa de epidermis de
rana en CPG-AA y Enzacryl-AA, y con tirosinasa de champiñón en CPG-AA
y en fibras de colágeno. La tirosinasa de epidermis de rana, para inmovilizar so
bre Enzacryl-AA y CPG-AA, fué extracto H^O/Pj activado por paso por colum
na de tripsina-sepharosa. La tirosinasa de champiñón para acoplar a CPG-AA
fué obtenida de Sigma (U.S. A. ). Los valores dados para la inmovilización de
tirosinasa de champiñón en membranas de colágeno están calculados a partir de
los resultados indicados por Letts y Chase (1974).
Soporte:
Fuente de enzima:
Act. esp. del SE (U/mg) :
Enzacryl-AA CPG-AA
epid. rana epid. rana
0,85
Enzima tra-tada(mU/mg gel): 50
Fracción de actividad sustraída: 0,97
0,85
50
'prot 0,51
Act||y|E(mU/mg gel): 35
Efic. acopl.: 0,72
'¡nm •
r¡
0,70
i n m / r prot (*)= 1 - 3 7
membranas de CPG-AA colágeno
(Letts y Chase, 1974)
champiñón champiñón
0,05
50
0,25
88 mU/cm 2
0,61
0,39
21
0,68
0,42
1,08
0.08
0,06
2,4
0,60
0,05
0,83
0,25
0,41
1,14 mU/cm2
0,053
0,013
0,031
(*) Esta razón es igual a la razón: Act esp. I ME / Act. esp. SE
ñon dio muy bajos rendimiento de inmovilización (r¡nm=0,05) en comparación
con tirosinasa de epidermis de rana((r¡nm=0,42). Asi', la baja actividad recupera
da en el derivado inmovilizado, respondió a que la enzima se unió en baja pro
porción al soporte, lo que pudo comprobarse por la razón de protei'na unida
(rp r o t=0,06) y por la fracción de actividad sustraída de la disolución de SE uti-
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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lizada( (Act. sust.=0,08), que fueron muy inferiores a los obtenidos con tirosina
sa de epidermis de rana. Estos hechos se interpretaron en función de las activi
dades especi'ficas de las disoluciones de enzima utilizadas, ya que las preparacio
nes de tirosinasa de champiñón, obtenida comercialmente, dieron una actividad
especi'f ica muy inferior (0,05 U/mg) a las de rana obtenidas por nosotros (0,2 U/
/mg en extractos P¡; 7-10 U/mg en purificado CM/Phe), habiéndose empleado
para estas experiencias extracto H^O/Pj. Tal como se describió anteriormente para
el Enzacryl-AA,( Fig. 20, cap.4.1), cuando se aplica una cantidad de proteína
muy superior a la máxima capacidad del soporte, éste se satura y da bajos r ¡ n m .
Sin embargo, de la actividad sustraída de la disolución, el 60 % se manifestó
en el derivado IME (ef. acop.=0,6), lo que representó una eficacia de acoplamien
to cercana a la obtenida con epidermis de rana. Así pues, aunque la cantidad
de proteína en las disoluciones de tirosinasa de champiñón limitó el rendimiento
de inmovilización de su actividad al CPG-AA, la eficacia de acoplamiento obte
nida, demostró que el efecto de la modificación química producida en la enzi
ma por la unión covalente al CPG-AA, fué del mismo orden que con la enzima
de rana. De todo ello se deduce, que las limitaciones del uso de tirosinasa de
champiñón no vienen determinadas por las características químicas de las molé
culas de enzima ni por el método de inmovilización que fué apropiado, sino
por el alto contenido de proteína de las preparaciones de enzima.
Letts y Chase (1974) obtuvieron muy bajos valores de r ¡ n m
al inmovilizar tirosinasa de champiñón en membranas de colágeno ( r ¡ n m = 0,013).
La actividad específica del derivado IME que obtuvieron fué muy inferior a la
del SE (Act esp. IME/Act esp. SE = •'¡nrrAprot = 0,031), lo que los autores lo
atribuyeron a la unión menos preferente de la tirosinasa que de otras proteí
nas, en base a que la razón o rendimiento de proteína unida al colágeno fué
superior a la fracción de actividad sustraída de la disolución ( r p r o t = 0 , 4 1 ; Act.
sust.= 0,25); sin embargo el valor de ésta última, no puede justificar tan bajos
valores de r ¡ n r n , y de actividad específica de la proteína inmovilizada. Por otro
lado, a partir de los datos reseñados por los autores, puede deducirse un valor
de eficacia de acoplamiento muy pequeño (ef. acop. = 0,053), lo que representa
que sólo el 5,3 % de la actividad sustraída de la disolución se manifestó en el
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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derivado inmovilizado. Por lo tanto, en este caso las limitaciones vienen impues
tas por el propio método de inmovilización, que disminuyó drásticamente la efi
cacia catalítica de la enzima al inmovilizarla. Dado que la inmovilización la reali
zaron por oclusión en el colágeno, que es un método físico, no hubo modifica
ción química de la enzima y por lo tanto, la disminución de la actividad sólo
pudo ser debida al microambiente que proporcionaba el soporte y/o a limitacio
nes difusionales. La importancia que tuvieron estas últimas lo prueba el hecho
de que la actividad que observaron en reactor de flujo continuo fué un orden
de magnitud inferior a la reseñada en la Tabla 6. Además cuando intentaron
aumentar la estabilidad de la unión de la enzima al soporte tratando el IME
con glutaraldehido y otros reactivos bifuncionales, la modificación química pro
ducida disminuyó aún más la actividad del IME.
Cabe resaltar pues, que ¡a inmovilización covalente de la tiro-
sinasa de epidermis de rana en Enzacryl-AA y en CPG-AA dio resultados muy
superiores respecto a los rendimientos de inmovilización y eficacias de acopla
miento que lo publicado anteriormente con tirosinasa de champiñón, e incluso
con esta última la alta eficacia de acoplamiento al CPG-AA demostró que con
preparaciones más purificadas de enzima podrían obtenerse mejores rendimien
tos de inmovilización. Con todo ello se ha logrado pues dar un paso adelante en
la aplicabilidad de la tirosinasa inmovilizada.
4.3. ESTUDIO DE LAS CONDICIONES ÓPTIMAS DE ENSAYO DE LA A C
TIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DEL ENZACRYL-AA-IME.
Dado que las enzimas pueden modificar notoriamente sus pro
piedades por la inmovilización (Vieth y Venkatasubramanian, 1974b), fué necesa
rio analizar las condiciones óptimas para la expresión de la actividad de la tiro
sinasa inmovilizada. En este apartado se expresan el efecto de la fuerza iónica,
pH y temperatura sobre la actividad.
En primer lugar se estudió el perfil pH-actividad,. para el En-
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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zacryl-AA-IME preparado con enzima purificada y activada, en el intervalo de
pH 6 a 8 a dos fuerzas iónicas distintas suministradas por tampón fosfato 0,05
M y 0,10 M, y se compararon con el de la enzima soluble purificada de la
misma forma Para las dos fuerzas iónicas analizadas, el pH óptimo se desplazó
muy ligeramente (0,3 unidades de pH) hacia pH alcalino con respecto al SE.
Los desplazamientos hacia zonas más básicas de pH están en consonancia con
lo esperable según. Katchalski et al (1971) para soporte de naturaleza polielec-
trolitica con una ligera carga negativa. El tramiento matemático se basa en la
consideración de una distribución de Maxwell-Boltzman para la concentración
H entre la parti'cula de gel-IME y el medio:
a u / a „ x t = exp z i e I ^ (15) de donde se deduce: H k T
z i el V pH = pH¡ - p H e x t = p H o p t S E - P H o p t | M E = 0,43 —¡^ 06 )
siendo: ajj y a^xt la actividad de H en el medio interior y exterior al gel;
z, la carga del ion; e, la carga eléctrica elemental; Y el potencial electrostático
en el dominio de la partícula de gel-IME; k, la constante de Boltzman; T la t
temperatura absoluta; pH¡ y pH e x^ , los pHs del medio interno y externo de la
partícula; p H o p j g E y pHO D j |(^£ , los pHs óptimos del SE eelME. En nuestro
caso con pH = — 0 , 3 , conduciría a un valor de ^ =—18 mV, valor sólo m
muy ligeramente negativo en comparación — 50-150 mV esperable de la teoría
de polielectrolitos ionizados (Goldstein, 1976). Así, el valor d e ^ obtenido no
es significativo, ni atribuíble a que el soporte esté cargado e influya en la ex
presión de la actividad con el pH. De hecho la actividad dopa oxidasa de la
misma enzima en este soporte (Manjón, 1978) dio también un ligero desplaza
miento del pH hacia pH ácido.
El efecto de la fuerza iónica sobre la actividad del Enzacryl-
-AA-IME, se determinó a diferentes fuerzas iónicas suministradas por distintas
concentraciones del tampón fosfato de pH 7,0 utilizado (entre 0,02 y 0,36 M).
La actividad del IME aumentó ligeramente al disminuir la fuerza iónica (Fig.22)
Este hecho está en consonancia con la hidrofobicidad manifestada por la enzima
(Cortés, 1978) y fué semejante al observado con la actividad dopa oxidasa. Da-
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1.0 < >
< _ i UJ
ce Q <
ü <
0,5
A Enzacryl-AA-IME
OSE
FOSFATO 0.05 M
6 7 8
PH
á Enzacryl AA IME
• SE
FOSFATO 0,1 M
—» i
7
pH
Fig. 21
Perfiles pH—actividad del
Enzacryl-AA-IME. Compa
ración con SE a dos fuer
zas iónicas.
F U E R Z A I Ó N I C A
Fig. 22. Efecto de la fuerza iónica sobre la actividad del Enzacryl-AA-IME.
Ensayos a pH 7,0 y T 25°C.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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do que la forma activa de la enzima es una conformación desplegada, la dismi
nución de la fuerza iónica favorecerá ese desplegamiento, pues al disminuir la
concentración de iones en el medio hace más favorable termodinámicamente la
interacción de los residuos hidrofi'licos con el entorno acuoso. Por otro lado,el
uso de tampón menos polar como tris-fosfórico en lugar de fosfato, condujo a
un ligero incremento de la actividad del IME, al igual que el ocasionado por a-
dicíón de 1 % de acetona. Este ligero aumento de la actividad es significativo de
que un ambiente hidrofóbico favorece la conformación activa de la enzima. De
todo esto se deduce que el uso del IME es preferible realizarlo a fuerzas ióni
cas bajas, con una concentración de fosfato mínima necesaria para asegurar una
capacidad reguladora suficienteepara mantener el pH dentro de los valores reco
mendables.
En general con la inmovilización, las enzimas aumentan su
estabilidad térmica, ya que la unión al soporte incrementa la resistencia a per
der la conformación activa (Barker y Epton, 1970). Asi', se ha observado que
muchas enzimas al inmovilizarlas, se incrementa la temperatura óptima a la cual
manifiestan máxima actividad (Gabel y Kasche, 1976), aumentando además la
resistencia al tratamiento térmico, llegándose incluso a activación de algunas en
zimas por cortos tratamientos térmicos previos a. la medida de actividad (Knigts
y Light, 1974; Manjón, 1978). Los efectos del tratamiento térmico sobre la t i
rosinasa se han estudiado para la actividad dopa oxidasa, tanto de la proenzima
y enzima soluble (Galindo, 1976), como de la enzima inmovilizada sobre Enza-
cryl-AA (Manjón, 1978), habiéndose encontrado un aumento notable de la resis
tencia térmica en esta última. Garci'a Carmona (198)) lo hizo sobre la actividad
tirosina hidroxilasa de protirosinasa y tirosinasa solubles, obteniendo un resultado
comparable al de dopa oxidasa. En nuestro caso se ha analizado el efecto de la
temperatura sobre la actividad tirosina hidroxilasa manifestada por Enzacryl-AA-
-IME, encontrándose que a 25 °C la enzima manifestó un máximo de actividad
(Fig. 23).
De los resultados obtenidos en este apartado, se dedujo que
las condiciones de pH 7,0, fosfato 0,1 M, temperatura 25 °C, eran condiciones
idóneas para la utilización de Enzacryl-AA—IME, con la ventaja de ser las mis-
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Fig. 23
Variación de la acti
vidad tirosina hidroxi-
lasa de Enzacryl-AA-
-IME con la tempe
ratura de ensayo.
20 40 60 80
TEMPERATURA DE ENSAYO (°C)
mas condiciones óptimas de ensayo para la enzima soluble. En el Cap. 6.4 se a-
nalizará el efecto de estos factores sobre la estabilidad del Enzacryl-AA-IME pa
ra su actuación a largo tiempo.
4.4. COMPORTAMIENTO CINÉTICO DEL ENZACRYL-AA-IME
Las propiedades cinéticas de las enzimas inmovilizadas suelen
alterarse con respecto a sus homologas solubles por las siguientes causas:
1) La modificación química covalente, los efectos esféricos ó las fuerzas electros
táticas y las interacciones hidrofóbicas que el soporte ejerce sobre la enzima pue
den afectar a su conformación. En ausencia de otros efectos, se obtendría la de
nominada velocidad de reacción intn'nseca del IME (Engasser y Horvath, 1976), de
lo que se deducen los correspondientes parámetros cinéticos intrínsecos.
2) Los efectos de partición pueden determinar la existencia de concentraciones di
ferentes en el microambiente que rodea a la enzima y el macroambiente de la di-
E
LU
ü <
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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solución. Estos efectos, en ausencia completa de problemas difusionales, pro
porcionaba la llamada velocidad inherente del IME.
3) Las resistencias difusionales internas y externas provocan un gradiente
de concentraciones entre el micro y el macroambiente de la enzima. Las
externas son fácilmente suprimibies con las condiciones ae agitación del reac
tor (Lil ly et al., 1974). La limitación difusional interna puede disminuirse
también por la agitación y por la disminución del tamaño de partícula o
de espesor de membrana del IME, pero en parte pueden considerarse inhe
rentes al propio derivado inmovilizado. Para unas condiciones reales, con
sus correspondientes limitaciones difusionales, se obtendrá la velocidad de
reacción efectiva. La relación entre Ve fec./ Vinh es el denominado factor
efectividad (Engasser y Horvath, 1976).
En nuestro caso para analizar la cinética de la actividad tiro-
sina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada, se aplicó la técnica de baño fuerte
mente agitado, tal como se describe para el método estándar de medida de ac
tividad del IME (Método: 12.8.2). En estas condiciones las limitaciones difusiona
les se redujeron al mínimo, pudiéndose afirmar que se midió la velocidad de reac
ción inherente y por lo tanto se determinaron los parámetros cinéticos denomi
nados inherentes. Se compararon las diferencias de comportamiento en función
del estado de purificación de la muestra de tirosinasa que se inmovilizó.
Se observaron cinéticas de primer orden para los derivados de
Enzacryl-AA-IME obtenidos con tirosinasa bajo la forma de extracto P¡, extracto
H2O/PJ y purificado CM (Fig. 24). Sin embargo los derivados Enzacryl-AA-IME
obtenidos a partir de tjro-sinasa purificada Phe y CM/Phe mostraron una cinética
con parcial saturación; a partir de ellos se dedujeron los parámetros cinéticos co
rrespondientes por la representación de Lineweaver-Burk (Fig. 25). De las abcisas
de los puntos de corte de las rectas de dicha figura, se calcularon los valores
de KJ J 2,7 mM y 2,0 mM. Estos valores fueron del mismo orden que los obte
nidos con enzima soluble y figuran expresados, junto con las constantes cinéticas
de velocidad, en la Tabla 7. A pesar de todo, en ningún caso se llegó a una sa
turación completa de la velocidad de reacción respecto al sustrato, debido a la
baja solubilidad de la L-tirosina (0,453 g/l ó 2,5 mM, en agua a 25 °C, Merck
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4 s * . 8
<
o o
A '
1,0 1,5 2,0
L- T I R O S I N A ( mM )
Fig. 24. Cinética del Enzacryl-AA-IME para distintos estados de purificación de la enzima.
%
(min . j»M''
Ss
0,3
) 0.2
0.1
i 0
_y^^O
• 5 1,0
« 1,5
• 2,0
<• CM/Ph*
1/S (mM1)
Fig. 25. Representación de Lineweaver-Burck de la cinética de los derivados de Enzacryl-AA-IME preparados con ti-rosinasa purificada Phe y CM/Phe.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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4.5. EFECTO DEL ASCORBATO Y DE LA HIDRACINA SOBRE LAS ACTI
VIDADES DEL SE Y DEL IME.
En el capítulo 2.1 ya se ha comentado que en presencia de
de ascorbato y de tirosinasa de champiñón, EI-Bayoum¡ y Frieden (1957) obser
varon que el catecol no se oxidaba a la quinona correspondiente, pero sí dio
un consumo de ascorbato. Igual fenómeno se observó con tirosinasa de Neuros-
pora utilizando L-dopa ó L-tirosina como sustrato (Sussman, 1961). La oxidación
de ascorbato podía ser detectada a 265 nm y se podía considerar como una
manifestación de la actividad de tirosinasa; incluso este método es utilizado ac
tualmente como criterio de medida de actividad en preparados comerciales de
tirosinasa de champiñón (Sigma, 1980). La estequimetría de las reacciones de
oxidación en presencia de ascorbato, fueron estudiadas en tirosinasa de Neuros-
pora por Fling et al. (1963) y sugirieron que la dopaquinona formada por oxi
dación enzimática de L-dopa, era reducida no enzimáticamente por ascorbato
para dar de nuevo L-dopa, en lugar de oxidarse no enzimáticamente a dopacro-
mo (Horowitz et al., 1970). Otros reductores como el ferrocianuro producen
un efecto semejante al ascorbato (Sussman, 1961).
Por otra parte, la h id rae ¡na y derivados manifiestan una inhi
bición de la melanogenesis en diferentes etapas. Así, el ácido hidracinoflorético
(AHP) y otros ácidos con grupos hidroxifenólicos manifiestan inhibición compe
titiva respecto a la formación de dopacromo, como análogos de la L-tirosina
(Fourche et al., 1977). Sin embargo disoluciones de AHP, de L-tirosina, y mez
clas de L-tirosina y AHP, en presencia de tirosinasa de champiñón, consumen
oxígeno a velocidades comparativamente semejantes, lo que implica que en rea
lidad actúan como sustratos, cuyos productos oxidados no pueden ciclarse para
dar las formas indólicas coloreadas de la forma con que la L-dopa lo hace a
dopacromo (Fourche et al.,1978). La fenilhidracina y los derivados como el áci
do o-hidracinobenzoico y p-hidrazinobenzoico, además de ser inhibidores de la
melanogenesis son también inhibidores del consumo de oxígeno, pero de tipo no
competitivo, lo que parece un fenómeno general debido, según afirma Fourche
et al. (1977), al grupo N ^ - NH2, lo cual se haobservado con el derivado más
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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simple, el sulfato de hidracina. Lerner et al. (1971), habi'an observado anterior
mente que la fenilhidracina mostraba inhibición no competitiva e irreversible
con muchas catecolasas vegetales, incluyendo la tirosinasa de champiñón; inhi
bición que aumentó con el tiempo de incubación y que requirió oxi'geno, pe
ro que fué independiente de la presencia de fenoles. Sin embargo la fenilhidra
cina estimulaba la oxidación enzimática de p-cresol y por lo tanto la actividad
cresolasa.
La hidracina ha sido también utilizada por Patel y Okun
(1977) como agente reductor para evitar la oxidación de L-dopa formada a par
tir de L-tirosina por tirosinasa de champiñón y por peroxidasa de rábano, con
tal de demostrar la posibilidad de hidroxiláción de L-tirosina por peroxidasa; el
empleo de hidracina en lugar de ascorbato viene justificado por los autores pa
ra evitar la oxidación no enzimática de la L-tirosina que el ascorbato parece ca
talizar en presencia de peróxidos , favorecida por la presencia de los iones me
tálicos Cu+ 2 y Fe+ 2 (Bezssonoff y Leroux, 1946; Udenfriend et al., 1954).
4.5.1. EFECTO DEL ASCORBATO E HIDRACINA EN LA FORMACIÓN DE
DOPACROMO.
En nuestro caso, hemos analizado el efecto del ascorbato y
de la hidracina sobre las actividades de la tirosinasa de epidermis de rana, tan
to en forma soluble como inmovilizada. La acumulación neta de L-dopa, obte
nida por oxidación enzimática de L-tirosina en presencia de ascorbato, ha sido
expuesta anteriormente cuando se estudió la cinética de la actividad tirosina h¡-
droxilasa de tirosinasa (Cap.2). En ausencia de ascorbato, la tirosinasa catalizó
la formación de dopacromo, tanto si se partió de L-tirosina como de L-dopa
como sustratos; la reacción se siguió espectrofotométricamente a 475 nm y el
comportamiento fué semejante para enzima soluble (Fig. 26) e inmovilizada
(Fig. 27). Utilizando la misma concentración para ambos sustratos (2,5 mM),
la velocidad de formación de dopacromo fué, con L-tirosina, aproximadamente
el 30 % que con L-dopa, siendo con L-tirosina prácticamente constante en el
tiempo de reacción ensayado (5 min), mientras que con L-dopa decayó rápida-
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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0,10 9 Sir. inhibidores A Hrdractna ' mW O Ascorbato 1 mM
S L TIROSINA
2 4 6
T I E M P O ( min )
Fig. 26
Efecto del ascorbato y la hidra-
cina sobre la formación de do-
pacromo con SE. 100 I de
extracto de SE con 3 mi de
disolución sustrato (L-tirosina
o L-dopa 2,5 mM).
0,3 # Sm inhibidores
¿ Hidracina t mM
O Ascorbato 1 mM
Fig. 27.
Efecto del ascorbato y la hi-
dracina sobre la formación de
dopacromo con Enzacryl-AA-
-IME. 8 mg gel-IME en 20 mi
de disolución sustrato (L-tiro
sina ó L-dopa 2,5 mM).
2 4 6
T I E M P O ( min )
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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mente.
La presencia de ascorbato((l mM) provocó una completa in
hibición de la formación de dopacromo, tanto con L-tirosina como con L-dopa.
y el efecto inhibidor fué semejante con SE que con Enzacryl-AA-IME. Con hi-
dracina el fenómeno observado fué similar, salvo que permaneció una ligera acti
vidad residual. Por otro lado, con ascorbato o con hidracina la tirosinasa catali
zó la formación de L-dopa a partir de L-tirosina, como ya se ha indicado en el
Cap. 2; por lo tanto el proceso impedido fué la conversión neta de L-dopa a
dopacromo.
4.5.2. EFECTO DEL ASCORBATO Y LA HIDRACINA SOBRE EL CONSUMO
DE OXIGENO.
En este apartado se analiza el consumo de oxi'geno en las
reacciones catalizadas, por tirosinasa en presencia de ascorbato y de hidracina con
tal de, en primer lugar, tratar de conocer el papel que pueden desempeñar estos
agentes reductores, y en segundo lugar, de averiguar hasta qué grado se requiere
un suministro de oxigeno en reactores con tirosinasa inmovilizada.
Aunque en presencia de ascorbato o de hidracina no hay oxi
dación neta de la L-dopa, sin embargo no parece que, en principio, se modifique
notablemente el mecanismo de acción de la tirosinasa si tenemos en cuenta los
siguientes hechos observados con extractos solubles de tirosinasa:
1) La velocidad de reacción , medida como formación de ^HOH a partir de L-
-tirosina-3,5- H en presencia o en ausencia de ascorbato es la misma que la de
formación de dopacromo en ausencia de ascorbato (Pomerantz, 1964, 1966).
2) Las propiedades cinéticas de de la actividad tirosina hidroxilasa obtenidas en
presencia de ascorbato midiendo la formación de L-dopa (Cap. 2), fueron seme
jantes a las determinadas en ausencia de ascorbato, tanto siguiendo la formación
de dopacromo, como con el método radiométrico (García Carmona, 1980).
La oxidación de L-tirosina a dopacromo, probablemente con
L-dopa como intermediario, comportó un consumo de oxi'geno de 12,5 U.O./min
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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bajo las condiciones expresadas en la Tabla 8-A; la presencia de ascorbato o
de hidracina impidió la oxidación de la L-dopa formada con la correspondien
te acumulación de esta, sin embargo, en este caso, la velocidad de consumo de
oxi'geno ( V Q ) fué muy superior (20,5 y 25,0 U.O./min). Este hecho puede
explicar la afirmación realizada por Lerner et al. (1974) de que la fenilhidracina
y ascorbato estimulaba la oxidación enzimática de p-cresol en vegetales, dado que
estos autores medi'an la actividad mediante el consumo de oxi'geno.
Con sustrato L-dopa, que dio lugar a una velocidad de formación
de dopacromo 3,2 veces superior que con L-tirosina, dio una V Q ? 1,7 veces su
perior que al utilizar L-tirosina (21,0 U.O./min, Tabla 8-B). Si la V 0 2 fuera 1,6
veces superior, corresponden'a proporcionalmente al hecho de que con L-dopa só
lo hay una etapa de oxidación. Por lo tanto las diferencias entre L-tirosina y L-
-dopa como sustratos respecto de las velocidades de consumo de oxi'geno y de
formación de dopacromo, parecen cumplir relaciones coherentes estequiométrica-
mente cuando la reacción se lleva acabo en ausencia de ascorbato. Cuando a la
reacción con L-dopa se le añadió ascorbato o hidracina, la V 0 2 aumentó unas
2 veces (40 — 45 U.O./min.). Con este hecho se confirma claramente que la pre
sencia de ascorbato no detuvo simplemente la reacción correspondiente a la acti
vidad dopa oxidasa, sino que provocó otra reacción oxidativa con una velocidad
de consumo de oxigeno incluso superior. Esta reacción podn'a impedir la oxida
ción de L-dopa por uno de los siguientes mecanismos:
A) Por la existencia de una reacción oxidativa que compita con la catálisis en
zimática de la oxidación de L-dopa; esto implican'a una interacción del agente
reductor con la molécula de enzima actuando como dador de electrones. El efec
to del reductor podría ser , en este caso, semejante al asignado a otras hidroxi-
lasas que contienen Cu , como por ejemplo la tirosina hidroxilasa adrenal
y la dopamina-i3-hidroxilasa ( Gunsalus, 1974) que participan en la biosi'ntesis de
catecolaminas; en ellas, el sustrato es monooxigenado a expensas de oxígeno mo
lecular, al mismo tiempo que el Cu es oxidado a Cu + ¿ ; el cofactor reductor,
lleva a cabo la reducción del Cu+^ a la forma reducida original de Cu , inicián
dose de nuevo el ciclo catalítico y no son absolutamente específicas respecto al
reductor.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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Tabla 8
Consumo de oxígeno, en presencia y ausencia de ascorbato o hidracina, en las
reacciones de oxidación de L-tirosina y L-dopa catalizadas por extractos solubles
de tirosinasa. Ensayos control realizados en ausencia de enzima o de sustrato.
Condiciones de ensayo
L-tirosina (mM)
A 2,5 2,5 2,5
B
— —
C 2 . 5 2,5 2,5 2,5 2,5
— — — — —
D
— — — — —
L-dopa (mM)
—
— —
2,5 2,5 2,5
—
— — — —
2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
—
— — — — —
Enzima (mU/ml)
33,5 33,5 33,5
33,5 33,5 33,5
—
— — — —
— — — — —
—
33,5 — —
33,5 33,5
Ascorbato (mM)
—
10 —
—
10 —
—
5
10 — —
—
5 10 — —
—
—
10 —
10 —
Hidracina (mM)
—
—
10
—
—
10
—
— —
5 10
— — —
5 10
—
— —
10 —
10
Vrk °2
(U.O./min)
(*)
12,5 20,5 25,0
21,0 40,0 45,5
0,0 1,7 2,2 0,6 2,6
0,0
1.7 2,6 0,6
1.2
0,0 0,0 0,5 0,0 1.3 1.3
(*) U.O. = Unidad de cantidad de oxi'geno consumido, que se definió como la cantidad del 1 % del oxigeno disuelto en 1 mi de disolución saturada con aire atmosférico ( O2 ~ 0,26 mM )
A) Ensayos con L-tirosina B) Ensayos con L-dopa C) Controles sin enzima
D) Controles sin sustratos
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B) Por existencia de una reacción en que el ascorbato o la hidracina actuase
reduciendo a un producto de oxidación de L-dopa, regenerando ésta; esto ¡m-
plican'a que en realidad no se habn'a detenido la acción enzimática de la tirosi-
nasa como dopa oxidasa. Sen'a la interpretación dada por Fling et al (1963), de
la reducción de la dopaquinona obtenida por la oxidación enzimática de la L-
-dopa. La formación de estas quinonas ha sido observada en algunas fenolasas
vegetales en las que la quinona es el producto final de oxidación de sus sustra
tos específicos. Con tirosinasas de animales y otras que emplean L-tirosina como
sustrato, la formación de dopaquinona como producto de reacción enzimática es
hasta ahora una suposición, dado que el dopacromo es el producto realmente
observado. Se han iniciado trabajos para la detección de esta dopaquinona (Gar
cía Carmona y García Cánovas, 1980).
En ausencia de enzima, pero en presencia de ascorbato o de hi
dracina se obtuvieron valores mínimos de V 0 2 de 0,2 — 2,6 U.O./min, en las
condiciones de la Tabla 8-C, lo que implica que el sistema L-tirosina/ascorbato
ó el L-dopa/ascorbato son sólo muy lentamente oxidables, pero lo suficiente pa
ra detectarse la formación de L-dopa de forma no enzimática, lo que pudo com
probarse dejando L-tirosina en presencia de ascorbato o de hidracina durante 24
horas a temperatura ambiente y determinando la concentración de L-dopa formada
alcanzando concentraciones dé 0,07 mM. Es conocido que las radiaciones U.V.
favorecen la conversión no enzimática de L-tirosina a L-dopa, mecanismo al que
se le asignó, originalmente, la oxidación de L-tirosina a L-dopa en el proceso
de la pigmentación de la piel (Arnow, 1937b).
Igualmente hubo un ligero consumo de oxígeno (1,3 U.O./min) en
el sistema enzima/reductor en ausencia de sustrato (Tabla 8-D).
Con enzima inmovilizada se observó el comportamiento sorprenden
te, respecto al consumo de oxígeno, que está expresado en la F¡g.28; después de
15 horas de funcionamiento continuo de un reactor empaquetada con Enzacryl-
AA-IME y sin reciclaje del sustrato, se perdió el 70 %de la capacidad catalítica
de conversión de L-tirosina a L-dopa en presencia de ascorbato, sin embargo, el
consumo de oxígeno no sólo no disminuyó, sino que aumentó con el paso de
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< a. O
0,3
0,2
0,1
_ 0,0
•
disolución
sustrato
1
/ » i 1 1
tampón fosfato
i
^--'"""""l ~"~"--- ^ J
" V ^ ^ . ^^""V.
^ ^ ^ Í 1 1
100
80
60
40
20
3 d O
o s z> V) z o o o z UJ o X o o
0 5 10 15
T I E M P O (horas)
Fig. 28. Oxígeno consumido y L-dopa formada en un reactor de columna empaquetada (PBCR). Medidas de L-dopa y oxi'geno a la salida del reactor. Disolución sustrato suministrada: L-tirosina, 2,5 mM; ascorbato, 2,5 mM; fosfato 0,1 M, pH 7,0; saturada de aire a 25°C.
la disolución sustrato a través de la columna; el consumo de oxígeno desapare-:
ció cuando se sustituyó la disolución sustrato por disolución tampón. Esto pare
ce indicar que el citado consumo de oxígeno pueda ser debido a una interac
ción del ascorbato con el oxígeno en presencia de la enzima inmovilizada.
4.5 3. CONSUMO DE ASCORBATO EN LA REACCIÓN
Cuando se ensayaron las actividades tirosina hidroxilasa y dopa
oxidasa de tirosinasa se observó que la concentración de ascorbato, medida es-
pectrofotométricamente a 265 nm, decreció con el tiempo de reacción (Fig.29),
hasta que se alcanzó una concentración mínima, a partir de la cual sa inició un
incremento de la absorbancia por formación de dopacromo.
Cuando se utilizó L-dopa como sustrato, la concentración de
ascorbato disminuyó linealmente con el tiempo, y la velocidad de consumo del as
corbato (Vasc) fué proporcional a la cantidad de enzima aplicada. Sin embargo
con L-tirosina, la desaparición de ascorbato no cumplió las mismas leyes de va-
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Extracto (mi)
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Fig. 29.
Consumo de ascorbato en la
reacción catalizada por tiro-
si nasa soluble.Efecto del tipo
de sustrato y de la cantidad
de enzima.
Ensayos con 3 mi de disolución
Sustrato (S) 2,5 mM,
Ascorbato inicial, 0,125 mM
4 6 8 10
T I E M P O ( min )
0,8
LO ce
o z < CC O tfí 00 <
0,4
0,0
S = L-tirosina
_l_ J .
1 2
T I E M P O
Fig. 30.
Consumo de ascrobato en
la reacción catalizada por
Enzacryl-AA-IME.
4 mg gel-IME en 5 mi de
disolución de sustrato re-
ciclando a través de cubeta
de flujo del espectrofotó-
metro.
Sustrato 2,5 mM
Ascorbato inicial, 0,125 mM.
( min )
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riación, no pudiéndose relacionar directamente con la cantidad de enzima apli
cada , aunque si' existió una mayor velocidad de consumo de ascorbato al au->
mentar la cantidad de enzima. El comportamiento de la enzima respecto al con
sumo de ascorbato no se modificó sensiblemente con el uso de enzima inmovi
lizada en Enzacryl-AA, dando curvas de ascorbato frente a tiempo del mismo
tipo (Fig. 30),
Para analizar el significado de las curvas de consumo de as
corbato con sustrato L-tirosina, se representó la variación de la velocidad de
consumo de ascorbato con el tiempo (Fig. 31). Se observó que la V a s c aumen
taba linealmente con el tiempo de reacción, al igual que lo haci'a la concentra
ción de L-dopa formada. Este resultado indicó que la velocidad de consumo de
ascorbato debi'a estar relacionada con la concentración de L-dopa formada en
I D U
_ 100
i
5 o t -< S 50 ce O 8 < _J
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T I E M P O ( rnin. )
80
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. 20
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- 20 j
1
¡ 8 <
O 10 i
(O
Fig. 31. Variación de la velocidad de consumo de ascorbato con el tiempo de
reacción en presencia de L-tirosina. Comparación con la concentración
de L-dopa formada con el tiempo. Condiciones de ensayo: las de la
Fig. 29 para 200yt f de enzima y con sustrato L-tirosina.
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S 0,20
1
O 5 0,15 CQ CC O ü C/3 < o 0,10
D z O O Q 0,05 < u O O
> 0,0
/ L-dopa
[ ^ ^ ~ ^ ^ L-tirosina
í 1 i
Fig. 32.
Efecto de la concentración
de sustrato sobre la veloci
dad de consumo de ascorba-
to con Enzacryl-AA-IME.4
4 mg de gel-IME en 10 mi
de disolución sustrato con
teniendo ascorbato 0,125
mM. Para sustrato L-tirosi-
V a s c fué medida como va
lor medio en el intervalo
de 1 a 2 minutos de reac
ción.
1 2
S U S T R A T O ( m M )
cada momento. Esta afirmación se confirmó cuando se estudió el efecto de la
concentración de los sustratos sobre la velocidad de consumo de ascorbato em
pleando Enzacryl-AA-IME (Fig. 32), resultando lineal con la concentración de
L-dopa.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980
5. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE
PROTIROSINASA EN ENZACRYL-AA.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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5. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE PROTIROSINASA
EN ENZACRYL-AA.
En este capítulo se pretende analizar el efecto de la unión
de protirosinasa al Enzacryl-AA sobre la manifestación de la actividad tirosi-
na hidroxilasa de la proenzima inmovilizada (Enzacryl-AA-1MP), ya que existía
el antecedente de la activación parcial de la actividad dopa oxidasa por la u-
nión covalente a soportes sólidos (Iborra et al, 1979). Así mismo se estudian
las propiedades generales del Enzacryl-IMP, cuando este derivado fué posterior
mente activado por tratamiento con tripsina soluble, y de su comparación con
las propiedades manifestadas por el Enzacryl-AA-IME, en el que la activación
con tripsina fué previa a su inmovilización, se dedujo la forma de proteína apro
piada para la inmovilización de tirosinasa.
5.1. ACTIVACIÓN DE PROTIROSINASA.
Purvis y Depstedt (1957) fueron los primeros en estraer la
tirosinasa de epidermis de Rana Pipiens añadiendo tripsina antes de la homoge-
neización, e interpretaron que la tripsina actuaba solubilizando las células y favo
reciendo la liberación de tirosinasa. Posteriormente se consideró que, en su estado
nativo, se encontraba como proenzima (McGuire, 1970; Barisas et al. 1973; Ben-
son y Triplett, 1974), ya que los extractos solubles de ésta(SP) no manifestaban
actividad dopa oxidasa. Miller et al (1970) aislaron y detectaron oxidasas de L-
-tirosina, dopamina y L-dopa de Rana pipiens, que en piel y ovario eran casi i-
nactivas para L-tirosina y L-dopa, siendo activadas por tratamiento con tripsina.
Hasta el presente se han descrito varios procedimientos de activación de la tiro
sinasa de epidermis de rana:
1) Interacción con tripsina o con otras enzimas proteolíticas (Barisas y McGuire,
1974; Lozano et al. 1975). La activación con tripsina es más eficaz y la activi
dad conseguida viene considerándose como el 100 % de la actividad de la en-
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zima. La activación por paso de las disoluciones de protirosinasa a través de co
lumna con tripsina inmovilizada en Sepharosa (Iborra et al. 1976; Manjón, 1978)
es la técnica utilizada sistemáticamente en este trabajo (Método: 12.1.2).
2) La activación por la acción de la luz que ha sido observada con protirosinasa
(Mikkelsen y Triplett, 1975), se atribuye a una molécula cromófora constituyen
te de la protei'na que al ser extrai'da con acetona la desensitiza. Este fenómeno
puede estar implicado en el mecanismo natural de activación de tirosinasa, para .
desencadenar la pigmentación de la piel como respuesta al tratamiento solar.
3) El tratamiento térmico también provoca parcial activación (Lozano et al, 1975),
asi' como el envejecimiento (Galindo, 1976).
4) La inmovilización a determinadas soportes sólidos por unión covalente provocó
la activación de protirosinasa (Manjón, 1978; Iborra et al. 1979) como consecuen
cia de la modificación química producida en la molécula de proenzima.
5) Miller et al (1970) mencionan que por incubación con L-tirosina a 0°C tam
bién hay una activación de la protirosinasa de epidermis. Este constituye el úni
co antecedente localizado de activación por el sustrato
Los estudios realizados en nuestro laboratorio, sugieren que
la activación transcurre a través de un cambio conformacional provocado por u-
na excitación luminosa, térmica ó por una modificación química covalente. Ese
cambio conformacional se ha comprobado que consiste en un desplegamiento de
la estructura tridimensional; diversos tipos de resultados lo confirman: los cam
bios en el espectro de fluorescencia (Manjón, 1978, Iborra et al. 1978), el com
portamiento frente a cromatografía hidrofóbica (Cortés, 1978), la mayor accesibi
lidad del centro activo a fotosensibilizadores inmovilizados específicos (Llorca,
1980) y así como de los puentes disulfuro a la acción del ditiotreitol (Iborra et
al. 1978; Ferragut, 1980). Por otro lado, estudios de desnaturalización térmica,
han demostrado que la forma activa desplegada es una forma más estable termo-
dinámicamente ((Galindo, 1976; García Carmona, 1980). Por lo tanto el proce
so de activación es un proceso espontáneo por transición a un estado más desor
denado, y las distintas formas de desencadenar el proceso proenzima —^enzima,
lo hacen proporcionando la energía de activación (caso de la luz, temperatura e
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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inmovilización) o aportando un mecanismo catalítico de menor energía de acti-
vación (catálisis por tripsina, inducción por el sustrato).
Una posible explicación para la más eficaz activación con
tripsina sería que ésta rompe elgún enlace peptídico y de esa forma libera la
conformación de la proenzima, permitiendo así la transconformación espontánea
a la estructura de enzima activa, más desordenada y estable. Además no se han
observado diferencias significativas en los valores de peso molecular de protirosi-
nasa y tirosinasa que indicaran la liberación de algún péptido, y la expresión de
la actividad viene acompañada por una dimerización de las cadenas polipeptídi-
cas desplegadas (Ferragut, 1980).
5.1.1. EFECTO DE LA TRIPSINA SOBRE LA ACTIVIDAD TIROSINA HI
DROXILASA DE PROTIROSINASA SOLUBLE.
La protirosinasa no manifestó actividad dopa oxidasa, en las
condiciones del ensayo estándar, en presencia de su sustrato L-dopa, si no se
activaba previamente con tripsina ó alguno de los métodos de activación ya ci
tados (Galindo, 1976). Sin ambargo con L-tirosina, en presencia de ascorbato,
se detectó actividad tirosina hidroxilasa por formación de L-dopa, después de un
periodo de inducción (Fig. 33). Para las condiciones de ensayo, este periodo
de inducción fué de unos 5-10 minutos. La velocidad de formación de L-dopa
con la SP fué máxima al cabo de unos 15 minutos de reacción y alcanzó el
50 % de la que manifestó la SE desde el primer momento. Cuando la proen
zima se trató durante 5 minutos con tripsina, bajo las condiciones de ensayo ex
presadas en la Fig. 33 , no se observó la existencia de dicho periodo de induc
ción y además la actividad manifestada fué notablemente superior y más estable
a lo largo del tiempo de reacción.
Estos resultados están de acuerdo con lo establecido anterior
mente de que la activación de la proenzima puede realizarse por un cambio con-
formacional, que puede conducir a diferente estado de agregación de la proteí
na, y que es inducible todo ello por el sustrato L-tirosina.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980
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400-
A
< Q.
10 20
TIEMPO (min)
Fig. 33.
Efecto del tratamiento con
tripsina de protirosinasa so
luble. 2 0 0 ^ 1 de SP purifi
cada, se trataron con 40/U
de tripsina (lmg/ml) duran
te 5 minutos a 25 °C y se
midió la formación de L-do-
pa después de la adición de
5 mi de disolución sustrato
(L-tirosina 2,5 mM, ascorbato
5,0 mM, en fosfato 0,1 M
pH 7,0)
Esta inducción por el sustrato L-tirosina fué observada por
Miller et al. (1970) en epidermis de Rana pipiens cuando incubó disolución de
proenzima con L-tirosina 1 mM, durante 160 minutos a 0°C. Igualmente en la
purificación por cromatografía de afinidad en tirosina-sepharosa de protirosinasa,
al eluir con L-tirosina la proenzima adsorbida, se observó un ennegrecimiento
del soporte; este hecho se puede interpretar en base a que la L-tirosina soluble
activaba a protirosinasa adsorbida por su interacción con el centro activo, mien
tras que la L-tirosina inmovilizada no lo hacía (Cortés, 1978).
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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5.1.2. ACTIVACIÓN DE PROTIROSINASA POR INMOVILIZACIÓN. EFECTO
DE LA TRIPSINA SOBRE ENZACRYL-AA-IMP.
La protirosinasa inmovilizada en Enzacryl-AA por el método
del ácido nitroso manifestó actividad tirosina hidroxilasa después de un perio
do de retardo sin necesidad de tratamiento con tripsina. Esto indicó que ha
bía una inducción de la actividad provocada por el sustrato al igual que suce
dió con el SP, pero con la salvedad de que al cabo de 30 minutos de reac
ción se llegó a alcanzar el 100%de la actividad del IMP que había sido tra
tado con tripsina. Así pues la modificación química producida por la inmovi
lización condujo a que la protei'na adoptara una conformación más favorable
a la inducción por el sustrato y por lo tanto más próxima a la forma activa.
Es equivalente a afirmar que la inmovilización produjo una parcial activación
de la proenzima. Esto es coherente con el hecho observado por Iborra et al.
(1979), de que la L-dopa no induci'a actividad dopa oxidasa en las condicio--.
nes normales de ensayo, sin embargo manifestó actividad después de inmovili
zarla covalentemente.
F¡g.34.
Efecto del tratamiento con
tripsina sobre el Enzacryl-AA-
IMP. 4 mg de gel-IMP lio-
filizado, se trataron con 0,5
mi de tripsina (1 mg/ml) du
rante 15 minutos, y se midió
la formación de L-dopa des
pués de la adición de 5 mi
de disolución sustrato (L-tiro-
sina 2,5 mM, ascorbato 5 mM
fosfato 0,1 M pH 7,0).
T I E M P O (min)
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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Para explicar el mecanismo por el que la inmovilización pro
vocó la activación parcial de la tirosinasa se debe tener en cuanta que:
1) La inmovilización de la protei'na sobre Enzacryl-AA se realiza fundamental
mente a través de los residuos tirosina de la proteína ( Goldstein et al., 1970;
Melrose, 1971).
2) En el proceso de activación se exponen más residuos de tirosina al medio,
como lo juatifican los espectros de fluorescencia de proenzima y enzima (Iborra
et al. 1978).
3) Es frecuente que la inmovilización covalente provoque cambios conformacio-
nales (Zaborsky, 1973), y en el método empleado para la inmovilización de tiro
sinasa sobre Enzacryl-AA, es probable que ese cambio se produzca en el sentido
de un desplegamiento de la estructura que hiciera accesibles a los residuos de t i
rosina para su unión al soporte. De hecho, se han observado desplazamientos
en la longitud de onda de emisión de fluorescencia al inmovilizar proenzima en
sepharosa 4B (Iborra et al. 1979) en el mismo sentido que el observado en el
proceso de conversión de proenzima a enzima (Iborra et al. 1978). El desplega
miento producido, se estabilizaría por los enlaces covalentes formados con el so
porte y por los que se formarían en la interacción de la enzima con el micro-
ambiente del soporte.
Junto con los cambios conformacionales favorables a la acti
vación que se produjeran por la unión al soporte, habrá de tenerse en cuanta
que el azar estadístico pudo producir modificaciones desfavorables para la acti
vación en una fracción de moléculas de proteína; dada la rigidez provocada por
los enlaces al soporte sólido, estas moléculas de conformación "equivocada" no
responderán al tratamiento con tripsina, ni a la inducción por ei sustrato, por
lo que quederían definitivamente inactivables para su función catalítica. Además
la activación provocada por inmovilización y por inducción por el sustrato no
deben tener las mismas características que que la activación con tripsina, pues
como se verá después, cuando se activó SP en columna de tripsina-sepharosa
y la SE recogida se inmovilizó sobre Enzacryl-AA, el I ME obtenido manifestó
muy distinto comportamiento que cuando se inmovilizó como proenzima, y el
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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Enzacryl-AA-IMP obtenido se activó luego por tratamiento con tripsina soluble.
5.2. RENDIMIENTOS DE INMOVILIZACIÓN DE PROTIROSINASA EN
ENZACRYL-AA.
Para el estudio del rendimiento de inmovilización y eficacia
de acoplamiento de protirosinasa en Enzacryl-AA, se siguió la misma sistemáti
ca que se aplicó con tirosinasa descrita en el cpi'tulo anterior, salvo que en
este caso, para la determinación de actividad de la proenzima soluble (SP¡ y
SPr) e inmovilizada (IMP), se trató previamente con tripsina soluble (Método:
12.1.3).
Se observó que la fracción de actividad sustraída de la di
solución de proenzima, fué mayor que la de protei'na unida al soporte, por
lo que la relación Act. sust./rp^ fué en todos los estados de purificación
utilizados superior a 1 (Tabla 9); esto, al igual que en la inmovilización de
enzima, se interpretó en función de una posible unión selectiva o de una i-
nactivación de la proenzima no unida al soporte. Además, la actividad sustraí
da de la disolución de proenzima (0,66 — 0,72) fué menor que lo obtenido
con enzima (0,98), lo que podría relacionarse con la menor densidad de resi
duos de tirosina en la superficie de la molécula de proenzima que de enzima.
La eficacia de acoplamiento de la protirosinasa fué muy in
ferior (0,30 — 0,36) a las obtenidas con enzima (0,88 — 0,75), lo que determinó
unos bajos valores de rendimiento de inmovilización y del proceso global de
purificación e inmovilización (r¡nmxrpur)- La razón r ¡ n m / r_ r o t fué inferior a 1
lo que indicó que la actividad específica de la proteína inmovilizada fuá infe
rior a la de la disolución de protirosinasa original, a diferencia de lo ocurrido
con la inmovilización de la enzima
Los menores valores de la eficacia de acoplamiento, determinados
por la baja actividad manisfestada por el gel-IMP, pueden asignarse a la resistencia
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Tabla 9
Comparación de los rendimientos de inmovilización de protirosinasa y tirosinasa
en Enzacryl-AA.
Forma de fracción Act. sust. r . 'inm
enzima rprot Act. sust. r r ¡ n m r pur x rinm
prot rprot
IMP de
extracto P¡ 0,24 0,66 2,7 0,20 0,83 0,20
IMP de purificado CM/Phe 0,58 0,72 1,2 0,26 0,43 0,14
IME de extracto P¡ 0,45 0,98 2,2 0,86 1,90 0,86
IME de purificado CM/Phe 0,59 0,98 1,7 0,73 1,20 0,35
del IMP a adquirir la conformación más activa, como consecuencia de la ma
yor rigidez que le proporciona a la enzima la unión al soporte; asi' a pesar del
tratamiento con tripsina empleado para la medida de actividad del IMP, la acti
vidad manifestada por éste fué muy inferior a la obtenida cuando se activó an
tes la proenzima soluble y se inmovilizó después en forma de enzima activa.
Otra confirmación de que el Enzacryl-IMP no ha alcanzado
la conformación desplegada más activa, a pesar del tratamiento con tripsina, fué
el comportamiento de la actividad del IMP con la temperatura de ensayo y su
comparación con la del Enzacryl-AA-IME (Fig. 35). Con el Enzacryl-AA-IME, la
temperatura de máxima actividad, en las condiciones del método estándar, fué
de unos 25°C; por enzima de esta temperatura el IME manifestó menor activi
dad, indicando con ello una inactivación por la mayor agitación térmica. Sin em
bargo, a pesar de que la proenzima soluble es menos estable a la desnaturaliza
ción térmica (Galindo, 1976; Garci'a Carmona, 1980), la temperatura de máxima
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actividad del IMP fué superior, próxima a 40 °C. Esto sugiere que la mayor a-
gitación térmica favorece cambios hacia conformaciones más desordenadas y des
plegadas que se aproximaron a la conformación más activa, mientras que el IME
que se encuentra en una conformación óptima, el aumento de temperatura con
duce a conformaciones menos activas.
=5 60
O)
E
c 1 o E
40 -
a < o > £ 20
ü <
20 40 60
TEMPERATURA ( °C )
Fig. 35. Comparación del efecto de la temperatura sobre
la actividad de Enzacryl-AA-IMP activado con tripsina r i
y de Enzacryl-AA-IMP.Actividad medida por la L-dopa formada en 10 minutos de ensayo.
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5.3.- COMPORTAMIENTO CINÉTICO DEL ENZACRYL-AA-IMP.
Cuando se analizó el comportamiento cinético del derivado
Enzacryl-AA-IMP activado con tripsina soluble, la si'ntesis de L-dopa ocurrió sin
existencia de un periodo de retardo apreciable, y con un crecimiento lineal de
la concentración de L-dopa con el tiempo, dentro de los primeros 20 minutos
de reacción, para todas las concentraciones de L-tirosina utilizadas (Fig. 36).
Cuando se realizó la representación de la velocidad de reac
ción frente a la concentración de sustrato (Fig. 37), al igual que lo obtenido
con los Enzacryl-AA-IMe preparados con tirosinasa poco purificada (Cap. 4.3),
que puede asociarse a un aumento del valor de KM,, valor no determinado por
causa de la baja solubilidad de la L-tirosina y que se refleja en una menor afi-
0 5 10 15
TIEMPO DE REACCIÓN (min)
Fig. 36. Formación de L-dopa catalizada por Enzacryl-AA-
IMP activado con t-ipsina para diferentes concentra
ciones de sustrato L-tirosina. 4 mg de Enzacryl-AA-
IMP activado 15 min. con 0,5 mi tripsina (1 mg/ml)
5 mi disolución sustrato conteniendo ascorbato 2,5 mM.
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o. |§ o> E c 1 "5 E
z o ü ü < LU
ce tu O O < Q ü O _l LU >
1,0 2,0
T I R O S I N A (mM)
Fig. 37. Cinética de primer orden del Enzacryl-AA-IMP tratado con
tripsina. Velocidad medida por la formación de L-dopa en
las condiciones de ensayo expresadas en la Fig. 36.
nidad de la proenzima activada por su sutrato L-tirosina.
Todos los derivados Enzacryl-AA-IMP obtenidos a con proen
zima a distintos estados de purificación manifestaron una cinética de primer or
den. Las constantes cinéticas obtenidas fueron similares entre sí, salvo la corres
pondiente a la proenzima purificada por CM-sephadex, y que correspondió con
el hecho de que la proenzima purificada por este método dio un mayor rendi
miento de purificación. La mayor actividad manifestada en esta caso por el IMP
no puede interpretarse sólo por el grado de pureza del proenzima, ya que con
proenzima más purificada (CM/Phe), se obtuvo un valor de K" inferior. Por lo
tanto, la diferencia pudo corresponder a que se eliminara un tipo de proteínas.
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Tabla 10
Constantes cinéticas de primer orden del Enzacryl-AA-IMP
Proenzima
purificada
por
extracto P¡
extracto H20/P¡
purificado CM
purificada Phe
purificada CM/Phe
Un di'a de
K
(min"')
9,1
9,2
17,4
8,3
11,4
almacenamiento
K'
(min"'-lit-g"
11,4
11,5
21,8
10,4
14,2
')
30 dias de a
K
(min"1)
8,5
7,3
12,2
5,9
6,2
Imacenamiento
K'
(min*1 -lit-g"1)
10,6
9,1
15,3
7,4
7,8
Cuando se midieron las mismas constantes de velocidad des
pués de 30 di'as de almacenamiento (liofilizado, a — 30°C), se observó que ha-
bi'an disminui'do en todos los casos, manifestando una pérdida de actividad por
el almacenamiento. Esta pérdida fué máxima para el caso con proenzima más
purificado (CM/Phe) que perdió un 45 % de actividad. Sin embargo, en el caso
de proenzima menos purificada (P¡), las pérdidas fueron sólo de un 7 % (Ta
bla 10).
Como resumen de este capítulo, podemos afirmar que la in
movilización de protirosinasa en Enzacryl-AA provocó en la protei'na cambios
conformacionales en el sentido de un acercamiento hacia la forma activa de
la enzima, pero que los rendimientos de inmovilización fueron menores que
cuando se inmovilizó tirosinasa previamente activada con tripsina-sepharosa. Por
ésto, y por la pérdida de sus propiedades catalíticas con el almacenamiento, la
inmovilización de protirosinasa ofrecía pocas ventajas para aplicaciones posteriores.
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6. ESTABILIDAD DE LOS DERIVADOS ENZACRYL-AA-IME,
ENZACRYL-AA-IMP y CPG-AA-IME.
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6. ESTABILIDAD DE LOS DERIVADOS ENZACRYL-AA-IME, ENZACRYL-
-AA-IMP y CPG-AA-IME.
En el presente capi'tulo se pretenden analizar aquellas propie
dades de la tirosinasa inmovilizada en Enzacryl-AA y CPG-AA, relacionadas con
su capacidad de utilización durante largo tiempo. Asi', la estabilidad al almacena
miento, estabilidad de la reacción catali'tica, en función del tipo de reactor, esta
do de purificación de la enzima inmovilizada, condiciones de pH, temperatura,
fuerza iónica, etc.; al igual que otros factores que afecten especialmente al uso
del IME en reactores de columna, como la P Q , , la velocidad de flujo volumétri
co y la velocidad lineal, etc.
6.1. EL FENÓMENO DE LA INACTIVACIÓN DE LA TIROSINASA POR LA
ACTUACIÓN.
Es característico y conocido desde hace tiempo que las tiro-
sinasas de diversas fuentes sufren el fenómeno de su rápida inactivación con la
actuación con sus sustratos (Nelson y Dawson, 1944; Shimao, 1962; Horowitz
et al., 1970) y por lo tanto es la principal dificultad para su aplicación con f i
nes analíticos, terapéuticos o industriales (Wykes et al. 1971).
Se ha observado que la melanización produce un efecto de
inactivación de tirosinasa (Seiji y Fitzpatrick, 1960; Seiji y Fukuzawa, 1972) y
que la tirosinasa se une a la melanina formada como producto de oxidación de
L-dopa por la tirosinasa, con lo que la inactivación parece estar relacionada con
la propia melanización (Seiji y Miyazaki, 1971). Shimao et al. (1974), estudian
do el proceso de inactivación, dedujeron que la inactivación dependía de la con
centración de enzima presente y que la unión de los productos a la enzima no
parece jugar un papel importante en el mecanismo; y puesto que la unión co
nocida de las melaninas es posterior a ia reacción de inactivación de ésta, dedu
cen que la inactivación que la inactivación se debía a un bloqueo de los centros
activos de la enzima con los intermediarios quinoideos. De hecho Wood e Ingra-
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ham (1965) observaron la incorporación de radioactividad a la protei'na cuando
emplearon 1- C-fenol como sustrato de tirosinasa de champiñón, habiendo su
gerido la posibilidad de que la nueva quinona formada pueda, antes de dejar el
centro activo, llevar una reacción de Mitchaell con un grupo amino libre de la
enzima, como se da en la ciclación de la dopaquinona formada para dar dopa-
cromo. Sin embargo Lerch (1978) no encontró incorporación de radioactividad
empleando C-fenol con tirosinasa de Neurospora crasa, mientras que sí detec
tó, por análisis de aminoácidos, la pérdida de un residuo de histidina que podrí-
a explicar la inactivación de la enzima; además especula que algún intermediario
generado en el ciclo catalítico pueda atacar al residuo de histidina.
Los diversos mecanismos cinéticos sugeridos (Ingraham, 1954,
1955; Laidler y Burting, 1973; Shimao et al. 1974), suponen la formación de
enzima inactiva a partir de un intermediario del proceso catalítico. Sin embargo,
no llegan a conclusiones reales, en unos casos por haber aplicado en el trata -
miento la suposición de un estado estacionario que en realidad no existió por
la inactivación de la enzima, o en otros por la dificultad de resolución de las
ecuaciones diferenciales planteadas.
En base al tratamiento matemático desarrollado por Varón
(1979) de la teoría de los compartimentos, García Carmona (1980) ha deduci
do los parámetros cinéticos del proceso de inactivación de la actividad tirosina
hidroxilasa de tirosinasa de epidermis de rana, según el esquema:
E +- S ^ = i ES > EP + P'
I I > E + Q (16)
E i
concluyendo que el fenómeno de inactivación se ajusta bien a una cinética de
primer orden, lo que apoyaría una inactivación a través de un intermediario,
dentro del concepto de enzima suicida (Abeles y Maycock, 1976), en que la i-
nactivación depende del número de veces que la enzima actúa y es indepen -
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diente de la concentración de sustrato.
Los tiempos de semiinactivación (ty2)> obtenidos midiendo
la actividad tirosina hidroxilasa por el método radiometrico de Pomerantz (1964),
dio valores de 4 - 5 minutos (Garci'a Carmona, 1980), semejantes a los obteni
dos por nosotros siguiendo la formación de dopacromo, y del mismo orden que
los obtenidos para la actividad dopa oxidasa (Manjón, 1978). En presencia de
ascorbato, y midiendo la concentración de L-dopa formada a partir del sustrato
L-tirosina, durante estos tiempos de reacción e incluso superiores (unos 20 mir.
ñutos, observamos que la reacción transcurría sin pérdida apreciable de la activi
dad (Cap. 2.3), lo que también ha sido observado por García Carmona (1980)
midiendo por el método radiometrico, indicando que en presencia de ascorbato
el mecanismo puede discurrir por otro camino. El papel del ascorbato debe estar
relacionado con la eliminación rápida de algún intermediario que podría acelerar
su transformación a la forma inactiva (E¡). Por ello no hay que descartar, como
se ha comentado anteriormente, una interacción entre la enzima y ascorbato. Sin
embargo, aún en presencia de ascorbato hay una inactivación con t-^n del o r
den de 30 a 90 minutos, que aumentaron al disminuir la concentración de en
zima. Por otro lado, la inmovilización de tirosinasa de epidermis de rana en En-
zacryl-AA aumentó la estabilidad a la reacción de la actividad dopa oxidasa con
valores de t - j ^ de unos 150 minutos en reactores de columna (Iborra et a l . ,
1978). Esto demostró que en el proceso de inactivación existe algún efecto con-
formacional que es parcialmente impedido por la mayor rigidez de la estructura
de la enzima inmovilizada.
Así pues las causas de la inactivación de la tirosinasa por su
actuación no están totalmente aclaradas. En nuestro caso, las experiencias lleva
das a cabo se realizaron para encontrar condiciones óptimas de máxima estabili
dad a fin de abrir posibilidades de aplicación de la enzima tirosinasa y de en
contrar nuevos puntos de vista respecto al problema de su inactivación.
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6.2. ESTABILIDAD AL ALMACENAMIENTO.
Para asegurar una aplicabilidad de una enzima inmovilizada
es necesario que posea una suficiente estabilidad al almacenamiento (Smiley y
Straridberg, 1972). La inmovilización de enzimas, por lo general, suele aumen
tar la estabilidad de éstas al almacenamiento, especialmente por acoplamiento co-
valente (Johnson, 1979; Klemes y Citri, 1979).
Para estudiar la estabilidad al almacenamiento de los derivados
Enzacryl-AA-IME, Enzacryl-AA-IMP y CPG-AA-IME, se almacenaron a — 30 °C
muestras liof¡tizadas, protegidas de la luz y con ambiente seco proporcionado
por gel de si'lice, y se midió la actividad tirosina hidroxilasa con el tiempo de
almacenamiento a porciones diferentes de derivado.
Se observó que el Enzacryl-AA-IME, durante 90 días de al
macenamiento conservó prácticamente inalterada su actividad, sin embargo con
IMP, en el mismo tiempo, perdió más del 50 % de actividad (Fig.38). La ma :
yor estabilidad de la tirosinasa inmovilizada como enzima activa que como pro
enzima, puede guardar relación con las interpretaciones dadas anteriormente res
pecto a la estabilidad conformacional de las dos formas de tirosinasa. Igualmente
el derivado CPG-AA-IME liofilizado mantuvo prácticamente inalterada su actividad
durante 30 di'as; una muestra almacenada durante 120 di'as conservó el 80 %
de la actividad.
Asi' pues, los derivados de enzima inmovilizada mantuvieron
suficiente estabilidad al almacenamiento como para que ésta no limitara su apli
cabilidad, no siendo asi' el derivado de proenzima; ni los extractos solubles de
proenzima que almacenados a 5 °C perdieron el 70 % de actividad, en 60 día?,
y con enzima, en las mismas condiciones, perdió el 50 % en 55 días. En las
demás experiencias de esta Memoria, dada la pérdida de actividad, los derivados
inmovilizados de proenzima, se utilizaron sólo dentro de 15 di'as desde su pre
paración.
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Enzscryl-AA-IMP
' « 30 60 90 120 160
T I E M P O DE A L M A C E N A M I E N T O ( d i n )
Fig. 38. Estabilidad al almacenamiento de Enzacryl-AA-IME e IMP.
Ensayos realizados con alícuotas tomadas de muestras lio-
füizadas y almacenadas en ambiente seco a — 30 °C.
6.3. ACTIVIDAD DE LOS REACTORES CON GEL-IME Y ESTABILIDAD DE
LA REACCIÓN A LARGO TIEMPO.
Cuando una enzima inmovilizada se emplea en un determina-
do reactor, para decidir si el sistema es utilizable para funcionamiento a largo
tiempo es necesario conocer las siguientes variables:
a) La actividad que el gel-IME manifiesta en las condiciones del reactor (Actp).
Esta va a depender de la naturaleza del gel-IME, del tipo de reactor y de las
condiciones de trabajo. Bajo las condiciones de un reactor determinado objeto
de estudio, la actividad manifestada por el IME puede variar notablemente res
pecto a la manifestada con el método o reactor estándar (Act |^ j^) . Por ello se
empleó el término actividad del reactor (Actp), entendida como la actividad ma
nifestada por gramo de gel-IME, en las condiciones del reactor en estudio. Como
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la actividad del reactor vana con el tiempo de uso, el valor de Actp 0 se refie
re en principio, al momento de máxima actividad, que para los reactores STR
fué a tiempo inicial y para los reactores continuos (CSTR y PBCR), fué el va
lor máximo que se obteni'a una vez alcanzado el estado estacionario. El concep
to de Capacidad de reacción del reactor (Cp), empleado para describir la capa
cidad catalítica total de éste (Vieth y Venkatasubramanian, 1976), vendría dado
por: C R = m • ActR (17)
b) La estabilidad de la reacción a tiempo largo. Para su determinación se empló como
criterio el tiempo de semiinactivación (t-j/?)' definido como el tiempo transcurri
do para disminuir la Actp hasta la mitad de su valor máximo.
En las Figs. 39, 40 y 41 se indican ejemplos del comporta
miento del Enzacryl-AA-IME a largo tiempo en reactores de baño agitado (STR),
en reactores de baño agitado continuo (CSTR) y en columna empaquetada (PBCR),
Fig. 39
Comportamiento del Enzacryl-AA-
IME a largo tiempo en reactor
de baño agitado (STR). Se repre
senta concentración de L-dopa a-
cumulada en el reactor con el
tiempo, para las condiciones de
p (Unidades estándar de gel-IME
por litro de disolución sustrato
procesada) que se indican.
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T I E M P O ( hr )
40. Comportamiento del Enzacryl-AA-IME a lo largo del tiempo en reactor continuo de baño agitado (CSTR). m = 4 mg de gel-IME de Act||YjE = 45 mU/mg gel a las velocidades de flujo (Q) indicadas en cada caso.
T I E M P O
41. Comportamiento del Enzacryl-AA-IME a largo tiempo enreactor
de columna empaquetada (PBCR). m = 4 mg de gel-IME de A c t ^
Act|Mp.=-45 mU/mg gel, para las condiciones de velocidad de flu
jo indicadas.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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respectivamente. Para poder estudiar de forma comparable la actividad y estabi
lidad de los derivados inmovilizados en los distintos reactores, se ensayó la ac
tividad en condiciones idénticas, no sólo de los factores ambientales (pH, T, PQ?>
concentraciones, etc.), sino también respecto al valor del parámetro p del reactor,
definido como la cantidad de enzima inovilizada, expresada en unidades estándar
de actividad, utilizada por unidad de volumen total de sustrato procesado a lo
largo da la vida de uso del reactor, y que se calculó por:
p=ME_ = m
vA c t I M E ( u / l ) ( 1 8 )
siendo V§ el volumen de sustrato procesado en el tiempo total de uso del
reactor ( t j ) .
Para un reactor dei tipo STR:
Vg = V p (volumen del reactor) (19)
Para reactores continuos:
V s = Q t T (20)
En reactores STR, t j se tomó como el tiempo necesario para consumir la activi
dad del gel-IME, y en reactores de flujo como el tiempo que tardó la Actp en
reducirse al 10-20 7ode su valor inicial (valor residual límite).
Como se observa en las citadas Figs. 43-45, el parámetro del
reactor, p, condiciona la actividad del gel-IME en los distintos reactores, o bien
directamente o a través del valor de la velocidad de flujo Q.
En la Tabla 11 se compara la actividad manifestada (Actp)
y la estabilidad a la reacción (t<|/«), de los reactores STR, CSTR y PBCR en
igualdad de condiciones respecto a p. Con ello, las diferencias observadas para
un mismo reactor, dependerán fundamentalmente del tipo de soporte y para
un mismo soporte, del t ipo de reactor. En STR la actividad manifestada por
los derivados inmovilizados varió bajo las mismas proporciones que los valores
de r ¡ n m ; este paralelismo respondió a que en el método estándar de medida
de actividad del gel-IME (Método: 12.8.2), empleado para determinar r ¡ n m el en
sayo se realiza en un reactor de baño agitado, aunque bajo otras condiciones.
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Tabla 11
Actividad (Actp ) y estabilidad (t-\/7) de los derivados IME en varios reactores.
Proenzima o enzima inmovilizada a partir de un extracto l-^O/Pj.
Forma
de
enzima
SE
Enzacryl-AA-IMP
Enzacryl-AA-IME
CPG-AA-IME
rinm <«>
—
0,26
0,72
0,41
Act R o (U/g gel)
STR
—
18
45
25
(¡i),
CSTR
—
14
40
22
(üi)
PBCR (iv)
—
4
10
18
h/2
STR
0,7
1,5
4,2
6,0
(h)
(üi)
CSTR
—
—
6,5
—
PBCR (iv)
—
5,7
12,0
16,0
(i) Actividades medidas en las condiciones de los métodos estándares (Métodos: 12.8.1. y 12.8.2.), habiéndose preparado el IME (P) son SE/m=50 U/g soporte
(ii) Actividad máxima inicial manifestada por el reactor (üi) Valores obtenidos para condiciones de parámetro del reactor p= 2 U/1 (iv) Con disolución sustrato saturada con aire.
En PBCR el Enzacryl-AA-IME y el Enzacryl-AA-IMP manifes
taron mucha menos actividad que en STR, siendo la razón ActpgQp/ActgjR
de 0,22 para Enzacryl-AA-IME y para Enzacryl-AA-IMP, mientras que con el soporte
de vidrio poroso, el CPG-AA-IME, esa razón fué de 0,72, indicando que este caso la
capacidad de reacción del derivado en el PBCR es más cercana al STR, que en
el caso del Enzacryl-AA-IME
La menor actividad manifestada en PBCR que en STR se in
terpretó en función de las limitaciones inherentes al reactor en estudio:
a) Deficiencia de oxígeno, que sólo es aportado a la columna por el disuelto
en la propia disolución sustrato que abastece al reactor; el consumo de oxigeno
está potenciado por la presencia de ascorbato, como se indicó anteriormente. La
influencia de esta limitación estuvo minimizada en los reactores de baño STR y
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CSTR, pues la agitación restituía el oxi'geno consumido a partir del aire burbujea
do en la disolución (Van suijdam et al. 1978).
b) Limitaciones por difusión de los sustratos , determinadas por el grado de em
paquetamiento de la columna y de la mínima agitación de la disolución, sólo
debida a la velocidad de circulación del fluido. Esta limitación fué menor en CP
CPG-AA-IME, gracias a la mayor porosidad del soporte; en este caso la limitación
más significativa fué la del oxi'geno, con lo cual la actividad manifestada en
PBCR, aún no llegando a la alcanzada en STR (72 % ) , se acercó más que en
el caso del soporte de poliacrilamida.
Como también se observa en la Tabla 11 , la estabilidad de
la reacción y por lo tanto la vida de uso del reactor, también varió notable
mente con la forma de tirosinasa, el tipo de soporte y el tipo de reactor. La
estabilidad a la reacción en reactores STR, medida por los t - j /_ , fué en todos
los casos mayor para la tirosinasa inmovilizada que soluble (0,7 h), mayor cuan
do se inmovilizó como enzima activa que proenzima (4,2 y 1,5 en Enzacryl-AA),
y algo mayor con CPG-AA como soporte que con Enzacryl-AA (6 y 4,2 h).
La estabilidad a la reacción de los derivados I ME mejoró en reactores CSTR y
fué máxima en ensayos utilizando el reactor PBCR, alcanzando valores de hasta
19 horas y conservando en algunos casos el 30 %de actividad después de 30
horas de funcionamiento continuo de reactor de columna.
La mayor estabilidad de los derivados inmovilizados en PBCR
respecto a STR y CSTR, se interpretó en función de los siguientes factores:
a) Menores efectos de inhibición por la acumulación del producto L-dopa, cuya
concentración forma un gradiente a lo largo del reactor y es asi' elui'do de es
te, mientras que en los reactores de baño, especialmente en CSTR , su acumu
lación provocó una disminución de la actividad manifestada por el reactor. En la
Fig. 42 puede apreciarse el efecto inhibidor de la Actp de concentraciones ini
ciales de L-dopa añadidas al reactor, con la correspondiente pérdida de la pro
ductividad del mismo. En un reactor de baño discontinuo, el producto L-dopa
permanece en el reactor, aumentando su concentración con el tiempo y por lo
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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III
~S
O)
< >
I
40
30
O 20 <
10
0
-93-
0)
a o •o
o E E
- 4 = Z O o ü O o ce
0 0,2 0,4 L-DOPA INICIAL (mM)
Fig. 42. Efecto de la concentración de L-dopa añadida sobre la acti
vidad inicial y sobre la producción en STR.
t T = 12 horas; p = 1,7 U/1
I
tanto su efecto inhibidor es creciente a lo largo del tiempo de uso del reactor
y será más notorio cuanto mayor sea la actividad enzimática que se aplique al
reactor; esto sen'a una razonable explicación de la rápida pérdida de actividad
en STR por el uso dando menores t-j/2 °.ue los demás tipos de reactores. En
el reactor de baño continuo CSTR, el producto es eliminado continuamente, por
lo que no se produciría alta acumulación de L-dopa y asi' la velocidad de inacti
tivación fué menor que en STR, pero por otro lado, dada la agitación del CSTR,
en todo el espacio del reactor actuaba el efecto inhibidor de una concentración
de L-dopa igual a la de salida limitando la Actp desde los momentos iniciales.
En PBCR se establece un gradiente de concentración de L-dopa, de forma que
sólo en las últimas capas del lecho de gel-IME sufrían los efectos de una con
centración igual a la de salida. Asi' pues, los valores de t - j ^ observados experi-
mentalmente, no corresponden exactamente a la inactivación de la enzima, sino
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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que interviene además la inhibición competitiva provocada por la acumulación
de producto, deteniendo la reacción enzimática, especialmente en los reactores
de baño.
b) Ausencia de turbulencia que puede provocar efector de desnaturalización
en los reactores de baño agitado y que es mi'nima en PBCR.
c) La menor actividad manifestada en PBCR, determina que también son proba
blemente menores los fenómenos de inactivación por reacciones secundarias pro
pias de la actuación de la enzima. Esta afirmación adquiere coherencia si se ad
mite que el mecanismo de inactivación de la enzima parte de un intermediario
del ciclo catali'tico, con lo que la velocidad de inactivación dependen'a del nú
mero de veces que la enzima es utilizada, por unidad de tiempo, para el proce
so catalítico, y de la probabilidad de que el mecanismo se desvi'e hacia la reac
ción de inactivación. De hecho, es significativo que los valores de t - ] ^ son me
nores en los reactores en que la enzima manifiesta más su actividad. Así en los
reactores de baño, dado que el IME manifiesta mayor actividad que en los reac
tores de columna, conllevarán en general una mayor producción de L-dopa a lo
largo de su vida de uso, a pesar de sus bajos valores de t^/2 •
6.4. INFLUENCIA DE VARIOS FACTORES SOBRE LA ESTABILIDAD Y
ACTIVIDAD DEL IME.
6.4.1. EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA Y DEL pH
La influencia del pH y de la fuerza iónica del medio sobre
la vida de uso del IME y su productividad, se estudió determinando t-j/2 y 'a
producción de L-dopa en un reactor de columna empaquetada.
Las variaciones de la fuerza iónica se suministraron con con
centraciones de tampón fosfato comprendida entre 0,02 y 0,50 M (Tabla 12).
En este intervalo no se observó una variación definida de los valores de t-j/2
con la fuerza iónica, sin embargo la productividad disminuyó ligeramente con el
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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Tabla 12
Efecto de la fuerza iónica sobre la estabilidad a la reacción y productividad
Reactor PBCR, 2 mg de gel-IME, Q = 7,5 m i /h .
Fosfato
(M)
0,02
0,05
0,10
0,15
0,20
0,50
*1/2
. (h)
10,0
8,5
9,5
9,5
9,0
8,8
Producción de L-dopa
en 12 h. (yii moles)
7,0
7,0
6,5
6,5
5,7
5,5
Tabla 13
Efecto del pH sobre la estabilidad a la reacción y productividad de Enzacryl-AA-IME
Reactor PBCR, 2 mg gel-IME, Q = 7,5 ml/h.
pH t ' i / 0 Producción de L-dopa
en 12 h. (/timóles)
6,0 8,0 5,1
6,5 9,5 7,9
7,0 11,5 8,0
7,5 12,5 7,5
8,0 9,5 6,1
*1/2
( h )
8,0
9,5
11,5
12,5
9,5
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980
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aumento de la concentración de fosfato, en consonancia con lo observado ante
riormente en el efecto de la fuerza iónica sobre la actividad del IME (Cap. 4.3).
Las variaciones del pH comprendidas entre 6,0 y 8,0 suminis
tradas con tampón fosfato 0,1 M, tampoco produjeron drásticas variaciones en
los valores de t^ /^ , que fueron máximos para pH 7 — 7,5. La productividad tam
bién fué máxima a estos valores de pH, disminuyendo notablemente para pH in
ferior a 6,5 y superior a 7,5, como consecuencia de la pérdida de actividad en
estas condiciones de pH (Cap. 4.3), tal como puede apreciarse en la Tabla 13.
Asi' pues de estos factores, especialmente el pH es el que
puede afectar en mayor grado a la actividad y por lo tanto a la productividad
del IME, mientras que la vida de uso del IME se altera sólo ligeramente dentro
de los márgenes de fuerza iónica y pH ensayados.
6.4.2. EFECTO DE LA TEMPERATURA
La actividad manifestada por el IME frente a temperatura, me
medida por el método estándar alcanzó un máximo a 25 °C (Cap. 5.2). Dicho
método estándar está referido en términos de velocidad inicial, en el que se em
plean tiempos cortos de reacción y con reactor en condiciones de alto valor del
parámetro p. .Para tiempos largos de reacción y con reactores de valores bajos de
p (volumen grande de disolución sustrato procesada), el efecto de la temperatu
ra sobre la estabilidad y actividad del Enzacryl-AA puede apreciarse en las ex
periencias representadas en la Fig. 43, para reactores STR y PBCR.
Se observó que en STR un aumento de la temperatura por
enzima de 20 °C fué en detrimento de la producción total. Asi' por ejemplo a
37 °C, temperatura que dio aproximadamente la misma actividad estándar que
a 20 °C condujo en STR a un comportamiento diferente; durante las primeras
horas de funcionamiento mostró algo más de actividad a 37 °C, pero a las 2 h
perdi'a rápidamente actividad y a las 3 h la producción de L-dopa estaba deteni
da, mientras que a 20 °C necesitó unas 7 h para la pérdida total de actividad,
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0 4 8 12 16
T I E M P O ( h )
Fig. 43. Efecto de la temperatura sobre el comportamiento
a largo tiempo de Enzacryl-AA-IME en STR y PBCR.
m = 4mggel-IME; V s = 50 míen STR; Q = 5 ml/h
en PBCR.
consiguiendo aproximadamente el doble de producción que a 37 °C. La mayor
actividad a 37 °C durante las 2 primeras horas, puede interpretarse por las mi
mismas razones que determinan la Ley de Arrenhius (mayores energías de coli
sión y más rápida disusión de sustratos y productos}, y la rápida inactivación
posterior por desnaturalización térmica.
Sin embargo, en PBCR a lo largo de 15 horas de funciona
miento, a 20 °C manifestó aproximadamente un 30 ^ menos de actividad que
a 37 °C, lo que debe estar realcionado con los fenómenos de difusión, dado
que es uno de los factores limitantes del Enzacryl-AA-IME en PBCR. Por enzi
ma de 45 °C no mostró prácticamente actividad, tanto en STR como en PBCR.
después de 30 minutos de funcionamiento.
El comportamiento con la temperatura de la tirosinasa inmo-
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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vilizada indicó que una temperatura comprendida entre 18 y 25 C es una tem
peratura idónea para su utilización en STR y de 20 a 37 °C en PBCR, siendo
25 °C la temperatura que normalmente se empleó para ambos tipos de reactores
6.4.3. EFECTO DEL ASCORBATO E HIDRACINA
El uso de hidracina como reductor para prevenir la oxidación
de L-dopa, provocó un ligero aumento de la producción de L-dopa, conrespecto
al uso de ascorbato, tanto en reactor de baño como de columna (Fig. 44).
No obstante a lo largo del presente trabajo se ha seguido utilizando el ascorr
bato como agente reductor. Por otro lado, concentraciones de ascorbato entre
1 y 10 mM no mostraron diferencias significativas sobre la actividad inicial ni
12
LU 8
"33 D>
o> o E 4 E
< a. O O
•
0 4 8 12 16
T I E M P O (h)
Fig. 44. Comportamiento a largo tiempo del Enzacryl-AA-IME
en presencia de ascorbato y de hidracina como re
ductor. m = 4 mg gel-IME; V s = 50 mi en STR; Q =
5,2 ml/h en PBCR.
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-99-
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1
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•
» 4 6 8
A S C O R B A T O ( mM )
10
Fig. 45. Efecto de la concentración de ascorbato sobre la
actividad y estabilidad del Enzacryl-AA-IME.
Reactor PBCR; m = 2 mg gel-IME; Q = 5,0 ml/h
sobre la estabilidad de la reacción. Asi' por ejemplo , en PBCR el Enzacryl-
-AA-IME mostró valores de t - j / 2 muy semejantes (Fig. 45), por lo que no se
apreciaron diferencias notables en la productividad del reactor. Asi' pues la
concentración de ascorbato no resultó un factor determinante de la producti
vidad de los reactores, siendo sólo necesaria la precaución de que la concen
tración del ascorbato sea lo suficiente alta para que en el tiempo de residen
cia de la disolución sustrato en el reactor, el ascorbato no sea consumido to
talmente, pues en ese momento empezaría a darse la oxidación de L-dopa a
dopacromo (Cap. 4.5).
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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6.5. FACTORES QUE AFECTAN ESPECIALMENTE A REACTORES DE
COLUMNA EMPAQUETADA.
6.5.1. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE OXIGENO.
La velocidad de consumo de oxigeno que se da en las reac
ciones catalizadas por la tirosinasa en presencia de ascorbato (Cap. 4.5), sugirió
que una de las razones de la menor productividad del PBCR respecto al STR,
podn'a ser una deficiencia del oxígeno necesario para la reacción. En STR éste
problema no existió dado que el oxígeno consumido por la reacción era repues
to por nuevo oxígeno atmosférico burbujeado y que se disolvió gracias a la a-
gitación. En PBCR el único oxígeno disponible fué el aportado por la disolución
que abastece al reactor.
Que la concentración de oxígeno era un factor limitante de
la productividad del PBCR se demostró al sustituir una disolución sustrato satu
rada por burbujeo con aire atmosférico ( P Q 9 0-21 atm) por una disolución sa
turada con oxígeno (Fig. 46) La concentración de L-dopa en el eluído, y por
tanto la productividad del PBCR, aumentó notablemente al introducir la disolu
ción saturada de oxígeno, y disminuyó de nuevo al utilizar la disolución original
saturada de aire.
Se comparó la productividad de dos reactores PBCR, uno ali
mentado con disolución saturada con oxígeno y otro con aire (Fig. 47). Cuando
el flujo fué suficientemente alto y por lo tanto el tiempo de residencia pequeño
( tpiu 0,48 min.mg gel), hubo poca diferencia en la productividad de ambos
reactores, lo que indicó que en estas condiciones, la disolución saturada de aire
suministró casi todo el oxígeno que requería el reactor. Sin embargo a flujos
lentos, en el tiempo de residencia del sustrato en el reactor, el oxígeno de la
disolución saturada con aire no fué suficiente para abastecer el necesario en la
reacción; con ello la deficiencia de oxígeno limitó notablemente la actividad ma
nifestada por el I ME en el reactor. Así en el ejemplo de la Fig. 47 a Q 4 ml/h
con un tp|y| de 1,8 min-mg gel, la actividad inicial del reactor con disolución
saturada de oxígeno fué 2,6 veces que con saturación por aire.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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Fig. 46. Efecto de la concentración de oxígeno en la actividad de un
reactor de columna. m = 4 mg gel-IME; Q = 7 ml/h. Las fle
chas indican el momento en que se inicia el suministro de
disolución sustrato saturada de oi'geno ó aire.
Fig. 47.
Influencia del oxígeno en
un reactor PBCR, en rela
ción con la velocidad de
flujo (Q).
m = 4 mg Enzacryl-AA-IME
10 15
T I E M P O (h)
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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6.5.2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO (L-TIROSINA).
Ya se ha indicado (Cap. 5.1.) que la interacción de la L-tiro-
sina con la protirosinasa provocaba tanto de la forma soluble como del deriva
do IMP. Si el derivado favoreció el paso a la conformación activa, también po
dría ser que las variaciones en la concentración del sustrato modificaran la esta
bilidad del IME en el mismo sentido. Para ello se realizaron determinaciones de
*1/? y c 'e ^ c t R e n P^CR, para concentraciones de L-tirosina comprendidas
entre 0,25 y 2,5 mM.
La estabilidad a la reacción, medida por los tiempos de semi-
inactivación, disminuyó con la concentración de L-tirosina, en contraposición al
hecho de que el sustrato pudiera estabilizar la conformación de la proteína en
su forma activa (Fig. 48). La actividad máxima inicial, sí aimentó con la con-
I I o <
I 0,5 1,0 1,5 2,0
L - T I R O S I N A ( m M )
ce z
[•2 e i
8 -c a.
- 1 -
LO _
Fig. 48. Efecto de la concentración de sustrato L-tirosina sobre
la actividad, estabilidad y producción de L-dopa en
PBCR.
m = 4 mg gel-IME; Q = 5ml /h .
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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centración de sustrato y como consecuencia la producción de L-dopa. La actividad
del IME medida por el método estándar, en STR, dio una respuesta casi lineal con
la concentración de sustrato y con el empleo de enzima purificada dio K^ de
2,7 mM. Sin embargo en estos ensayos en PBCR la actividad aumentó con la
concentración de sustrato con tendencia a la saturación al aumentar la concen
tración del sustrato. Una representación de Lineweaver-Burk de éstos valores
dio un valor de K^ de 0,47 mM, , lo que da un valor de 5,7 para la rela
ción K|y|(PBCR)/K|y|(STR), que al estar muy alejado del valor 1,0, normalmente
se considera indicativo de existencia de limitaciones difusionales en el reactor
PBCR (Ngo et al. 1979). Pero en nuestro caso la saturación de la actividad
con la concentración del sustrato observada, también puede interpretarse tenien
do en cuanta que al aumentar la actividad con la concentración de sustrato, au
mentó no solo la velocidad de síntesis de L-dopa, sino también la velocidad de
consumo de oxi'geno; asi' se llega a situación de deficiencia de oxi'geno que limi
ta la actividad manifestada por el IME en PBCR, aparte de los efectos de limi
taciones por difusión. Desde esta punto de vista pierde sentido real los valores
de K^ calculados para este sistema.
A pesar de que los valores de t* /_ disminuyeron con la con
centración de sustrato, dado que aumentó la actividad manifestada por el IME,
la producción de L-dopa a lo largo de 18 foras de uso continuo del reactor au
mentó con la concentración de sustrato; este aumento fué pequeño por enzima
de S 1 mM. Este comportamiento sugirió que la disminución de estabilidad a
la reacción y por lo tanto los valores de t - j / ^ , no fué consecuencia de un efec
to inestabilizador del sustrato; más bien parece haber una realación entre la acti
vidad manifestada por el IME y la inactivación por el uso, de forma que a una
velocidad alta de la reacción catalizada por el IME, le correspondió una mayor
velocidad de inactivación. Esto equivale a afirmar que la inactivación no depen
dió sólo del tiempo de uso del IME, sino también del número de veces que ca
da centro activo ha sido utilizado. Esto sería coherente con el mecanismo de i-
nactivación en el cual un intermediario del proceso catalítico iniciase una reac
ción secundaria de inactivación, tal como se ha descrito anteriormente (Sec. 6.1),
y que tiene una determinada probabilidad de ocurrir cada vez que una molécula
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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de sustrato es transformada en producto.
6.5.3. EFECTO DE LA VELOCIDAD DE FLUJO VOLUMÉTRICO (Q) Y DE
LA VELOCIDAD LINEAL (u).
La velocidad de flujo volumétrico puede afectar al comporta
miento del IME en PBCR en base a que éste determina dos variables:
1) La velocidad de suministro de sustratos, especialmente el oxígeno, lo que pue
de limitar la Actp si Q no es lo suficiente elevado para para suministrar la de
manda de oxígeno de la reacción. El efecto de la concentración de oxígeno ya
ha sido analizada anteriormente en relación con Q (Secc. 6.5.1.).
2) La velocidad lineal (u , cm/h) de avance del fluido (calculada por u=Q/A,sien
do A la superficie transversal de la columna) puede afectar a los fenómenos de
difusión interna y externa. Para analizar la importancia de este factor, se deter
minó la actividad, estabilidad y producción de L-dopa, en reactores PBCR, bajo
condiciones en las que la velocidad lineal fuera la única variable del sistema. Pa
ra ello, se tomaron varios reactores de columna que poseían distintas dimensio
nes de altura y diámetro (Fig.49-A), en los que se empaquetó la misma cantidad
de gel-IME (4 mg) y por lo tanto el mismo volumen de lecho (30 mm ), y
fueron alimentados con disolución sustrato a la misma velocidad de flujo volumé
trico (Q = 6 ml/h), de forma que los reactores estuvieran en las mismas condicio
nes respecto a los distintos parámetros determinantes del reactor (Vp, Q, tpjyj,
p, q, etc.), pero a una velocidad lineal diferente en cada reactor.. Este tipo de
experiencias han sido sugeridas (Pitcher, 1975), como método sencillo y práctico
de demostrar la existencia de problemas difusionales; de forma que si la activi
dad del IME aumenta con u corresponde a la existencia de limitaciones por di
fusión.
La actividad máxima inicial manifestada por el reactor y la
producción de L-dopa aumentó con la velocidad lineal (Fig.49-B), lo que demos
tró que en PBCR la difusión de los sustratos fué uno de los factores que limi-
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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0 = 2 mm 3 mm 6 mm 10 mm
Fig.49-A.. Dimensiones relativas de reactores en columna con
lecho empaquetado, Formas cih'ndricas. Se represen
ta una sección longitudinal.
IZZZ3 lecho de gel-IME
O)
!
H1 ? i
3 ~4 5 6 7 8 910 M
VELOCIDAD LINEAL (cm/h)
Fig. 49-B. Efecto de la velocidad lineal en PBCR .
m = 4 mg Enzacryl-AA-IME; Q = 6 ml/h
Ensayos en reactores con dimensiones va
riables (Fig. 49).
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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taron la acitividad del IME. Asi' pues, respecto a la productividad del reactor,
resultó más ventajoso utilizar un reactor PBCR con una altura mucho mayor
que el diámetro, aunque dichas columnas tienen el inconveniente de que requie
ren altas presiones para mantener el flujo del fluido de alimentación.
En general, el aumento de Q proporcionó condiciones que fa-
favorecieron a una mayor capacidad de reacción del reactor y por lo tanto una
mayor cantidad de producto formado en un determinado tiempo, sin embargo
el volumen de sustrato procesado fué mucho mayor y el producto formado que
dó con menor concentración de L-dopa. En la Tabla 14 se dan los resultados
experimentales obtenidos en el efecto de Q sobre el comportamiento del IME
en PBCR. Se observó que efectivamente, la actividad inicial del reactor (Actpl
aumentó con Q, pero por otro lado, disminuyó la estabilidad a la reacción, lo
que pudo apreciarse por los valores de t-|/_ que disminuyeron de 13,5 a 5 ho
ras al aumentar Q de 2,9 a 70 ml/h; sin embargo el aumento de la Actp fué
suficiente para compensar sobradamente la pérdida de actividad ocasionada, con
lo que la producción finalmente obtenida en 15 horas de funcionamiento con
tinuo (Pr-j-) fué 4 veces superior con Q 70 ml/h que a 2,9 ml/h, pero con el
inconveniento de que a valores altos de Q el producto obtenido se recogió en
un volumen mayor y por lo tanto con bajo factor de conversión medio (X=
L-dopa formada/L-tirosina inicial), según puede apreciarse en la misma Tabla 14.
Que los valores de t-|/£ disminuyeran al aumentar Q podría
atribuirse a:
a) Mayores efectos mecánicos sobre la enzima, dado que al aumentar Q , aumen
ta la velocidad lineal del fluido con la mayor probabilidad de inactivación por
turbulancia, arrastre de subunidades, eliminación de cobre, etc.
b) Más inactivación por un mayor uso, dado que al aumentar Q aumenta la
Actp , favoreciendo la posibilidad de las reacciones secundarias que parten del
intermediarios del ciclo catalítico, según el mecanismo de inactivación que se ha
descrito anteriormente.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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Tabla 14
Efecto de la velocidad de flujo (Q), sobre el comportamiento del IME en PBCR
m = 4 mg Enzacryl-AA-IME de 45 U/mg. Columna de 3 mm de diámetro.
Q
(ml/h)
Acto «o
(mU/mg gel)
l1/2
( h )
PrT en 15 h. X
(mg dopa/mg gel) ' ' ° '
2,9
5,0
13,2
70,0
7,2
9,2
17,6
46,7
13,5
10,0
8,5
5,0
0,68
0,98
1,6
2,6
6,2
5,2
3,2
1,0
6.6. COMPARACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON OTROS IN
TENTOS DE ESTABILIZACIÓN DE TIROSINASA POR INMOVILIZA
CIÓN.
Al comparar lor resultados obtenidos con otros intentos ante
riores de estabilizar la actividad de tirosinasas, cabe destacar que se ha consegui
do mayor estabilidad de la enzima al almacenamiento y a su utilización conti
nuada, acompañado de mayores rendimientos de inmovilización.
Asi' Wykes et al. (1971) inmovilizó tirosinasa de champiñón
sobre DEAE-celulosa activada con 2,4-dicloro-6-amino-S-triazina, a fin de estabili
zar la actividad tirosina hidroxilasa, que midió por la formación de L-dopa en
presencia de ascorbato. El derivado inmovilizado que obtuvo perdió el 20 % de
actividad después de un di'a de almacenamiento a 15 °C. En cuanto a la estabi
lidad a la actuación sólo menciona que en 24 horas en un reactor de flujo, ha-
bi'a perdido el 75 % de la actividad trabajando a baja temperatura (15 °C) y
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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con sustrato L-tirosina a concentración por debajo de la saturación (1,6 mM),
condiciones en las cuales la estabilidad lograda se hizo a consta de infrautilizar
la actividad de la enzima; además no menciona los rendimientos de inmoviliza
ción alcanzados. Por otro lado, el trabajo de estos autores representa la prime
ra sugerencia de la aplicación de la tirosinasa inmovilizada a la si'ntesis de L-do
pa.
El otro intento significativo es el de Letts y Chase (1974)
que inmovilizaron tirosinasa de champiñón por atrapamiento en membranas. De
los resultados que publicaron puede deducirse que la oclusión de la enzima en
las membranas de colágeno, se consiguó con una eficacia de coplamiento del
12,4 % lo que condujo rendimientos de inmovilización muy bajos, de 0,7 a
3,1 % según se ensayase en reactor de flujo ó de baño. La estabilidad lograda
aumentó respecto a la enzima soluble, Dero sólo hasta valores de t-¡/2 de unas
2-3 horas; la modificación por entrecruzamiento con adipimidato aumento los
tiempos de semiinactivación a 3-4 horas, y con gíutaraldehido a unas 8-10 horas,
pero en este caso con una pérdida de actividad por la modificación del 70 % .
Asi' la estabilización lograda de la tirosinasa no logró compensar los bajos rendi
mientos de inmovilización, de cara -a su utilización para la producción de L-dopa.
Schiller et al. (1976) y Schiller y Liu (1978), al inmovilizar
tirosinasa de champiñón por atrapamiento en gel de poliacrilamida para usos ana
líticos, obtuvieron un derivado IME que perdi'a el 53 % de la actividad en 19
días de almacenamiento, y del que no especifican eficacia de acoplamiento ni
el rendimiento de inmovilización alcanzado. No estudiaron la estabilidad al uso
continuo, pero perdió el 40 % de la actividad después de utilizarse en 4 en
sayos repetidos discontinuos de 15 minutos cada uno.
Madhosing y Sundberd (1974) mencionan la inmovilización de
tirosinasa sobre agarosa activada con BrCN, para su utilización como soporte de
cromatografía de afinidad para detectar proteínas inhibidoras de tirosinasa en
champiñón, pero no mencionan la actividad ni la estabilidad del derivado de t i -
rosina-agarosa obtenido.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980
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En nuestro caso, habiendo obtenido con tirosinasa de epider
mis de rana, derivados inmovilizados con altos rendimientos de inmovilización,
de hasta 90 % , que implica un alto aprovechamiento de la actividad del IME
respecto a la del SE en reactores de baño, y una estabilidad que proporciona
valores de t-|/_ próximos a 20 horas en reactores de flujo, podemos considerar
que se ha dado un paso adelante en las posibilidades de aplicación de tirosinasa
inmovilizada a procesos industriales y a usos anah'ticos.
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7. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES DE TIROSINASA EN
GELES DE NYLON MODIFICADO.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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7. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES DE TIROSINASA EN GELES DE
NYLON MODIFICADO.
Tirosinasa purificada y activada con tripsina-sepharosa, se in
movilizó sobre geles de nylon modificado aplicando los métodos descritos ante
riormente (Cap. 3). De la comparación de los rendimientos de inmovilización ob
tenidos y del comportamiento de los derivados IME en reactores de baño y de
columna, se seleccionaron aquellos que condujeron a mejores resultados; de éstos,
se estudiaron algunas propiedades caracten'sticas, como perfil pH-actividad, cinéti
ca, estabilidad al almacenamiento, efecto de la cantidad de protei'na, etc.. Todo
ello con vistas a las aplicaciones que se describen en los Capi'tulos 8 a 10.
7.1. RENDIMIENTOS DE INMOVILIZACIÓN.
Para estudiar los rendimientos de inmovilización, se trató ca
da derivado modificado de nylon con una determinada cantidad de disolución
de enzima, y se analizó el comportamiento frente a la inmovilización con la mis
ma sistemática utilizada para el estudio del Enzacryl-AA-IME.
Se observó que, en general, el rendimiento de protema unida
al gel fué menor que el de actividad manifestada por el gel-IME (Tabla 15). Es
te hecho determinó que la actividad específica del IME respecto a protema au
mentara respecto a la de la enzima soluble en un factor que vino dado por el
valor de la relación ' , ¡ n m / rD ro t * ' ° c ' u e ^u e esPec¡a 'mente notorio en el deriva
do NB-glut-IME que manifestó el 110 °/o de la actividad de la enzima soluble,
mientras que sólo se unió el 35 % de la protema nativa. Esto significó que la
unión de la enzima al soporte produjo una activación de ésta, de forma semejan
te a lo observado anteriormente con Enzacryl-AA.
El derivado NPAA-IME se obtuvo por las mismas reacciones
de acoplamiento que para el Enzacryl-AA-IME y proporciona igualmente un mi-
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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Tabla 15
Rendimientos de inmovilización en geles de nylon-6 modificado.
Disolución de enzima utilizada: 0,181 U/ml; act. esp. 4,89 U/mg de protei'na.
Cantidad de enzima tratada: SEj/m = 10 U/g de gel
derivado
gel-IME
NH-IME
NAQA-IME
NPI-acético-IME
NPI-IME
NPAA-IME
NB-glut-IME
NB-nitroso-IME
A c t | M E
(U/g)
6,6
7,6
3,7
3,3
9,3
11,0
5,0
rprot
0,33
0,54
- ( * )
- ( * )
0,76
0,35
0,43
Efic.
acopl.
0,85
1,60
0,43
0,44
0,99
1,42
1,56
rinm
0,66
0,76
0,37
0,33
0,93
1,10
0,50
r inm/rp r o t
2,00
1,41
—
—
1,22
3,14
1,16
(*) Los reactivos de acoplamiento interfieren la medida de protei'na en la disolución residual.
croambiente eléctricamente neutro; de hecho, al igual que en Enzacryl-AA se ob
tuvieron altos valores de r ¡ n m y la sobreactivación producida por la inmoviliza
ción pudo interpretarse también por un desplegamiento de la estructura favoreci
do por la unión de residuos de tirosina al soporte.
En el caso de NB-glut-IME, el soporte también aporta un mi-
croambiente neutro, a diferencia de los otros derivados activados glutaraldehido
que proporcionan carga negativa (NH-IME) ó positiva (NAQA-IME). Además el
NB-glut-IME posee en su estructura grupos hidrófobos aromáticos aportados por
la bencidina; estos hechos pueden interpretar los altos valores de r ¡ n m obtenidos.
En este caso, la sobreactivación no puede interpretarse, como se ha realizado con
el Enzacryl-AA y con el NPAA, por un desplegamiento consecuente de la unión
al soporte de residuos que estuvieran ocluidos en la estructura de la enzima. Es
to es asi porque la unión se realizó fundamentalmente a través de residuos de
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I . I
Fig. 50 Esquema por el que la inmovilización a soporte activado con glu-
taraldehido puede provocar un mayor desplegamiento de la confor
mación de la enzima en su unión a residuos de Usina.
——{glutaraldehido; — o residuos de Usina; E enzima; CA centro activo
N matriz del soporte derivado de nylon.
lisina, que están localizados en la superficie de la proteína. Sin embargo, dado
que el nylon es un soporte poco poroso, la unión de la enzima fué superficial
y se puede esperar una modificación de la conformación de la proteína de la
forma expresada en la Fig. 50.
Los bajos rendimientos obtenidos con los derivados de NPI,
pueden ser debidos a que los reactivos de acoplamiento estuvieron en contacto
con la disolución de enzima, provocando un bloqueo de los residuos de aminoá
cidos de la enzima. En los demás casos, la activación del soporte se realizó pre
viamente a la interacción del soporte con la disolución de enzima.
Para la preparación de NH-IME, NB-glut-IME y NAQA-IME,
la activación del soporte fué por tratamiento con glutaraldehido como reactivo
bifuncional, obteniéndose derivados IME activos con elevados rendimientos; sin
embargo cuando se ha empleado el glutaraldehido como reactivo para entrecru-
zamiento de la enzima con albúmina (Manjón, 1979), la enzima se inactivo ca-
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s¡ por completo. En el mismo sentido se comportó cuando Letts y Chase (1974,
entrecruzaron con glutaraldehido tirosinasa de champiñón que había sido ocluida
en membranas de colágeno; el tratamiento redujo la actividad a una tercera par
te.
Los menores r ¡ n m obtenidos en la unión de la enzima sobre
NB activado con nitroso que en la obtención de NB-glut-IME y que NPAA-IME,
puede atribuirse a la carga neta positiva que proporcionó el soporte al microam-
biente de la enzima.
7.2. COMPORTAMIENTO DE LOS GELES-NYLON-IME A TIEMPOS LARGOS
DE REACCIÓN.
Se estudió el comportamiento de los geles-IME tanto en STR
como en PBCR, para seleccionar el sistema de inmovilización que era más idó
neo para su utilización a tiempos largos.
Cuando en reactores STR se ensayaron para producción de
L-dopa con las mismas cantidades de gel-IME por unidad de volumen de sustrato
(q — 1 mg/ml), se observó (Fig. 51) que a lo largo del tiempo, la reacción se
detuvo llegando a unas concentraciones finales de L-dopa que fueron máximas
en los casos de NPAA-IME, NB-glut-IME y mínimas para NB-nitroso-IME y para
los derivados de NPI. Esto era esperable en función de los rendimientos de in
movilización y actividad mostrada por cada uno de los derivados.
Al determinar la productividad en STR de los geles-IME al
cabo de 6 horas de utilización con las mismas unidades de actividad inicial por
volumen de sustrato procesado (p = 4 mU/ml), las diferencias de comportamiento
fueron debidas a las diferencias en la estabilidad con el uso de los distintos de
rivados. Así las mayores concentraciones de L-dopa final se obtuvieron con NB-—
-glut-IME, NPAA-IME y NH-IME (Tabla 16), Así pues, éstos fueron los derivados
que en reactor STR dieron mayor estabilidad y que manifestaron mayor activi
dad, con lo cual la producción de L-dopa por mg de gel fué notoriamente supe-
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0,8
0,6
0,4
0,2 l i i i
_ - -^ NB^kit-IME
t N H I H F
«NPI IME
- * NPI acéticolME
i
20 40 60 900 T I E M P O ( min )
Fig. 51 . Comportamiento de los geles-nylon-IME en STR.
q = 1 mg gel/ml de sustrato.
Tabla 16
Productividad de los geles-nylon-IME en STR
p = 4 U de IME/litro de sustrato; t-|- = 6 horas
GEL- IME
gel-IME
NB-glut-IME
NPAA-IME
NH-IME
NPI-acético-IME
NPI-IME
NB-nitroso-IME
NAQA-IME
L-DOPA
(mM)
0,41
0,39
0,37
0,32
0,31
0,28
0,22
Producción en
mo)/U de
102
98
92
79
77
71
56
IME
6 horas
mol/mg gel
1,02
0,82
0,55
0,27
0,23
0,36
0,38
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rior a los restantes de la serie; dado que en la inmovilización se habi'a aplicado
en todos los casos la misma cantidad de enzima soluble, son también éstos deri
vados los que permitieron un mayor aprovechamiento en la utilización de la en
zima.
El comportamiento en reactor PBCR de los distintos deriva
dos se expresa en los datos de la Tabla 17. A diferencia de lo obtenido en STR,
el NPAA-IME dio en PBCR una menor actividad que los demás derivados, lo que
pudo ser debido a que, por sus características físicas mostró mayor empaqueta
miento con mayores problemas difusionales. La mayor actividad la mostraron los
derivados NB-glut-IME y NH-IME, que a su vez fueron los más estables a la re
acción dando mayores valores de t^/~ (11 y 8,5 horas, respectivamente). Por e-
llo fueron los que condujeron a una mayor producción de L-dopa después de
15 horas de funcionamiento. El hecho de que el NB-glut-IME sea más estable
que los otros dos derivados acoplados también con glutaraldehido((NH-IME y
NAQA-IME), puede interpretarse en relación con que en el NB-glut-IME el so-
Tabla 17
Actividad, estabilidad (t- j /J y productividad de los geles-nylon-IME en PBCR
m = 10 mg gel-IME; Q = 5 ml/h.
gei-IME
NB-glut-IME
NAQA-IME
NH-IME
NB-nitroso-IME
NPAA-IME
*1/2 ( h )
11.0
7,0
8,5
3,5
6,5
A c t R o
(U/g gel)
2,17
1,97
2,04
1,90
1,43
Producción en 12 horas
(m mol dopa/g gel )
1,15
0,75
0,83
0,61
0,57
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porte es neutro, mientras que en el NH-IME y en el NAQA-IME los soportes a-
portan cargas negativas y positivas, respectivamente. El NB-nitroso-IME dio baja
producción, debido a su rápida inactivación (t-|/« 3,5 h.), a pesar de dar alta
actividad inicial en el PBCR.
Como resumen, los geles que se consideraron de mejor com
portamiento fueron: 1) el NB-glut-IME, que tanto en STR como en PBCR dio
alta estabilidad, actividad y productividad. 2) el NH-IME que dando un nivel me
medio en su comportamiento en ambos reactores, ofreció la ventaja de que su
preparación es la menos laboriosa. 3) el NPAA-IME dio buenos resultados en
STR, pero no en PBCR, lo que junto con el hecho de que su preparación es
muy laboriosa, limitan lias posibilidades de su utilización.
7.3. EFECTO DE LA CANTIDAD DE PROTEINA SOBRE LA INMOVILIZA
CIÓN.
Para estudiar la capacidad de unión de los soportes NB y NH,
para la obtención de los derivados NB-glut-IME y NH-IME, que fueron los selec
cionados para su uso posterior, se trataron con cantidades crecientes de protei'na
y se midió la actividad manifestada por los geles-IME obtenidos. Se observó que
para el NH-IME se alcanzó antes la saturación del soporte que en el caso de
NB-glut-IME (Fig. 5 2 ) , lo que debe ser debido a la existencia de mayor número
de grupos funcionales en el soporte NB. A cantidades bajas de protema no hay
apenas diferencia de comportamiento entre ambos soportes, dado que están muy
por debajo de las cantidades necesarias para saturarlo.
De estos resultados se deduce que, las cantidades óptimas de
enzima aplicada para conseguir alta actividad en el gel-IME, pero sin pérdida de
rendimiento de inmovilización, son de unas 10 U/g gel para el NH-IME y de
20 U/g gel para el NB-glut-IME, con la preparación de enzima purificada utiliza
da, lo que correspondió a 1,53 y 3,07 mg de protei'na/g gel.
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30 r— • 1
0 I i i i J • •
0 20 40 60
P R O T E I N A ( U d e SE/g gel)
Fig. 52 Efecto de la cantidad de proteína sobre la inmovilización
en NH y NB. Enzima purificada CM/Phe con actividad es
pecífica de 6,5 U/mg de protei'na.
7.4. ESTABILIDAD A L ALMACENAMIENTO.
Para estudiar cómo se comportaban los derivados NH-IME y
NB-glut-IME con el almacenamiento, una porción de gel se guardó en frigorífico
(5 °C) suspendida en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0, y otra se liofilizó y alma
cenó en congelador (—30 °C), y se midió la actividad en pequeñas porciones
tomadas a distintos tiempos. (Fig. 53)
Se observó que, tanto el NH-IME como el NB-glut-IME su
frían una notoria pérdida de actividad por el proceso de liofilización, pero se
mantenía la actividad residual estable al menos durante 60 días. En cambio los
geles suspendidos en tampón fosfato experimentaban una pequeña pérdida de ac
tividad con el tiempo, lo que fué algo más notorio con el NH-IME que con el
NB-glut-IME. Normalmente, en la realización de los trabajos de esta Memoria,
los preparados de nylon-gel-IME se almacenaron en frigorífico suspendidos en tam
pón fosfato.
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20
T I E M P O ( di» )
NB-glut-IME (Pi.5°C)
40 60
Fig. 53. Estabilidad al almacenamiento del NH-IME y del NB-glut-IME
P¡: suspendido en tampón fosfato a 5°C
L: liofilizado y conservado a —30°C
7.5. PERFILES pH-ACTIVIDAD.
Cuando se comparó la variación de la actividad con el pH
para varios derivados inmovilizados en los soportes de nylon, se observó en ge
neral muy ligeros desplazamientos del pH óptimo hacia pH alcalino, y que au
mentó la estabilidad a los cambios del pH con respecto a la enzima soluble, es
pecialmente con NH-IME y NPAA-IME, en que la actividad sufre sólo pequeñas
variaciones entre pH 6,0 a 8,0. Los ligeros desplazamientos del pH óptimo ob
servados, no son significativos a la hora de interpretar los efectos de la concen
tración de H en la actividad del IME.
De los resultados obtenidos se optó por el pH 7,0, como va
lor óptimo para la utilización de los derivados de gel-nylon-IME, valor igual al
que se veni'a utilizando con la enzima soluble y con la enzima inmovilizada en
Enzacryl-AA y en CPG-AA.
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7.6. PROPIEDADES CINÉTICAS DE LOS GELES-NYLON- IME.
Para el estudio de la propiedades cinéticas de los derivados
inmovilizados se utilizó, al igual que con Enzacryl-AA, el reactor de baño agita
do, en las condiciones del método estándar de medida de actividad (Método: 12.
8.2). Se analizó la cinética para NH-IME, NPAA-IME y NB-glut-IME. Los datos
experimentales de v frente a S, se ajustaron también a una ecuación de primer
orden (Tabla 18). El hecho de que la actividad responda proporcionalmente a la
concentración del sustrato, puede proporcionar algunas ventajas de cara a las a-
plicaciones anah'ticas de estos derivados inmovilizados de enzima en nylon.
Tabla 18
Cinética Cinética de primer orden de los geles-nylon-IME
Ecuación ajustada: v = k-S -f- b; k' = k/q , siendo q = m / V g (mg gel/ml)
k x lO 3 bx lO 3 k' r gel-IME
(min ) (mM/min) (min • g gel • mi)
NH-IME
NPAA-IME
NB-glut-IME
9,6
13,6
16,4
2,1
2,4
3,5
2,4
3,4
4,1
0,996
0,994
0,908
r: coeficiente de correlación.
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8. APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA A LA
SÍNTESIS DE L-DOPA.
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8. APLICACIÓN DE LA TIROSIIMASA INMOVILIZADA A LA SÍNTESIS DE
L-DOPA.
El compuesto L-dihidroxifenilalanina, conocido como L-dopa
ó levodopa es un fármaco que se ha utilizado y sigue empleándose en el tra
tamiento de la enfermedad de Parkinson (Van Woert, 1976). También se ha su
gerido entre otras, su aplicación a determinados cánceres de piel por la toxicidad
selectiva que muestra la L-dopa sobre células de melanoma (Wick et al. 1977 )
y también en procesos de desarrollo infantil (Chakmakyan et al. 1973) y en tra
tamientos de enfermedades afectivas (Costa y Gessa, 1977). Por ello, en la actua
lidad existen varios métodos de si'ntesis qui'mica, bajo diversas patentes comercia
les (Merck Index, 1978). En nuestro caso, hemos estudiado la capacidad de re
actores con tirosinasa inmovilizada para la si'ntesis de L-dopa a partir de L-tiro-
sina, en presencia de ascorbato. El desarrollo de un método bioqui'mico para la
si'ntesis de este fármaco, estuvo encaminada tanto hacia la posibilidad de su apli
cación industrial, como hacia la implantación del sistema inmovilizado en seres
vivos, para la si'ntesis in situ de L-dopa
8.1. CRITERIOS DE COMPARACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE DISTINTOS
REACTORES Y SOPORTES.
La producción de L-dopa se estudió en los reactores de baño
agitado (STR), de baño agitado continuo (CSTR) y de columna de lecho empa
quetado (PBCR), utilizando los derivados de tirosinasa inmovilizada Enzacryl-AA-
-IME, CPG-AA-IME, NB-glut-IME y NH-IME, en cada uno de los anteriores reac
tores. Todos los ensayos para un determinado gel-IME se realizaron con muestras
del mismo, obtenidas a partir de una misma preparación de <ME, e inmovilizada
inmediatamente después de la purificación del extracto de tirosinasa.. Además todas las
experiencias se realizaron dentro de un intervalo de tiempo lo suficientemente cor*
to, como para que de acuerdo con lo expresado para la estabilidad al almacena
miento, no se dieran cambios significativos en las propiedades del gel-IME. Asi'
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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-122-
pues los resultados para un determinado gel-IME se obtuvieron en condiciones
perfectamente comparables. La disolución sustrato que se procesó en todos los
casos estaba constitui'da por: L-tirosina 2,5 mM, L-ascorbato 2,5 mM en tampón
fosfato 0,1 M pH 7,0, sin adición de otros aditivos y a una temperatura de 25°C.
Para poder comparar la producción de L-dopa en los reactores
con geles-IME de distintos soportes, se optó por no expresar la cantidad de gel-
-IME en unidades de masa (g ó mg), sino en unidades estándar de actividad en-
zimática (U), medidas por el método estándar (Método: 12.8.2). Asi', IME repre
sentó la cantidad en U de gel-IME aplicad a a un reactor y que se calculó por
IME = m- A c t , M E (2D
siendo m la masa en gramos de gel-IME utilizada, y Act||y|£ la actividad están
dar del mismo en U/g gel. Por otro lado, dado que los reactores de gel- IME
perdían actividad con el tiempo, la productividad del reactor (producto sintetiza
do por unidad de tiempo) disminuía paralelamente con la actividad manifestada
por el gel -IME en el reactor (Actp), cuya estabilidad a la reacción a largos
tiempos ya se ha analizado (Cap. 6 y7) y se cuantifico según los valores de t - j / -
Por todo ello, para espresar de forma cuantitativa la producción de un reactor
a lo largo de su vida de uso, se empleó el término Producción específica (Pr )
para indicar la cantidad de L-dopa sintetizada en un tiempo t por unidad
estándar de gel-IME y se expresó en mol dopa/U ó g dopa/U, y el de Produc
ción específica total ( Pr j ) para la producción específica en el tiempo total ó
vida de uso del reactor ( ty). Para t j se adoptó en STR el tiempo necesario pa
ra agotar la actividad y en PBCR el tiempo en que la Actp se redujera al 15%
de la Actp . El valor de Pr-j- obtenido para un determinado reactor, en unas
determinadas condiciones, nos indicó el grado de aprovechamiento o el rendimien
to en la utilización del IME para la síntesis de L-dopa, y teniendo encuenta el
rendimiento de inmovilización, se puede calcular la productividad del IME respec
tó a la cantidad de SE utilizada para su preparación. Para expresar el rendimien
to de utilización del sustrato L-tirosina, se empleó el factor de conversión (X)
definido por la fracción de L-tirosina transformada en L-dopa y calculada por:
X = (dopa)/(tir)Q (22)
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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-123-
y el denominado factor de conversión medio (X) como el del volumen de sus
trato total (Vgj ) procesado por el reactor en el tiempo ty .
Todos los datos necesarios para calcular Pr-|- y X de un reac
tor se obtuvieron a partir de la medida experimental de las concentraciones de
L-dopa en las disoluciones producto, de las características conocidas del gel-IME
utilizado y de las condiciones impuestas al reactor. Asi' para calcular la produc
ción específica se empleó la definición operativa:
Pr = dopa t /m • A c t | M E (23)
y la dopa sintetizada en un tiempo t , dopat , se cálculos
En STR por:
dopat = (dopa)t • M • Vg (24)
siendo, (dopa)t la concentración molar de L-dopa en el reactor en el tiempo t;
M el peso molecular de la L-dopa y Vg el volumen de sustrato en el reactor.
En reactores continuos (CSTR y PBCR) por:
n n d°Pat = 2 1 ((d°Pa)f ' Q - Atf j = Q 2 1 ((dopa)f • Atf ) (25)
1 1
siendo: f una fracción individual eluída del reactor y n el número de fracciones
eluídas en el tiempo t; (dopa)f la concentración de L-dopa en la fracción f;
Atf en tiempo empleado en eluir dicha fracción; Q el caudal o flujo volumétri
co, constante a lo largo del proceso.
El factor de conversión en el tiempo t se calculó
en STR por:
X = (dopayí tir )Q (26)
y en reactores continuos por:
X = (dopa)t / (tir )Q (27)
siendo la concentración media de L-dopa obtenida en tiempo t: n
y (dopa)f 1 (28)
(dopa)1
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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-124-
Dado que existi'a una inhibición por el producto, era espera-
ble que la cantidad de gel-IME afectase a la producción, en el sentido de que
una mayor cantidad de gel-IME por unidad de volumen de sustrato procesado,
acumulase mayor concentración de producto, con el correspondiente detrimento
de la actividad manifestada por el IME. Además con una mayor velocidad de
consumo de los sustratos dará condiciones de menor concentraciones de éstos,
especialmente del oxígeno en PBCR. Por todo ello, en el estudio de la produc
ción de un determinado reactor, se empleó como variable definitoria de las con
diciones del reactor el parámetro p que se ha definido anteriormente como las
unidades estándar de gel-IME empleadas por litro de disolución sustrato procesa
do en el tiempo ty . Asi' mismo se indicó anteriormente cómo afectaban las va
riaciones de este parámetro a la actividad y estabilidad del IME en los distintos
reactores (Cap. 6.2).
Para comparar la producción de dos tipos de reactores distin
tos ( p. ej. STR y PBCR) ó dos reactores iguales con distintos derivados IME
(p. ej. Enzacryl-AA-IME y CPG-AA-IME en STR), es necesario que ambos reac
tores están en condiciones que podamos considerar "equivalentes". En nuestro ca
so se consideró que dos reactores estaban en condiciones operativas equivalentes
cuando teni'an el mismo valor del parámetro p, De esta forma, a igualdad de p,
las diferencias observadas en la producción específica, se atribuyeron al efecto
del tipo de reactor ó a los efectos microambientales del tipo de soporte. Para
ello, especialmente al comparar diferentes derivados IME, fué necesario que la
producción se expresase en términos de cantidad de dopa sintetizada por unidad
estándar de IME, tal como se ha definido Pr y Pr-p
El resultado del estudio de un determinado reactor en unas
determinadas condiciones estuvo resumido en los valores de la Producción especí
fica total (Prj) y del factor de conversión medio o final (X) obtenidos. Ambas
magnitudes pueden relacionarse con el valor de p impuesto al reactor, tenien
do en cuenta lo siguiente:
<*epat (dTpa) t - V ST ' M
p r = : = 1 (g dopa/U) (29) IME IME
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y siendo que: X • = (dopa) t / ( t j r ) y que : p = IME/V S T según (18),
se deduce que:
X - ( t i r ) - M PrT = - (30)
-3 y por lo tanto: para ( tir )Q 2,5xlO~J M y M 197 dalton se obtiene:
(31)
Asi' pues el valor de p determina directa y necesariamente
el valor de la razón Pr-p / X, pero los valores concretos de estas magnitudes de
penderán del tipo de reactor y del soporte.
En unos ejes de coordenadas en los que se representen los
valores de P r j en ordenadas, frente a X en abcisas, los puntos del plano que
toman un determinado valor de p, y por lo tanto un determinado valor de la
razón P r j / X , forman lineas rectas para cada valor de p que convergen al cen
tro de coordenadas (isoli'neas de p ó I meas iso-p). Esto permitió hacer represen
taciones en el plano P r j — X como los de las Figs. 55 a 59, en las que cada
punto experimental representa una experiencia con un reactor que produjo la ca
cantidad de L-dopa expresada como P r j en ordenadas, con el factor de conver
sión medio X dado en abcisas, cuando el reactor se sometió a las condiciones
de trabajo que corresponden al valor de p que se expresa por la proximidad
a las i meas iso-p. Estas representaciones con tres variables tuvieron una coheren
cia impuesta por la relación teórica que existi'a entre P r j , X y p, y sirvieron de
comparación de la capacidad de producción de L-dopa de la tirosinasa inmovili
zada en los diferentes soportes y funcionando en los distintos reactores que se
han estudiado, lo que se analizará én las siguientes Secciones de este Capi'tulo
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8.2. PRODUCCIÓN DE L-DOPA EN REACTORES CON ENZACRYL-AA-IME.
EFECTO DEL TIPO DE REACTOR.
8.2.1. PRODUCCIÓN EN REACTORES DE BAÑO AGITADO (STR).
Se ensayaron a microescala reactores STR, utilizando en todos
los casos la misma cantidad de gel-IME (m = 4 mg) de la misma Act||y|£ (45
U/g gel), y con volúmenes variables de sustrato, lo que determinó valores varia
bles de p.
Se observó que la concentración final de L-dopa obtenida, y
por lo tanto X, aumentó con el valor de p, mientras que la producción especí
fica total obtenida (Pty) disminuyó al aumentar p (Fig. 54), lo que fué debi
do a que la capacidad catalítica disminuyó notablemente con el aumento de p
P ( U/1 )
Fig. 54. Variación de la producción (Pr-¡-) y conversión (X) con
las variaciones del parámetro p del rector STR con En-
zacryl-AA-IME.
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Estos datos se representaron en la Fig. 55 bajo la forma de Pr-j- frente a X
en vistas a la comparación con otros reactores. La curva de Producción-Conver
sión indicó que si se pretende un alto rendimiento en la utilización del sustrato,
habrá que utilizar reactores que den alta conversión, lo que puede conseguirse
con altos valores de p; en estas condiciones la Prj es baja y por tanto se obtie
ne un bajo rendimiento en la utilización de la enzima. La elección entre condi
ciones que den un mejor rendimiento en el uso del sustrato o de la enzima, de
penden de la finalidad de la aplicación, y si esta es la síntesis industrial de L-
-dopa, dependerá de los costos correspondientes.
8.2.2. PRODUCCIÓN EN REACTOR CONTINUO DE BAÑO AGITADO (CSTR).
Se empleó un reactor t ipo, con un volumen de reactor V p de
10 mi conteniendo 4 mg de Enzacryl-AA-IME, siendo el V p mucho menor que
el volumen total de sustrato procesado V g j . La concentración de L-dopa en el
eluído del reactor aumentó inicialmente con el tiempo de reacción, hasta alcan
zar un estado estacionario, a partir del cual fué disminuyendo, debido a la pér
dida gradual de actividad del IME (Cap. 6.2).
Al igual que en STR, el aumento de p condujo a obtener
concentraciones mayores de L-dopa en el eluído y por tanto mayor conversión
de producto, disminuyendo la producción específica. Para un mismo valor de p,
los valores de Pr j y X fueron inferiores en CSTR que en STR (Fig. 55). En
este tipo de reactor el efecto inhibidor por el producto L-dopa, fué un factor
limitante de la producción, dado que al estar agitado la concentración de L-db-
pa fué en todo el volumen del reactor y en cada instante, la del producto de
salida, que sólo disminuyó con la pérdida de actividad del gel-IME. En STR, la
concentración de L-dopa sólo fué alta sólo fué alta después de que el reactor
funcionara durante laro tiempo y se hubieran producido grandes cantidades de
L-dopa y en el reactor PBCR se estableció un gradiente a lo largo del reactor.
Por ello, la producción de un CSTR sólo se acercó la la de un STR para con
diciones de muy bajos valores de conversión.
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so Q. O
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P O R C E N T A J E DE C O N V E R S I Ó N
Fig. 55. Curvas de Producción-Conversión ( Prj—X ) de L-dopa en reactores
con Enzacryl-AA-IME.
8.2.3. PRODUCCIÓN EN REACTOR DE COLUMNA EMPAQUETADA (PBCR).
Microcolumnas de 3 mm de diámetro interior, conteniendo
5 mg de Enzacryl-AA-IME de 45 U/g gel, se emplearon como reactores tipo
de PBCR. Reactores con distintos valores de p se consiguieron sometiendo los
reactores a diferentes valores de velocidad de flujo Q. Conocida la existencia
de problemas de suministro de oxigeno (Cap. 6.5.), se estudiaron reactores PBCR
con sustrato saturado de aire y de oxígeno.
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A) PBCR con sustrato saturado de aire
Se observó que para bajos valores de Q y por lo tanto para
altos valores de p, proporcionó mayores concentraciones de L-dopa en elui'do.A-
sf, al igual que en los reactores de baño, aumentó el procentaje de conversión,
pero fué en detrimento de la productividad. Las curva de Pry—X obtenida con
PBCR con disolución saturada de aire (Fig. 55) sugirió la existencia de un valor
h'mite de X y que además resultó muy bajo con respecto a los valores máxi
mos de conversión observados con los otros reactores (menor del 11 % en PB
CR , 70 % en STR y 45 % en CSTR).
Este h'mite de conversión se consideró debida fundamentalmen
te a la deficiencia de oxi'geno a que se sometió el sistema cuando se trabajó a
flujos lentos; el tiempo de residencia del sustrato fué elevado y la reacción ca
talizada consumió casi completamente el oxi'geno disuelto. Para flujos elevados,
valores bajos de p, el oxigeno se convirtió en un factor menos limitante y la ca
cantidad de L-dopa sintetizada fué mayor, pero eluyó del reactor a menor con
centración. Por otro lado, incluso a valores altos de Q la producción fué infe
rior a la observada en los otros reactores en las mismas condiciones, por loque
otros factores limitantes , como problemas difusionales, como consecuencia del
empaquetamiento del gel-IME en la columna influyeron en la obtención de me
nores rendimientos.
B) PBCR con disolución sustrato saturada de O^
Comparando la diferencia de comportamiento al saturar la di
solución de sustrato con O? puro (PQ 1 atm) en lugar de con aire atmosféri
co (PQ 0,21 atm), se observó que para un mismo valor de p dio mayor pro
ducción y conversión (Fig. 55), especialmente en condiciones de valores altos
de p, Asi' pudieron obtenerse factores de conversión de hasta 30 % .
De todas formas, en PBCR la producción fué menor que en
los otros tipos de reactores, por lo que su utilización para síntesis de L-dopa
sólo estan'a justificada cuando lo que se pretenda sea mantener un nivel de con-
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centración de L-dopa en un fluido durante largo tiempo y no una máxima pro
ducción.
En resumen, desde el punto de vista de la producción y si
guiendo el criterio de las curvas Pry—X con respecto al parámetro p, podemos
afirmar que el orden de eficacia de los diferentes tipos de reactores fué el de
STR >CSTR'> PBCR y este último mejor con disolución saturada con O2 que
con aire.
Una discusión más detallada de los factores que limitaron la
producción en los distintos reactores se hará al final del capítulo en comparación
con los resultados obtenidos con CPG-AA-IME. y con los geles-nylon-IME.
8.3. PRODUCCIÓN DE L-DOPA CON CPG-AA-IME. EFECTO DE LA POROSI
DAD DEL SOPORTE.
Como se vio anteriormente (Cap. 6.2), la estabilidad de la t i -
rosinasa en CPG-AA fué algo superior a la observada en Enzacryl-AA-IME en un
factor de 1,4 -1,5 veces, tanto en STR como en PBCR. Por otro lado, la activi
dad del Enzacryl-AA-IME. en reactores PBCR fué muy inferior que en STR, cum
pliéndose que A c t p B C R o = 0 , 2 1 - A c t ^ ^ , mientras que con CPG-AA-IME fué
ActpRpD = 0,72. Act PBQRQ para unas condiciones determinadas de ensayo (p =
2 U/1). Con ello, aunque el CPG-AA-IME retuvo menos actividad que el Enza
cryl-AA-IME en la inmovilización ( Act^pQ.|jv1£ / Act | rn z a c ry|_|ME = 0,55), la
columna empaquetada manifestó 1,8 veces más actividad que con Enzacryl-AA-
-IME. Estas diferencias de comportamiento se interpretaron como debidas funda
mentalmente a la porosidad del CPG-AA, en el cual quedaron minimizadas las
limitaciones difusionales.
Estas propiedades determinaron las diferencias observadas cuan
do se empleó CPG-AA-IME para la síntesis de L-dopa, con respecto al Enzacryl-
AA-IME. En la Fig. 56 se dan las curvas Pry—X obtenidas con los reactores
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STR, CSTR y PBCR con disolución saturada de aire. La diferencia más signifi
cativa respecto al uso de Enzacryl-AA-IME, es que las curvas P r T - X del reactor
de columna se acercan más al comportamiento del reactor de baño. Por ello,
mientras en STR el comportamiento es muy semejante con ambos soportes, en
PBCR resultó más eficaz el empleo de CPG-AA como soporte.
P O R C E N T A J E D E C O N V E R S I Ó N
Fig. 56. Producción de L-dopa en reactores con CPG-AA-IME.
Curvas Pr-y - X.
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8.4. PRODUCCIÓN DE L-DOPA EN REACTORES CON GELES-NYLON- IME.
Los derivados de nylon que habi'an sido seleccionados por su
mejor comportamiento respecto a rendimientos de inmovilización y por la esta
bilidad de la reacción a latgo tiempo (Cap.7), se ensayaron para producción de
L-dopa.
En reactor de baño STR, se estudió la capacidad de síntesis
de L-dopa de los derivados NPAA-IME, NB-glut-IME y NH-IME. Desde el punto
de vista de las curvas de P i y - X se apreció que la capacidad de síntesis fué
del mismo orden que lo observado anteriormente para el Enzacryl-AA-IME y el
CPG-AA-IME (Fig. 57)
1,0 2.0. • 3.0 . •
J L 10 30 50
C O N V E R S I Ó N ( XxlOO)
Fig. 57. Curvas Pr j — X en reactores STR con geles-nylon-IME.
Ensayos con 10 mg gel-IME y Vg variable para dar los
valores de p que se indican.
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En el reactor de columna PBCR no se aplicó el derivado
NPAA-IME, ya que había dado muy baja actividad en este reactor. El deriva
do NB-glut-IME dio en PBCR mayor producción específica que el NH-IME como
consecuencia de la mayor estabilidad a la reacción, especialmente para bajos valo
res de p, ya que para altos valores de p ambos estaban limitados por el sumi
nistro de oxígeno. (Fig. 58).
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2.0
4,0
12 16 20 24
PORCENTAJE DE CONVERSIÓN (Xx 100)
Fig. 58. Curvas P r j - X en reactor PBCR con geles-ny Ion-I ME
Ensayos con 10 mg del-IME y condiciones variables de Q.
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Cuando se comparó las curvas Pr-j- — X para los reactores
STR y PBCR con un mismo gel-IME, por ejemplo NH-IME en la Fig. 59, se
observó que efectivamente en PBCR la productividad fué menor que en STR, co
como consecuencia de las limitaciones que ya se han comentado para este tipo
de reactores. Ahora bien, las citadas curvas, indican que la producción con los
geles-nylon-IME aplicados en PBCR fué del mismo orden que con CPG-AA-IME
y por lo tanto mayor que con Enzacryl-AA-IME; lo que fué especialmente cier
to con NB-glut-IME a bajos valores de p. Esto no era debido a la estabilidad
de la reacción, dado que los geles de nylon-IME dieron menores t - j / j que el En-
zacryl-AA-IME, sino que puede relacionarse con el hecho de que la razón de
Actpg£R / Ac t j j f p fué mayer con íos geles-nylon-IME, lo que debe encontrar ex
explicación en la existencia de menores limitaciones difusionales que en el caso
del Enzacryl-AA-IME.
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• • 4,0
. . • ' 6,0
STR
, , t 20 40 60
PORCENTAJE DE CONVERSIÓN ( X x 100)
Fig. 59. Curvas PrT - X en reactores STR y PBCR con NH-IME.
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Como resumen de este capítulo, en base a la comparación de
las curvas de Producción — Conversión para los reactores estudiados, tanto con
Enzacryl-AA-IME (Fig. 55) como con CPG-AA-IME (Fig. 56) y con los derivados
de geles-nyIon-I ME (Fig 57 a 59), respecto a la producción de L-dopa con reac
tores de tirosinasa inmovilizada podemos decir que:
1) En todos los tipos de reactores y con los diferentes soportes, se aumenta la
producción al disminuir el valor de p, pero en este caso disminuye el factor de
conversión. La elección entre una mayor producción (mayor rendimiento en el
uso del IME) o un mayor factor de conversión (mejor rendimiento de aprove- .
criamiento del sustrato), puede depender de la finalidad a la que se aplique el
reactor.
2) El reactor de baño agitado, no modificó apenas su comportamiento al modi
ficar la porosidad del soporte y resultó más eficaz que los demás tipos de reac
tores. En reactor de columna empaquetada con empaquetada con Enzacryl-AA-IM
-IME dio muy baja productividad que mejoró saturando la disolución sustrato
con C>2- El comportamiento descrito por las curvas de Producción-Conversión se
acercó más a la del baño agitado cuando se utilizó un soporte de mayor tama
ño de poro, como ef CPG-AA, ó que no fuera poroso y por lo tanto la unión
de la enzima al soporte fuera superficial, como en el caso de. los geles-nylon; esto
se debe a que en ambos casos disminuyen las limitaciones difusionales respecto
al caso del Enzacryl-AA.
Los factores que limitaron el rendimiento de los reactores
en los procesos de transferencia de masa fueron principalmente:
a) Acumulación de producto. Dado que existe un efecto de inhibición por la
acumulación de L-dopa, en todos los reactores disminuyó la productividad cuan
do se aplicaron condiciones para dar altos factores de conversión. En CSTR, e's-
te factor fué más determinante que por ejemplo en STR, porque en él la con
centración de L-dopa fué en todo el volumen y en todo el tiempo de uso del
reactor, la del flujo de salida, dando menor producción que en STR, aunque
en el CSTR no había tampoco problemas difusionales ni de suministro de C>2-
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b) Problemas de difusión. Fueron especialmente importantes en PBCR, como con
secuencia del empaquetamiento y la falta de agitación. Los problemas difusiona-
les dismunuyeron su importancia con el uso de CPG-AA y de soportes de nylon
por sus características de porosidad. Para un mismo flujo, cuando se aumentó
la velocidad lineal diaminuyendo la sección de paso del reactor, se mejoró ligera
mente la eficacia del reactor. En STR la producción fué semejante con los dife
rentes soportes ya que no hubo problemas difusionales gracias a la agitación.
c) Suministro de oxígeno. El proceso catalizado por la tirosinasa consume oxíge
no, por lo que en el reactor PBCR sin más oxígeno que el aportado por la pro
pia disolución de sustrato, se tienen serios problemas de rendimientos a pesar de
dar mayores t - j / ? que en los demás tipos de reactores.
d) La inactivación por el uso. La pérdida de actividad del IME a lo largo del
tiempo de funcionamiento del reactor, limitaron la productividad de acuerdo con
lo expuesto anteriormente respecto a la estabilidad de la reacción medida por lo
los valores de t - | / „ .
La acumulación de las limitaciones b y c, hicieron a los reac
tores de lecho empaquetado los menos productivos, aunque su vida de uso fuera
mayor, por lo que su utilización sólo estará justificada para aplicaciones en los
que se pretenda mantener un nivel de L-dopa en un fluido durante largo tiem
po. Así por ejemplo en aplicaciones para investigaciones fisiológicas o terapéuti
cas.
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9. INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA EN TUBOS Y
MEMBRANAS DE NYLON.
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9. INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA EN TUBOS Y MEMBRANAS DE
NYLON.
Los métodos de inmovilización seleccionados en el estudio
con los geles de nylon (NH y NB activados con glutaraldehido) por dar majores
resultados y por la sencillez de su preparación, se aplicaron a otras formas f ísk .
cas de nylon, como tubos capilares y membranas o mallas. Se intentó aplicar
estos derivados inmovilizados con fines analíticos en la realización de un electro
do de enzima para la determinación de sustratos de la enzima.
9.1. INMOVILIZACIÓN EN TUBO DE NYLON
9.1.1. RENDIMIENTO DE INMOVILIZACIÓN.
En la inmovilización de tirosinasa sobre la superficie inteeior
de tubo de nylon, resultó significativo que el rendimiento de inmovilización fue
ra mayor en la preparación del tubo NH-IME que en la del NB-IME (Tabla 19)
contrariamente a lo ocurrido con los geles-IME (Cap.7.1). La explicación de es
te hecho podría atribuirse al propio proceso de preparación del gel-IME y del
tubo-IME que se diferencian entre sí en el tratamiento físico-químico previo a
la modificación química. Así, para la preparación del gel de nylon, éste se sus
pendió en una disolución de ClCa anhidro al 20 % en metanol y luego se pre
cipitó en medio acuoso como partículas finas de gel (Método: 12.2.2). Sin em
bargo el tratamiento en eJ caso de tubo fué más suave puesto que la disolución
de ClCa contenía también agua (18,6 % de ClCa y 18,6 % de H2O en me
tanol), con lo cual no se llegaba a disolver, sino simplemente sufría un efecto
superficial de hinchamiento y de aumentar el carácter amorfo de la superficie.
En esta diferencia de tratamiento es en lo único en que podría basarse las di
ferencias entre gel y tubo.
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Tabla 19
Rendimiento de inmovilización en tubo de nylon
Enzima tratada: SE/m = 10 mU/cm de tubo.
Tubo de 1 mm de diámetro.
Tipo de activado ^ c t I M E
nylon con (mU/cm) r ' n m
NH glutaraldehido 9,6 0,96
NB glutaraldehido 6,0 0,60
9.1.2. PROPIEDADES CINÉTICAS DEL TUBO-IME
Para estudiar el comportamiento cinético, se midió la activi
dad a distintas concentraciones de sustrato por el método estándar (Método:
12.5.2) en el cual el sustrato se recicló a través del tubo-IME a alta velocidad
de flujo para garantizar la ausencia de problemas difusionales y de suministro
de oxi'geno para la reacción.
Al igual que en geles-IME, respondió a una cinética de seu-
doprimer orden (Fig.60). Realizando una representación de Lineweaver-Burk de
las inversas de velocidad y la concentración de sustrato, se obtuvo un valor de
K|y| de 4,7 mM, valor lo suficientemente superior a la concentración de suistra-
tQ?que permite la solubilidad de la tirosina, como para dudar seriamente de
su significación..
El hecho de que la actividad del tubo-IME respondiera de
forma lineal con la concentración de sustrato, sugirió la posibilidad del uso
del sistema tubo-IME para fines analíticos de determinación de sustratos espe
cíficos de la enzima.
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6
4 . / • /
(mU/cm) j /
2 ¡" / i '
!" •
O * ' ' -J ' ' — O 1 2
L-TIROSINA (mM)
Fig. 60. Cinética de seudoprimer orden del tubo NB-IME.
9.1.3. ESTABILIDAD A L USO CONTINUO E INTERMITENTE DEL TUBO-
-IME. POSIBILIDADES ANALÍTICAS.
Las posibilidades del uso de las enzimas inmovilizadas en tu
bo de nylon para métodos analfticos, ya fueron sugeridas por Hornby et al.
(1973) de cara a análisis automáticos. Sundaram (1977a) hace una revisión de
las enzimas inmovilizadas en tubo de nylon que se han utilizado para análisis
de metabolitos en sistemas bilógicos. Recientemente se han descrito métodos a-
coplados a un analizador automático para la determinación de glucosa en suero
empleando glucosa deshidrogenasa inmovilizada en tubo de nylon (Sundaram et
al., 1979); asi* como creatinina y creatina mediante el uso de creatinasa acopla
da a piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa (Sundaram e Igloi, 1979). Tam
bién se ha aplicado el sistema de tubo-IME para la determinación de urea en la
orina y suero, por medio de un sencillo sistema de acoplamiento del tubo-IME
a una micropipeta de émbolo (Sundaram yJayarama, 1979). Este sistema deno-
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-141-
minado " Impette" por Sundaram (1979), evita el costoso empleo de un anali
zador automático para determinaciones de rutina.
Pensando en estas posibilidades se ha estudiado la estabilidad
del tubo-IME a la reacción para uso continuo a lo largo del tiempo o para u-
so repetitivo con cortos tiempos de reacción.
Cuando se ensayó a largo tiempo se observó que la veloci
dad de inactivación era mayor que la que dio el gel-IME preparado por el mis
mo procedimiento (Fig. 61). Este hecho cabe interpretarse en función de que
la inmovilización en tubo de nylon es más superficial y por lo tanto, la enzi
ma está expuesta a los fenómenos de desnaturalización mecánica más en el tu
bo que en el gel. Esta inactivación limitó enormemente la posibilidad de uti l i
zación del sistema para un análisis continuo de un sustrato de la enzima.
s 0,3 E
< a. 0,2; O O
i
0,1 ¡
0,0 0 5 10 15
T I E M P O ( horas )
Fig. 61 Estabilidad del tubo-NB-IME al uso continuo. Compara
ción con gel-NB-IME. Ensayos con 0,16 U de gel ó tu
bo -IME a Q 5,2 ml/h.
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Se analizó también el efecto de la interacción de pequeñas
muestras de sustrato (1 mi) durante periodos cortos de tiempo (10 min.) y de
forma intermitente sobre la actividad del tubo-IME. Al término de cada ensa
yo el tubo-IME se lavó con disolución de tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 du
rante 5 minutos y se reutilizó en el siguiente ensayo. Se observó suficiente
estabilidad durante al menos 9-10 ensayos, salvo una notable pérdida de activi
dad en el primer ensayo en el tubo-NH-IME (Fig. 62). Esta pérdida de activi
dad en el primer ensayo puede ser debida a la eliminación de enzima que no
estuviese unida covalentemente al soporte. La posibilidad de aplicación de la
tirosinasa inmovilizada entubo de nylon dependió de la obtención de un siste
ma idóneo de almacenamiento, ya que después de almacenarlo durante cinco
di'as en tampón fosfato en nevera a 5 °C, no sólo habi'a perdido más del 50
% de actividad, sino que la estabilidad del I ME al uso intermitente decayó
notablemente.
—m. I-i 1 1 1 • I
2 4 « S 10
NUMERO DE ENSAYOS
Fig. 62. Estabilidad del tubo-IME al uso intermitente.Los ensayos
de actividad se realizaron al di'a siguiente de su prepara
ción según método estándar (12.8.2).
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9.2. INMOVILIZACIÓN EN MEMBRANAS DE NYLON.
Se inmovilizó tirosinasa sobre membranas de nylon modifi
cadas como NB y NH activadas con glutaraldehido, con el f in de obtener mem
branas sensibles a los sustratos específicos de la tirosinasa para aplicaciones
analíticas.
9.2.1. RENDIMIENTO DE INMOVILIZACIÓN EN FUNCIÓN DE LA CANTI
DAD DE PROTEINA.
En experimentos en los que se aplicó hasta 65 mU de en
zima purificada, no se logró saturar toda la capacidad de unión del soporte.
La actividad manifestada por las membranas-IME obtenidas fué aproximadamen
te proporcional a la cantidad de protema ¡nicialmente presente en la disolución
de inmovilización (Fig. 63). Los rendimientos de inmovilización que pueden de-
20 40 60
PROTEINA TRATADA ( mU/ cm2 )
Fig. 63. Efecto de la cantidad de proteína sobre la actividad mani
festada por las membranas-IME.
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berse a la menor porosidad, rugosidad y carácter amorfo del material que constituye el
tejido o malla de las membranas de nylon, en comparación con el del gel de nylon, lo que
se reflejaría en una menor protección de la estructura de la enzima inmovilizada.
En el Capítulo siguiente se analizará la aplicación de estas
membranas de nylon con tirosinasa inmovilizada para la determinación analítica de sus
sustratos por medio de un electrodo de enzima.
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10. APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA EN MEM
BRANA DE NYLON A UN ELECTRODO DE ENZIMA.
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10. APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA EN MEMBRANA
DE NYLON A UN ELECTRODO DE ENZIMA.
Una de las aplicaciones analíticas de las enzimas inmoviliza
das son los electrodos de enzima. Un electrodo de enzima- se define básicamen
te como la unión de una enzima y un sistema electroquímico. La enzima in
movilizada en un soporte insoluble en agua se acopla a un electrodo selectivo
de iones que puede medir la desaparición de un sustrato ó el aumento de la
concentración de uno de los productos de la reacción catalizada por la enzima.
La sustancia a medir difunde en la capa de la enzima del electrodo, producien
do o consumiendo una sustancia electroactiva, la cual se detecta por el elec
trodo. El potencial o la corriente producida es una función de la concentración
de la sustancia detectada.
Updike y Hicks (1967) fueron los primeros en" emplear un
electrodo con glucosa oxidasa inmovilizada en gel de poliacrilamida y fijada
sobre un electrodo de oxígeno. A partir de entonces se han desarrollado dife
rentes electrodos de enzima para la detección de sustratos y metabolitos (Guil-
bault y Lubrano, 1973, 1974a, 1974b; Clark, 1972; Clark y Clark, 1973), ba
sados fundamentalmente en métodos amperométricos.
En la bibliografía se ha sugerido el uso de tirosinasa para
la determinación analítica de L-t¡rosina en muestras fisiológicas de suero y ori
na. Así Kumar y Christian (1976) mencionan el empleo de tirosinasa soluble
de champiñón para la determinación de L-tirosina, basado en la velocidad de
consumo de oxígeno midiendo éste con un electrodo de Clark. Schiller y Liu
(1976) utilizaron la tirosinasa inmovilizada en gel de poliacrilamida para la de
tección de fenoles y compuestos relacionados, en efluyentes industriales y a-
guas residuales mediante medidas espectrofotométricas de la velocidad de reac
ción, y más tarde Schiller et al. (1978) describieron el empleo del mismo sis
tema, acoplado a un electrodo de platino para la medida potenciométrica fren
te a un electrodo de calomelanos como referencia. Aunque el método fué muy
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Ar
Cat.
El
Fig. 65. Detalle del electrodo de enzima. An, conexión al ánodo de Ag. Cat, conexión al cátodo de Pt. BE, bloque del electrodo. M-PTFE, membrana de teflóm. M-NY-IME, membrana de nylon con enzima inmovilizada. Ar, arandela de goma. El, electrolito.
Fig. 66. Esquema general del electrodo de enzima. E, electrodo de oxigeno. S, disolución de sustrato. BM, barra magnética. AM, agitador magnético. T, fluido de termostatización. UE, unidad electrónica. R, registrador.
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sensible, la enzima asi' inmovilizada fué muy inestable al uso y al almacena -
miento y no permitía el uso repetitivo del electrodo de enzima.
10.1. DISEÑO DE UN ELECTRODO DE TIROSINASA.
Se diseñó y construyó un electrodo de enzima basado en
tirosinasa inmovilizada por unión covalente a las membranas de nylon modifi
cadas como NB y activadas con glutaraldehido. La membrana de NB-IME se
acopló posteriormente a un electrodo de Clark, el cual es sensible a las con
centraciones de oxígeno. La reacción enzimática de la tirosinasa lleva consigo
un consumo de oxi'geno, por lo que era de esperar una respuesta del sistema
al interaccionar con los sustratos especi'ficos de la enzima.
El esquema del montaje del electrodo de enzima diseñado
se describe en las Figs. 65 y 66.
10.2. RESPUESTA TÍPICA DEL ELECTRODO DE ENZIMA Y CRITERIOS
DE MEDIDA.
En la Fig. 67 se muestra la respuesta característica que dio
el electrodo de enzima en su interacción con una disolución de sustrato. Para
cuantificar esta respuesta se adoptaron los siguientes criterios de medida de la
actividad:
A) Pendiente máxima. Representa el valor máximo de velocidad de consumo
de oxígeno a lo largo de la duración del ensayo. Esto viene a coincidir con
la velocidad inicial, una vez que se ha superado un corto periodo de retardo,
el cual en la mayor parte de los casos no era detectable.
B) Porcentaje de oxígeno consumido a un tiempo fijo, por ejemplo 36 D 60
segundos. La medida por este método pudo hacerse con más precisión que en
el caso anterior.
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100
* - 80 O Q
| 60 co Z O Ü 40 O
z LU
O 20 >< O
o
_ » ( O j l «n i
• t-1 •*<
O] ipimniHg i l - M m
20
z LU C?
60 >< O
80
100 0 1 2 3
T I E M P O ( min. )
Fig. 67. Respuesta del electrodo de enzima con el tiempo.
Criterios de medida. (Ver texto).
C) Porcentaje de oxígeno consumido a largo tiempo, una vez alcanzado el es
tado estacionario. Este criterio, en principio, parece el más adecuado, pero tie
ne el inconveniente de una mayor duración del ensayo, lo que implica una
mayor fatiga del electrodo.
10.3. EFECTO DE LA AGITACIÓN, DE LA PRESENCIA DE ASCORBATO
Y DEL TIPO DE SUSTRATO SOBRE LA RESPUESTA DEL ELECTRO
DO.
Para comprobar en qué grado influían los fenómenos de
transferencia de masa con limitaciones difusionales sobre la respuesta del elec
trodo, se comparó la diferencia de respuesta que dio el electrodo en ensayos,
realizados en iguales condiciones, pero unos con agitación magnética de la di
solución y otros sin ella. La agitación dio respuestas con menor velocidad ini
cial y menor consumo de oxígeno para alcanzar el estado estacionario ( Fig.
68). Este hecho sugirió la presencia de fenómenos de difusión externa en la
actividad del electrodo. Respecto a la presencia de ascorbato, tanto al utilizar
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Fig. 68. Efecto de la agitación, de la presencia de ascorbato y del
tipo de sustrato sobre la respuesta del electrodo de enzima.
Sustrato 1 mM, ascorbato 2,5 mM
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L-tirosina como L-dopa, la respuesta fué más intensa respecto a la velocidad
lineal y al oxi'geno consumido para alcanzar el estado estacionario. Este hecho
era esperable dado que el ascorbato es a su vez oxidado por el sistema de re
acciones que se dan en presencia de tirosinasa (Cap. 4.5). También se observó
que a igualdad de concentraciones de los dos sustratos empleados, la respuesta
fué notoriamente más intensa con L-dopa que con L-tirosina. Esto fué cohe
rente con el hecho de que la actividad dopa oxidasa sea mayor que la acivi-
dad tirosina hidroxilasa.
Dadas estas diferencias de comportamiento, a la hora de es
tudiar las propiedades analíticas del electrodo pareci'a conveniente analizar cada
una de estas condiciones de ensayo.
10.4. EFECTO DEL VOLUMEN Y DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRA
TO SOBRE LA RESPUESTA DEL ELECTRODO DE ENZIMA.
Si la velocidad de difusión de oxígeno a la membrana fue
ra mucho mayor que la velocidad de la reacción enzimática, el oxígeno esta
ría en equilibrio de difusión en el exterior e interior de la membrana, en cu
yo caso la respuesta del electrodo respondería a las variaciones de concentra
ción de oxígeno de la disolución. Si esto fuera así, dos ensayos realizados con
la misma membrana y en las mismas condiciones consumirían la misma canti
dad de oxígeno por unidad de tiempo; si en uno de ellos se emplease un vo
lumen mayor de muestra, el consumo de oxígeno sería menor en términos de
concentración, y por lo tanto la intensidad de respuesta del electrodo también
sería menor. Sin embargo, se observó que al aumentar el volumen del medio
de 1 a 4 mi, no se producía una disminución de la señal registrada, tanto res
pecto a velocidad inicial como al oxígeno consumido a un determinado tiempo
Esto significó que los equilibrios de difusión son más lentos que la velocidad
de reacción y que por lo tanto se está midiendo solamente la concentración
local de oxígeno en las inmediaciones de la membrana, que son las inmedia
ciones del electrodo.
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Por otro lado, al variar la concentración del sustrato la res
puesta del electrodo varió proporcionalmente (Fig. 69). Esto sugirió que verda
deramente podía aplicarse el sistema para la determinación de L-tirosina y L-
-dopa con fines analíticos, dado que era propiamente un electrodo que respon
día a la concentración y es específico para los sustratos propios de la enzima.
La validez como sistema analítico dependerá de la precisión, exactitud, sensibi
lidad, fatiga, etc., características que se analizarán a continuación.
ESCALA DE TIEMPO ( " 1 min.
< )
Fig. 69. Variación de la respuesta del electrodo de tirosinasa con la concen
tración de sustrato. L-tirosina a la concentración indicada en presen
cia de ascorbato 2,5 mM. El origen de cada curva representa el tiem
po inicial para cada ensayo.
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10.5. EFECTO DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA MEMBRANA SO
BRE LA RESPUESTA DEL ELECTRODO DE ENZIMA.
La respuesta del electrodo aumentó con la actividad enzimá-
tica de la membrana utilizada de forma aproximadamente proporcional con
los distintos criterios de medida (Fig. 70). Esto demostró que, por un lado la
respuesta del electrodo es realmente un fenómeno dependiente de una actividad
enzimática y que por lo tanto es un verdadero electrodo de enzima, y por otro
lado indicó que la sensibilidad del electrodo podía aumentarse empleando mem
branas con más actividad enzimática.
o 9-°
¡ I
6 W 15
ACTIVIDAD MEMBRANA ( mU/cmM
Fig. 70. Efecto de la actividad enzimática sobre la
respuesta del electrodo de tirosinasa.
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10.6. INTERPRETACIÓN DE LA RESPUESTA DEL ELECTRODO.
Es difícil interpretar el mecanismo que se da en un electro
do de enzima debido normalmente a los fenómenos de superficie que se dan
por lo general en los electrodos especi'ficos. Las caracten'sticas de la respuesta
del electrodo indican que son tres los fenómenos que intervienen y que se es
quematizan en la Fig. 71 y que se describen a continuación:
1) Difusión del oxígeno y del sustrato de la disolución a la membrana de en
zima. En la velocidad de este proceso influye la concentración de sustrato en
la disolución. La concentración de oxígeno inicial no afectó a la diferencia de
respuesta en los diferentes ansayos, ya que en todos los casos se empleó diso
luciones saturadas de aire en las mismas condiciones.
2) La reacción en zimática catalizada por la tirosinasa que consiste en la oxi
dación de un sustrato específico de ella. La velocidad de esta reacción depende
de la concentración de sustrato y va acompañada de la correspondiente veloci
dad de consumo de sus inmediaciones, y le seguirá una difusión de los produc
tos de reacción hacia el exterior (disolución de sustrato).
3) Difusión del oxígeno a través de la membrana de teflón del electrodo de
Clark. El oxígeno que difunde es el que se encuentra en las inmediaciones de
la membrana de enzima dando una respuesta polarográfica que es electrónica
mente traducida por el aparato que la registra como porcentaje de concentra
ción de oxígeno respecto a la disolución blanco con que se ajusta el aparato.
La combinación de estos procesos da como consecuencia
una respuesta que depende de la concentración de sustrato que puede explicar
se de la siguiente forma:
La concentración de oxígeno detectada en las inmediaciones
de la membrana depende fundamentalmente de la velocidad de reacción enzi-
mática que lo consume y de los equilibrios de difusión que lo incorporan a
partir de la disolución. Estos equilibrios son más lentos que la reacción enzi-
mática, como se ha confirmado anteriormente. Por lo tanto, ante la presencia
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ÁNODO
CÁTODO
ÁNODO
0 2 + 2 H20 + (4 e )
electrolito (BrK)
I ME • H20
membrana de
nylon IME y
m
-\-—X }2ext
>ext ext
DISOLUCIÓN DE
ENSAYO
Fig. 71. Interpretación de la respuesta del electrodo de enzima.
Las flechas de trazo grueso indican el sentido neto de
flujo. S, sustrato. P, producto de reacción. IME, tirosi-
nasa inmovilizada en la membrana de nylon. ext, en la
disolución externa, m, en las inmediaciones de la enzima
situada en la membrana de nylon. i, intensidad de co
rriente registrada. Potencial dé polarización del electro
do: 0,8 voltios.
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de sustrato, la reacción enzimática disminuirá la concentración de oxígeno en
la membrana a una velocidad inicial que depende de [a concentración del pro
pio sustrato. Conforme la concentración de oxígeno disminuyó con el tiempo,
la velocidad de difusión de éste desde la disolución hacia la membrana aumen
tó. Así, el balance neto fué que la concentración de oxígeno detectada en la
membrana disminuyó a una velocidad cada vez más lenta, hasta alcanzar una
situación de estado estacionario, en que la velocidade de incorporación de
oxígeno por difusión y la de consumo por la reacción enzimática fueran iguales.
Así, la concentración de oxígeno alcanzó un valor final estacionario, cuyo
valor fué menor cuanto mayor fué la concentración de sustrato en la disolu
ción, tal como se observó en la Fig. 69.
10.7. FATIGA DEL ELECTRODO CON EL NUMERO DE ENSAYOS.
Para estudiar las posibilidades analíticas de un electrodo
hay que tener en cuenta la fatiga de éste, es decir, la pérdida de actividad con
su uso. Si la fatiga es muy pequeña, el electrodo puede calibrarse inicialmente
y después utilizarse para hacer determinaciones hasta que la pérdida de activi
dad por el uso sea como máximo del mismo orden que el error admisible del
método. Si la pérdida de actividad en cada ensayo es próxima al error admi
sible, sólo podría utilizarse el electrodo para fines analíticos, si previamente
se estudia la fatiga por el uso y en cada ensayo se le aplica el factor de co
rrección correspondiente.
En nuestro caso se ha analizado la pérdida de actividad con
el número de ensayos utilizando L-tirosina ó L-dopa como sustratos, en presen
cia y ausencia de ascorbato y aplicando los distintos criterios de medida de la
respuesta del electrodo.
Con sustrato L-tirosina, los valores experimentales de activi
dad relativa representados frente al número de ensayos se ajustaron a una rec
ta (ejemplo en Fig. 72). El valor de la pendiente ( m ) de ésta recta, nos
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indicó la pérdida de respuesta por ensayo. Como puede verse en la Tabla 20,
el valor de la pendiente de la recta no varió notablemente al aplicar los dis
tintos criterios de medida ó las condiciones, como la presencia ó ausencia de
ascorbato. Cabe señalar que cuando se empleó como criterio de medida el oxi'-
geno consumido a un tiempo fi jo, en general se obtuvieron coeficientes de co
rrelación superiores a los otros dos criterios de valoración de la respuesta del
electrodo.
A l medir la respuesta del electrodo con sustrato L-dopa, las
curvas obtenidas se ajustaron a una ecuación de segundo grado, obteniéndose
curvas de pérdida de actividad (fatiga), como la representada en la Fig. 73. En
éste caso a diferencia de lo ocurrido con L-tirosina, en ausencia de ascorbato
las pérdidas de respuesta fueron mucho mayores, lo que se puede observar si
se comparan los valores de los coeficientes de primer grado ( —b ) obtenidos
en la Tabla 21. También fueron bastante distintos según el criterio de medida
empleados.
Esta pérdida de respuesta del electrodo debe atribuirse a la
pérdida de actividad de la enzima inmovilizada en la membrana. Por ello, cada
membrana fué utilizada generalmente para 15 ensayos como máximo, y en to
dos los casos el valor obtenido se dividió por la actividad relativa correspon
diente al número de ensayo. Este valor se calculó según las condiciones de tra
bajo con los valores de las Tablas 20 y 21.
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Tabla 20
Fatiga del electrodo por el número de ensayos para sustrato L-tirosina.
Ecuación de la recta ajustada: *x _ b — m x ActQ
Actx, respuesta del electrodo en el ensayo número x.
Act0 , respuesta inicial del electrodo.
Criterio de
medida
A
A
B
B
B
L-tirosina
(mM)
1,0
1.5
1,0
1,5
1,0
ascorbato
(mM)
2,5
2,5
2,5
2,5
—
b
0,94
0,98
0,98
1,06
1,01
m
0,015
0,016
0,017
0,018
0,013
r
0,900
0,737
0,967
0,910
0.895
coeficiente de correlación.
E N S A Y O S
Fig. 72. Fatiga del electrodo de enzima por el uso con sustrato
L-tirosina (1 mM con ascorbato 2,5 mM). Criterio B.
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Tabla 21
Fatiga del electrodo de enzima con el número de ensayos para sustrato L-dopa
Acuación ajustada: A c t x = c — b x H- a x*
Actr
x, número de ensayo. Actx, actividad en el ensayo x, ActQ actividad inicial.
Criterio de L-dopa ascorbato
medida (mM) (mM) a -10
A
A
B (36 seg)
B (36 seg)
B (60 seg)
B (60 seg)
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
1,13
0,93
1,08
1,02
1,01
1,00
0,100
0,035
0,065
0,031
0,060
0,018
41,0
3,9
9,7
-- 1.9
5,2
- 7 , 5
Fig. 73.
Fatiga del electrodo de enzi
ma por el uso con sustrato
L-dopa (2,5 mM con ascorba
to 2,5 mM). Criterio B.
NUMERO DE EXPERIENCIAS
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10.8. DEPENDENCIA DE LA RESPUESTA DEL ELECTRODO CON LA
CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO.
Como ya se ha mencionado anteriormente, la respuesta del
electrodo varió con la concentración de sustrato. Cuantificando la respuesta pa
ra cada uno de los criterios de medida sugeridos, se observó que la respuesta
fué lineal para cada uno de los sustratos en función de la concentración de
éste. Con el criterio basado en la medida del consumo de oxígeno a un tiem
po fi jo, las medidas fueron más precisas, lo que puede observarse en la Tabla
22, si se comparan los valores de los coeficientes de correlación de las curvas
de calibrado, obtenidas en la aplicación de los distinto criterios de medida
utilizados. En las Fig 74 y 75 se muestran dos ejemplos de curvas de calibra
do del electrodo con el criterio de medida a un tiempo f i jo, para los sustra
tos L-tirosina y L-dopa respectivamente.
Tabla 22
Calibrado del electrodo para los distintos criterios de medida de la respuesta.
Ensayos con L-tirosina variable ( 0 -2 ,5 mM) y ascorbato 2,5 mM.
Ecuación ajustada: Act = b + m x
Criterio de b m r
medida
1,19 0,599 0,949
9,40 26,3 0,992
24,2 32,0 0,969
r, coeficiente de correlación.
A) Velocidad inicial
B) Oxi'geno consumido en 36 seg.
C) Oxígeno consumido al alcanzar el estado estacionario
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Fig. 74.
Calibrado del electrodo de
enzima con sustrato L-tiro-
sina. Ensayos con ascorba-
to 2,5 mM. Ecuación ajus
tada:
y = 9 , 0 4 + 27,7 (L-tir)
(r = 0,990)
Fig. 75.
Calibrado del electrodo de
enzima con sustrato L-do-
pa. Ensayos con ascorbato
2,5 mM. Ecuación ajustada:
y . 0,04 + 44,0 (L-dopa)
( r= 0,991)
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La presencia de ascorbato en el medio de medida, condujo
a un consumo de oxigeno mayor que en ausencia del mismo pero que fué de
bido a una mayor respuesta del blanco. Aparentemente, parece más idóneo tra
bajar sin ascorbato, ya que la curva de calibrado convergía asi' al centro de
coordenadas, (Fig. 76). Sin embargo se propone la realización de los ensayos
en presencia de exceso de ascorbato, pues cabe la posibilidad de que en mues
tras biológicas a las que se le aplicase el método contengan ascorbato u otro
agente reductor equivalente, y de no tenerlo en cuenta ¡nterferería en el com
portamiento del electrodo de tirosinasa. Otra razón para utilizar ascorbato fué
que en la interacción con L-dopa, la fatiga del electrodo fué menor en los
ensayos en presencia de ascorbato. Además la precisión de las medidas fué su-
parior con ascorbato, como lo demuestra los mayores coeficientes de correlación
obtenidos
80 -
40 -
o z
x O C 20 c s 3 V) Z O
-
-
-
-
o/
1
o
•
o
. . . 1 —
con ascorbato /
/ o
JO
~s sin ascorbato • j7
i i
o
o
•
i
0,5 1,0 1,5 2,0 2.5
T I R O S I N A I m M I
Fig. 76.
Influencia del ascorbato sobre
la ley de respuesta-concentra
ción del electrodo de enzima.
Ecuación ajustada:
Con ascorbato 5 mM
y = 17,5 + 18,5(L-tirosina) r = 0,993
Sin ascorbato:
y = 0,0 + 17,5(L-tirosina) r = 0,985
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10.9. APLICACIÓN DEL ELECTRODO A LA DETERMINACIÓN DE MUES
TRAS DE L-TIROSINA Y L-DOPA.
En la Tabla 32 se muestra una aplicación del electrodo de
tirosinasa a 4 muestras distintas, 2 de L-tirosina y 2 de L-dopa de concentra
ción conocida. Para cada muestra se empleó una membrana distinta, sobre la
cual se hicieron siete ensayos con patrones para calibrar el electrodo, y otros
siete ensayos para la determinación de la muestra.. De los resultados obtenidos
se ha podido establecer que el electrodo de enzima contrui'do con tirosinasa
inmovilizada en membranas de nylon acopladas a un electrodo de oxigeno, per
mite posibilidades anali'ticas. La sensibilidad del método (0,1 mol en 1 mi de
muestra), no es superior a otros métodos analíticos de fenoles, pero permite
medidas en muy corto tiempo (un ensayo dura un minuto) y con la especifi
cidad propia de la enzima. El inconveniente principal del método, radica en la
fatiga del electrodo por la pérdida de actividad de la enzima. Este inconvenien
te creemos que se podrá superar en un futuro próximo, pues la estabilidad de
la enzima inmovilizada en estos soportes fué superior a la observada por su u-
so en el electrodo. Por ejemplo, los valores de t - j / - de tubo-IME fueron de
5 — 8 horas y en gel-IME de 8—13 horas. Asi' en gel-IME, implica que en 10
horas de uso continuo perdi'a el 50 °/o de actividad, por lo tanto 0,08 % por
minuto, mientras que en las membranas-IME utilizadas en el electrodo tuvieron
pérdidas del 1-2 % por ensayo de 1 minuto. La forma de lavado y tratamien
to del electrodo entre cada ensayo, podn'a ser otra de las causas que alteraron
la estabilidad de la enzima.
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Tabla 23
Aplicación del electrodo de tirosinasa a la determinación de muestras de L-ti-
rosina y L-dopa.
Sustrato
L-tirosina
L-tirosina
L-tiros¡na
L-tirosina
L-dopa
L-dopa
L-dopa
L-dopa
Concentración añadida (mM)
0,50
1,00
1,50
2,00
0,30
0,60
1,00
1,50
Val de
or 7
medio medido ensayos (mM)
0,50
1,01
1,47
1,95
0,29
0,62
0,93
1,55
desviación estándar
± 0,02
± 0,04
± ±
±
± ± ±
0,05
0,05
0,03
0,05
0,05
0,06
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11. CONCLUSIONES.
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11. CONCLUSIONES.
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1. Se han analizado las propiedades generales de la actividad tirosina hidroxi-
lasa de la tirosinasa inmovilizada por unión covalente a soportes modifica
dos de poliacrilamida, de vidrio poroso y de nylon, bajo distintas formas
fi'sicas y reactores. Se ha aplicado a la síntesis bioenzimática de L-dopa
y a la determinación analítica de L-tirosina y L-dopa mediante un electro
do de enzima.
2. En general, la inmovilización produjo derivados de la enzima con una ma
yor actividad específica tirosina hidroxilasa que la enzima soluble, al con
trario de lo que se había obtenido anteriormente con la actividad dopa
oxidasa. Estas diferencias, junto a lo establecido, en base a la extracción
y purificación, de que ambas actividades se manifestaron por la misma
proteína, sugirieron que los centros activos para L-tirosina y L-dopa actúan
en la misma proteína, pero con un comportamiento catalítico independien
te.
3. La protirosinasa se activó parcialmente por la inmovilización, dando aproxi
madamente un 30 °/0 de la actividad de la proenzima soluble activada con
tripsina-sepharosa, y después de un tiempo de interacción con el sustrato
alcanzó el mismo grado de activación que la proenzima inmovilizada trata
da con tripsina. Esta activación se produce como consecuencia de cambios
conformacionales provocados por la unión al soporte.
4. El estudio sistemático del comportamiento de la tirosinasa frente a los dis
tintos métodos de inmovilización ha permitido encontrar sistemas de alta
eficacia de acoplamiento y proporcionando rendimientos de inmovilización
que en algunos casos fueron del orden del 100 % .
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La actividad manifestada por los derivados inmovilizados se vio notablemen
te afectada por las características del tipo de reactor utilizado y de la po
rosidad del soporte. En reactores de columna empaquetada manifestaron en
general menor actividad que la observada en reactores de baño agitado, co
mo consecuencia de las mayores limitaciones difusionales y de suministro
de oxi'geno que se dan en el reactor de columna.
La inmovilización a los soportes estudiados aumentó notablemente la esta
bilidad de la tirosinasa, tanto al almacenamiento como a su utilización du
rante largo tiempo, con respecto a la enzima soluble. La estabilidad depen
dió de la forma de enzima, del tipo de soporte, y muy notablemente del
tipo de reactor y de las condiciones de trabajo de éste. Se obtuvo una ma
yor estabilidad en reactores continuos de columna empaquetada que en los
reactores de baño, llegándose a obtener en algunos casos tiempos de semi-
inactivación próximos a 20 horas, lo que representó una estabilización de
unas 30 veces superior que la actuación de la enzima soluble en presencia
de ascorbato y de unas 250 veces en ausencia de éste. Este aumento de
la estabilidad, junto con lo; altos rendimientos de inmovilización abrieron
el camino para aplicaciones industriales de la tirosinasa inmovilizada.
En general, el tipo de reactor y las condiciones de trabajo aplicadas al
mismo influyeron en el sentido de que las condiciones que favorecieron un
aumento de la actividad manifestada por el derivado inmovilizado, aumenta
ron la producción de L-dopa a lo largo de la vida de uso del reactor, pe
ro disminuyeron la estabilidad del derivado inmovilizado cuando se midió
por los valores de tiempo de semünactivación. Esto demostró que la pro
babilidad de inactivación, dependió no sólo del tiempo de uso, sino que a-
demás, en gran, medida de pendió del número de veces que su centro acti
vo es utilizado en ciclos catalíticos. Esto apoyó la hipótesis de que la re
acción de inactivación parte de un intermediario del ciclo catalítico. Por
otro lado, el aumento de la estabilidad por inmovilización sugirió que el
proceso de inactivación puede implicar cambios conformacionales ó del es-
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tado de agregación y que son parcialmente impedidos por la unión al so
porte sólido.
8. Se han aplicado los derivados de tirosinasa inmovilizada a la si'ntesis de L-
-dopa en los distintos tipos de reactores. Se han analizado los resultados
obtenidos en base a curvas de Producción-Conversión, que permitieron la
comparación de la capacidad de producción de L-dopa, utilizando como
criterio de comparabilidad de los distintos reactores y de los distintos de
rivados inmovilizados, la igualdad de una parámetro p asignado al reactor
y definido por las unidades de actividad estándar utilizadas por litro de di
solución procesada durante la vida de uso del reactor. Para un mismo de
rivado y con reactores con el mismo valor del parámetro p del reactor, se
obtuvo mayor producción en todos los casos, empleando el reactor de ba
ño agitado. La mayor producción en este tipo de reactor, a pesar de que
en él la enzima inmovilizada tenía menos estabilidad al uso, estuvo asocia
da a la mayor actividad manifestada en este tipo de reactor.
9. Un electrodo de enzima construido con tirosinasa inmovilizada en membra
nas de nylon, acopladas a un electrodo de oxígeno tipo Clark, ofrece po
sibilidades analíticas para la determinación de los sustratos de la enzima,
por un método sencillo y rápido, y con la especificidad propia de la enzi
ma, pero con el inconveniente de una fatiga del electrodo por su utiliza
ción,
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12. MÉTODOS EXPERIMENTALES
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12. MÉTODOS EXPERIMENTALES.
12.1. OBTENCIÓN DE ENZIMA.
Como fuente de enzima se empleó epidermis de Rana esca
lenta ridibunda, obtenida de suministradores locales durante los meses de Octu
bre a Marzo, que es el periodo durante el cual manifestaron mayor actividad
(Galindo, 1976).
12.1.1. EXTRACCIÓN DE PROTIROSINASA.
Para la extracción de la tirosinasa bajo la forma de proenzi
ma, se utilizó el mismo procedimiento que ha sido empleado anteriormente en
el Departamento por Cortés (1978) y Manjón (1978).
Las pieles de rana se maceraron con BrK 2 M en cámara
fn'a a 5 °C durante 24 horas, después de lo cual las epidermis se separaron de
la dermis por simple raspado. Las epidermis se lavaron varias veces con agua
destilada hasta eliminación de bromuros; se liofiiizaron en un liofilizador Telstar-
Criolab y se almacenaron a —30°C en ambiente seco hasta su uso.
La extracción de la protirosinasa se llevó a cabo por el si
guiente procedimiento estándar: se homogenizaron 600 mg de epidermis liofiliza-
da con 30 mi de agua bidestilada en un homogenizador Potter con émbolo de
vidrio. El homogenado se centrifugó a 18.000xg durante 30 minutos en centrí
fuga angular Sorvall con cabezal SS-1. El sobrenadante sk decantó y desechó.
El sedimento se volvió a homogenizar con 30 mi de tampón fosfato 0,1 M
pH=7,0, y se centrifugó de nuevo a la misma velocidad, recogiéndose el sobre
nadante como fuente de proenzima. El extracto obtenido por este procedimien-
se etiquetó como extracto estándar H20/P¡, y el obtenido suprimiendo el trata
miento previo con agua, como extracto Pj. Todo el proceso de extracción se
llevó a cabo en cámara fría a 5oC.
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12.1.2. PURIFICACIÓN DE PROTIROSINASA.
La purificación de la protirosinasa se llevó a cabo en dos e-
tapas consecutivas: 1) Interacción por intercambio iónico con CM-Sephadex G-
50 2) Cromatografía de afinidad hidrofóbica con Phenyl-Sepharosa CL-4B. Para
ello se aplicó el siguiente procedimiento:
Se pesaron 0,5 g de CM-Sephadex y se hincharon con agua
destilada durante 1 hora en baño maría; se f i l t ró en una placa de vidrio poro
so (porosidad 4) y se equilibró con tampón fosfato 0,05 M pH 7,0. Cien mi
de extracto de proenzima, obtenido por el método descrito anteriormente, se
diluyeron al doble de volumen con agua destilada, para que la concentración
en tanpón fosfato fuese 0,05 M. A continuación se adicionaron al CM-Sephadex
y se mantuvo la interacción gel-enzima durante 30 minutos con agitación suave,
Al cabo de este tiempo se f i l tró en placa porosa y el fi ltrado se desechó. La
elución de la proenzima se realizó en la misma placa porosa por adición de 10
mi de tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 con suave agitación con varilla de vidrio,
los cuales se succionaron después de 10 minutos por medio de vaci'o. Se repitió
esta operación cuatro veces más, recogiéndose 50 mi de disolución de proenzima
purificada por CM-Sephadex, con rendimiento del 60/o y un factor de purifica
ción de 4-5 veces el extracto original.
Estos 50 mi de extracto de proenzima que habían sido pu
rificados con CM-Sephadex, se adsorbieron en una columna (9 mm $) empaque
tada con 3 mi de Phenyl-Sepharosa, previamente embebidos en tampón fosfato
0,5 M, a una velocidad de flujo de 12 ml/h. Previamente, a la disolución de
proenzima se le añadió la cantidad de fosfato monosódico y disódico sólidos
necesarios para dar una concentración final de 0,5 M. A continuación se lavó
el gel con la proteína adsorbida con 10 mi de tampón fosfato 0,5 M, pH 7,0.
La proenzima se eluyó de la columna con 25 mi de tampón fosfato 0,1 M,
pH 7,0. El rendimiento de esta etapa fué del 8 0 % con un factor de purifica
ción de 2-3. Una muestra de proenzima así purificada, se sometió a caracteri
zación analítica de su pureza por electroforesis en gel de poliacrilamida y se
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etiquetó como protirosinasa purificada CM/Phe.
12.1.3. ACTIVACIÓN DE LA PROTIROSINASA.
Para la conversión de protirosinasa a tirosinasa activa se uti
lizó la activación que provoca la enzima tripsina, según procedimientos descritos
por Iborra et al.(1976). La activación se llevó a cabo, en cada caso, por uno
de los dos métodos siguientes:
a)Activación con tripsina soluble. Este procedimiento se empleó solamente en
la activación de pequeñas cantidades de disolución de proenzima para la medi
ción de su actividad enzimática. Para ello, a 0,1 mi de disolución de proenzima
se añadieron 0,01 mi de disolución de tripsina ( 1 mg/ml) y se incubaron a
37°C durante 5 min.. La enzima se utilizó inmediatamente después.
b)Activación con tripsina inmovilizada. Este método se utilizó cuando fué nece
sario disponer de grandes cantidades de tirosinasa, sin que estuviera contaminada
por la enzima proteolítica. Para conseguir la activación, se inmovilizó previamen
te la tripsina en Sepharosa activada con BrCN, según el procedimiento descrito
por Axen y Ernback (1971). Un gramo de tripsina-Sepharosa, se colocó en una
columna de 9 mm de diámetro, se lavó con tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 y
a través de ella se pasó disolución de proenzima a una velocidad de flujo de
20 ml/h, a temperatura ambiente. Una vez elui'da de la columna, la enzima ac
tiva mostró iguales niveles de actividad que la alcanzada por la activación con
tripsina soluble y pudo conservarse durante 1-2 semanas sin pérdida apreciable
de actividad.
12.1.4. CRITERIO DE HOMOGENEIDAD. ELECTROFORESIS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA A pH 4,3.
Para determinar el grado de purificación de las disoluciones
de tirosinasa y para comprobar la identidad de la proteiha con actividad dopa
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oxidasa con la de actividad tirosina hidroxilasa, se utilizó como criterio la elec
troforésis de disco en geles de poliacrilamida, de tipo catiónica a pH 4,3. Se u-
tilizó para ello el equipo de la firma Buchier Inst.Co. de electroforésis anali'tica
con fuente estabilizada. Se emplearon geles con grados de reticulación de 5%
de bisacrilamida, cuyo límite máximo de separación de proteínas era de unos
500.000 dalton (Shuster, 1971). Los geles separadores de poliacrilamida, de 6
cm de longitud se formaron por copolimerización de acrilamida y bisacrilamida
en presencia de riboflavina y persulfato amónico como catalizadores.
Se procedió a realizar la electroforésis conectando la fuente
de alimentación a los terminales. Se aplicó corriente de 1 mA por tubo duran
te 10 min. y a continuación 2 mA por tubo hasta que el indicador visual lle
gó al extremo inferior ( polo negativo ). Una vez concluida la electroforésis, u-
nos geles se fijaron y tiñeron durante 5 horas con disolución de azul Comassie
R 250 ( 1,25 g en 500 mi de agua conteniendo 227 mi de metanol y 46 mi
de ácido acético). Después los geles se destiñeron electroforéticamente en una
disolución de 50 mi de metanol y 75 mi de ácido acético glacial por litro. Li
na vez desteñidos se conservaron en la misma disolución de destinción y se
procedió a realizar densitogramas por lectura de absorbancia a 685 nm en un
densitómetro Transdyne
Por otro lado y simultáneamente otros geles se tiñeron con
una disolución de L-dopa ( 2 mg/ml) en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0, conte
niendo tripsina (0,1 mg/ml), para visualizar la proteína con actividad dopa oxi-
dasa (Pomerantz, 1963 ; Ferragut, 1980). No se añadió tripsina cuando la mues
tra sometida a electroforésis había sido previamente activada por su paso a tra
vés de la columna de tripsina inmovilizada. También se tiñeron geles con L-t¡-
rosina (2mM), en las mismas condiciones que la tinción con L-dopa, para de
tectar la banda de proteína con actividad tirosina hidroxilasa. Así pues, la com
paración de los geles teñidos con los tres procedimientos indicados permitió i-
dentificar las bandas de proteína con la tinción con azul Comassie y su corres
pondencia con las bandas que poseyeron actividad tirosina hidroxilasa y/o dopa
oxidasa.
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12.2. PREPARACIÓN DE SOPORTES.
12.2.1. ENZACRYL-AA Y CPG-AA.
El Enzacryl-AA, soporte de poliacrilamida, modificado con
grupos reactivos arilamina fué suministrado por Koch-Light Lab. (England), en
estado liofilizado. El soporte CPG-AA es de vidrio de poro controlado, recu
bierto con óxido de circonio y modificado también con grupos funcionales a-
rilamina, preparado por la firma Corning y que fué suministrado por Pierce
Chem. Co. (USA).
12.2.2. PREPARACIÓN DE POLVO DE NYLON.
Para la preparación de los distintos soportes a partir de pol
vo de nylon, se partió de nylon-6 comercial en forma de granza, proporcionado
gentilmente por BASF ESPAÑOLA S.A.. Para la preparación del polvo de ny
lon se utilizó el procedimiento descrito por Hornby y Goldstein (1976). Para
ello , se suspendieron 15 g de nylon-6 comercial en 500 mi de una disolución
de cloruro calcico anhidro al 20% en metanol; se agitó a temperatura ambien
te hasta que se obtuvo una disolución homogénea muy viscosa. La disolución
de nylon se adicionó gota a gota a un gran volumen de agua en fuerte agita
ción. El gel así precipitado se separó por filtración en placa porosa ( porosidad
3). Se lavó y se resuspendió dos veces con agua y por último se volvió a lavar
con etanol y éter, y después se secó con corriente de aire. El polvo seco se
trituró en mortero y se conservó en desecador conteniendo pentóxido de fos
foro.
12.2.3. MODIFICACIÓN DE MEMBRANA Y TUBO DE NYLON.
Para la preparación de membranas se utilizaron mallas de 10
mieras de tamaño de poro ( NY-10 HD Super) suministrada por ZBF (Switzer-
land). El tubo de nylon-6, de 1 mm de diámetro interno, se obtuvo de la fir-
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ma Portex (U.K.), en grado estándar. Para hinchar y hacer amorfa la superficie
de las membranas y del interior de los tubos de nylon, se trataron con una
mezcla de cloruro calcico al 18,6 % y agua al 18,6 % e n metanol, a 40 °C,
durante 30 minutos ( Daka y Laidler, 1978). Se lavó después con agua duran
te 20 minutos. El nylon amorfo obtenido se empleó inmediatamente en los tra
tamientos o modificaciones posteriores.
12.2.4. PREPARACIÓN DE NYLON ALQUILAMINA (NAQA).
Se realizó según el método descrito por Hornby y Goldstein
(1974). Se suspendieron 100 mg de polvo de nylon con 2 0 mi de N,N-dime-
tilmetilendiamina en baño termostatizado a 70 °C durante 12 horas. Se fi l tró
y lavó con agua destilada eb frío ( 5 °C). Se almacenó suspendido en agua a
5 °C.
12.2.5. PREPARACIÓN DE NYLON PARCIALMENTE HIDROLIZADO (NH).
El gel de nylon parcialmente hidrolizado se preparó por el
método descrito por Goldstein et al. (1974b),modificado ligeramente por noso
tros: 3 g de polvo de nylon, obtenido por el método 12.2.2, se suspendieron en
90 mi de CIH 4 M y se dejó agitando durante un di'a en agitador mecáríictr
de vaivén a temperatura ambiente. Al cabo de dicho tiempo, se f i l tró a través
de placa porosa (porosidad 4) y se lavó con agua destilada y sucesivas porcio
nes de etanol y éter. Después se pasó durante 15 minutos aire seco para elimi
nar el éter, y se almacenó en un desecador con pentóxido de fósforo.
En el caso de utilizar membrana de nylon, aproximadamente
unos 80 cm2 de membrana con su superficie amorfa, se introdujeron en un
matraz de 50 mi. Se le añadieron 45 mi de CIH 4 M, sometiéndose a conti
nuación al mismo procedimiento descrito para el gel de nylon, salvo que los
lavados se hicieron por decantación.
Cuándo se empleó tubo de nylon, un metro de tubo con
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su superficie amorfa, se introdujo en un baño a 40 °C, y se le reciclaron, por
medio de una bomba peristáltica, 50 mi de CIH 4 M a 40 °C durante 3 ho
ras y a un flujo de 20 ml/h. La hidrólisis se detuvo por lavado con agua des
tilada, etanol y éter. Se guardó en desecador hasta su utilización.
12.2.6. PREPARACIÓN DE NYLON-BENCIDINA (NB)
NH (200 mg de gel, 50 cm de tubo ó 40 cm2 de membra
na), preparado por el método 12.2.5, se trató durante 4 horas a 10 °C con
50 mi de cloruro de metileno, 50 mi de bencidina y diciclohexilcarbodiimida
al 0,5 % cada una de ellas en cloruro de metileno. Se lavó con 50 mi de
cloruro de metileno, 50 mi de acetona y finalmente con 50 mi de agua desti
lada y se utilizó inmediatamente después de su preparación.(Daka y Laidler,
1978).
12.2.7. PREPARACIÓN DE NYLON POLIISONITRILO (NPI)
Gel de NPI se preparó según el método descrito por Golds-
tein et al. (1974b). En un matraz de 100 mi se suspendió 1 g de NH en 40
mi de isopropanol, se adicionaron 10 mi de acetaldehido y 4 mi de 1,6-diiso-
cianohexano, sintetizado como se describe posteriormente, y se dejó agitando
a temperatura ambiente durante 24 horas. Se f i l tró en placa porosa ( por. 4)
y se lavó en pequeñas porciones con 25 mi de isopropanol, 100 mi de éter
y se secó con aire seco.Para su conservación se guardó en un desecador con
pentóxido de fósforo a 5 °C en la oscuridad.
La si'ntesis de 1,6-diisocianohexano se llevó a cabo según
Goldstein et al. (1974a). Se disolvieron 60 g de 1,5-diaminohexano en 170 mi
de formiato de etilo por agitación sobre baño de hielo. Después de la comple
ta disolución y formación de un precipitado blanco, se le añadieron 50 mi
más de formiato de etilo. El compuesto insoluble formado, N,N-diformil,l,6-dia-
minohexano, se separó por decantación y se secó en rotavapor. El punto de
fusión del sólido fué de 105 °C. A una disolución de 150 g de cloruro de
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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p-tolueno sulfonilo en 300 mi de piridina secada con KOH, se le añadieron 30
g de N,N-diformil,l,6-diaminohexano, en pequeñas porciones y con agitación.
Una vez disuelto este compuesto y que el medio adquiriera un color oscuro,
se siguió agitando durante 2 horas a temperatura ambiente. A l cabo de este
tiempo, se añadieron 250 mi de agua y hielo picado para bajar la temperatura.
El 1,6-diisocianohexano formado, se extrajo con tres porciones de 150 mi de
éter, el extracto etéreo se lavó tres veces con 250 mi de agua, se secó con
sulfato sódico anhidro y el éter se evaporó en evaporador rotatorio Buchi. El
aceite crudo obtenido se destiló a vacío a presión inferior a 0,3 mm Hg y
temperatura de 90 °C. Se guardó en viales cerrados a —30 °C.
12.2.8. PREPARACIÓN DE NYLON POLIARILAMINA (NPAA).
El NPAA se preparó a partir del NPI por el método de
Goldstein et al. (1976). Se suspendieron 0,5 g de NPI en 50 mi de metanol
conteniendo 0,5 g de p,p<J¡aminofen¡lmetano y 0,15 mi de isobutiral. Después
se añadieron 0,5 mi de ácido acético glacial y se dejó durante 24 horas con
agitación a temperatura ambiente. El NPAA obtenido se separó por filtración
en placa porosa y se lavó con metanol y éter en pequeñas porciones, y se se
có durante 15 minutos con aire seco. El NPAA se guardó en un desecador
con pentóxido de fósforo a 5 °C.
12.3. INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA.
12.3.1. INMOVILIZACIÓN A SOPORTES CON GRUPOS ARILAMINA
ACTIVADOS CON ACIDO NITROSO.
Este método de unión se aplicó para la inmovilización de
tirosinasa a los soportes Enzacryl-AA, CPG-AA, NPAA y NB, en forma de gel.
Con Enzacryl-AA también se acopló protirosinasa. El procedimiento que se si-.,
guió para la unión por activación con ácido nitroso, fué, con ligeras modifica
ciones, el especificado por las casas suministradoras para el Enzacryl-AA y el
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descrito por Hornby y Goldstein(1976) para el soporte NPAA.Cuando se emple
aron cantidades de gel menores de 100 mg para inmovilización, el tratamiento
con los distintos reactivos de acoplamiento se realizó por técnica de columna
de 0=0,9 mm, por reciclaje de los reactivos a través de la columna a una velo
cidad de flujo de 30 ml/h. Cuando las cantidades de gel fueron de 100 mg,
activación y acoplamiento se realizaron por técnica de baño con suave agitación
y se eliminaron los reactivos por filtración a vacío en placa de vidrio poroso
(por. 4). Todas las operaciones se realizaron en cámara fn'a a 3-5 °C. El tra
tamiento fué el siguiente: 100 mg de gel se suspendieron en CIH 2M, después
se trataron con una mezcla de 10 mi de CIH 2 M y 4 mi de N0 2 Na al 4 %
durante 1 hora. El derivado del soporte diazotado se lavó con 10 mi de tam
pón fosfato 0,1 M pH 7,0, después de lo cual se trató durante 48 horas con
disolución de proenzima o enzima en el mismo tampón conteniendo, según el
el experimento, de 5 a 10 U de actividad tirosina hidroxilasa, lo que corres
pondía a 1-50 mg de proteína, según el estado de purificación. El derivado
de enzima o proenzima inmovilizada se lavó con tampón fosfato 0,5 M pH
7,0, a temperatura ambiente, después con fosfato 0,1 M pH 7,0 y finalmen
te con agua destilada. Los derivados de enzima inmovilizada se etiquetaron co
mo Enzacryl-AA-IME, CPG-AA-IME, NPAA-IME y NB-nitroso-IME.
12.3.2 INMOVILIZACIÓN A SOPORTES CON GRUPOS ALQUILAMINA Y/O
ARILAMINA ACTIVADOS CON GLUTARALDEHIDO.
Se inmovilizó tirosinasa en los derivados NH, NAQA y NB
por activación con glutaraldehido por el siguiente procedimiento: Se trataron
100 mg de gel ó 40 cm] de membrana con 30 mi de disolución de glutaral
dehido al 12,5 % en tampón borato 0,2 M pH 8,5. La suspensión se dejó
agitando durante 1 hora a temperatura ambiente. Después el gel se f i l t ró en pla
ca porosa y la membrana o el gel se lavaron con tampón fosfato 0.1M pH 7,0
Posteriormente se les adicionó una disolución de enzima purificada CM/Phe
(5-50 mU de enzima por mg de gel o cm2 de membrana). Se dejó agitando
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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suavemente durante 24 horas en cámara fn'a (5°C). El derivado inmovilizado
se separó de la disolución por filtración o decantación y se lavó con tampón
fosfato 0,1M pH 7,0. El gel-IME se almacenó suspendido en tampón fosfato
0,1 M pH 7,0 a 5°C o se liofilizó y almacenó a —30°C, mientras que las
membranas-I ME se almacenaron en el tampón fosfato a 5°C. Para la inmovili
zación sobre tubo de nylon se siguió el mismo procedimiento que con geles,
salvo que el tratamiento con giutaraldehido y enzima se realizó por reciclaje de
de los reactivos a través del tubo a una velocidad de flujo de 20 ml /h; se u-
nieron 5-50 mU de enzima por cm lineal de tubo, y el tubo-IME se almacenó
a 5°C lleno de tampón fosfato 0,1 M pH 7,0. Los derivados obtenidos se de
nominaron como NAQA-IME, NH-IME y NB-glut-IME.
12.3.3. INMOVILIZACIÓN SOBRE NPI ACTIVADO CON ACETALDEHIDO.
Se inmovilizó enzima sobre gel de NPI por acoplamiento de
ambos con acetaldehido en presencia o ausencia de acetato, por el procedimien
to descrito por Hornby y Goldstein (1976).
Para la unión de la proteína en presencia de acetato, se sus
pendieron 100 mg de gel de NPI en 10 mi de una disolución de fosfato sódico
y acetato sódico 0,5 M de pH 7,0; se añadieron 25 mi de disolución de enzi
ma ( 50 mU/mg de gel) y 0,5 mi de acetaldehido y se dejaron agitando duran
te 24 horas, después de lo cual se f i l tró y se lavó con agua destilada. El deri
vado obtenido se etiquetó como NPI-acético-IME y se almacenó suspendido en
agua destilada a 5°C. Todas las operaciones se realizaron en cámara fría (0-5°C)
Para el tratamiento en ausencia de acetato, se suprimió la a-
dición de los 10 mi de disolución: fosfato-acetato y se aumentó el volumen de
acetaldehido a 2 mi. En este caso el derivado se denominó NPI-IME.
Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert
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12.4. DETERMINACIÓN DE PROTEINA.
Para la determinación de proteína se utilizó una modificación
del método de Lowry propuesta por Hartree (1972). El procedimiento fué el
siguiente: A 1 mi de disolución, conteniendo 5-120 g de proteína, se le adi
cionaron 0,9 mi de disolución A, y la disolución resultante se calentó durante
10 minutos en un baño a 50 °C. Posteriormente se enfrió a temperatura am
biente y se añadieron 0,1 mi de disolución B y se agitó. Después de 10 minu
tos a temperatura ambiente se añadieron 3 mi de disolución C, se agitó, se
mantuvo durante 10 minutos a temperatura de 50 °C, luego se enfrió a tempe
ratura ambiente y se midió la absorbancia a 650 nm en un espectrofotómetro
Hitachi 100-60 frente a un blanco exento de proteína. Se determinó la concen
tración de proteína comparando con una curva de calibrado construida emple
ando albúmina de suero bovino como proteína patrón.
Disolución A: 2 g de tartrato sódico potásico y 100 g de
carbonato sódico disueltos en 500 mi de NaOH 1 M y llevados a 1 litro con
agua bidestilada.Disolución B: 2 g de tartrato sódico potásico y 1 g de sulfato
de cobre disuelto en 90 mi de agua bidestilada y 10 mi de NaOH 0,1 M.Diso
lución C: Un volumen de reactivo de Folin-Ciocalteu por cada 15 volúmenes
de agua bidestilada; se prepara inmediatamente antes de usarla.
La cantidad de proteína unida en cada uno de los derivados
inmovilizados obtenidos, se determinó por diferencia entre la cantidad de pro
teína en las disoluciones antes y después de la reacción de acoplamiento.
12.5. DETERMINACIÓN DE ASCORBATO.
Muchas de las experiencias que se realizaron ocurrían con
un consumo de ascorbato a lo largo del tiempo de reacción. La variación de
la concentración de ascorbato con el tiempo se estudió, de forma directa mi
diendo la absorbancia a 265 nm, longitud de onda a la que el ascorbato pre-
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senta un máximo de absorción y a la que no interfiere el cambio espectral
provocado por la conversión de L-tirosina a L-dopa en las reacciones enzimáti-
cas de la tirosinasa. Se calibró el método con patrones que contenían L-tirosi
na 2 mM en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 y añadiendo ascorbato inmediata
mente antes de medirse, a partir de una disolución concentrada (1 mM), prepar
rada dentro del mismo di'a. En estas condiciones la curva de calibrado dio:
Ascorbato(mM)=0,116-Ab265 — 0,001 , siendo lineal hasta valores de 1,5 unida
des de absorbancia.
12.6. DETERMINACIÓN DE OXIGENO DISUELTO.
La determinación del oxígeno consumido en las reaccio
nes catalizadas por tirosinasa soluble e inmovilizada, se llevóa cabo polaro-
gráficamente mediante un oxígrafo de la firma Yellow Sprig modelo YSI-53,
con electrodo de Clark y dotado de células termostatizadas con baño de pre
cisión de 0,01°C. Para el ensayo estándar, 5 mi de disolución de tirosina o
dopa, de concentración especificada en cada experimento, se adicionaron a una
de las células del oxígrafo, provistas de un agitador magnético. Se burbujeó
aire en la disolución para alcanzar la saturación, lo que correspondió a una
concentración de oxígeno de 0,26 mM (Yamaguchi et al., 1969) en tampón
fosfato 0,1 M pH=7,0. A continuación se añadieron 0,2 mi de disolución de
enzima ó 4 mg de derivado inmovilizado. Inmediatamente se introdujo el elec
trodo y se registró la desaparición de oxígeno con el tiempo de reacción.
12.7 DETERMINACIÓN DE L-DOPA.
Se enSpleó el método descrito por Arnow(1937) modificado
por nosotros. Se basó en la formación de un derivado diazotado de la L-dopa,
que en medio ácido da un color amarillo estable que puede medirse colorimé-
tricamente a 460 nm. En el método original de Arnow, el complejo formado
tomaba una coloración roja por adición de NaOH, midiéndose la absorbancia
a 495 nm. Pero aunque de esta forma la sensibilidad era mayor, el color fué
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muy inestable, lo que ocasionaba una gran imprecisión en el método.
El procedimiento aplicado fué el siguiente:A 1 mi de disolu-
que contenía L-dopa (0,005—1,5 mM) se le añadió 1 mi de CIH 0,5 M. A con
tinuación se trató con 1 mi de una disolución formada por N0 2Na al 15% y
Mo04Na al 15 % ; se agitó intensamente con un agitador de tubos Mixotub-
Gricel, dejándose en reposo durante 5-15 minutos. La agitación intensa fué ne
cesaria cuando las medidas se realizaban en presencia de ascorbato (Letts y
Chance, 1974). Si en el medio existía material insoluble, como partículas de
gel-IME, la disolución resultante se f i l tró a través de un f i l tro tipo jeringuilla
con papel Wattman n°3. Se leyó la absorbancia de la disolución frente a un
blanco, exento de L-dopa, a 460 nm. El método dio una linealidad de absor
bancia para una concentración de L-dopa en el rango de 0,002—0,8 mM ( E =
l ,22-10"3mor lcm"1); para concentraciones de 0,8—1,5 mM la curva de calibrado
se ajustó a una ecuación de segundo grado.Midiendo a 420 nm el método fué
algo más sensible (E=l,85-10"3mol"'''cm"1), pero disminuyó el intervalo de con
centraciones en que la respuesta fué lineal ( 0,002-0,4 mM). Dado que en nues
tro caso se manejaron normalmente concentraciones elevadas de L-dopa (0,1—
1,0 mM), se prefirió la medida a 460 nm, tal como se ha descrito.
12.8 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.
12.8.1. ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE LA PROTEINA SOLUBLE
La determinación de actividad se basó en la medida de la
L-dopa formada en un tiempo determinado de reacción, utilizando L-tirosina
como sustrato. Para evitar la oxidación de la L-dopa a la forma de quinona
por efecto de la actividad d opa oxida sa de la misma enzima,'se adicionó al me
dio de reacción ascorbato sódico. El procedimiento fué el siguiente: Se colocó
en un tubo de ensayo, 0,2 mi de disolución de enzima, previamente activada
con tripsina según el método descrito en 12.1.3. Se añadió 1 mi de disolución
de sustrato ( L-tirosina 2,5 mM; ascorbato 2,5 mM; en tampón fosfato 0,1 M
a pH=7,0) y se dejó reaccionar durante 10 minutos a 25 °C, después de lo
cual se detuvo la reacción por adición de 1 mi de CIH 0,5 M y se midió la
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L-dopa formada por el método colorimétrico descrito en 12.7. Se comprobó
que en las condiciones descritas, la velocidad de reacción se mantuvo constante,
en el intervalo de tiempo empleado y que no existió el periodo de retardo ca-
rasten'stico de la actividad tirosina hidroxilasa (Pomerantz, 1966; García Carmo-
na, 1980).
12.8.2. ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE TIROSINASA I N M O V I L I
ZADA.
Para medir la actividad de la enzima inmovilizada en geles,
a 10 mg de gel-IME liofilizado, o su equivalente húmedo, se adicionaron 5 mi
de disolución sustrato (L-tirosina 2,5 mM y ascorbato2,5 mM en tampón fosfa
to 0,1 M pH=7,0). Se mantuvo agitando en un agitador mecánico de vaivén du
rante 30 minutos. A los 15 y 30 minutos respectivamente, se tomaron alícuotas
de 1 mi y se añadieron en tubos de ensayo que contenían 1 mi de CIH 0,5 M
y se determinó la concentración de L-dopa por el método descrito en 12.7.
Si la enzima estaba inmovilizada en membranas, el ensayo
de actividad consistía en adicionar 1 cm2 de membrana-1 ME a cada uno de des
tubos, conteniendo 1 mi de disolución sustrato. A los 15 minutos en el primer
tubo y a los 30 en el segundo, se adicionó 1 mi de CIH 0,5 M y a continua
ción se determinó la concentración de L-dopa formada.
En el caso de enzima inmovilizada en la superficie interna
de tubo de nylon, se recicló 1 mi de disolución sustrato, a una velocidad de
flujo de 1 ml/min, a través de 2 cm de tubo-IME, durante 15 minutos. A con
tinuación se añadió 1 mi de CIH 0,5 M y se midió la concentración de L-dopa
formada. Con otros 2 cm de tubo-IME se repitió el ensayo para 30 minutos de
tiempo de reacción.
Los métodos anteriormente descritos se consideraron como
métodos estándar de medida de la actividad de enzima inmovilizada (Act|(yj^).
Para el estudio de la actividad manifestada por I ME en reactores funcionando
durante largo tiempo (Actp), se empleó siempre como criterio la determinación
de L-dopa formada en la disolución producto de reacción. Así, en reactores de
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baño discontinuo, se tomaron alícuotas de 1 mi a distintos tiempos a lo largo
de la vida de uso del reactor y se determinó la concentración de L-dopa en
las alícuotas. En el caso de reactores de flujo continuo, el producto de reac
ción se recogió en una serie de fracciones tomadas a un tiempo definido y
durante 1 hora por fracción, determinándose posferiormente la concentración de
L-dopa en cada una de ellas.
En todos los casos, se definió la unidad de actividad (U),
como se ha realizado para la enzima soluble. La actividad de los derivados in
movilizados se expresó en mU/mg de gel para los geles-IME, en mU/cm2 para
las membranas-IME y en mU/cm lineal de tubo para los tubos-IME.
12.8.3. ACTIVIDAD DOPA OXIDASA DE TIROSINASA
La determinación de la actividad dopa oxidasa de tirosinasa
se basó en la medida espectrofotométrica directa, a 475 nm, del dopacromo
formado como producto de la oxidación de la L-dopa. Para ello a 0,1 mi de
disolución de tirosin'asa, previamente activada (método 12.1.3), se añadieron 2,9
mi de disolución saturada de L-dopa (2 mg/ml) en tampón fosfato 0,1 M a
pH 7,0, y se siguió la formación de dopacromo a 475 nm.(E=3,7-103mor ,cm" l>
Waite, 1976). La unidad de actividad dopa oxidasa se definió como la cantidad
de enzima que catalizó la formación de 1 micromol de dopacromo por minuto
a 25 °C y pH 7,0 (Fling et al. 1963) y en términos de velocidad inicial.
12.8.4. DETERMINACIONES CON EL ELECTRODO DE TIROSINASA INMO
VIL IZADA
Para la preparación del electrodo de enzima, se inmoviliza
ron 50 mi l de tirosinasa purificada por cm2 de membrana modificada como
NB-glut-IME, según método descrito en 12.2..6 y 12.3.2. y se conservó en fri
gorífico (5o) suspendida en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0. Mediante una a-
randela de goma, la membrana-IME junte con una membrana de teflón^ se fija
ron a un electrodo de oxígeno tipo Clark.
Para realizar un ensayo de respuesta del electrodo frente a
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una disolución de un sustrato de la enzima se siguió el procedimiento siguiente:
2 mi de tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0, saturados de aire por burbujeo, se co
locaron en la cubeta de ensayos del oxigrafo, se introdujo en electrodo de en
zima y se ajustó el 100 % del aparato manteniendo la disolución agitada con
agitador magnético. A continuación, se sustituyó la disolución de tampón por
2 mi de la disolución conteniendo sustrato en una determinada concentración
e igualmente saturada de aire, se introdujo de nuevo el electrodo de enzima
y se registró el porcentaje de oxi'geno consumido, en función del tiempo. Fina
lizado el ensayo, el electrodo se lavó con agua destilada y se equilibró de nue
vo con tampón saturado de aire durante 5 minutos. Todos los ensayos se rea
lizaron a 25°C.
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