Dr. J. V. SinisterraBiotransformations Group

Faculty of PharmacyUniversidad Complutense

www.biotransformaciones.com

INMOVILIZACION DE ENZIMAS -1

Estabilidad de la lipasa de C. rugosa almacenada a distintas temperaturas

Reacción test. Hydrolysis de aceite de oliva.

Diseño de biocatalizadores con una elevada actividad por unidad de volumen

Una elevada actividad específica (U/ cat) es beneficiosa para un proceso escalablepues así se requiere menor volumen de reactor para lograr la msima actividad.

En general el boiocatalizador no supera el 10% de la masa total y el “catalizador”Suele ocupar entre el 10-20% del reactor.

Hay dos metodologías para obtener biocatalizadores robustos con altas cargasde actividad

High payload carriers .- soportes que admiten una gran cantidad de enzimainmovilizada.

CLEA.- Carrier-bound-cross linked enzymes

Ca0 L. Curr. Opinion Chem. Boiol. 2005, 9, 217-226

High payload carriers .- soportes que admiten una gran cantidad de enzima inmovilizada.

Se obtienen jugando con la superficie del soporte y el tamaño de poro.

La relación enzima/soporte varia entre 0.1 y 0.2

El soporte suele tener unos 200 m2 /g y el tamaño de poro es de unos 100nm

Esto permite que muchas moléculas de enzima entren en el interior del soporte

Ca0 L. Curr. Opinion Chem. Boiol. 2005, 9, 217-226

CLEAS.- Carrier – bound cross-linked enzyme aggregates

CLEAs are prepared by 1) aggregation of enzymes2) chemical cross-linking of enzyme aggregates

The main problem is that the particles size is < 10 µm- difficult to separatefrom the reaction mixture

IMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADESIMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADES

ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALES(polialdehídos)

ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALESENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALES(polialdeh(polialdehíídos)dos)

C

O

H

Inmovilización y Estabilización de Enzimas Multiméricas

IMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADESIMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADES

ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALES(polialdehídos)

ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALESENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALES(polialdeh(polialdehíídos)dos)

C

O

H

Inmovilización y Estabilización de Enzimas Multiméricas

InmovilizaciInmovilizacióón de enzimasn de enzimas

ENZIMASENZIMAS

ADSORCIÓNUNIÓN COVALENTE

ATRAPAMIENTO

1.-atrapamiento en micelas2.- atrapamiento en organogeles3.- atrapamiento en sistemas sol-gel

CLEAS

InmovilizaciInmovilizacióón de enzimasn de enzimas

Requerimientos del método de inmovilización

1) Método sencillo2) Método reproducible3) Método suave en las condiciones de reacción4) Método económico5) Método seguro6) Método versátil7) Método factible de escalado8) Buena congruencia geométrica enter la superficie del soporte y la enzima9) Elevada demsidad de grupos activos por unidad de superficie en el soporte.

Métodos de inmobilización de una enzima monomérica

¿Es inerte el soporte?En los procesos en que se trabaja con poca agua, la capacidad de captación deagua por el soporte es determinante de la actividad catalítica´Se determina mediante la AQUOFILIA

Se dteermina con 1% de agua, 100mg de soporte y 1,5 mg deEnzima unida

Breslow et al. Eur,J, Biochem. 172,573-8 (1988)

Actividad de la α-quimotripsina inmovilizada en distintos soportes,en la esterificación de L-N-acetilfenilalanina con etanol

Breslow et al. Eur,J, Biochem. 172,573-8 (1988)

¿Qué residuos aminoacídicos se pueden utilizar para la inmovilización?

Los mas abundantes y Los mas expuestos almedio

Grupos reactivos

Criterios para seleccionar la metodología de inmovilización1) Estabilidad del biocatalizador inmovilizado2) Facilidad de manejo del biocatalizador inmovilizado3) Soporte: precio, aquofilia, estabilidad, resistencia a la contaminación

Bacteriológica.4) Naturaleza y estructura de la enzima

Criterios para seleccionar una reacción de inmovilización1) Reacción sencilla2) Reacción reproducible3) Reacción que se lleve a cabo en condiciones suaves de T, medio de reacción etc.4) Reacción barata5) Reacción segura6) Reacción escalable

Tipos de soportes

1) polisacaridos: sefadex, celulosa, agarosa, agar, quitina, etc

2) Soportes inorgánicos: óxidos metálicos, vidrio poroso, silice etc.

3) Proteinas fibrosas : colágeno, queratina etc.

4) Polímeros sintéticos : poli-acrilatos, poli- acrilamidas, alcohol polivinílico

5) Hidrogeles iónicos: alginato, pectato, carraginano etc.

Inmovilización por adsorción

Métodos de activación de

soportes

Métodos de activación de

soportes

La funcionalización mas utilizada de los soportes es el grupo epóxidoya que permite muchas modificaciones de la superficie para interaccionar

con los distintos grupos funcionales de la proteína

El proceso de unión covalente es un proceso que ocurre en varios pasos

Union covalente a soportes polifuncionales

Si se quiere inmovilizar vía grupos ácido de la proteínaEl empleo de las carbodiimidas se considera como el método

de elección

Inmovilización de α-chimotripsina en

un copolimero PE/HENMA

Síntesis de Tyr-Leu

Inmovilización via grupos sulfuro

COOEt

CH3

COOH

HCH3

lLipaseC. rugosa

Inmovilización

Ventajas:Mayor estabilidad enzimática.Disminución interacciones proteína-proteína.Facilidad de manipulación del microentornoDisminución de costes por reutilizaciónFácil separación del biocatalizador del producto

Métodos de inmovilización:Fisicos: Atrapamiento, encapsulación, inclusiónQuímicos: entrecruzamiento o unión directa al soporte

Unión directa:

Inmovilización por adsorción: hidrofóbica (Octil-Agarosa, EP100), iónica (Duolite)

InconvenientesAlteración de la conformación enzimática.Existencia de sistema soporte-enzima heterogéneo.Posible pérdida de actividad enzimática

Proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente los grados de libertadde movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc... por su unión a un soporte(Taylor, Protein immobilization: fundamentals and applicatrions, 1991.)

OH2N

Eupergit C Enzima

OH

NH

Inmovilización covalente (Eupergit)