α-synukleiini Parkinsonin taudin mallintamisessa jyrsijöillä
Sauli Pätsi
Helsingin yliopisto
Farmasian tiedekunta
Farmakologian ja toksikologian osasto
Maaliskuu 2013
Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion – Faculty
Farmasia/Farmakologia ja toksikologia
Laitos/Institution– Department
Tekijä/Författare – Author
Sauli Pätsi Työn nimi/Arbetets titel – Title
α-synukleiini Parkinsonin taudin mallintamisessa jyrsijöillä
Oppiaine/Läroämne – Subject
Farmakologia
Työn laji/Arbetets art – Level
Pro Gradu
Aika/Datum – Month and year
Maaliskuu 2013
Sivumäärä/Sidoantal – Number of pages
60 Tiivistelmä/Referat – Abstract
Parkinsonin tauti on rappeuttava hermosairaus, jolle on tunnusomaista mustatumakkeen dopamiinia
tuottavien hermosolujen vähittäinen tuhoutuminen sekä solunsisäisten Lewyn kappaleiden
muodostuminen. α-synukleiinin on havaittu olevan olennainen osa Lewyn kappaleita, minkä lisäksi
mutaatioiden α-synukleiinigeenissä on havaittu altistavan harvinaisille suvuittain esiintyville
Parkinsonin taudin muodoille.
Parkinsonin taudin eläinmallien luomisessa käytetään hermomyrkkyjä, sairauteen liittyvien geenien
suhteen siirtogeenisiä eläimiä sekä virusvektoreita. Siirtogeeniset eläin- ja virusvektorimallit
näyttävät ilmentävän perinteisiä hermomyrkkymalleja paremmin Parkinsonin taudin aiheuttamia
hermostomuutoksia. Siirtogeeni sekä geenin ilmentämisessä käytetty promoottori määräävät,
minkälaisia hermostomuutoksia sekä liikehäiriöitä siirtogeenisessä eläinmallissa esiintyy.
Erikoistyössä tutkittiin adenoassosioidun virusvektorin (AAV1-vektori) kykyä siirtää aivojuovioon
tai mustatumakkeeseen WT- tai A53T-α-synukleiinigeeniä, sekä näiden yli-ilmentymisen vaikutusta
hiirten liikkumiseen ja aivojuovion dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden pitoisuuksiin.
Tässä tutkimuksessa selvitettiin myös prolyyliendopeptidaasientsyymin (PREP) estäjän vaikutuksia
A53T-α-synukleiinin yli-ilmentymiseen hiiren nigrostriataaliradalla, koska PREP:n on havaittu
nopeuttavan α-synukleiinin aggregoitumista ja siten ehkä lisäävän α-synukleiinin hermosoluille
haitallisia vaikutuksia.
Hiirten liikkumista mittaavissa kokeissa (liikeaktiivisuus, pyörivä sauva, tasapainorima) ei havaittu
tilastollisesti merkitseviä eroja ryhmien välillä. Vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) värjäyksen
perusteella nähtiin GFP:n vähäinen ilmentyminen aivojuoviossa, minkä perusteella virusvektorit
levisivät aivoissa heikosti ja ilmensivät siirtogeeniä huonosti. Tämä voi selittää myös sen, miksi α-
synukleiinin yli-ilmentymistä ei havaittu. Dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden
pitoisuuksissa oli vain pieniä eroja. Tutkimuksen II lopuksi tehdyssä PREP-aktiivisuuden
mittauksessa havaittiin, että PREP-estäjähoito (KYP-2047) oli alentanut PREP:n aktiivisuutta
huonosti.
Erikoistyössä virusvektorit eivät aiheuttaneet α-synukleiinin yli-ilmentymistä, mutta aiemmin
ainakin AAV2- ja AAV6-vektorit ovat toimineet jyrsijöissä. Useimmissa näytteissä havaittu korkea
PREP-aktiivisuus johtunee KYP-liuoksen annostelussa käytetyn minipumpun asennuksen
epäonnistumisesta. Vaikka erikoistyössä virusvektoreilla ei saatu luotua Parkinsonin taudin
eläinmallia, ne ovat tulevaisuudessa tärkeä menetelmä Parkinsonin taudin mallintamisessa.
Avainsanat – Nyckelord – Keywords
α-synukleiini, Parkinsonin tauti, eläinmalli, virusvektori Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where deposited
Farmasian tiedekunta, Farmakologian ja toksikologian osasto Muita tietoja – Övriga uppgifter – Additional information
Ohjaajat: Mari Savolainen, Timo Myöhänen
Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion – Faculty
Pharmacy/Pharmacology and Toxicology
Laitos/Institution– Department
Tekijä/Författare – Author
Sauli Pätsi Työn nimi / Arbetets titel – Title
α-synuclein-based murine models of Parkinson’s disease
Oppiaine/Läroämne – Subject
Pharmacology
Työn laji/Arbetets art – Level
Master’s Thesis
Aika/Datum – Month and year
March 2013
Sivumäärä/Sidoantal – Number of pages
60 Tiivistelmä/Referat – Abstract
Parkinson's disease is a neurodegenerative disease which is characterized by progressive loss of
dopaminergic neurons in the substantia nigra and formation of intracellular Lewy bodies. α-
synuclein is an essential part of Lewy bodies. In addition, mutations in the α-synuclein gene have
been found to cause rare familial forms of Parkinson's disease.
Animal models of Parkinson's disease are created by neurotoxins, transgenic animals and viral
vectors. Transgenic animal models and viral vector models seem to reflect the pathology of
Parkinson’s disease better than the traditional neurotoxin models. In the transgenic animal models,
the transgene and the promoter used in the expression of the transgene guide the pathology and
motor dysfunctions that the animal model exhibits. In the viral vector models, it is important to use
a suitable animal strain and a correct viral serotype in order to express the transgene sufficiently
enough in the laboratory animals.
The aim of the study was to investigate the ability of adeno-associated viral vector (AAV1-vector)
to transfect WT- or A53T-α-synuclein gene into the striatum or the substantia nigra, and the effects
of their overexpression on motor functions and concentrations of striatal dopamine and its
metabolites in mice. In addition, the effect of a prolyl endopeptidase (PREP) inhibitor on the
overexpression of A53T-α-synuclein in the mouse nigrostriatal pathway was studied, as PREP has
been found to stimulate the aggregation of α-synuclein and therefore perhaps to increase
neurotoxicity of α-synuclein.
There were no statistically significant differences between the groups in the motor function tests
(locomotor activity, rotarod and balance beam walk). Green fluorescent protein immunostaining
showed that the GFP gene was weakly transfected into the striatum by the AAV1-vector, and no
overexpression was observed. There were only minor differences in the striatal concentrations of
dopamine and its metabolites. Finally, PREP-activity measurements showed that PREP-inhibitor
(KYP-2047) treatment had poorly reduced PREP-activity.
In this study, the viral vectors did not induce the overexpression of α-synuclein, although previously
AAV2- and AAV6-vectors have been efficient in mice and rats. High PREP-activities that were
found in most of the samples probably resulted from failed installations of mini-pumps that
delivered the PREP-inhibitor. While in this study the viral vectors were not a successful attempt in
the creation of an animal model of Parkinson's disease, they are an important method to model
Parkinson’s disease in the future.
Avainsanat – Nyckelord – Keywords
α-synuclein, Parkinson’s disease, animal model, viral vector Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where deposited
Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacology and Toxicology Muita tietoja – Övriga uppgifter – Additional information
Supervisors: Mari Savolainen, Timo Myöhänen
KÄYTETYT LYHENTEET JA TERMIT
5-HT 5-hydroksi-tryptamiini
5-HIAA 5-hydroksi-indolietikkahappo
6-OHDA 6-hydroksidopamiini
AAV adenoassosioitu virus
ANOVA varianssianalyysi
aSyn α-synukleiini
CaMKIIα kalsium/kalmoduliini-riippuvainen proteiinikinaasi IIα
CBA kanan β-aktiini
CMV sytomegalovirus
DA dopamiini
DBS aivojen syvien osien stimulointi
DNS aasin normaaliseerumi
DOPAC 3,4-dihydroksifenyylietikkahappo
GFP vihreä fluoresoiva proteiini
GDNF gliasoluperäinen hermokasvutekijä
GNS vuohen normaaliseerumi
HPLC korkean erotuskyvyn nestekromatografia
HVA homovanilliinihappo
mPr hiiren prioniproteiini
MPTP 1-metyyli-4-fenyyli-1,2,3,6-tetrahydropyridiini
NAC N-asetyylikysteiini
NAP mikrotubuluksiin liittyvä peptidi NAPVSIPQ
PB fosfaattipuskuri
PBA 4-fenyylibutyyrihappo
PBS 0,9 % natriumkloridi fosfaattipuskurissa
PDGF- β ihmisen verihiutalekasvutekijä-β
PITX3 aivolisäkkeen homeobox-geeni-3
S1 synapsiini-1
s.c. ihonalaisesti
SEM keskiarvon keskivirhe
SNCA α-synukleiinigeeni
Str aivojuovio
SN mustatumake
TH tyrosiinihydroksylaasi
Thy-1 tymosyyttien erilaistumisantigeeni-1
tTa tetrasykliinikontrolloitu transaktivaattori
VMAT2 vesikulaarinen monoamiinien kuljetusproteiini-2
WPRE metsämurmelin hepatiittiviruksen transkription jälkeinen
säätelyosa
WT villityyppi
aivojuovio striatum
aivoturso hippocampus
mustatumake substantia nigra
sinertävä aivotäplä locus caeruleus
SISÄLLYSLUETTELO
I KIRJALLINEN OSA: α-SYNUKLEIINIIN PERUSTUVAT PARKINSONIN
TAUDIN JYRSIJÄMALLIT
1 JOHDANTO ............................................................................................................. 1
2 α-SYNUKLEIINI ..................................................................................................... 4
3 α-SYNUKLEIININ SUHTEEN SIIRTOGEENISET HIIRET ................................ 7
3.1 Villityypin α-synukleiinia ilmentävät hiiret ............................................ 8
3.2 A53T-α-synukleiinia ilmentävät hiiret .................................................. 11
3.3 A30P-α-synukleiinia ilmentävät hiiret .................................................. 14
3.4 Muita siirtogeenisiä malleja .................................................................. 16
4 α-SYNUKLEIININ VIRUSVEKTORIMALLIT ................................................... 18
4.1 Virusvektorit rotissa .............................................................................. 19
4.2 Virusvektorit hiirissä ............................................................................. 21
5 YHTEENVETO ...................................................................................................... 22
II KOKEELLINEN OSA: VILLITYYPIN TAI A53T-α-SYNUKLEIININ YLI-
ILMENTÄMISEN JA YHDISTETYN PREP-ESTÄJÄHOIDON VAIKUTUKSET
HIIRTEN LIIKKUMISEEN JA NIGROSTRIATAALISIIN
DOPAMIINIHERMOSOLUIHIN
1 JOHDANTO ........................................................................................................... 25
2 MATERIAALIT JA MENETELMÄT ................................................................... 28
2.1 Eläimet .................................................................................................. 28
2.2 Käytetyt kemikaalit ja lääkeaineet ........................................................ 28
2.3 Stereotaktinen leikkaus ......................................................................... 30
2.4 Liikkumista mittaavat käyttäytymiskokeet ........................................... 30
2.5 Kudosnäytteiden valmistus ja immunohistokemialliset värjäykset ...... 32
2.6 Korkean erotuskyvyn nestekromatografia eli HPLC ............................ 34
2.7 PREP-aktiivisuuden mittaus .................................................................. 35
2.8 Tulosten käsittely ja tilastolliset testit ................................................... 36
3 TULOKSET ............................................................................................................ 37
3.1 Koesarja I .............................................................................................. 37
3.1.1 Immunohistokemialliset värjäykset ............................................ 37
3.1.2 Liikeaktiivisuus ........................................................................... 38
3.1.3 Pyörivä sauva .............................................................................. 39
3.1.4 Tasapainorima ............................................................................. 40
3.1.5 Monoamiinimääritykset .............................................................. 41
3.2 Koesarja II ............................................................................................. 41
3.2.1 Liikeaktiivisuus ........................................................................... 42
3.2.2 Pyörivä sauva .............................................................................. 43
3.2.3 Tasapainorima ............................................................................. 43
3.2.4 Monoamiinimääritykset .............................................................. 44
3.2.5 PREP-eston voimakkuus ............................................................. 45
4 TULOSTEN TARKASTELU JA POHDINTA ...................................................... 46
5 YHTEENVETO ...................................................................................................... 51
6 KIRJALLISUUSLUETTELO ................................................................................ 52
1
1 JOHDANTO
Parkinsonin tauti on Alzheimerin taudin jälkeen toiseksi yleisin rappeuttava
hermosairaus, jota sairastaa 1-2 prosenttia 60 vuotta täyttäneistä ihmisistä (de Lau ja
Breteler 2006). Parkinsonin taudin yleisimmät oireet ovat lepovapina, jäykkyys,
liikkeiden hitaus ja asentojen epävakaus, mutta siihen liittyy myös muita kuin
liikkumiseen liittyviä oireita, kuten autonomisen hermoston toimintahäiriöitä, hajuaistin
häiriöitä, mielialan muutoksia ja dementiaa (Olanow ym. 2009; Shulman ym. 2011).
Parkinsonin taudille on tunnusomaista mustatumakkeen dopamiinia tuottavien
hermosolujen vähittäinen tuhoutuminen sekä solunsisäisten, runsaasti proteiinia
sisältävien Lewyn kappaleiden muodostuminen. Lewyn kappaleita esiintyy
hermosolujen runko-osassa lähes kaikkialla potilaiden aivoissa (Spillantini ja Goedert
2000). Muissa hermosolujen osissa sijaitsevia vastaavia kertymiä kutsutaan Lewyn
neuriiteiksi. α-synukleiiniaggregaattien eli liukenemattomien kasautumien on havaittu
olevan olennainen osa Lewyn kappaleita (Spillantini ym. 1998).
Dopamiinihermosolujen tuhoutuminen johtaa kyseisen välittäjäaineen puutokseen
hermojen päätealueella, aivojuoviossa (Shulman ym. 2011). Liikehäiriöitä alkaa ilmetä,
kun 60 % mustatumakkeen dopamiinihermosoluista on tuhoutunut ja aivojuovion
dopamiini vähentynyt 80 %. Parkinsonin taudin tyypillisiä löydöksiä ovat myös
muutokset ääreishermostossa, kolinergisissa hermosoluissa, sinertävän aivotäplän
noradrenaliinia erittävissä hermosoluissa, limbisen järjestelmän mantelitumakkeessa ja
aivotursossa, noradrenergisissa hermosoluissa, serotonergisissa hermosoluissa sekä
hermosoluissa aivokuorella ja selkäytimessä. Dopamiinihermosolujen tuhoa
edeltävätkin muutokset erityisesti selänpuoleisessa liikehermostossa ja hajukäämissä.
Parkinsonin taudin aiheuttajaa ei tunneta, mutta nykytiedon perusteella se on seurausta
ympäristön ja geenien monimutkaisista yhteisvaikutuksista. Riskiä sairastua tautiin
lisäävät esimerkiksi korkea ikä, miessukupuoli, eurooppalainen syntyperä sekä
altistuminen tuholaismyrkyille ja raskasmetalleille.
Parkinsonin taudin hoidossa käytettäviä lääkkeitä ovat levodopa, dopamiiniagonistit,
monoamiinioksidaasi-B:n estäjät, katekoli-O-metyylitransferaasin estäjät, antikolinergit
ja amantadiini (Olanow ym. 2009). Mikäli lääkkeillä on merkittäviä haittavaikutuksia,
2
voidaan kokeilla aivojen syvien osien stimulointia eli DBS-hoitoa. Nykyisin käytettävät
lääkkeet auttavat sairauteen liittyviin liikehäiriöihin, mutta muihin oireisiin niiden teho
on heikko. Lisäksi mikään nykyhoidoista ei pysäytä etenevää dopamiinihermosolujen
tuhoa eikä siten vaikuta sairauden ennusteeseen (Chesselet ja Richter 2011).
Oireenmukaisella hoidolla voidaan kuitenkin parantaa potilaiden elämänlaatua.
Parkinsonin taudin tutkimuksessa on tavoitteena löytää lääke, joka suojaa hermosoluja
tuhoutumiselta tai korjaa jo vaurioituneita hermosoluja (Chesselet 2008; Olanow ym.
2009; Beal 2010). Ennen kuin uutta lääkekandidaattia voidaan testata ihmisillä
kliinisissä kokeissa, vaaditaan tehosta todisteita prekliinisissä kokeissa, joihin kuuluvat
muun muassa eläinkokeet. Perinteiset Parkinsonin taudin eläinmallit perustuvat
mustatumakkeen dopamiinihermosolujen tuhoamiseen erilaisilla hermomyrkyillä, joista
käytetyimmät ovat 6-hydroksidopamiini (6-OHDA) ja 1-metyyli-4-fenyyli-1,2,3,6-
tetrahydropyridiini (MPTP). Mediaaliseen etuaivokimppuun injisoitu 6-OHDA
aiheuttaa totaalileesion eli hermosolujen täydellisen tuhoutumisen ja aivojuovioon
injisoitu 6-OHDA osittaisleesion (Decressac ym. 2012a). Toksiinimallit ilmentävät
yleensä hyvin sairauteen liittyviä liikehäiriöitä, mutta taudin aiheuttamia hermosoluihin
kohdistuvia muutoksia ne ilmentävät huonosti. Solutuho on äkillistä eikä ajan mittaan
etenevää, kuten Parkinsonin tautia sairastavilla potilailla. Muun muassa tämän vuoksi
mielenkiinto on siirtynyt sairautta mahdollisesti paremmin ilmentäviä geneettisiä
eläinmalleja ja virusvektorimalleja kohtaan.
Sairauden syntyperä ja oireita aiheuttavat muutokset täytyy tuntea hyvin ennen kuin
uusia hoitomuotoja voidaan alkaa kehittää. Eläinmalleja käytetään sairauksien syiden
selvittämiseen sekä uusien hoitojen testaukseen ennen ihmisillä tehtäviä kliinisiä
tutkimuksia. Yleisesti eläinmallien laatua voidaan arvioida tarkastelemalla sen
ominaisuuksia. Täydellinen malli perustuu sairauden varmistettuun syyhyn, se ilmentää
sairauden oireita ja siinä nähdään sama hoitovaste kuin oikeissa potilaissa (Chesselet ja
Richter 2011). Harvoin kuitenkaan löytyy tällaista mallia, vaan joudutaan tyytymään
malleihin, jotka ilmentävät vain jotain sairauden ominaisuutta. Täydelliselle
Parkinsonin taudin eläinmallille on useita vaatimuksia. Yli 50 %
dopamiinihermosoluista pitäisi tuhoutua vähitellen aikuisiässä (Beal 2010). Mallin tulisi
3
sisältää Parkinsonin taudin tyypillisimmät liikehäiriöoireet. Lisäksi mallin pitäisi
ilmentää Lewyn kappaleita tai α-synukleiinin kertymätuotteita. Taloudellisista syistä
tärkeää olisi myös sairauden kokonaisetenemisen suhteellisen lyhyt kesto. Parkinsonin
taudin tutkimuksessa eläinmallien avulla voidaan ennustaa mahdollisen hoidon tehoa,
mutta vasta oikeilla potilailla tehtyjen tutkimusten tuloksista voidaan päätellä, miten
hyvin eläinmalli soveltuu kliinisen tehon ennustamiseen (Chesselet ja Richter 2011).
Sen lisäksi, että α-synukleiini on Lewyn kappaleiden olennainen rakenneosa, α-
synukleiinigeenin mutaatioiden on havaittu altistavan harvinaisille suvuittain
esiintyville Parkinsonin taudin muodoille (Polymeropoulos ym. 1997; Krüger ym. 1998;
Singleton ym. 2003; Zarranz ym. 2004; Chartier-Harlin ym. 2004). α-synukleiini on siis
mielenkiintoinen Parkinsonin taudin tutkimuskohde. Tähän kirjallisuuskatsaukseen on
koottu erilaisia α-synukleiiniin perustuvia jyrsijämalleja, joita käytetään Parkinsonin
taudin tutkimuksessa. Siirtogeenisten eläinlinjojen lisäksi käsitellään virusvektoreilla
aiheutettua α-synukleiinin yli-ilmentymistä.
4
2 α-SYNUKLEIINI
α-synukleiini on 140 aminohaposta koostuva pääasiassa aivoissa oleva proteiini, jonka
molekyylimassa on 14,46 kDa (Jakes ym. 1994). Ihmisen α-synukleiinigeeni (SNCA)
sijaitsee kromosomissa 4q21 (Chen ym. 1995; Spillantini ym. 1995). Vaihtoehtoisen
silmukoinnin seurauksena kokonaisen α-synukleiini-140:n lisäksi on olemassa ainakin
kaksi muuta isoformia: α-synukleiini-126 ja α-synukleiini-112 (Uversky 2007). α-
synukleiini koostuu kolmesta osasta: N-terminaali- (aminohappotähteet 1-60), keskus-
(aminohappotähteet 61-95) ja C-terminaalialueesta (aminohappotähteet 96-140). Vaikka
0,5-1 % aivojen soluliman proteiineista on α-synukleiinia, sen toimintaa ei ole vielä
tarkalleen selvitetty (Iwai ym. 1995; Surguchov 2008). Tutkimusten perusteella α-
synukleiinia on runsaasti sitoutuneena hermopäätteiden vesikkeleihin eli kalvon
muodostamiin rakkuloihin, joten se ilmeisesti säätelee keskushermostossa
välittäjäaineiden vapautumista (Uversky 2007; Surguchov 2008). Lisäksi α-synukleiini
säätelee solukalvojen lipidiosien järjestystä, fosfolipaasi D:n ja kinaasien toimintaa sekä
saattaa suojata normaaleina pitoisuuksina hermosoluja. Koska α-synukleiini ei ole
rakenteeltaan tarkasti laskostunut, sillä on paljon yhteisvaikutuksia eri proteiinien ja
ionien kanssa. α-synukleiinin rakenne on herkkä ympäristöolosuhteiden vaikutuksille ja
siitä tunnetaan ainakin seitsemän eri konformaatiomuotoa.
Vaikka Lewyn kappaleiden on tiedetty pitkään olevan Parkinsonin taudin, Lewyn
kappale-dementian sekä multippelisysteemiatrofian tunnusmerkki, pysyi niiden
koostumus tuntemattomana, kunnes liukenemattomien α-synukleiiniaggregaattien
havaittiin olevan niiden merkittävä rakenneosa (Spillantini ym. 1998; Spillantini ja
Goedert 2000). Jopa 90 % Lewyn kappaleiden sisältämästä α-synukleiinista on
fosforyloitunut proteiinin 129. aminohapon, seriinin kohdalta (Fujiwara ym. 2002).
Fosforyloituminen saattaa siis olla tärkeä syy α-synukleiinin aiheuttamille haitallisille
vaikutuksille, sillä koeputkiolosuhteissa fosforyloituminen lisää α-synukleiinin
säikeistymistä. Liukenemattomat α-synukleiiniaggregaatit sisältävät sekä epämääräisen
muotoisia osia että säikeitä (Uversky 2007; Surguchov 2008). α-synukleiinin herkkyys
aggregoitua voi selittyä sen rakenteellisella monimuotoisuudella sekä lukuisilla
yhteisvaikutuksilla. Aggregaattien muodostumista edeltää α-synukleiinin osittainen
5
laskostuminen (Kuva 1). Laskostumattoman ja osittain laskostuneiden muotojen välillä
vallitsee normaalisti tasapaino, mutta esimerkiksi tuholaismyrkyt, korkea α-
synukleiinipitoisuus, pistemutaatiot, matalan pH:n tavoin vaikuttavat kationit ja
oksidatiiviset vauriot voivat siirtää tasapainoa osittain laskostuneen muodon suuntaan.
Tasapainon siirtyminen osittain laskostuneiden muotojen suuntaan siis edesauttaa
aggregaattien muodostumista. α-synukleiiniaggregaattien tiedetään aiheuttavan
hermosolujen tuhoutumista, tulehdusreaktioita ja sen epäillään aiheuttavan lysosomien
toimintahäiriöitä (Surguchov 2008). Erityisesti α-synukleiinista koostuvat pienet
oligomeerit saattavat olla tärkeitä α-synukleiinin haitallisuuden kannalta (Surguchov
2008). Lysosomijärjestelmän on puolestaan havaittu pilkkovan autofagisesti α-
synukleiinia ja α-synukleiiniaggregaatteja, joten α-synukleiini itse saattaa edesauttaa
aggregaattien muodostumista (Schneider ja Zhang 2010). Lysosomien lisäksi α-
synukleiini pilkkoutuu proteasomien sekä useiden entsyymien (esim.
metalloproteinaasit ja kallikreiini-6) kautta (Surguchov 2008).
Kuva 1 Normaalisti monomeerinen α-synukleiini on järjestäytymätön. Tietyissä
olosuhteissa α-synukleiini alkaa laskostua ja siitä muodostuu oligomeereja. Osa
oligomeereistä muodostaa säikeitä, jotka puolestaan ovat merkittävä osa Lewyn
kappaleita. α-synukleiinin haitallisuuden syy ei ole täysin selvillä. Hermosoluille
toksisia saattavat olla tietyt oligomeerit tai esisäikeet, vaikka Lewyn kappaleet ovat
tyypillisin löydös (mukaillen Waxman ja Giasson 2009).
monomeerinen
aSyn
β-laskostumat
rengasmaiset
oligomeerit
säikeistymättömät oligomeerit
oligomeerit
oligomeerit
esisäikeet
Lewyn kappale aSyn-säikeet
6
Suurin osa Parkinsonin tautitapauksista on satunnaisia, mutta kolmen α-
synukleiinigeenin eri pistemutaation (A53T, A30P tai E46K) tai geenin kaksin- tai
kolminkertaistumisen on havaittu aiheuttavan harvinaisia perinnöllisiä taudin muotoja
(Taulukko 1) (Polymeropoulos ym. 1997; Krüger ym. 1998; Singleton ym. 2003;
Zarranz ym. 2004; Chartier-Harlin ym. 2004). A53T-mutaatiossa α-synukleiinin 53.
aminohappo alaniini on vaihtunut treoniiniin, koska geenin 209. emäs guaniini on
vaihtunut adeniiniin (G209A) (Polymeropoulos ym. 1997). A30P-mutaation aiheuttaa
α-synukleiinigeenin 88. emäksen guaniinin vaihtuminen sytosiiniin (G88C), josta seuraa
proteiinin 30. aminohapon alaniinin vaihtuminen proliiniin (Krüger ym. 1998). E46K-
mutaatio on seurausta 46-glutamiinihapon vaihtumisesta lysiiniin, mikä johtuu 188.
emäksen guaniinin vaihtumisesta adeniiniin (G188A) (Zarranz ym. 2004).
Pistemutaatiot nopeuttavat α-synukleiinin β-laskostumista ja liukenemattomien
säikeiden muodostumista, mistä seuraa yleensä varhain alkava Parkinsonin tauti (Narhi
ym. 1999; Waxman ja Giasson 2009). α-synukleiinigeenin kolminkertaistuminen
altistaa myös varhain alkavalle Parkinsonin taudille, mutta kaksinkertaistumisesta
johtuva Parkinsonin tauti muistuttaa taudin idiopaattista muotoa (Singleton ym. 2003;
Chartier-Harlin ym. 2004). Idiopaattinen eli ilman tunnettua syytä kehittyvä Parkinsonin
tauti alkaa siis vanhemmalla iällä ja etenee hitaasti. Lisäksi dementia ja muut
älykkyyteen liittyvät oireet ovat tavallisessa Parkinsonin taudin muodossa
harvinaisempia kuin pistemutaatioiden tai geenin kolminkertaistumisesta johtuvissa
tautimuodoissa. Kaikki mutaatiot on löydetty tutkittaessa sellaisia sukuja, joissa on
esiintynyt normaalia runsaammin Parkinsonin tautia. Osassa mutaatioista tiedot
perustuvat vain muutamiin potilaisiin.
7
Taulukko 1. Parkinsonin tautia aiheuttavien α-synukleiinigeenin mutaatioiden
ominaisuudet. Kaikki pistemutaatiot periytyvät autosomaalisesti (mutaatio ei sijaitse
sukusolussa) ja ovat dominoivia (kantaja ilmentäjää geeniä). aSyn = α-synukleiini, 2 x
SNCA = α-synukleiinigeenin kaksinkertaistuminen, 3 x SNCA = α-synukleiinigeenin
kolminkertaistuminen, ↑ = lievä lisäys, ↑↑ = runsas lisäys.
Mutaatio Taudin muoto Vaikutukset aSyn:iin Lähde
A53T Varhain alkava,
nopeasti etenevä, 85 %
kantajista sairastuu
Kertyminen ↑↑, β-
laskostuminen ↑ ja
säikeiden muodostuminen
(Polymeropoulos
ym. 1997; Waxman
ja Giasson 2009)
A30P Varhain alkava, melko
nopeasti etenevä
Kertyminen ↑, β-
laskostuminen ↑ ja
säikeiden muodostuminen ↑
(Krüger ym. 1998;
Narhi ym. 1999)
E46K Varhain alkava, melko
nopeasti etenevä
Säikeiden muodostuminen ↑ (Zarranz ym. 2004;
Waxman ja Giasson
2009)
2 x SNCA Muistuttaa tavallista Proteiinin muodostuminen ↑ (Chartier-Harlin ym.
2004; Waxman ja
Giasson 2009)
3 x SNCA Varhain alkava,
nopeasti etenevä,
dementia ↑
Proteiinin muodostuminen
↑↑
(Singleton ym.
2003; Waxman ja
Giasson 2009)
3 α-SYNUKLEIININ SUHTEEN SIIRTOGEENISET HIIRET
Viimeisen reilun kymmenen vuoden aikana on kehitetty useita α-synukleiinia yli-
ilmentäviä hiirikantoja (Masliah ym. 2000; Fleming ym. 2004; Rockenstein ym. 2005)
(Taulukko 2). Siirtogeenisen kannan tuottamisen jälkeen hiirten käyttö on helppoa,
kunhan mutaatio ei häiritse liikaa lisääntymistä eikä elinvoimaisuutta (Chesselet 2008).
Eniten on käytetty ihmisen villityypin (WT) α-synukleiinigeeniä sekä geenin
pistemutaatioita A53T ja A30P.
Geenin siirrossa promoottori määrää, millä alueilla geeni ilmenee (Crabtree ja Zhang
2012). Mallin elimistöön aiheuttamien muutosten pitäisi muistuttaa mahdollisimman
hyvin potilaiden tilaa. Tällöin ei siis periaatteessa pitäisi käyttää promoottoria, joka
ilmentää geeniä esimerkiksi vain katekoliamiineja sisältävissä hermosoluissa.
Promoottoreina on käytetty esimerkiksi hiiren prioniproteiinin (mPr-), ihmisen
verihiutalekasvutekijä-β:n (PDGF-β-), tyrosiinihydroksylaasin (TH) ja tymosyyttien
8
erilaistumisantigeeni-1:n (Thy-1) geenien promoottoreita. Näistä TH-promoottori
ilmentää geeniä ainoastaan TH:a sisältävissä hermosoluissa ja muut promoottorit
kaikissa hermosoluissa. Mielenkiintoinen tapa tutkia α-synukleiinin merkitystä
Parkinsonin taudin kehittymisessä on luoda konditionaalisia hiirimalleja, joissa α-
synukleiinigeeni voidaan halutessa hiljentää tai kytkeä päälle (Nuber ym. 2008; Lim
ym. 2010; Lin ym. 2012).
Taulukko 2. Siirtogeenisiä eläinmalleja, joita kuvataan tarkemmin myöhemmin
tekstissä. aggr. = aggregoituminen, aSyn = α-synukleiini, DA = dopamiini, hThy-1 =
hamsterin tymosyyttien erilaistumisantigeeni-1, mPr = hiiren prioni, mThy-1 = hiiren
tymosyyttien erilaistumisantigeeni-1, Prom. = promoottori SN = mustatumake, SNCA =
α-synukleiinigeeni, Str = aivojuovio, TH = tyrosiinihydroksylaasi, WT = villityyppi, + =
ilmenee mallissa, - = ei ilmene mallissa, ↓ = heikkenee/vähenee, ↑ = lisääntyy.
Geeni
(SNCA) Prom.
aSyn
aggr.
DAergiset
vaikutukset
Liike-
häiriöt Muuta Viitteet
WT mThy-1 SN + Str DA ↓ + Hajuaisti ↓
(Rockenstein ym.
2002; Fleming ym.
2004; Fleming ym.
2008)
A53T mPr - - +
Mitokondrio-
häiriöt,
liike-
hermosolut ↓
(Giasson ym. 2002;
Lee ym. 2002; Martin
ym. 2006)
A30P mThy-1 - - + Kognitio ↓ (Kahle ym. 2001;
Neumann ym. 2002;
Freichel ym. 2007)
A30P +
A53T hThy-1 SN +
Str DA ↓,
SN TH ↓ + - (Ono ym. 2009)
Y39C mThy-1 + - + - (Zhou ym. 2008)
aSyn
1-120/
1-130
TH +
Str DA ↓,
SN TH ↓
(1-130)
+ -
(Tofaris ym. 2006;
Wakamatsu ym. 2008;
Shelkovnikova ym.
2011)
A53T aSyn - - + Suolisto-
oireet ↑ (Kuo ym. 2010)
3.1 Villityypin α-synukleiinia ilmentävät hiiret
WT-α-synukleiinigeenin ilmentämisessä on käytetty useita eri promoottoreita.
Promoottorin vaikutus näyttää merkittävältä sen kannalta, minkälaisia
hermostomuutoksia ja oireita WT-α-synukleiinigeenin ilmentymisestä seuraa.
Esimerkiksi käytettäessä Thy-1-promoottoria hiirille kehittyi ajan mittaan pahenevia
9
liikehäiriöitä (Fleming ym. 2004). Kun käytettiin mPr-promoottoria, mitään merkitseviä
käyttäytymis- tai hermostomuutoksia ei syntynyt (Lee ym. 2002; Unger ym. 2006).
Yhdessä ensimmäisistä tutkimuksista käytettiin PDGF-β-promoottoria (Masliah ym.
2000). Kahdessa kuukaudessa siirtogeenisille hiirille muodostui α-synukleiinia ja
ubikitiiniä sisältäviä inkluusioita eli solunsisäisiä kappaleita aivokuorelle, aivotursoon ja
mustatumakkeeseen. Tätä seurasi myös dopamiinihermopäätteiden tuhoutuminen
aivojuoviossa. Samalla kehittyi liikehäiriöitä ja eniten α-synukleiinia ilmentävät hiiret
suoriutuivat merkitsevästi heikommin pyörivällä sauvalla, joka mittaa hiirten
liikkumiskykyä, tasapainoa ja kestävyyttä. Inkluusiokappaleet sijaitsivat sekä
solulimassa että tumassa. Tämä eroaa Parkinsonin tautia sairastavista potilaista, joilla
inkluusiot ovat lähes pelkästään solulimassa. Siirtogeenisillä hiirillä TH:n pitoisuudet
sekä entsymaattinen aktiivisuus olivat merkitsevästi vähentyneet. Toisessa
tutkimuksessa samalle hiirikannalle annosteltiin stereotaktisena injektiona lysosomien
autofagian säätelijää (bekliini 1), joka vähensi α-synukleiinin aggregoitumista ja
hermopäätteiden tuhoutumista (Spencer ym. 2009). Eräässä tutkimuksessa pitkäaikainen
suun kautta annosteltu N-asetyylikysteiini (NAC) suojasi TH:a sisältäviä hermopäätteitä
tuhoutumiselta (Clark ym. 2010). NAC-hoidetuilla hiirillä oli myös merkitsevästi
vähemmän α-synukleiinia aivokuorella ja aivojuoviossa. Näiden lisäksi passiivinen
immunisaatio α-synukleiinin vasta-aineella (9E4) on tehokkaasti vähentänyt α-
synukleiinin aggregoitumista ja liikehäiriöiden kehittymistä (Masliah ym. 2011).
Kun promoottorina käytettiin Thy-1:tä, hiirille kehittyi muutamassa kuukaudessa
havaittavia ja ajan mittaan pahenevia liikehäiriöitä (Fleming ym. 2004). α-synukleiinia
aggregoitui sekä aivokuorelle että mustatumakkeeseen (Rockenstein ym. 2002; Fleming
ym. 2004). Näillä hiirillä havaittiin myös hajuaistin heikentymistä, mikä on yleinen
prekliininen Parkinsonin taudin oire (Fleming ym. 2008). Lisäksi korkeat α-
synukleiinipitoisuudet heikentävät aivokuorelta aivojuovioon kulkevia
hermosoluyhteyksiä vähentämällä välittäjäaineiden vapautumista ennen kuin
dopamiinihermosolut alkavat tuhoutua (Wu ym. 2010). Thy-1 saattaa siis olla hyvä
promoottori tutkittaessa Parkinsonin taudin varhaisia hermostoon kohdistuvia
muutoksia. Samalla hiirikannalla on havaittu, että nuorilla hiirillä (enintään 6 kk)
10
aivojuovion solunulkoisen dopamiinin määrä oli huomattavasti kohonnut (Lam ym.
2011). Myös hiirten liikeaktiivisuus avokenttätestissä oli kasvanut. Samoilla hiirillä
aivojuovion dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden pitoisuudet olivat selvästi
laskeneet 14 kuukauden iässä. Eräässä tutkimuksessa hermosoluja oksidatiiviselta
stressiltä sekä dopamiinin haitallisilta vaikutuksilta suojaava mikrotubuluksiin liittyvä
peptidi NAPVSIPQ (NAP) paransi hiirten liikkumiskykyä ja vähensi α-synukleiini-
inkluusiokappaleiden muodostumista (Fleming ym. 2011). Myös kolesterolin
muodostumista estävän lääkeaineen, lovastatiinin vaikutuksia α-synukleiinin
kertymiseen on tutkittu, koska kolesterolin hajoamistuotteen 27-hydroksikolesterolin on
epäilty nopeuttavan α-synukleiiniaggregaattien muodostumista (Koob ym. 2010). WT
α-synukleiinia ilmennettiin hiirissä hiiren Thy1.2- ja PDGF-β-promoottorilla ja α-
synukleiini kertyi laajasti molemmissa ryhmissä. Lovastatiinihoito vähensi
merkitsevästi α-synukleiinin kertymistä siirtogeenisissä hiirissä, mutta se ei vaikuttanut
merkitsevästi kontrollihiirten α-synukleiinipitoisuuksiin.
Rotan TH-promoottori ilmensi WT-α-synukleiinia voimakkaasti mustatumakkeessa,
mutta liikehäiriöitä tai hermostomuutoksia nigrostriataaliradalla ei havaittu (Richfield
ym. 2002). Siirtogeenisillä hiirillä dopamiinin kuljettajaproteiinin pitoisuus oli
kohonnut, mutta dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden tasoissa ei havaittu
muutoksia. Sen sijaan toisessa (TH)WT-α-synukleiinimallissa hiirten liikeaktiivisuus
laski ajan mittaan ollen lopulta 22 kuukauden ikäisillä hiirillä 78 % kontrollihiirten
aktiivisuudesta (Thiruchelvam ym. 2004). Mustatumakkeen TH:a sisältävien
hermopäätteiden määrä oli laskenut 19 kuukaudessa 19 %.
Konditionaalisessa poistogeenisessä hiirimallissa havaittiin, että korkeat α-
synukleiinipitoisuudet vähentävät uusien hermosolujen muodostumista ja aiheuttavat
hermosolujen tuhoutumista aivotursossa (Nuber ym. 2008). Lisäksi hiirille kehittyi
pyörivällä sauvalla havaittavia liikehäiriöitä. Mallissa käytettiin hamsterin
prioniproteiinin promoottoria sekä kalsium/kalmoduliini-riippuvaista proteiinikinaasi IIα –
promoottoria (CaMKIIα-promoottori). Promoottoreihin oli liitetty tetrasykliinikontrolloitu
transaktivaattori (tTa), jolloin α-synukleiinigeeni voidaan halutessa hiljentää
doksisykliinillä. Geenin hiljentämisen jälkeen α-synukleiinin yli-ilmentyminen ja
11
hermosolujen tuhoutuminen loppuivat, mutta oireet eivät hävinneet. Näin ollen α-
synukleiinin määrää pitäisi pystyä rajoittaa mahdollisimman varhaisissa sairauden
vaiheissa. Toisessa vastaavanlaisessa mallissa havaittiin, että juuri kypsyvät hermosolut
ovat herkimpiä α-synukleiinin yli-ilmentymisen haitallisille vaikutuksille (Lim ym.
2010).
3.2 A53T-α-synukleiinia ilmentävät hiiret
Myös A53T-α-synukleiinin ilmentämiseen on käytetty eri promoottoreita, mutta
promoottorista riippumatta se vaikuttaa aiheuttavan voimakkaimmat hermostoon
kohdistuvat muutokset sekä oireet verrattuna WT- ja A30P-α-synukleiiniin.
Promoottoreista käyttökelpoisin lienee mPr-promoottori, joka näyttää muutamissa
tutkimuksissa ilmentävän Parkinsonin tautia eniten oikeita potilaita muistuttavalla
tavalla (Giasson ym. 2002).
Hiiren Thy-1-promoottoria käytettäessä A53T-α-synukleiini on aiheuttanut hiirille
selkäytimeen ja hermo-lihasliitoksiin merkittäviä muutoksia, joista seurasi varhain
havaittavia liikehäiriöitä (van der Putten ym. 2000). Mustatumakkeen
dopamiinihermosoluissa ei kuitenkaan havaittu muutoksia. Kun käytettiin mPr-
promoottoria, hiiret olivat terveitä ja oireettomia kahdeksan kuukauden ikään asti, jonka
jälkeen hiirten sukiminen vähentyi, paino laski ja niille ilmaantui ajoittaisia raajojen
halvauksia (Giasson ym. 2002). Oireet alkoivat myöhään, mutta etenivät nopeasti ja
hiiret olivat täysin toimintakyvyttömiä kolmen viikon kuluessa ensimmäisten oireiden
alkamisesta. Hiirten aivoista ja selkäytimistä löytyi paljon liukenemattomia α-
synukleiiniaggregaatteja. Myös kahdessa muussa samalla promoottorilla tehdyssä
tutkimuksessa A53T-α-synukleiini aiheutti vakavat oireet (Lee ym. 2002; Martin ym.
2006). Ikääntyville hiirille kehittyi liikehäiriöitä, jotka johtivat nopeaan kuolemaan.
Aivoihin kertyi sekä α-synukleiinia että ubikitiiniä. Siirtogeenisten hiirten
mitokondriaalisessa DNA:ssa havaittiin häiriöitä, ja lisäksi mitokondrioihin kertyi α-
synukleiini-inkluusiokappaleita (Martin ym. 2006). Lisäksi näiden hiirten
liikehermosolujen lukumäärä oli vähentynyt selvästi (75 %). Yllättäen myöskään Leen
12
tutkimuksessa WT- tai A30P-α-synukleiinia ilmentävillä hiirillä ei havaittu merkittäviä
hermostomuutoksia tai oireita, vaikka proteiinia muodostui paljon (Lee ym. 2002).
Näiden tulosten perusteella A53T-α-synukleiini on kaikkein haitallisin hermosolujen
normaalille toiminnalle.
(mPrP)A53T-α-synukleiinia ilmentäville hiirille on kehittynyt liikehäiriöitä myös
silloin, kun α-synukleiini ei ole aggregoitunut (Gispert ym. 2003). Hiirten
suoriutuminen heikentyi merkitsevästi useissa testeissä (askelpituus, avokenttä,
etutassujen puristusvoima ja pyörivä sauva) joko ensimmäisen tai vasta toisen
elinvuoden aikana α-synukleiinitasosta riippuen. (mPrP)A53T-α-synukleiinin yli-
ilmentymisen on toisaalta havaittu aiheuttavan myös yliaktiivisuutta, vaikka yleensä
siitä seuraa ajan mittaan pahenevia liikehäiriöitä ja liikeaktiivisuuden laskua.
Siirtogeeniset hiiret olivat liikeaktiivisuudeltaan normaaleja viiden kuukauden ikäisinä,
mutta seitsemän kuukauden iässä hiirten havaittiin olevan merkitsevästi yliaktiivisia
liikeaktiivisuustestissä (Unger ym. 2006). Hiiret olivat 19 kuukauden ikäisinä yhä
yliaktiivisia, mutta 15 % hiiristä sai vanhemmalla iällä liikehäiriöitä ja nämä hiiret
kuolivat 2-3 viikossa. Yliaktiivisilla hiirillä havaittiin dopamiinin D1-reseptorin
lukumäärän nousseen mustatumakkeessa ja yliaktiivisuus kumoutuikin D1-reseptorin
estäjällä (SCH 23390). Dopamiinin kuljettajaproteiinin lukumäärän ja dopamiinin
takaisinoton havaittiin laskeneen aivojuoviossa. Tämä tutkimus eroaa siis huomattavasti
aiemmin käsitellyistä tutkimuksista, jossa (mPrP)A53T-α-synukleiinin aiheuttamat
oireet muistuttivat hyvin Parkinsonin tautipotilaiden oireita. Erot selittynevät A53T-α-
synukleiinigeenin ilmentymisvoimakkuuden eroilla, koska aiemmissa tutkimuksissa α-
synukleiini kertyi ilmeisesti voimakkaammin. Tutkijat arvelivat, että A53T-α-
synukleiinipitoisuuksien noustessa korkeiksi oireet muuttuvat yliaktiivisuudesta
monenlaisiin liikehäiriöihin (Unger ym. 2006). Tämä johtunee siitä, että vasta korkeat
α-synukleiinipitoisuudet aiheuttavat liikehermosolujen tuhoutumista erityisesti
selkäytimessä. Uudemmassa (mPrP)A53T-α-synukleiinitutkimuksessa mitattiin
aivojuovion dopamiinipitoisuuksia ennen kuin hermosolujen odotettiin tuhoutuvan
(Kurz ym. 2010). Nuorten hiirten aivojuovion dopamiinitasojen havaittiin olevan
suoraan verrannollisia α-synukleiinin pitoisuuksiin, mikä on tyypillistä Parkinsonin
taudin varhaisessa vaiheessa. Yllättäen dopamiinitasot pysyivät korkeina myös
13
vanhoilla hiirillä. Vanhoilla hiirillä ei myöskään havaittu selvää hermosolujen
tuhoutumista, α-synukleiiniaggregaatteja eikä TH-tasojen laskua. Dopamiinipitoisuuden
nousun lisäksi havaittiin dopamiinia pilkkovan entsyymin (katekoli-O-
metyylitransferaasi) määrän vähentyneen sekä dopamiinireseptoreiden määrän
nousseen. Nämä löydökset saattavat kuvastaa aivojen pyrkimystä korjata dopamiinin
vähentyneen vapautumisen seurauksia.
Lisäksi (mPrP)A53T-hiirillä on havaittu muutoksia noradrenaliinin pitoisuuksissa
(Sotiriou ym. 2010). 15 kuukauden ikäisillä siirtogeenisillä hiirillä noradrenaliinin
pitoisuus oli merkitsevästi laskenut aivojuoviossa, mustatumakkeessa sekä
hajukäämissä. TH:n määrä oli laskenut selkäytimessä ja hajukäämissä, mutta
dopamiinipitoisuus ei ollut vähentynyt. Tämä viittaa juuri noradrenaliinia erittävien
hermopäätteiden tuhoutumiseen. Hiirten noradrenaliinia erittävät hermosolut saattavat
siis olla vielä dopamiinihermosolujakin herkempiä α-synukleiinin haitallisille
vaikutuksille. Rotan TH-promoottori ilmensi A53T-α-synukleiinia pelkästään
nigrostriataalijärjestelmän hermosolujen solukeskuksissa, hermosolujen
viejähaarakkeissa sekä hermopäätteissä (Richfield ym. 2002). Näille hiirille kehittyi iän
myötä liikehäiriöitä samalla, kun dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden
pitoisuudet laskivat. Dopamiinihermosolujen tuhoutumista ei kuitenkaan havaittu.
Konditionaalisessa poistogeenisessä hiirimallissa CaMKIIα-promoottorilla ilmennetty
A53T-α-synukleiini kertyi erityisesti limbiseen järjestelmään saaden aikaan
hermotukisolujen liiallista aktivaatiota ja jakautumista, minkä lisäksi hiirille kehittyi
muistihäiriöitä (Lim ym. 2011). Nämä muutokset kumoutuivat osittain, kun geeni
hiljennettiin doksisykliinillä. Toisessa konditionaalisessa hiirimallissa doksisykliiniä
sisältävää ruokaa annosteltiin emoille tiineysajan alusta alkaen, jolloin poikasilla alkaa
muodostua A53T-α-synukleenia vasta doksisykliinin annostelun loppumisen jälkeen
(Lin ym. 2012). Geenin ilmentämisessä käytettiin aivolisäkkeen homeobox-geeni-3:n
(PITX3) promoottoria, johon oli liitetty tTa. PITX3-promoottori ilmentää geeniä
lähinnä keskiaivojen dopamiinihermosoluissa, joiden havaittiin tuhoutuvan etenevästi.
α-synukleiini kertyi keskiaivojen dopamiinihermosoluihin ja aggregoitui hermosolujen
viejähaarakkeisiin. Lisäksi α-synukleiinin havaittiin aiheuttavan dopamiinihermosolujen
14
normaalin toiminnan kannalta tärkeän transkriptiotekijä Nurr1:n tuhoutumista. Hiirten
suoriutuminen avokenttä-, pyörivä sauva- sekä askelpituustestissä heikentyi 1-2
kuukaudessa.
Siirtogeeni saadaan ilmentymään vain α-synukleiinia sisältävissä soluissa, kun
käytetään α-synukleiinigeenin luonnollista promoottoria (Kuo ym. 2010). (aSyn)A53T-
hiirille kehittyi ajan mittaan pahenevia suoliston toimintahäiriöitä, jotka havaittiin jo 3
kuukauden iässä, ennen esimerkiksi hajuaistin häiriöitä. Suoliston toimintahäiriöt ovat
mielenkiintoinen tutkimuskohde, koska ne saattavat alkaa jo vuosikymmeniä ennen
Parkinsonin taudin varsinaista puhkeamista. Siirtogeenisille hiirille kehittyi myös
liikehäiriöitä (avokenttätesti ja pyörivä sauva), vaikka keskushermostossa ei havaittu α-
synukleiiniaggregaatteja, hermosolujen tuhoutumista tai muutoksia aivojuovion
dopamiinitasoissa.
3.3 A30P-α-synukleiinia ilmentävät hiiret
A30P-α-synukleiinin ilmentämisessä promoottorin valinta näyttää yhtä tärkeältä kuin
WT-α-synukleiinin kohdalla. Ainakin Thy-1-promoottori vaikuttaa käyttökelpoiselta
Parkinsonin taudin mallintamisessa, sillä yli-ilmentymisen aiheuttamat
hermostomuutokset ja oireet alkavat varsin myöhään. A53T-α-synukleiinin verrattuna
A30P-α-synukleiinin yli-ilmentyminen on kuitenkin vähemmän haitallista (Lee ym.
2002; Unger ym. 2006). mPr-promoottorilla A30P-α-synukleiini ilmentyi voimakkaasti,
mutta hiirille ei kehittynyt selviä oireita tai haitallisia aivoihin kohdistuvia muutoksia 24
kuukaudessa (Lee ym. 2002). α-synukleiinia kertyi hiirten aivoihin, mutta siitä ei
muodostunut samanlaisia liukenemattomia aggregaatteja kuin A53T-α-synukleiinia
ilmentävillä hiirillä. Myöskään toisessa samalla promoottorilla tehdyssä tutkimuksessa
ei havaittu liikehäiriöitä tai liikeaktiivisuuden muutoksia, vaikka A30P-α-synukleiinia
muodostui paljon (Unger ym. 2006). Koeputkikokeissa on havaittu, että A53T-α-
synukleiini muodostaa A30P-α-synukleiinia herkemmin liukenemattomia aggregaatteja
(Conway ym. 1998). Tämä voi osittain selittää erot hiirten oireiden välillä. On myös
tutkimuksia, joissa (mPrP)A30P-α-synukleiini on aiheuttanut hiirille liikeaktiivisuuden
15
laskun sekä heikentyneen suoriutumisen pyörivällä sauvalla, vaikka
dopamiinihermosolujen tuhoutumista ei näissäkään ole havaittu (Yavich ym. 2005;
Piltonen ym. 2013). Kuitenkin tällä hiirikannalla dopamiinin vapautuminen
aivojuoviossa on vähentynyt voimakkaassa stimulaatiossa (Yavich ym. 2005). Lisäksi
α-synukleiinia kertyi aivojuovioon, aivotursoon ja aivokuorelle (Yavich ym. 2005;
Piltonen ym. 2013). Hamsterin Pr-promoottorilla α-synukleiini ilmentyi myös laajasti ja
hiirille kehittyi vakavia liikehäiriöitä iän myötä (Gomez-Isla ym. 2003).
Keskushermostossa havaittiin gliasolujen määrän ja aktiivisuuden nousseen, mutta
dopamiinihermosolujen määrässä tai dopamiinin pitoisuuksissa ei tapahtunut
muutoksia.
Thy-1 promoottoria käytettäessä A30P-α-synukleiini ilmentyi hiirten vanhetessa joka
puolella aivoja, mutta mustatumakkeessa ei havaittu α-synukleiinin aggregoitumista
(Kahle ym. 2001; Neumann ym. 2002; Freichel ym. 2007). Ilmeisesti Thy-1-
promoottori ei ilmennä α-synukleiinigeeniä tarpeeksi paljon mustatumakkeessa. α-
synukleiini laskostui ja fosforyloitui epänormaalisti, mikä voi aiheuttaa häiriöitä aivojen
normaalin toimintaan. Erityisesti aivorungossa sekä selkäytimessä havaittiin
normaalista poikkeavia muutoksia ja hiirille kehittyikin ensimmäisen elinvuoden aikana
liikehäiriöitä (Neumann ym. 2002). Neljän kuukauden ikäisillä Thy-1-A30P-hiirillä ei
havaittu käytösmuutoksia eikä α-synukleiinin aiheuttamia muutoksia hermosoluissa,
mutta 12 kuukauden iässä nämä hiiret suoriutuivat merkitsevästi kontrollihiiriä
heikommin kognitiota eli älyllistä suorituskykyä mittaavista testeistä (Morrisin
vesisokkelo ja pelkoehdollistumiskoe) ja samalla myös α-synukleiinin aiheuttamia
muutoksia aivoissa oli havaittavissa (Freichel ym. 2007). Nuorten siirtogeenisten hiirten
tulokset liikeaktiivisuustestissä ja pyörivällä sauvalla eivät eronneet kontrolleista, mutta
12 kuukauden ikäisinä hiiret olivat yliaktiivisia. Toisen elinvuoden aikana hiirten
liikeaktiivisuus alkoi kuitenkin heikentyä merkitsevästi ja hiiret saivat jopa kuolemaan
johtavia oireita.
16
3.4 Muita siirtogeenisiä malleja
Villityypin ja yksittäisten pistemutatoituneiden proteiinien ilmentämisen lisäksi
Parkinsonin tautia on mallinnettu hiirissä esimerkiksi käyttämällä poistogeenisiä hiiriä,
fuusioproteiineja sekä mutaatioiden yhdistelmiä. WT-α-synukleiinin ja vihreän
fluoresoivan proteiinin (GFP) fuusioproteiinia on ilmennetty PDGF-β-promoottorilla,
joka aiheutti α-synukleiinin kertymistä aivokuorelle ja muihin aivojen osiin
(Rockenstein ym. 2005). Lysosomijärjestelmässä oli havaittavissa toimintahäiriöitä ja
lysosomeissa α-synukleiini-GFP-proteiinin kertymistä. Näitä tuloksia on tulkittava
varoen, koska GFP:n liittäminen α-synukleiinin rakenteeseen saattaa edistää α-
synukleiinin aggregoitumista.
A30P- ja A53T-kaksoismutatoituneen α-synukleiinin yli-ilmentyminen (hamsterin Thy-
1-promoottori) aiheutti hiirille ajan mittaan pahenevia liikehäiriöitä, jotka alkoivat 2,5
kuukauden iässä (Ono ym. 2009). Hiiret suoriutuivat heikommin pyörivällä sauvalla
sekä pystysuoralla rimalla laskeutumisessa. Kun hiiriä hoidettiin proteiinien
oikeinlaskostumista tehostavalla ja aggregoitumista estävällä 4-fenyylibutyyrihapolla
(PBA), liikehäiriöt lieventyivät. Suun kautta annostellun PBA:n havaittiin vähentävän
mustatumakkeen TH:a sisältävien hermosolujen tuhoutumista sekä pysäyttävän
fosforyloituneen α-synukleiinin kertymisen. Näiden seurauksena aivojuovion
dopamiinipitoisuus ei enää laskenut. PBA ei laskenut α-synukleiinia sisältävien
hermosolujen lukumäärää, jonka perusteella PBA ei ole hermosoluille myrkyllinen
yhdiste. Toisessa A30P/A53T-mallissa rotan TH-promoottori aiheutti myös ajan mittaan
pahenevia liikehäiriöitä, mutta kahden kuukauden iässä hiirten liikeaktiivisuus oli vielä
ennallaan (Thiruchelvam ym. 2004). Kahdeksan kuukauden kohdalla tehdyssä
mittauksessa liikeaktiivisuus oli laskenut ja lopulta 22 kuukauden iässä aktiivisuus oli
60 % kontrollihiirten aktiivisuudesta. 19 kuukaudessa mustatumakkeen TH:a sisältävien
hermopäätteiden määrä oli vähentynyt 55 %.
Parkinsonin taudin mallintamisessa on käytetty myös laboratoriossa luotua Y39C-
pistemutaatiota, jossa tyrosiini on vaihtunut kysteiiniin (Zhou ja Freed 2004). Y39C-
mutaation on havaittu lisäävän α-synukleiinin aggregoitumista soluviljelmissä. (Thy-
17
1)Y39C-hiirillä α-synukleiini yli-ilmentyi laajasti aivoissa ja 9-12 kuukauden iässä
hiirille kehittyi pyörivällä sauvalla havaittavia liikehäiriöitä (Zhou ym. 2008). 15-18
kuukauden iässä α-synukleiini alkoi muodostaa oligomeerejä liikehäiriöiden yhä
pahentuessa. α-synukleiini oli aggregoitunut voimakkaasti hiirten ollessa 21-24
kuukauden ikäisiä, jolloin havaittiin myös Lewyn kappaleiden kaltaisia α-synukleiinia
ja ubikitiiniä sisältäviä inkluusioita sekä solukuolemaa. α-synukleiini oli usein
fosforyloitunut 129-seriinin kohdalta. Hiirten muisti heikentyi iän myötä, mikä
havaittiin selvästi Morrisin vesisokkelossa. Tämän tutkimuksen perusteella (Thy-
1)Y39C vaikuttaa mallintavan melko hyvin Parkinsonin taudin oireita, sillä liikehäiriöt
alkavat hitaasti ja pahenevat ajan mittaan. Lisäksi α-synukleiinin aggregoitumista ja
Lewyn kaltaisten kappaleiden muodostumista edelsi α-synukleiinin
oligomerisoituminen, mikä on harvinaista siirtogeenisissä eläinmalleissa. Tässäkään
tutkimuksessa ei kuitenkaan havaittu mustatumakkeen merkitsevää
dopamiinihermosolujen tuhoutumista.
α-synukleiinia on ilmennetty hiirissä käyttämällä luonnollisesta α-synukleiinista
lyhyempiä osia, jolloin voidaan selvittää eri terminaalialuiden merkitystä proteiinin
aggregoitumiseen ja haitallisten hermostomuutosten syntymiseen. Kun C-
terminaalialueesta katkaistua α-synukleiinia (aminohapot 1-120) ilmennettiin rotan TH-
promoottorilla, hiirille muodostui α-synukleiini-inkluusioita mustatumakkeeseen sekä
hajukäämiin (Tofaris ym. 2006; Shelkovnikova ym. 2011). Siirtogeenisillä hiirillä
aivojuovion dopamiinipitoisuus oli laskenut merkitsevästi jo kolmen kuukauden
ikäisinä ja hiirten luonnollinen liikeaktiivisuus oli vähentynyt merkitsevästi 18
kuukauden iässä kontrolleihin verrattuna (Tofaris ym. 2006). Toisessa tutkimuksessa
siirtogeenisten hiirten suoriutuminen pyörivällä sauvalla oli merkitsevästi heikentynyt
14 kuukauden iässä (Shelkovnikova ym. 2011). Antihistamiini dimeboliinin on havaittu
hidastavan Alzheimerin taudin oireiden ilmentymistä, mutta tässä tutkimuksessa sen
jatkuva annostelu ei parantanut hiirten suorituskykyä eikä estänyt aivojuovion
dopamiinipitoisuuden laskua tai α-synukleiinin kertymistä. Mustatumakkeen
dopamiinihermosolut eivät tuhoutuneet (Tofaris ym. 2006; Shelkovnikova ym. 2011).
Käyttämällä lyhennettyä α-synukleiinia (aminohapot 1-130, rotan TH-promoottori) on
saatu luotua siirtogeenimalli, jossa havaitaan selvää mustatumakkeen
18
dopamiinihermosolujen tuhoutumista (Wakamatsu ym. 2008). Tuhoutuminen kuitenkin
tapahtui alkionkehityksen aikana geenin ilmentymisen alkamisen jälkeen eikä siis ollut
asteittaista kuten oikeissa potilaissa. Siirtogeenisten hiirten luonnollinen liikeaktiivisuus
oli laskenut luultavasti aivojuovion dopamiinipitoisuuden vähentymisen seurauksena.
Muita liikehäiriöitä ei havaittu ja myös liikeaktiivisuuden lasku palautui levodopalla.
α-synukleiinipoistogeenisillä hiirillä havaittiin muutoksia nigrostriataalisella
dopamiiniradalla, mutta ei vakavia oireita (Abeliovich ym. 2000). Dopamiinin
vapautuminen lisääntyi sähköstimulaation tai Ca2+
-ionien vapautumisen seurauksena,
mutta aivojuovion dopamiinin pitoisuus laski. α-synukleiinin puuttuminen aiheuttaa
häiriöitä dopamiinijärjestelmään viitaten rooliin tärkeänä dopamiinin vapautumisen
presynaptisenä säätelijänä.
4 α-SYNUKLEIININ VIRUSVEKTORIMALLIT
Virusvektorit ovat perinteisiä hermomyrkkymalleja ja siirtogeenisiä eläimiä uudempi
menetelmä mallintaa sairauksia eläimissä. Koska Parkinsonin taudille on tyypillistä
mustatumakkeen dopamiinihermosolujen rappeutuminen, suora geeninsiirto näihin
hermosoluihin on mielenkiintoinen tapa tutkia sairauden oireita, syitä ja hoitoa
eläimissä (Korecka ym. 2001). Virusvektorimalleissa tapahtuu dopamiinihermosolujen
asteittaista tuhoutumista. Tämä Parkinsonin taudin tärkeä löydös puuttuu yleensä
siirtogeenisistä eläinmalleista. Yleisimmin käytetyt vektorit geeninsiirroissa ovat
lentivirusvektorit ja adenoassosioidut virusvektorit (AAV-vektorit). α-synukleiinigeenin
siirtämisessä käytetään tavallisesti AAV-vektoreita, koska niitä pidetään tehokkaampina
ja turvallisempina keskushermostoon kohdistuvissa geeninsiirroissa (Korecka ym.
2001). Virukset luokitellaan eri serotyyppeihin pinta-antigeeniensä perusteella. AAV-
vektorin avulla tehdyissä geeninsiirroissa on käytetty ainakin serotyyppejä 2 ja 6 sekä
serotyyppien risteytystä AAV1/2.
19
4.1 Virusvektorit rotissa
Vaikka virusvektoreiden avulla α-synukleiinia on ilmennetty rotissa jo 10 vuotta sitten,
julkaistuja tutkimuksia on varsin vähän (Taulukko 3). Niissä on käytetty sekä WT- että
A53T-α-synukleiinia. Ilmeisesti ensimmäisessä, vuonna 2002 julkaistussa
tutkimuksessa AAV-vektoreissa injisoitiin joko WT- tai A53T-α-synukleiinigeeniä
rottien mustatumakkeen yläpuolelle (Kirik ym. 2002). α-synukleiini ilmentyi
tehokkaasti kolmessa viikossa ja nigrostriataaliset dopamiinihermosolut tuhoutuivat
etenevästi. Dopamiinihermosolujen määrä vähentyi 30-80 % ja aivojuovion dopamiinin
määrä laski 40-50 %. Tutkimuksessa havaittiin, että rottien liikkumiskyky heikkeni
merkitsevästi, jos dopamiinihermosoluja tuhoutui yli 50-60 %. Tulosten perusteella
juuri dopamiinihermosolut ovat herkkiä korkeille α-synukleiinipitoisuuksille, koska
haitallisia muutoksia ei havaittu muissa kuin dopamiinihermosoluissa.
Toisessa virusvektorimallissa siirrettiin A53T-α-synukleiinigeeni AAV1/2-vektorissa
rottien mustatumakkeeseen (Koprich ym. 2010). Myös tässä tutkimuksessa α-
synukleiini ilmentyi voimakkaasti kolmessa viikossa ja liukenemattomia α-
synukleiiniaggregaatteja havaittiin mustatumakkeen dopamiinihermosoluissa, joiden
määrä vähentyi 52 %. Yllättäen myös eräänä kontrollina käytetty AAV1/2-GFP-
proteiini aiheutti mustatumakkeen dopamiinihermosolujen tuhoutumista (24 %), mutta
tyhjä AAV1/2-vektori ei tuhonnut hermosoluja. Tämän perusteella ei siis voida tehdä
johtopäätöstä, että dopamiinihermosolut olisivat herkkiä pelkästään korkeille α-
synukleiinipitoisuuksille. Aivojuoviossa A53T-α-synukleiini-injektiosta seurasi TH:a
sisältävien hermosolujen määrän vähentyminen (53 %), mutta GFP-ryhmässä vastaavaa
ei havaittu.
AAV6-vektorissa rotille mustatumakkeen yläpuolelle injisoitu WT-α-synukleiini
ilmentyi voimakkaasti nigrostriataaliradalla jo kolme viikkoa injektion jälkeen
(Decressac ym. 2012a). Kahdeksan viikon jälkeen rotat suoriutuivat merkitsevästi
heikommin liikkumiskykyä mittaavissa kokeissa. Tutkimuksessa α-synukleiinimalli
ilmensi 6-OHDA:aan verrattuna paremmin Parkinsonin taudin hermostomuutoksia.
Virusvektorimallin aiheuttamat muutokset muistuttivat enemmän hermomyrkyillä
20
aiheutettua osittais- kuin totaalileesioita, mutta liikkumiskykyä mittaavissa kokeissa
virusvektorit aiheuttivat enemmän totaalileesiota muistuttavat tulokset. Suurimmat erot
hermomyrkky- ja virusvektorimallin välillä olivat siinä, miten hermostoon kohdistuvat
muutokset ja oireet kehittyivät. Tutkimusryhmän mukaan virusvektorit aiheuttavat
asteittain etenevän solutuhon ja hitaammin kehittyvät käytösmuutokset verrattuna
hermomyrkkyjen aiheuttamiin äkillisiin muutoksiin. Saman mallin avulla on myös
pyritty selvittämään, miksi hermomyrkkymalleissa dopamiinihermosoluja
tuhoutumiselta tehokkaasti suojannut gliasoluperäinen hermokasvutekijä (GDNF) ei ole
ollut tehokas kliinisissä kokeissa (Decressac ym. 2012b). Tulosten perusteella α-
synukleiinin yli-ilmentyminen soluissa johtaa transkriptiotekijä Nurr1:n ilmentymisen
vähentymiseen. Nurr1 säätelee GDNF:n reseptorin Ret:n ilmentymistä. Tästä seuraa siis
solujen Ret-reseptoreiden väheneminen, jolloin solut eivät reagoi GDNF:ään ja
GDNF:n hermosoluja suojaavat vaikutukset jäävät heikoiksi. Nurr1:n yli-ilmentymisen
(AAV6-vektorilla) havaittiin puolestaan suojaavaan hermosoluja α-synukleiinin
haitallisilta vaikutuksilta, joten Nurr1 on mahdollinen hermosoluja suojaava
lääkekandidaatti.
Taulukko 3. α-synukleiiniin perustuvien virusvektoritutkimusten virusten serotyypit,
tiitterit, promoottorit sekä geenin ilmentymisen voimistajat (transkription jälkeiset
säätelyosat). A53T = A53T-α-synukleiini, CBA = kanan β-aktiini, CMV = sytomegalovirus,
eCMV = sytomegaloviruspromoottorin voimistajat, S1G = synapsiini-1-geeni, WPRE =
metsämurmelin hepatiittiviruksen transkription jälkeinen säätelyosa, WT = villityypin α-
synukleiini, gc/ml = genomikopiota millilitrassa, gp/ml = genomipartikkelia millilitrassa, IU/ml
= infektoivaa yksikköä millilitrassa, vg/ml = virusgenomia millilitrassa.
Viite Vektori Tiitteri Promoottori Voimistaja
(Kirik ym.
2002)
ei
ilmoitettu
WT: 8,2 x 1011 IU/ml
A53T: 1,4 x 1012
IU/ml CBA eCMV
(Koprich ym.
2010) AAV1/2 A53T: 5,1 x 10
12 gp/ml CBA WPRE
(Decressac
ym. 2012a) AAV6 WT: 3,7 x 10
12 gc/ml S1G WPRE
(Decressac
ym. 2012b) AAV6 WT: 2,5 x 10
13 gc/ml S1G WPRE
(St Martin ym.
2007) AAV2 WT: 8,9 x 10
10 vg/ml CMV WPRE
(Cao ym.
2010) AAV2 WT: 6,0 x 10
10 vg/ml ei ilmoitettu ei ilmoitettu
(Ulusoy ym.
2012) AAV6
WT: 0,7 x 1012
, 1,5 x 1012
,
3,0 x 1012
gc/ml S1G WPRE
21
4.2 Virusvektorit hiirissä
Myös hiirillä tehtyjä tutkimuksia on julkaistu vasta vähän. Hiirissä virusvektorit
näyttävät aiheuttavan hieman lievemmät oireet ja hermostoon kohdistuvat muutokset
kuin rotissa. Ensimmäinen hiirillä tehty tutkimus, jossa käytettiin virusvektoria α-
synukleiinin yli-ilmentämisessä, julkaistiin vuonna 2007 (St Martin ym. 2007). AAV2-
vektoreissa mustatumakkeeseen siirretty α-synukleiinigeeni yli-ilmentyi 4, 12 ja 24
viikkoa injektion jälkeen. Dopamiinihermosolujen määrä oli ennallaan neljän viikon
kuluttua injektiosta, 12 viikon jälkeen oli havaittavissa hyvin lievää määrän alentumista
ja 24 viikon jälkeen solumäärä oli vähentynyt 25 %. Tutkimuksessa mitattiin myös
solun stressistä kertovien proteiinien tasoa. Niistä havaittiin positiivinen korrelaatio α-
synukleiinin ilmentymisen ja solujen stressistä ja mitokondrioiden toimintahäiriöistä
kertovien lämpösokkiproteiinien (Hsp27, Hsp40, Hsp70) sekä kaspaasi 9:n välillä.
Toisessa AAV2-vektoriin perustuvassa tutkimuksessa α-synukleiini yli-ilmentyi jo
kaksi viikkoa injektion jälkeen ja TH:a sisältävien hermosolujen määrä oli vähentynyt
27 % 24 viikkoa injektion jälkeen (Cao ym. 2010). Tutkijat arvelivat, että α-
synukleiinin yli-ilmentyminen lisää IgG-vasta-aineiden muodostumista, mikä aktivoi
mikrogliasoluja tuottamaan tulehdusvälittäjäaineita. Pitkäkestoinen tulehdusreaktio
aiheuttaa hermosolukuolemaa, joten dopamiinihermosolujen tuhoutuminen voi olla
tämän ketjureaktion seuraus.
Uusimmassa julkaistussa tutkimuksessa tutkittiin dopamiinitasojen ja α-synukleiinin
yhteisvaikutuksen merkitystä dopamiinihermosolujen toimintaan (Ulusoy ym. 2012).
WT-α-synukleiinigeenin siirrossa käytettiin AAV6-vektoria, jolla saatiin aikaan α-
synukleiinin yli-ilmentyminen hiiren nigrostriataaliradalla. Tutkimuksessa verrattiin
myös serotyyppejä 2, 5 ja 6 GFP:n geenin siirrossa. Näistä tarkimmin geeniä
nigrostriataaliradalla ilmensi serotyyppi 6, joten tämän perusteella Parkinsonin taudin
mallintamisessa AAV6 saattaa olla käyttökelpoisin. Tutkimuksessa käytettiin
villityypin hiiriä ja hiiriä, joilla oli mutaatio VMAT2-geenissä (vesikulaarinen
monoamiinien kuljetusproteiini-2), josta seuraa heikentynyt dopamiinin varastointi ja
käsittely. Tuloksista havaittiin dopamiinihermosolujen tuhoutuvan enemmän
viimeiseksi mainituilla hiirillä, joilla solunsisäisen dopamiinin määrä oli koholla.
22
Häiriöt dopamiinin säätelyssä saattavat siis voimistaa α-synukleiinin kertymisen
haitallisia vaikutuksia.
5 YHTEENVETO
Erilaiset eläinmallit ovat tärkeä osa Parkinsonin taudin tutkimusta (Beal 2010).
Aiemmin dopamiinihermosolujen tuhoamisessa käytettiin hermomyrkkyjä, jotka
mallintavat melko hyvin Parkinsonin tautipotilaiden liikkumiseen liittyviä oireita.
Tulevaisuudessa käytetään enemmän α-synukleiiniin perustuvia siirtogeenisiä eläin- ja
virusvektorimalleja, sillä ne näyttävät mallintavan hermomyrkkyjä paremmin myös
Parkinsonin taudin aiheuttamia hermostomuutoksia (Giasson ym. 2002; Decressac ym.
2012a). Siirtogeenisiä eläimiä käytettäessä promoottorin valinta näyttää määräävään,
minkälaisia hermostomuutoksia ja oireita α-synukleiinista seuraa. Pistemutaatioista
A53T-α-synukleiinin yli-ilmentyminen aiheuttaa yleensä voimakkaimmat
keskushermostoon kohdistuvat muutokset ja oireet, jotka johtavat jopa kuolemaan (Lee
ym. 2002; Unger ym. 2006). WT- ja A30P-α-synukleiinin osalta tulokset ovat
vaihtelevampia. Joissain tutkimuksessa varsinkin villityypin α-synukleiini aiheuttaa
voimakkaita hermostomuutoksia ja oireita, mutta osassa tutkimuksista kumpikaan näistä
ei aiheuta merkittäviä muutoksia (Rockenstein ym. 2002; Lee ym. 2002; Fleming ym.
2004; Unger ym. 2006). Yleisesti ottaen siirtogeenisten hiirimallien suurin heikkous on
mustatumakkeen dopamiinihermosolujen asteittaisen tuhoutumisen puuttuminen
useimmissa eläinmalleissa, jolloin eläinmallilla on mahdoton testata mahdollista
hermosoluja tuhoutumiselta suojaavaa hoitoa. Yhdessä uudessa konditionaalisessa
hiirimallissa on kuitenkin saatu aikaan keskiaivojen dopamiinihermosolujen etenevää
tuhoutumista (Lin ym. 2012).
Muutamien tutkimusten perusteella virusvektorit vaikuttavat siirtogeenisiä eläinmalleja
paremmalta keinolta mallintaa Parkinsonin tautia jyrsijöissä, koska niissä tapahtuu
asteittaista mustatumakkeen dopamiinihermosolujen tuhoutumista (Kirik ym. 2002;
Decressac ym. 2012a). Lisäksi oireet ja hermostomuutokset ilmenevät nopeammin.
23
Erityisesti rotissa virusvektorit ilmentävät Parkinsonin taudin oireita ja
hermostomuutoksia hyvin. Useat julkaistut tutkimukset ovat kuitenkin saman
tutkimusryhmän tekemiä, joten tulevaisuudessa tarvitaan vielä uusia eri laboratorioissa
tehtyjä tutkimuksia, jotta virusvektoreiden laatu Parkinsonin taudin mallintamisessa
voidaan varmasti osoittaa.
24
II KOKEELLINEN OSA: VILLITYYPIN TAI A53T-α-SYNUKLEIININ YLI-
ILMENTÄMISEN JA YHDISTETYN PREP-ESTÄJÄHOIDON VAIKUTUKSET
HIIRTEN LIIKKUMISKYKYYN JA NIGROSTRIATAALISIIN
DOPAMIINIHERMOSOLUIHIN
25
1 JOHDANTO
α-synukleiini on 140 aminohaposta koostuva proteiini ja aivoissa sitä on noin 1 %
kaikista soluliman proteiineista (Jakes ym. 1994). Viime vuosien aikana α-synukleiini
on yhdistetty rappeuttaviin hermosairauksiin, sillä α-synukleiiniaggregaattien on
havaittu olevan merkittävä osa Lewyn kappaleita, jotka ovat muun muassa Parkinsonin
taudin tyypillinen löydös. Sen lisäksi α-synukleiinigeenin mutaatioiden on havaittu
altistavan harvinaisille suvuittain esiintyville Parkinsonin taudin muodoille
(Polymeropoulos ym. 1997; Krüger ym. 1998; Singleton ym. 2003; Zarranz ym. 2004;
Chartier-Harlin ym. 2004). Näiden lisäksi α-synukleiinin yli-ilmentymisen on havaittu
aiheuttavan liikehäiriöitä esimerkiksi rotissa (Kirik ym. 2002).
Parkinsonin taudin eläinmallien luomisessa on perinteisesti käytetty hermomyrkkyjä tai
siirtogeenisiä jyrsijäkantoja (Chesselet 2008). Myöhemmin on otettu käyttöön
virusvektoreita, joista käytetään erityisesti lentiviruksia ja adenoassosioituja viruksia
(AAV). Virusvektorimallin on havaittu ilmentävän hermomyrkkymalleja paremmin
Parkinsonin taudin hermostoon kohdistuvia muutoksia ja joissakin koeasetelmissa
virusvektorilla aiheutettu α-synukleiinin yli-ilmentyminen on saanut aikaan
nigrostriataalisten hermosolujen rappeutumisen (Decressac ym. 2012a). Lisäksi
virusvektoreilla tehdyt tutkimukset voivat olla lyhytkestoisempia ja siten edullisempia
kuin perinteisillä eläinmalleilla.
PREP eli prolyyliendopeptidaasi on seriiniproteaaseihin kuuluva entsyymi, joka pilkkoo
ensisijaisesti enintään 30 aminohapon mittaisia peptidejä proliinin
karboksyylihappopäästä (Cunningham ja O'Connor 1997). Näin ollen se ei pilko α-
synukleiinia. Sen sijaan PREP:n on havaittu nopeuttavan α-synukleiinin
aggregoitumista ja siten Lewyn kappaleiden kaltaisten proteiinikertymien
muodostumista (Brandt ym. 2008). PREP:n toiminnan estäminen puolestaan vähentää
α-synukleiiniaggregaattien määrää ja niiden muodostumista soluviljelmissä sekä
kahdessa α-synukleiinia ilmentävässä hiirikannassa (Myöhänen ym. 2012). 4-
fenyylibutanoyyli-L-prolyyli-2(S)-syanopyrrolidiini (KYP-2047) on veri-aivoesteen
hyvin läpäisevä PREP-estäjä, jonka vaikutus on tehokas ja pitkäaikainen (Jalkanen ym.
26
2011). Tämän vuoksi se on kiinnostava molekyyli rappeuttavien hermosairauksien
tutkimuksessa.
Tämän työn kokeellinen osa koostui kahdesta eri tutkimuksesta (Taulukko 4).
Ensimmäisessä tutkittiin AAV1-vektorin kykyä siirtää aivojuovioon ihmisen villityypin
(WT) ja A53T-pistemutatoituneen α-synukleiinin geenejä, sekä näiden yli-ilmentymisen
vaikutusta hiirten liikkumiskykyyn ja aivojuovion monoamiinien pitoisuuksiin.
Kirjallisuudessa ei ole aiemmin kuvattu koejärjestelyä, jossa α-synukleiinipatologiaa
pyrittäisiin ilmentämään aivojuovion kautta nigrostriataaliradalla. Toisessa
tutkimuksessa selvitettiin KYP-2047:n vaikutuksia A53T-α-synukleiinin yli-
ilmentymiseen hiiren nigrostriataaliradalla. Virusvektorit injisoitiin jälkimmäisessä
tutkimuksessa mustatumakkeeseen viikko ennen KYP-2047:n tai vehikkelin
aivokammioihin kohdennetun minipumppuannostelun aloitusta. Molemmissa
tutkimuksissa hiirten liikeaktiivisuutta mitattiin 20 tunnin ajan. Tasapainon ja
liikkumiskyvyn mittauksessa käytettiin pyörivää sauvaa ja tasapainorimaa. Kokeiden
lopuksi otetuista aivonäytteistä värjättiin immunohistokemiallisesti α-synukleiini,
tyrosiinihydroksylaasi (TH) ja vihreä fluoresoiva proteiini (GFP). Molempien
tutkimusten hiirten aivonäytteistä mitattiin korkean erotuskyvyn nestekromatografialla
(HPLC) dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden 3,4-dihydroksifenyylietikkahapon
(DOPAC) ja homovanilliinihapon (HVA), sekä 5-hydroksitryptamiinin (5-HT) ja sen
aineenvaihduntatuotteen 5-hydroksi-indolietikkahapon (5-HIAA) pitoisuudet. Näillä
mittauksilla pyrittiin selvittämään, oliko α-synukleiinin ilmentäminen aiheuttanut
hermosolujen katoon tai toiminnan häiriöön viittaavia muutoksia monoamiinien
pitoisuuksissa. Tutkimuksessa II lopuksi mitattiin PREP-eston voimakkuus
aivonäytteistä, mikä varmistaisi osmoottisten minipumppujen toimivuuden.
27
Taulukko 4. Kokeellinen osa koostui kahdesta eri tutkimuksesta, joissa molemmissa oli
neljä ryhmää. A53T aSyn = A53T-α-synukleiini, GFP = vihreä fluoresoiva proteiini,
KYP = 4-fenyylibutanoyyli-L-prolyyli-2(S)-syanopyrrolidiini, Sham = fysiologinen
keittosuolaliuos, STR = aivojuovio, SN = mustatumake, Veh = vehikkeli, WT aSyn =
villityypin α-synukleiini.
Tutkimus I II
Ryhmä 1 2 3 4 5 6 7 8
n 8 8 8 8 6 6 6 6
Injektiopaikka STR STR STR STR SN SN SN SN
Injektoitu aine Sham GFP WT
aSyn
A53T
aSyn Sham Sham
A53T
aSyn
A53T
aSyn
Minipumppu - - - - Veh KYP Veh KYP
Tutkimuksen
kesto 9 viikkoa injektion jälkeen
4 viikkoa minipumpun
asennuksen jälkeen
Avokenttätesti 0, 4, 8 viikkoa injektiosta 0, 2, 4 viikkoa (minipumppujen
asennuksen jälkeen)
Pyörivä sauva,
tasapainorima 0, 3, 6, 9 viikkoa injektiosta
0, 2, 4 viikkoa (minipumppujen
asennuksen jälkeen)
28
2 MATERIAALIT JA MENETELMÄT
2.1 Eläimet
Kokeissa käytettiin yhteensä 60 C57BL/6JRccHsd-uroshiirtä, jotka hankittiin
kahdeksan viikon iässä (Harlan Laboratories, Alankomaat). Hiirten paino oli
tutkimusten aikana 25-35 grammaa. Hiiriä pidettiin 4-6 hiiren ryhmissä, mutta osa niistä
piti erottaa yksittäin tutkimuksen aikana. Lisäksi leikkausten jälkeen hiiret toipuivat
muutaman päivän omissa laatikoissa ja tutkimuksen II hiiret olivat minipumppujen
asennusten jälkeen yksin. Eläimiä säilytettiin sekä Scantainer-kaapissa että sen
ulkopuolella, ja ruokaa ja vettä oli tarjolla jatkuvasti. Vesi vaihdettiin kaksi kertaa
viikossa ja laatikot vaihdettiin yhden tai kahden viikon välein riippuen hiirten
lukumäärästä. Hiirihuoneen valot olivat päällä 06.00-18.00.
2.2 Käytetyt kemikaalit ja lääkeaineet
3,4-dihydroksifenyylietikkahappo
(DOPAC) Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa
4-fenyylibutanoyyli-L-prolyyli-2(S)-
syanopyrrolidiini (KYP-2047) Kuopion Yliopisto, Kuopio, Suomi
5-hydroksi-indolietikkahapon (5-HIAA) Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa
5-hydroksitryptamiini (5-HT) Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa
7-amino-4-metyylikumariini-
standardiliuos (AMC) 10 mM Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa
Aasin normaaliseerumi (DNS) Vector Laboratories, Burlingame CA, USA
ABC-pakkaus Vector Elite Kit PK-6100. Vector Laboratories Inc.,
Burlingame CA, USA
Adenoassosioidut virusvektorit
(ilman voimistajia)
AAV1 SYN-A53T #5-11-10, tiitteri 1,4 x 1012
genomikopiota/ml, NIDA, Baltimore, USA
AAV1 SYN-wt #5-11-10, tiitteri 8,0 x 1012
genomikopiota/ml, NIDA, Baltimore, USA
dsAAV1GWeGFP #10-21-08, tiitteri 2,9 x 1013
genomikopiota/ml, NIDA, Baltimore, USA
Albumiinistandardiliuos 2 mg/ml (BSA) Pierce Biotechnology, USA
BCA reagenssi A ja B Pierce Biotechnology, USA
Buprenorfiinihydrokloridi Temgesic 0,3 mg/ml. Reckitt Benckiser
Pharmaceuticals, Richmond, USA
Depex-peittausaine VWR International, Leuven, Belgia
29
Diaminobentsidiinihydrokloridi (DAB) Sigma Chemical CO, St. Louis, USA
Dimetyylisulfoksidi (DMSO) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Dinatriumvetyfosfaatti (Na2HPO4) Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Dopamiini (DA) Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa
Etanoli 96,5 % (ETAX A) Altia Corporation, Rajamäki, Suomi
Etanoli 99 % (ETAX AA) Altia Corporation, Rajamäki, Suomi
Etikkahappo (CH3COOH) Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Etyleenidiamiinitetraetikkahapon
dinatriumsuola (EDTA) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Fosforihappo Mallinckrodt Baker B.V., Denvender, Hollanti
Gelatiini VWR International, Leuven, Belgia
Homovanilliinihappo (HVA) Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa
Hydroksipropyyli-β-syklodekstriini Acros Organics, New Jersey, USA
Isofluraani Baxter, Vantaa, Suomi
Kaliumdivetyfosfaatti (KH2PO4) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Kaliumkloridi (KCl) Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Ksyleeni Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Kysteiini Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Lidokaiini-adrenaliiniliuos 10 mg/ml Orion Pharma, Espoo, Suomi
Metanoli Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Natriumasetaatti (CH3COONa) Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Natriumdivetyfosfaatti (NaH2PO4) Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Natriumhydroksidi VWR International, Leuven, Belgia
Natriumkloridi Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa
Natriumkloridiliuos 9 mg/ml Fresenius Kabi Norge As, Oslo, Norja
Oksaalihappo Mallinckrodt Baker B.V., Denvender, Hollanti
Paraformaldehydi VWR International, Leuven, Belgia
Pentobarbitaali Mebunat Vet 60 mg/ml, Orion Pharma, Espoo,
Suomi
Perkloorihappo Yliopiston Apteekki, Helsinki, Suomi
Sakkaroosi Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Suc-Gly-Pro-AMC-substraattikantaliuos
10 mM Bachem AG, Budendorf, Sveitsi
Suolahappo Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Tislattu vesi Helsingin Yliopisto, Farmakologian ja toksikologian
osasto, Helsinki, Suomi
Tissue-Tek Sakura, Alphen aan den Rijn, Alankomaat
Triton-X Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Vasta-aineet
- Lampaan anti-aSyn: ab6162, Abcam, Cambridge,
Iso-Britannia
- Kanin anti-GFP: Millipore, Bedford MA, USA
- Kanin anti-TH: AB152, Millipore, Bedford MA,
USA
- Aasin anti-lammas HRP-konjugoitu: ab97125,
Abcam, Cambridge, Iso-Britannia
- Vuohen anti-kani HRP-konjugoitu: Vector
Laboratories, Burlingame CA, USA
- Vuohen anti-kani, biotiinikonjugoitu: BA1000,
Vector Laboratories, Burlingame CA, USA
Vetyperoksidi (H2O2) Merck KGaA, Darmstadt, Saksa
Vuohen normaaliseerumi (GNS) Vector Laboratories, Burlingame CA, USA
30
2.3 Stereotaktinen leikkaus
Virusvektorit injisoitiin hiirten molemmille aivopuoliskoille stereotaktisessa
leikkauksessa (stereotaktinen laite: Stoelting Stereotaxic, Stoelting Co., USA, muut
leikkaukseen tarvittavat osat: AgnTho’s AB, Ruotsi, mikroinjektiolaite: The Stoelting
Quintessential Injector No 53311, Stoelting Co., USA, injektioruisku ja -neula: Nanofil
Syringe and 33 G Blunt Needle: World Precision Instruments Inc., Sarasota, USA).
Hiirten anestesiassa käytettiin isofluraania, jonka pitoisuus aloituksessa oli 4,0 %
(virtausnopeus 200-250 ml/min) ja ylläpidossa 1,0-2,5 %. Paikallispuudutteena
käytettiin 10 mg/ml lidokaiini-adrenaliiniliuosta. Injektiopaikkojen koordinaatit
laskettiin luusaumojen risteymäkohdan eli bregman perusteella ja syvyyskoordinaatti
aivon pinnasta (aivojuovio: A/P: +0,7 mm, M/L: +/-1,8 mm, D/V: -2,7 mm;
mustatumake A/P: -3,10 mm, M/L: +/- 1,1 mm, D/V: -4,1 mm) (Franklin ja Paxinos
1997). Oikea syvyyskoordinaatti mustatumakeinfuusiota varten katsottiin erillisillä
harjoituseläimillä (n = 2), joilla kokeiltiin kahta eri syvyyttä. Virusvektoreita injisoitiin
aivojuovioon 2 μl ja mustatumakkeeseen 1 μl nopeudella oli 0,5 μl/min, minkä jälkeen
neulaa pidettiin paikallaan vielä kahden minuutin ajan. Kipulääkkeenä käytettiin
buprenorfiinia annoksella 0,1 mg/kg. Stereotaktisessa leikkauksessa laitettiin myös
niskanahan alle implantoitavat minipumput (Micro-Osmotic Pump Model 1004, Alzet,
USA), joihin oli kiinnitetty noin yhden senttimetrin pituisella letkulla aivoihin
asennettava kanyyli (Brain Infusion Kit 3, Alzet, USA). Kanyylin koordinaatit laskettiin
bregman perusteella (A/P: -0,3 mm, M/L: +1,0 mm, D/V: -2,5 mm). Minipumppu
annosteli 16 mM KYP-2047-liuosta (1,5 % hydroksipropyyli-β-syklodekstriini + 0,2 %
DMSO suolaliuoksessa) tai vehikkeliä sivukammioon 28 päivän ajan nopeudella 0,11
μl/h. Minipumppu täytettiin kaksi vuorokautta ennen sen asentamista. Käytetyn KYP-
2047-liuoksen pitoisuus laskettiin aiemman julkaisun perusteella (Jalkanen ym. 2011).
2.4 Liikkumista mittaavat käyttäytymiskokeet
Koska α-synukleiinin ilmentäminen liikkeitä säätelevien hermoratojen alueella saattaa
heikentää koe-eläinten liikkumiskykyä ja motorista koordinaatiota, hiirten
31
toimintakykyä seurattiin useilla liikkumista mittaavilla käyttäytymiskokeilla (Brooks ja
Dunnett 2009; Chesselet ja Richter 2011). Hiirten normaalia liikeaktiivisuutta ja sen
vuorokausirytmiä mitattiin läpinäkyvässä mittauslaatikossa, joka oli neliönmuotoinen ja
sivun pituus oli 24 cm ja korkeus 15 cm (Activity Test Chamber ENV-515, Med
Associates Inc., USA). Mitattavat parametrit olivat hiirten kulkema kokonaismatka
senttimetreinä, kuljettu matka aikapisteiden (15 minuuttia) välillä, ylösnousujen
kokonaismäärä sekä ylösnousujen määrä aikapisteiden (15 minuuttia) välillä. Mittaukset
aloitettiin klo 12 ja mittauksen kesto oli 20 tuntia. Liikeaktiivisuustestissä hiirten
liikkumasta matkasta ja takatassuille nousujen lukumäärästä laskettiin ryhmien
keskiarvo ja keskiarvon keskivirhe (SEM) 15 minuutin jaksoissa. Lisäksi laskettiin koko
20 tunnin mittauksen aikana hiirten liikkuman matkan ja takatassuille nousujen
keskiarvo ± SEM. Hiirten lähtötaso mitattiin ennen injektioita ja ensimmäisessä
tutkimuksessa 4 ja 8 viikkoa injektion jälkeen, tutkimuksessa II mittaukset tehtiin 2 ja 4
viikkoa minipumppujen asennuksen jälkeen.
Pyörivä sauva-testissä mitattiin aikaa, jonka hiiri pysyi pyörivän sauvan päällä (Mouse
Rota Rod 47600, Ugo Basile, Italia). Testi mittaa hiirten kestävyyttä, tasapainoa sekä
motorista koordinaatiokykyä (Brooks ja Dunnett 2009). Mittauksen enimmäiskesto oli
300 sekuntia ja se tehtiin kiihtyvällä nopeudella 4-40 kierrosta minuutissa. Putoamiseksi
laskettiin myös se, mikäli hiiri tarttui sauvaan kiinni ja pyöri sen mukana vähintään
kolme kierrosta. Pyörivän sauvan tuloksista laskettiin ryhmien sauvallapysymisaikojen
keskiarvo ± SEM. Tutkimuksessa I mittaukset tehtiin perustason lisäksi 3, 6 ja 9 viikkoa
injektion jälkeen ja tutkimuksessa II perustason lisäksi mittaukset suoritettiin 2 ja 4
minipumppujen asennuksen jälkeen.
Myös tasapainorimatesti mittaa hiirten tasapainoa ja liikkeiden koordinaatiokykyä
(Brooks ja Dunnett 2009). Testissä käytettiin käytettiin ohuita 47 cm korkeudella
pöytätasosta olevia puurimoja, joita pitkin hiiret juoksivat riman toisessa päässä olevaan
mustaan 20 x 17 x 12 cm laatikkoon. Mitattavat parametrit olivat riman ylitysaika
(enintään 60 sekuntia), rimalta putoamiset tai ylösalaisin pyörähtämiset sekä
takatassujen lipsumiset. Ennen varsinaista mittausta hiiriä totutettiin mittaukseen
edellisenä päivänä ja mittausaamuna. Harjoituksissa hiiri laitettiin ylittämään
32
halkaisijaltaan 21 mm rima neljä kertaa. Varsinaiset mittaukset suoritettiin kahdella
ohuemmalla rimalla, joiden halkaisijat olivat 12 ja 8 mm. Ennen mittauksia hiiret
harjoittelivat kerran myös ohuemmilla rimoilla. Tasapainorimatestin tuloksista laskettiin
ryhmien keskiarvot ± SEM riman ylitysajalle, takatassujen lipeämisten ja hiirten
tippumisten määrälle. Tutkimuksessa I mittaukset tehtiin perustason lisäksi 3, 6 ja 9
viikkoa injektion jälkeen ja tutkimuksessa II perustason lisäksi mittaukset suoritettiin 2
ja 4 viikkoa minipumppujen asennuksen jälkeen.
2.5 Kudosnäytteiden valmistus ja immunohistokemialliset värjäykset
Tutkimuksessa I kolme hiirtä jokaisesta ryhmästä nukutettiin pentobarbitaalilla, jonka
jälkeen rintakehä avattiin ja hiirtä perfusoitiin eli huuhdeltiin sydämen kautta ensin
minuutti 0,9 % NaCl-liuoksella PB:ssä (PBS) ja sitten 3 minuuttia 4 %
paraformaldehydillä PB:ssä (PFA). Tätä varten oli valmistettu 0,1 M fosfaattipuskuri eli
PB-liuos (2 litraa 0,1 M Na2HPO4 · 2 H2O, johon lisättiin 0,1 M NaH2PO4 · H2O,
kunnes liuoksen pH oli 7,4.) Tämän jälkeen hiirten päät irrotettiin dekapitoimalla ja
aivot kerättiin talteen kudosleikkeiden tekoa varten. Loput tutkimuksen I hiiristä
dekapitoitiin ilman edeltävää perfuusiota ja aivoista tehtiin metallisen matriisin avulla 2
mm paksuisia leikkeitä, joista eristettiin aivojuovio, mustatumake sekä aivojen loppuosa
-80oC syväjäähän aivojen dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden
pitoisuusmittauksia varten. Tutkimuksessa II kaikki hiiret perfusoitiin PBS:llä minuutin
ajan, jonka jälkeen aivot irrotettiin ja puolitettiin pituussuunnassa. Oikean puolen
aivojuovio, mustatumake ja aivojen loppuosa laitettiin -80oC syväjäähän
monoamiinimittausta sekä PREP-aktiivisuuden mittausta varten. Vasen aivopuolisko
kiinnitettiin yön yli huoneenlämmössä 4 % PFA-liuoksessa, siirrettiin seuraavana
päivänä jääkaappiin 10 % sakkaroosiliuokseen (PB:ssa) ja sitä seuraavana päivänä 30 %
sakkaroosiliuokseen säilytykseen, jotta ne kestäisivät pakastusta. Tutkimuksen I
perfusoiduille aivoille tehtiin myös sama suojakäsittely.
40 mikrometrin paksuiset aivoleikkeet immunohistokemiallisia värjäyksiä varten tehtiin
Leica CM3050-kryostaatilla. Kudosnäytteistä värjättiin immunohistokemiallisesti α-
33
synukleiini (joka 3. aivoleike) sen ilmentymisen voimakkuuden mittaamiseksi, TH (joka
6. aivoleike) dopamiinihermosolujen määrän arvioimiseksi ja GFP (joka 6. aivoleike)
virusvektoreiden geeninsiirtokyvyn selvittämiseksi (Taulukko 5).
Immunohistokemiallisten värjäysten menetelmät on kuvattu aiemmin
alkuperäisjulkaisuissa (Mijatovic ym. 2007; Myöhänen ym. 2008). α-synukleiinin ja
GFP:n värjäyksiin menetelmää on muokattu vaihtamalla erikoistyöhön sopivat vasta-
aineet, joita käytettiin aiemmin hyviksi havaituilla pitoisuuksilla. Kaikki menetelmät
ovat epäsuoria immunohistokemiallisia värjäyksiä, jossa luontaisen
peroksidaasiaktiivisuuden sammutuksen sekä normaaliseerumi-inkubaation jälkeen
haluttu proteiini tunnistetaan ensin primaarisella vasta-aineella. Menetelmätarkkuus
paranee, kun primaarinen vasta-aine tunnistetaan vielä sekundaarisella vasta-aineella ja
TH-värjäyksessä signaalia vahvistetaan ABC-reaktiolla ennen DAB-värireaktiota.
Objektilaseille siirretyt leikkeet kuivattiin ja peitattiin seuraavana päivänä. Värjätyistä
leikkeistä otettiin kuvat mikroskoopilla ja jokaisesta ryhmästä valittiin kolme leikettä
Image-Pro-ohjelmalla (versio 6.3) tehtävää optisen tiheyden mittausta varten. Kuvat
muutettiin mustavalkoisiksi ja mittaus tehtiin ohjelman viivatyökalulla piirtämällä viiva
aivojuovion halki.
Taulukko 5. Immunohistokemiallisen värjäyksen vaiheet ja käytetyt liuokset.
Leikkeiden pesuun ja liuoksien laimennoksiin on käytetty 0,5 % Triton-X-100:a
PBS:ssa, jos muuta ei ole mainittu. aSyn = α-synukleiini, DAB =
diaminobentsidiinihydrokloridi, DNS = aasin normaaliseerumi, GFP = vihreä
fluoresoiva proteiini, GNS = vuohen normaaliseerumi, PBS = 0,9 % natriumkloridi
fosfaattipuskurissa, TH = tyrosiinihydroksylaasi.
Vaihe Liuos
Leikkeiden pesu 4 x 30 min PBS:ssa
Sammutus 10 min 10 % metanoli + 3 % H2O2 PBS:ssa
Leikkeiden pesu 1-2 x 15 min
Epäspesifisen
sitoutumisen esto
aSyn: 10 % DNS PBS:ssa
GFP: 10 % GNS
TH: 10 % GNS
Primaarinen vasta-
aineinkubaatio
aSyn: 1 % DNS, lampaan anti-aSyn, laimennos 1/500
GFP: 1 % GNS, kanin anti-GFP, laimennos 1/1000
TH: 1 % GNS, kanin anti-TH, laimennos 1/1000
Leikkeiden pesu aSyn-värjäys: 3 x 20 min,
GFP: 3 x 20 min
34
TH: 3 x 15 min PBS:ssa
Sekundaarinen vasta-
aineinkubaatio
aSyn: 1 % DNS, aasin anti lammas HRP-konjugoitu, laimennos 1/500
GFP: 1 % GNS, vuohen anti kani HRP-konjugoitu, laimennos 1/500
TH: 1 % GNS, vuohen anti kani biotiini-konjugoitu, laimennos 1/500
Leikkeiden pesu
aSyn: 3 x 20 min
GFP: 3 x 20 min PBS:ssa
TH: 3 x 15 min PBS:ssa
ABC-reaktio 2 tippaa liuoksia A ja B + 10 ml PBS, vain TH-värjäyksessä
Leikkeiden pesu 2 x 15 min PBS:ssa, vain TH-värjäyksessä
DAB-värireaktio 0,05 % DAB-liuos: 0,05 % DAB-kantaliuos + 0,3 % H2O2 PBS:ssa
Inkubointiajat: aSyn: 30-60 s, GFP: 4 min, TH: 20 s
Leikkeiden pesu
aSyn: 3 x 20 min, PBS
GFP: 3 x 20 min, PBS
TH: 3 x 15 min, PBS
Leikkeiden kuivaus 1 x 3 min H2O, 2 x 5 min 70 % EtOH, 2 x 5 min 95 % EtOH, 2 x 5
min 99 % EtOH, 1-2 x 5 min ksyleeni
2.6 Korkean erotuskyvyn nestekromatografia eli HPLC
Molempien tutkimusten aivojuovionäytteistä tehtiin HPLC-mittausta varten
homogenaatit. Aivojuoviot punnittiin ja niihin lisättiin 500 μl homogenisointiliuosta (24
ml 0,2 M HClO4 + 4 ml antioksidanttiliuos, joka sisälsi 25,3 mg oksaalihappoa + 72,7
mg kysteiiniä + 1,15 ml jääetikkahappoa ad 200,0 ml H2O) ja näytteet homogenisoitiin
ultraäänihomogenisaattorilla (Rinco Ultrasonics AG, Sveitsi). Tämän jälkeen näytteet
sentrifugoitiin (14 000 rpm, 35 min, 4oC, Eppendorf Centrifuge), liukoinen osa eli
supernatantti siirrettiin suodattimellisiin näyteputkiin (Amicon Ultra – 0,5 ml 30 K,
Centrifugals Filters, Carrigtwohill, Irlanti) ja sentrifugoitiin uudelleen (9 000 rpm, 35
min, 4oC). Lopuksi siirrettiin 120 μl näytettä HPLC-näyteputkiin. Näytteet analysoitiin
CoulArray 5600A-kromatografilla ja tulosten käsittelyssä käytettiin CoulArray-
ohjelmaa (versio 1.02). Airavaara ryhmineen on kuvannut menetelmän ja laitteiston
aiemmin, mutta pumppu (Shimadzu SIL-20AC Prominence Autosampler, Shimadzu
Corporation, Japani) sekä kolonni (Phenomenex D4601-E0 c18-kolonni, jossa 5 μm
partikkelikoko, pituus 10 cm, Phenomenex Inc., USA) ovat vaihtuneet (Airavaara ym.
2006).
35
2.7 PREP-aktiivisuuden mittaus
Tutkimuksen II PREP-aktiivisuuden mittauksessa käytetty menetelmä on kuvattu
aiemmissa julkaisuissa (Toide ym. 1995; Venäläinen ym. 2002). Menetelmä perustuu
siihen, että PREP pilkkoo määrityksessä käytetyn substraattiliuoksen proliinin ja
AMC:n välisen sidoksen. Tällöin AMC vapautuu ja fluoresenssin voimakkuus korreloi
suoraan PREP:n aktiivisuuteen. Mittausta varten valmistettiin homogenaatit oikean
aivopuoliskon osista lukuun ottamatta aivojuoviota ja mustatumaketta. Aivoista
punnittiin pieni näyte ja niihin lisättiin 10-kertainen tilavuus inkubointipuskuria. Sen
jälkeen kudokset homogenisoitiin ultraäänihomogenisaattorilla ja sentrifugoitiin
Eppendorf Centrifuge-laitteella. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantit otettiin talteen ja
pakastettiin -80oC.
Aiempien menetelmäkuvausten mukaisesti 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 ja 5 nmol AMC-
standardiliuokset valmistettiin suoraan kuoppalevylle. Näytekuoppiin pipetoitiin 75 μl
0,1M Na-K-fosfaattipuskuria eli inkubointipuskuria (500,0 ml 0,1 M Na2HPO4 · 2 H2O,
johon lisättiin 0,1 M KH2PO4, kunnes liuoksen pH oli 7,00) ja 10 μl näytettä, minkä
jälkeen inkuboitiin 30 minuuttia, +30 oC. Standardeja ja näytteitä pipetoitiin kahteen
rinnakkaiseen kuoppaan. Inkuboinnin jälkeen näytekuoppiin lisättiin 25 μl 4 mM
substraattiliuosta (Suc-Gly-Pro-AMC-liuos inkubointipuskurissa) ja inkuboitiin 60
minuuttia, +30 oC. Lopuksi näytekuoppiin pipetoitiin reaktion pysäyttämiseksi 100 μl 1
M Na-asetaattipuskuria (500,0 ml 1 M CH3COOH, johon lisättiin 1 M CH3COONa,
kunnes liuoksen pH oli 4,2) ja levy luettiin Victor2-laitteella (eksitaatio- ja
emissioaallonpituudet olivat 355 ja 460 nm).
PREP-aktiivisuuden suhteuttamiseksi proteiinimäärään mitattiin myös näytteiden
proteiinipitoisuus Bradfordin menetelmällä käyttäen Piercen BCA-
proteiinimäärityspakkausta (BCA Protein Assay Kit, Pierce, USA) (Bradford 1976).
Menetelmä perustuu indikaattoriliuokseen, jonka väri muuttuu proteiinipitoisuuden
mukaan. Sitä varten valmistettiin naudan seerumin albumiinista (BSA) standardiliuokset
(0.00 mg/ml, 0.04 mg/ml, 0.08 mg/ml, 0.20 mg/ml, 0.28 mg/ml, 0.40 mg/ml, 0.48
mg/ml ja 0.60 mg/ml). Indikaattorina oli proteiininmääritysreagenssi (BCA), jossa oli
36
reagensseja A ja B suhteessa 50:1. Kudosnäytteistä tehtiin laimennokset 1:20
inkubointipuskuriin ja laimennoksista pipetoitiin 10 μl mikrotiitterilevylle. Standardi- ja
näyteliuoksista oli kaksi rinnakkaista näytettä. Lopuksi kuoppaan pipetoitiin 200 μl
indikaattoriliuosta, minkä jälkeen folioon käärittyä levyä inkuboitiin 30 minuuttia, +37
oC. Lopuksi kaikista kuopista mitattiin absorbanssi aallonpituudella 595 nm.
Tutkimuksessa käytetty KYP-2047 testattiin samaa menetelmää käyttäen heti
valmistuksen sekä yhden ja kahden viikon säilytyksen jälkeen (+37 oC). Näytekuoppiin
laitettiin 10 μl 20 μM KYP-2047-liuosta ja inkubointipuskurin määrää vähennettiin 10
μl, joten liuoksen loppuvahvuus oli 1 μM. Näytteenä käytettiin puhdasta PREP:a.
2.8 Tulosten käsittely ja tilastolliset testit
Graafiset esitykset tehtiin GraphPad Prism-ohjelmalla (versio 5). Yksittäisen hiiren
mittaustulos on hylätty, jos arvo poikkeaa selkeästi muista tuloksista (keskiarvo ± 2 x
keskihajonta). Lisäksi kesken tutkimuksen menehtyneet kaksi hiirtä on poistettu kaikista
mittauksista. Tilastollisissa testeissä käytetty ohjelma oli IBM SPSS Statistics (versio
20). Liikkumista mittaavista kokeista tehtiin toistettujen mittausten varianssianalyysi
(ANOVA), HPLC:n tuloksista kaksisuuntainen ANOVA ja PREP-inhibition tuloksista
yksisuuntainen ANOVA. Yksisuuntaisen ANOVA:n jatkotestinä oli Tukey HSD.
37
3 TULOKSET
3.1 Koesarja I
3.1.1 Immunohistokemialliset värjäykset
α-synukleiini värjäytyi immonuhistokemiallisesti tasaisesti kaikista leikkeistä, mutta
merkitsevää yli-ilmentymistä ei havaittu (Kuva 2). TH-värjäyksen voimakkuudessa ei
havaittu eroja ryhmien välillä (Kuva 3). GFP:n havaittiin värjäytyvän injektiokanavan
reunoilla, mutta ei kauempana aivojuoviossa (Kuva 4). Tutkimuksen I α-synukleiini- ja
TH-värjäysten optisten tiheyden tuloksille tehty yksisuuntainen varianssianalyysi ei
löytänyt tilastollisesti merkitseviä eroja (tulokset eivät näkyvillä).
Kuva 2. Koesarjan I aivojuovioiden α-synukleiinivärjäykset. A = Sham, B = A53T
aSyn, C = GFP, D = WT aSyn.
Kuva 3. Koesarjan I aivojuovioiden TH-värjäykset. GFP-ryhmästä ei värjätty TH:a,
vaan saliiniryhmä oli ainoa kontrolli. A = Sham, B = A53T aSyn, C = WT aSyn.
38
Kuva 4. Koesarjan I GFP-värjäykset. A53T ja WT aSyn-ryhmistä ei värjätty GFP:a. A =
Sham, B = GFP.
3.1.2 Liikeaktiivisuus
Liikeaktiivisuutta mitattiin 20 tunnin ajan (Kuva 5, Kuva 6). Kuvista nähdään, että
tuloksissa oli vaihtelua ja selkeitä ryhmien välisiä muutoksia ei havaita.
Liikeaktiivisuusmittauksessa oli vain enintään 6 hiirtä/ryhmä. Yksittäisten mittausten
yksityiskohtaiset tulokset eivät ole näkyvillä.
0 4 80
100
200
300
400
500Sham
WT aSyn
GFP
A53T aSyn
Aika (vko)
Ku
ljett
u m
atk
a (
m)
Kuva 5. Tutkimuksen I liikeaktiivisuustestin tulokset kaikissa mittauksissa. Mittauksen
kesto oli 20 tuntia. Kuvassa on esitetty eri mittauksissa hiirten kulkemien
kokonaismatkojen keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen mittausten ANOVA:lla ei
saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.
39
0 4 80
500
1000
1500Sham
A53T aSyn
GFP
WT aSyn
Aika (vko)
Pysty
yn
no
usu
jen
luku
määrä
Kuva 6. Tutkimuksen I liikeaktiivisuustestin tulokset kaikissa mittauksissa. Mittauksen
kesto oli 20 tuntia. Kuvassa on esitetty eri mittauksissa hiirten pystyynnousujen
kokonaismäärien keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen mittausten ANOVA:lla ei
saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.
3.1.3 Pyörivä sauva
Pyörivän sauvan tuloksista nähdään, että ryhmien tulokset yleensä paranivat
mittauksesta toiseen (Kuva 7).
0 3 6 90
100
200
300Sham
GFP
A53T aSyn
WT aSyn
Aika (vko)
Aik
a (
s)
Kuva 7. Pyörivän sauvan tulokset tutkimuksen I hiirille. Kuvassa näkyy
sauvallapysymisajan keskiarvo + SEM, n = 7-8. Toistettujen mittausten ANOVA:lla ei
saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.
40
3.1.4 Tasapainorima
Tasapainoriman tuloksista ovat esillä ainoastaan rimojen ylitysajat (Kuva 8, Kuva 9).
Tassujen lipsumista ja rimalta tipahtamista ei ole kuvattu, koska mittauksissa oli
teknisiä ongelmia ja tulokset eivät olleet käyttökelpoisia. Tuloksissa oli suurta vaihtelua
varsinkin ohuempaa rimaa käytettäessä.
0 3 6 90
5
10
15
20Sham
GFP
A53T aSyn
WT aSyn
Aika (vko)
Aik
a (
s)
Kuva 8. Tasapainoriman 12 mm riman ylitysaikojen tulokset tutkimuksen I hiirille.
Kuvassa näkyy ryhmien riman ylitysaikojen keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen
mittausten ANOVA:lla ei saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.
0 3 6 90
10
20
30
40
50Sham
A53T aSyn
GFP
WT aSyn
Aika (vko)
Aik
a (
s)
Kuva 9. Tasapainoriman 8 mm riman ylitysaikojen tulokset tutkimuksen I hiirille.
Kuvassa näkyy ryhmien riman ylitysaikojen keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen
mittausten ANOVA:lla ei saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.
41
3.1.5 Monoamiinimääritykset
HPLC:llä mitattiin hiirten aivojuovioiden dopamiinin ja 5-HT:n sekä niiden
aineenvaihduntatuotteiden pitoisuudet (Kuva 10). Kuvasta nähdään, että DOPAC:n
määrissä on selkeät erot Sham- ja GFP-ryhmän sekä Sham- ja WT aSyn-ryhmän välillä,
mutta esimerkiksi dopamiinin määrissä nämä erot ovat suhteessa selvästi pienemmät.
DA DOPAC HVA 5-HT 5-HIAA0
1000
2000
3000
4000
500010000150002000025000
Sham
A53T aSyn
GFP
WT aSyn
*#
Mitattu analyytti
Pit
ois
uu
s (
ng
/g)
Kuva 10. DA, DOPAC, HVA, 5-HT ja 5-HIAA pitoisuudet aivojuoviossa tutkimuksen I
hiirillä. n = 7-8. Tuloksille tehtiin yksisuuntainen ANOVA. Tilastollisesti merkitsevät
erot ovat DOPAC:n määrässä (* p = 0.006 GFP vs. Sham, # p = 0.003 WT aSyn vs.
Sham).
3.2 Koesarja II
Immunohistokemiaan tarkoitettujen leikkeiden teossa ilmenneiden teknisten ongelmien
vuoksi näytteet eivät olleet edustavia, eikä värjäys onnistunut tyydyttävästi. Värjäyksen
tarkempaa analyysia ei voitu suorittaa eikä tuloksia esitetä tässä yhteydessä.
42
3.2.1 Liikeaktiivisuus
Liikeaktiivisuutta mitattiin 20 tunnin ajan (Kuva 11 ja Kuva 12). Selkeitä ryhmien
välisiä eroja ei ole. Yksittäisten mittausten yksityiskohtaiset tulokset eivät ole näkyvillä.
0 2 40
500
1000
1500
Sham/KYP
Sham/veh
A53T/veh
A53T/KYP
Aika (vko)
Mit
att
u m
atk
a (
m)
Kuva 11. Tutkimuksen II liikeaktiivisuustestin tulokset kaikissa mittauksissa.
Mittauksen kesto oli 20 tuntia. Kuvassa on esitetty eri mittauksissa hiirten kulkemien
kokonaismatkojen keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen mittausten ANOVA:lla ei
saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.
0 2 40
500
1000
1500
2000
Sham/KYP
A53T/veh
Sham/veh
A53T/KYP
Aika (vko)
Pysty
yn
nn
ou
su
jen
luku
määrä
Kuva 12. Tutkimuksen II liikeaktiivisuustestin tulokset kaikissa mittauksissa.
Mittauksen kesto oli 20 tuntia. Kuvassa on esitetty eri mittauksissa hiirten
pystyynnousujen kokonaismäärien keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen mittausten
ANOVA:lla ei saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.
43
3.2.2 Pyörivä sauva
Pyörivän sauvan tuloksissa oli vaihtelua mittausten välillä eikä niissä havaittu
samanlaista kehitystä kuin koesarjassa I (Kuva 13).
0 2 40
100
200
300
Sham/KYP
Sham/veh
A53T aSyn/KYP
A53T aSyn/veh
Aika (vko)
Aik
a (
s)
Kuva 13. Pyörivän sauvan tulokset tutkimuksen II hiirille. Kuvassa näkyy
sauvallapysymisajan keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen mittausten ANOVA:lla ei
saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.
3.2.3 Tasapainorima
Tasapainoriman tuloksista ovat esillä ainoastaan rimojen ylitysajat (Kuva 14 ja Kuva
15). Tassujen lipsumista ja rimalta tipahtamista ei ole kuvattu, koska mittauksissa oli
teknisiä ongelmia ja tulokset eivät olleet käyttökelpoisia.
44
.
0 2 40
5
10
15
20
Sham/KYP
Sham/veh
A53T/KYP
A53T/veh
Aika (vko)
Aik
a (
s)
Kuva 14. Tasapainoriman 12 mm riman ylitysaikojen tulokset tutkimuksen II hiirille.
Kuvassa näkyy ryhmien riman ylitysaikojen keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen
mittausten ANOVA:lla ei saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.
0 2 40
20
40
60
Sham/KYP
Sham/veh
A53T/KYP
A53T/veh
Aika (vko)
Aik
a (
s)
Kuva 15. Tasapainoriman 8 mm riman ylitysaikojen tulokset tutkimuksen II hiirille.
Kuvassa näkyy ryhmien riman ylitysaikojen keskiarvo + SEM, n = 5-6. Toistettujen
mittausten ANOVA:lla ei saatu tilastollisesti merkitseviä eroja.
3.2.4 Monoamiinimääritykset
HPLC:llä mitattiin hiirten aivojuovioiden dopamiinin ja 5-HT:n sekä niiden
aineenvaihduntatuotteiden pitoisuudet (Kuva 16).
45
DA DOPAC HVA 5-HT 5-HIAA0
1000
2000
3000
4000
10000
20000
30000
Sham/KYP
Sham/veh
A53T/KYP
A53T/veh
p = 0.02
p = 0.03
p = 0.03
p = 0.04
Mitattu analyytti
Pit
ois
uu
s (
ng
/g)
Kuva 16. DA-, DOPAC-, HVA-, 5-HT- ja 5-HIAA-pitoisuudet aivojuoviossa
tutkimuksen II hiirillä. n = 5-6. Tuloksille tehtiin kaksisuuntainen ANOVA.
Virusinjektion saaneissa ryhmissä analyyttien (paitsi 5-HT:n) pitoisuudet olivat
tilastollisesti merkitsevästi korkeampia sham-injektion saaneisiin ryhmiin verrattuna (p-
arvot näkyvillä kuvaajassa).
3.2.5 PREP-eston voimakkuus
Tutkimuksen II lopuksi hiirten aivonäytteistä mitattiin PREP-estäjä KYP-2047:n
aiheuttaman PREP-eston voimakkuus (Kuva 17). Ainoastaan ryhmässä A53T/KYP
näkyy heikko (ei tilastollisesti merkitsevä) esto, koska tämän ryhmän kahdella hiirellä
PREP-aktiivisuus oli hieman laskenut. Lopuksi testattiin myös käytetyn KYP-2047:n
toimivuus. Se vaimensi PREP-aktiivisuuden täysin heti valmistuksen jälkeen sekä
säilytti tehonsa myös yhden ja kahden viikon säilytyksen jälkeen (+37 oC, tulokset ei
näkyvillä).
46
0
50
100
150Sham/veh
A53T/KYP
A53T/veh
Sham/KYP
Ryhmä%:a
Sh
am
/ve
h-k
on
tro
llir
yhm
ästä
(%
)
Kuva 17. KYP-2047:n aiheuttama PREP-aktiivisuuden muutos tutkimuksen II hiirillä.
Kuvassa on hiirten keskimääräinen PREP-aktiivisuus + SEM prosentteina verrattuna
Sham/veh-kontrolliryhmään (jonka keskiarvo = 3,1 nmol AMC), n = 5-6. Tuloksille
tehtiin yksisuuntainen ANOVA, jonka jatkotestinä oli Tukey HSD.
4 TULOSTEN TARKASTELU JA POHDINTA
Tutkimuksessa I immunohistokemiallisesti värjäämällä ei havaittu villityypin α-
synukleiinin tai A53T-α-synukleiinin vektorin aiheuttaneen α-synukleiinin yli-
ilmentymistä hiirten aivojuovioissa. Yhdelle ryhmälle annosteltiin GFP:n geeniä
virusvektorilla, jotta virusvektoreiden toimivuutta voitiin arvioida. Värjäämällä GFP
havaittiin, että GFP:a ilmeni ainoastaan injektiokanavan reunoilla. Myöskään
fluoresenssimikroskoopilla ei havaittu GFP:a laajemmalla alueella. Virusvektorit eivät
siis siirtäneet GFP:n geeniä laajasti. α-synukleiinin ei havaittu lisääntyneen edes
injektiokanavassa, mutta tämä voi johtua siitä, että aivoissa on luonnollisesti paljon α-
synukleiinia, joten geeninsiirtymisen olisi pitänyt olla paljon voimakkaampaa, jotta se
olisi voitu värjäämällä havaita. α-synukleiinivärjättyjä leikkeitä tarkasteltiin myös
valomikroskoopin voimakkaasti suurentavilla objektiiveilla pienien erojen
havaitsemiseksi, mutta niitä ei ollut. Koska GFP ilmentyi heikosti, sen perusteella oli
odotettavissa, että α-synukleiinin yli-ilmentymisestä ei ollut merkkejä ja optisen
tiheyden mittauksessa ei voitu löytää eroja ryhmien välille. Toisaalta α-synukleiinin on
havaittu siirtyvän tehokkaasti endosytoosin avulla solujen välillä, joten vaikka
47
geeninsiirto olisi vain paikallinen, niin α-synukleiinin määrä olisi voinut kasvaa
laajemmalla alueella (Desplats ym. 2009; Kordower ym. 2011). GFP ei siirry yhtä
tehokkaasti kuin α-synukleiini, joten GFP:n perusteella ei pysty suoraan päättelemään
α-synukleiinin ilmentymistä. Optisen tiheyden muutoksien havaitsemiksi vaaditaan
varsin suuria eroja proteiinin määrissä, joten tuloksen tarkistamisessa olisi ollut hyvä
käyttää Western Blotting -menetelmää, tähän ei kuitenkaan ollut aikaa
erikoistyöprojektin keston puitteissa. Myöskään tutkimuksessa II A53T-α-synukleiini ei
aiheuttanut α-synukleiinin yli-ilmentymistä hiirten mustatumakkeeseen. Suolaliuos oli
ainoa kontrolli, joten toisin kuin tutkimuksessa I, GFP:a ei voitu värjätä
virusvektoreiden geeninsiirtokyvyn havaitsemiseksi. Immunohistokemialliset värjäykset
tehtiin kirjallisuudesta löytyvien yleisesti käytettyjen menetelmien mukaisesti
(Mijatovic ym. 2007; Myöhänen ym. 2008). Lisäksi menetelmien onnistumisen
varmistamiseksi värjättiin aivoleikkeitä, joissa tiedettiin α-synukleiinin yli-ilmentyneen.
Erikoistyössä virusvektorit injisoitiin molemmille aivopuoliskoille, koska pyrittiin
luomaan eläinmalli, jota on helppo verrata esimerkiksi siirtogeenisiin eläinmalleihin.
Tulevaisuudessa kannattaa harkita toispuolisten injektioiden käyttöä, koska tällöin
virusvektoreiden toimivuutta on helpompi arvioida toisen aivopuoliskon toimiessa
kontrollina.
α-synukleiinin odotettiin yli-ilmentyvän, koska AAV-vektoreiden α-synukleiinigeenin
siirtokyky on osoitettu hyväksi ja nopeaksi (Kirik ym. 2002; Koprich ym. 2010;
Decressac ym. 2012a). Decressacin vuonna 2012 julkaistussa tutkimuksessa rotille
mustatumakkeen yläpuolelle injisoitu α-synukleiinigeeni ilmentyi voimakkaasti
nigrostriataaliradalla jo 3 viikkoa AAV6-injektion jälkeen (Decressac ym. 2012a).
Kahdeksan viikkoa injektion jälkeen rotat suoriutuivat merkitsevästi heikommin
liikkumiskykyä mittaavissa kokeissa. Tutkimuksessa α-synukleiinimalli ilmensi 6-
OHDA:aan verrattuna paremmin Parkinsonin taudin syitä. Tutkimusryhmän mukaan
virusvektorit aiheuttavat asteittain etenevän solutuhon ja hitaammin kehittyvät
käytösmuutokset verrattuna hermomyrkkyjen aiheuttamiin äkillisiin muutoksiin. Suurin
osa tutkimuksista on tehty rotilla kenties siitä syystä, että hiirillä on havaittu olevan
paljon neutraloivia vasta-aineita AAV-vektoreita kohtaan toisin kuin rotilla (Rapti ym.
2012). Hiirilläkin AAV-vektorit ovat kuitenkin toimineet, joskaan eivät yhtä
48
voimakkaasti ja nopeasti kuin rotilla (St Martin ym. 2007). St Martinin tutkimuksessa
AAV2-vektoreissa mustatumakkeeseen siirretty α-synukleiinigeeni yli-ilmentyi 4, 12 ja
24 viikkoa injektion jälkeen. Dopaminergisten hermosolujen määrä oli ennallaan 4
viikon kuluttua injektiosta, 12 viikon jälkeen oli havaittavissa hyvin lievää määrän
alentumista ja 24 viikon jälkeen solumäärä oli vähentynyt 25 %. Rotilla
dopaminergisten hermosolujen on havaittu vähentyneen 30-80% jo 8 viikkoa injektion
jälkeen (Kirik ym. 2002).
AAV-vektoreista on useita eri serotyyppejä, jonka merkitys saattaa olla suuri
geeninsiirtokyvyn kannalta. Virukset voidaan jakaa pintarakenteessa olevien
antigeenien perusteella eri serotyyppeihin. Yleisimmin käytetyt serotyypit ovat AAV2
ja AAV6 tai kahdesta serotyypistä koostuvat vektorit, kuten esimerkiksi AAV1/2
(Koprich ym. 2010; Decressac ym. 2012a). Ulusoyn vuonna 2012 julkaistussa
tutkimuksessa käytettiin serotyyppejä AAV2, AAV5 ja AAV6, joilla kaikilla saatiin
aikaan α-synukleiinin yli-ilmentyminen hiiren nigrostriataaliradalla (Ulusoy ym. 2012).
Kaikissa edellä mainituissa tutkimuksissa virusvektoreihin on lisätty geenin
ilmentymisen promoottoreita tai transkription jälkeisiä säätelyelementtejä, jotka lisäävät
siirtogeenin ilmentymisen määrää ja kestoa. Esimerkiksi transkription jälkeinen WPRE-
säätelyosa on yleinen ja se vaikuttaisi tärkeältä kunnollisen geenin ilmentymisen
aikaansaamiseksi. Tässä erikoistyössä käytettiin siis AAV-vektorin serotyyppiä 1 eli
AAV1 ilman säätelyelementtejä, joiden puute siis saattoi olla ratkaisevaa
virusvektoreiden geeninsiirtokyvyn kannalta. Lisäksi hiirten seerumissa on todettu
olevan neutraloivia vasta-aineita juuri tässä erikoistyössä käytettyä AAV1-vektoria
kohtaan (Rapti ym. 2012). Sellaisia tutkimuksia, joissa olisi käytetty tätä samaa
virusvektoria α-synukleiinin yli-ilmentämiseen hiirissä, ei löytynyt. AAV1-vektoria
kuitenkin on käytetty hiirillä geeninsiirrossa sydämeen ja lihaksiin ja sen on havaittu
olevan tehokas molemmissa tapauksissa (Xiao ym. 1999; Su ym. 2006). AAV-
vektoreiden toimivuus hiirissä riippuu todennäköisesti siis vektorin serotyypistä, onko
virusvektoriin lisätty sopivat säätelyosat ja onko hiirikannalla neutraloivia vasta-aineita
käytettävää virusvektoria vastaan.
49
Kaikissa liikeaktiivisuutta ja liikkumiskykyä mittaavissa kokeissa tuloksissa oli suurta
hajontaa ja vaikka yksittäisissä mittauksissa ryhmien välillä oli eroja, niin selviä
muutoksia ei voida havaita, koska tulokset vaihtelivat paljon mittausten välillä. Syitä
suurille variansseille ja yhdenmukaisten muutosten puutteelle voivat olla muun muassa
liikkumista mittaavissa menetelmissä havaitut ongelmat, virusvektoreiden heikoksi
havaittu geeninsiirtokyky ja tutkimuksessa II minipumppujen asennusleikkauksen
vaikutukset hiirten terveydentilaan. Käytetty hiirikanta osoittautui myös liikkumista
mittaavien kokeiden kannalta ongelmalliseksi. Hiiret olivat aggressiivisia toisia kohtaan
ja tappelut aiheuttivat useille hiirille hännänkatkeamisia ja haavoja, millä saattoi olla
vaikutusta liikkumista mittaavien kokeiden tuloksiin.
Liikeaktiivisuuden mittauksessa käytetty laitteisto oli vanha ja toimi epäluotettavasti.
Muutamia tuloksia jouduttiin hylkäämään, koska merkittävästi muista poikkeaville
mittaustulokselle syynä oli todennäköisesti laitteistovika. Kumulatiivisten arvojen
lisäksi mittauksissa laskettiin hiirten kulkeman matkan ja pystyynnousujen määrä 15
minuutin jaksoissa. Näistä ei ole tuloksia näkyvillä, mutta kaikki mittaukset noudattivat
samaa tapahtumasarjaa. Alussa hiiret olivat aktiivisia tutustuessaan uuteen ympäristöön,
jonka jälkeen seurasi vaihe, jolloin hiiret pysyttelivät enimmäkseen paikoillaan. Kun
mittaushuoneen valot sammuivat, hiiret jälleen aktivoituivat. Pyörivällä sauvalla hiiret
pystyivät kääntymään väärinpäin, mistä seurasi suurin osa putoamisista hiiren yrittäessä
juosta taaksepäin. Hiiriä olisi kannattanut totuttaa ennen ensimmäistä mittausta
laitteeseen, sillä tutkimuksen I tuloksissa on havaittavissa oppimista. Tutkimuksessa II
hiirten tulokset eivät parantuneet perustasoon verrattuna, mutta tämä johtunee
minipumppujen aiheuttamasta suorituskyvyn laskusta.
Tasapainorimatestissä kaikkia hiiriä opetettiin yhtä paljon testimenetelmään, mutta osa
hiiristä ei siltikään halunnut liikkua rimalla. Puiselta pyöreältä rimalta hiiret eivät putoa
helposti, vaan ne jäävät roikkumaan siihen. Lisäksi tutkija vaikuttaa hiirten
lähtöasentoon, koska hiiri piti asettaa mittauksen alussa aina riman toisen päähän.
Tutkimuksessa I paksumman 12 mm riman kaikkien ryhmien tulokset ovat samaa tasoa
mittauksesta toiseen lukuun ottamatta perustasomittauksen kahden ryhmän tuloksia.
Näiden ryhmien hiiret olivat saaneet vammoja tappeluissa, mikä näytti vaikuttavan
50
ensimmäisiin tuloksiin. Kahdeksan mm rimaa käytettäessä tulokset vaihtelevat paljon ja
selvää oppimistakaan ei ole havaittavissa. Eniten näihin tuloksin vaikutti se, kuinka
hyvän lähtöasennon hiiri sai. Tasapainon menetys alussa johti yleensä siihen, että hiiren
tassut lipsahtivat rimalta ja hiiri ryömi riman yli. Tästä seurasi myös se, että hiirten
takatassujen lipsumisia ei voitu laskea. Myöskään hiirten putoamisten määrää ei voinut
järkevästi verrata, koska ryömivä hiiri ei tipahda rimalta, kun taas nopeammin juokseva
hiiri saattaa lipsahtaa rimalta maahan. Menetelmää tulisi kehittää siten, että hiiri on
aluksi tasaisella alustalla, josta se pitäisi saada itse siirtymään rimalle.
PREP-eston määrityksissä havaittiin, että vain kahdella hiirellä KYP-2047 oli
aiheuttanut PREP-aktiivisuuden laskua. KYP-2047 on kuitenkin todettu aiemmin hyvin
tehokkaaksi PREP-estäjäksi ja lisäksi myös tutkimuksessa käytetty KYP-2047-erä
testattiin tutkimuksen lopuksi ja se oli toimivaa (Jalkanen ym. 2011). Ilmeinen syy
PREP-eston puuttumiselle on minipumppujen asennuksen epäonnistuminen useilla
hiirillä, koska käytetty syanoakrylaattiliima kiinnittyi huonosti kalloon, jos se oli
vähänkin kostea. Näin ollen minipumppu saattoi jäädä koholle tai väärään asentoon ja
pumppu siis annosteli KYP-2047:n tai suolaliuoksen muualle kuin aivokammioihin. On
myös mahdollista, että liima tukki infuusiokanyylin. Minipumput asennettiin viikko
virusvektoreiden injektoinnin jälkeen, joten edellinen leikkaushaava ei ollut vielä täysin
parantunut ja minipumppuleikkauksen haavaa on vaikea tikata uudelleen kiinni. Lisäksi
minipumpun asentamisen jälkeen useat hiiret vaikuttivat muutaman päivän ajan
heikkokuntoisilta, mikä näkyi vielä seuraavissa liikkumista mittaavissa kokeissa.
Koesarjojen välillä havaitut erot monoamiinien pitoisuuksissa voivat johtua
injektiopaikan erosta. Hiiren aivojuoviossa mekaaninen vaurio saattaa saada aikaan
TH:n lisääntymisen, ja sitä kautta dopamiinin ja sen aineenvaihduntatuotteiden
pitoisuuksien kohoamisen (Howells ym. 1996). Tutkimuksen I TH:n määrissä ei
havaittu värjäysten perusteella eroja, mutta menetelmä ei ole herkkä pienten erojen
havaitsemiseksi. Lisäksi tutkimuksessa I DOPAC:n määrä väheni, joten ylimääräinen
dopamiini on ehkä varastoitunut eikä siitä muodostunut DOPAC:a. Yleensä α-
synukleiinin yli-ilmentyminen laskee aivojen dopamiinipitoisuuksia, mutta Parkinsonin
51
taudin varhaisessa vaiheessa dopamiinipitoisuudet voivat olla kuitenkin koholla ja sama
ilmiö on havaittu myös siirtogeenisessä eläinmallissa (Kurz ym. 2010).
5 YHTEENVETO
Erikoistyössä tutkittiin AAV-vektorin käyttöä α-synukleiiniin yli-ilmentämiseen hiiren
nigrostriataaliradalla ja yli-ilmentymisen aiheuttamia muutoksia hiirten liikkumisessa ja
dopamiinihermosoluissa. Yli-ilmentymisen seurauksia ei päästy tutkimaan, koska
siirtogeeni ilmentyi huonosti. Ainakin virusvektorin serotyyppi, virusvektorissa olevat
geenin ilmentymisen säätelyosat ja käytetty eläinkanta vaikuttavat siihen, ilmeneekö
siirtogeeni riittävän hyvin. Erikoistyön tulosten perusteella AAV1-vektorin käyttö ilman
WPRE-säätelyosaa ei aiheuta riittävää α-synukleiinin yli-ilmentymistä hiirissä.
Parhaiten AAV-vektoreista ovat toimineet serotyypit 2 ja 6, joita tulevaisuudessa
kannattanee käyttää. Lisäksi α-synukleiinin aiheuttamat hermostomuutokset ja oireet
ovat olleet voimakkaampia rotissa kuin hiirissä, mikä voi johtua erityisesti hiirissä
olevista neutraloivista vasta-aineista.
52
6 KIRJALLISUUSLUETTELO
Abeliovich A, Schmitz Y, Fariñas I, Choi-Lundberg D, Ho WH, Castillo PE, Shinsky
N, Verdugo JM, Armanini M, Ryan A, Hynes M, Phillips H, Sulzer D, Rosenthal A:
Mice lacking alpha-synuclein display functional deficits in the nigrostriatal dopamine
system. Neuron 25: 239-252, 2000
Airavaara M, Mijatovic J, Vihavainen T, Piepponen TP, Saarma M, Ahtee L: In
heterozygous GDNF knockout mice the response of striatal dopaminergic system to
acute morphine is altered. Synapse 59: 321-329, 2006
Beal MF: Parkinson's disease: a model dilemma. Nature 466: S8-10, 2010
Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:
248-254, 1976
Brandt I, Gérard M, Sergeant K, Devreese B, Baekelandt V, Augustyns K, Scharpé S,
Engelborghs Y, Lambeir AM: Prolyl oligopeptidase stimulates the aggregation of alpha-
synuclein. Peptides 29: 1472-1478, 2008
Brooks SP, Dunnett SB: Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nat
Rev Neurosci 10: 519-529, 2009
Cao S, Theodore S, Standaert DG: Fcgamma receptors are required for NF-kappaB
signaling, microglial activation and dopaminergic neurodegeneration in an AAV-
synuclein mouse model of Parkinson's disease. Mol Neurodegener 5: 42, 2010
Chartier-Harlin MC, Kachergus J, Roumier C, Mouroux V, Douay X, Lincoln S,
Levecque C, Larvor L, Andrieux J, Hulihan M, Waucquier N, Defebvre L, Amouyel P,
Farrer M, Destée A: Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial
Parkinson's disease. Lancet 364: 1167-1169, 2004
Chen X, de Silva HA, Pettenati MJ, Rao PN, St George-Hyslop P, Roses AD, Xia Y,
Horsburgh K, Uéda K, Saitoh T: The human NACP/alpha-synuclein gene: chromosome
assignment to 4q21.3-q22 and TaqI RFLP analysis. Genomics 26: 425-427, 1995
Chesselet MF: In vivo alpha-synuclein overexpression in rodents: a useful model of
Parkinson's disease? Exp Neurol 209: 22-27, 2008
Chesselet MF, Richter F: Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet Neurol 10:
1108-1118, 2011
53
Clark J, Clore EL, Zheng K, Adame A, Masliah E, Simon DK: Oral N-acetyl-cysteine
attenuates loss of dopaminergic terminals in alpha-synuclein overexpressing mice.
PLoS One 5: e12333, 2010
Conway KA, Harper JD, Lansbury PT: Accelerated in vitro fibril formation by a mutant
alpha-synuclein linked to early-onset Parkinson disease. Nat Med 4: 1318-1320, 1998
Crabtree DM, Zhang J: Genetically engineered mouse models of Parkinson's disease.
Brain Res Bull 88: 13-32, 2012
Cunningham DF, O'Connor B: Proline specific peptidases. Biochim Biophys Acta 1343:
160-186, 1997
de Lau LM, Breteler MM: Epidemiology of Parkinson's disease. Lancet Neurol 5: 525-
535, 2006
Decressac M, Mattsson B, Björklund A: Comparison of the behavioural and histological
characteristics of the 6-OHDA and alpha-synuclein rat models of Parkinson's disease.
Exp Neurol 235: 306-315, 2012a
Decressac M, Kadkhodaei B, Mattsson B, Laguna A, Perlmann T, Björklund A: alpha-
Synuclein-Induced Down-Regulation of Nurr1 Disrupts GDNF Signaling in Nigral
Dopamine Neurons. Sci Transl Med 4: 163ra156, 2012b
Desplats P, Lee HJ, Bae EJ, Patrick C, Rockenstein E, Crews L, Spencer B, Masliah E,
Lee SJ: Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron
transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci USA 106: 13010-13015, 2009
Fleming SM, Tetreault NA, Mulligan CK, Hutson CB, Masliah E, Chesselet MF:
Olfactory deficits in mice overexpressing human wildtype alpha-synuclein. Eur J
Neurosci 28: 247-256, 2008
Fleming SM, Salcedo J, Fernagut PO, Rockenstein E, Masliah E, Levine MS, Chesselet
MF: Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type
human alpha-synuclein. J Neurosci 24: 9434-9440, 2004
Fleming SM, Mulligan CK, Richter F, Mortazavi F, Lemesre V, Frias C, Zhu C, Stewart
A, Gozes I, Morimoto B, Chesselet MF: A pilot trial of the microtubule-interacting
peptide (NAP) in mice overexpressing alpha-synuclein shows improvement in motor
function and reduction of alpha-synuclein inclusions. Mol Cell Neurosci 46: 597-606,
2011
Franklin KBJ, Paxinos G: The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic
Press, San Diego 1997
54
Freichel C, Neumann M, Ballard T, Müller V, Woolley M, Ozmen L, Borroni E,
Kretzschmar HA, Haass C, Spooren W, Kahle PJ: Age-dependent cognitive decline and
amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging 28: 1421-
1435, 2007
Fujiwara H, Hasegawa M, Dohmae N, Kawashima A, Masliah E, Goldberg MS, Shen J,
Takio K, Iwatsubo T: alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions.
Nat Cell Biol 4: 160-164, 2002
Giasson BI, Duda JE, Quinn SM, Zhang B, Trojanowski JQ, Lee VM: Neuronal alpha-
synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human
alpha-synuclein. Neuron 34: 521-533, 2002
Gispert S, Del Turco D, Garrett L, Chen A, Bernard DJ, Hamm-Clement J, Korf HW,
Deller T, Braak H, Auburger G, Nussbaum RL: Transgenic mice expressing mutant
A53T human alpha-synuclein show neuronal dysfunction in the absence of aggregate
formation. Mol Cell Neurosci 24: 419-429, 2003
Gomez-Isla T, Irizarry MC, Mariash A, Cheung B, Soto O, Schrump S, Sondel J,
Kotilinek L, Day J, Schwarzschild MA, Cha JH, Newell K, Miller DW, Uéda K, Young
AB, Hyman BT, Ashe KH: Motor dysfunction and gliosis with preserved dopaminergic
markers in human alpha-synuclein A30P transgenic mice. Neurobiol Aging 24: 245-
258, 2003
Howells DW, Liberatore GT, Wong JY, Donnan GA: Dopaminergic responses to
striatal damage. J Neurol Sci 139: 125-130, 1996
Iwai A, Masliah E, Yoshimoto M, Ge N, Flanagan L, de Silva HA, Kittel A, Saitoh T:
The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a
presynaptic protein of the central nervous system. Neuron 14: 467-475, 1995
Jakes R, Spillantini MG, Goedert M: Identification of two distinct synucleins from
human brain. FEBS Lett 345: 27-32, 1994
Jalkanen AJ, Hakkarainen JJ, Lehtonen M, Venäläinen T, Kääriäinen TM, Jarho E,
Suhonen M, Forsberg MM: Brain pharmacokinetics of two prolyl oligopeptidase
inhibitors, JTP-4819 and KYP-2047, in the rat. Basic Clin Pharmacol Toxicol 109: 443-
451, 2011
Kahle PJ, Neumann M, Ozmen L, Müller V, Odoy S, Okamoto N, Jacobsen H,
Iwatsubo T, Trojanowski JQ, Takahashi H, Wakabayashi K, Bogdanovic N, Riederer P,
Kretzschmar HA, Haass C: Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy
body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol 159: 2215-
2225, 2001
55
Kirik D, Rosenblad C, Burger C, Lundberg C, Johansen TE, Muzyczka N, Mandel RJ,
Björklund A: Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of
alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci 22: 2780-2791, 2002
Koob AO, Ubhi K, Paulsson JF, Kelly J, Rockenstein E, Mante M, Adame A, Masliah
E: Lovastatin ameliorates alpha-synuclein accumulation and oxidation in transgenic
mouse models of alpha-synucleinopathies. Exp Neurol 221: 267-274, 2010
Koprich JB, Johnston TH, Reyes MG, Sun X, Brotchie JM: Expression of human A53T
alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a
rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and
nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson's disease.
Mol Neurodegener 5: 43, 2010
Kordower JH, Dodiya HB, Kordower AM, Terpstra B, Paumier K, Madhavan L,
Sortwell C, Steece-Collier K, Collier TJ: Transfer of host-derived alpha synuclein to
grafted dopaminergic neurons in rat. Neurobiol Dis 43: 552-557, 2011
Korecka J, Schouten M, Eggers R, Ulusoy A, Bossers K, Verhaagen J: Comparison of
AAV Serotypes for Gene Delivery to Dopaminergic Neurons in the Substantia Nigra.
Viral Gene Therapy 205-224, 2001
Krüger R, Kuhn W, Müller T, Woitalla D, Graeber M, Kösel S, Przuntek H, Epplen JT,
Schöls L, Riess O: Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in
Parkinson's disease. Nat Genet 18: 106-108, 1998
Kuo YM, Li Z, Jiao Y, Gaborit N, Pani AK, Orrison BM, Bruneau BG, Giasson BI,
Smeyne RJ, Gershon MD, Nussbaum RL: Extensive enteric nervous system
abnormalities in mice transgenic for artificial chromosomes containing Parkinson
disease-associated alpha-synuclein gene mutations precede central nervous system
changes. Hum Mol Genet 19: 1633-1650, 2010
Kurz A, Double KL, Lastres-Becker I, Tozzi A, Tantucci M, Bockhart V, Bonin M,
García-Arencibia M, Nuber S, Schlaudraff F, Liss B, Fernández-Ruiz J, Gerlach M,
Wüllner U, Lüddens H, Calabresi P, Auburger G, Gispert S: A53T-alpha-synuclein
overexpression impairs dopamine signaling and striatal synaptic plasticity in old mice.
PLoS One 5: e11464, 2010
Lam HA, Wu N, Cely I, Kelly RL, Hean S, Richter F, Magen I, Cepeda C, Ackerson
LC, Walwyn W, Masliah E, Chesselet MF, Levine MS, Maidment NT: Elevated tonic
extracellular dopamine concentration and altered dopamine modulation of synaptic
activity precede dopamine loss in the striatum of mice overexpressing human alpha-
synuclein. J Neurosci Res 89: 1091-1102, 2011
Lee MK, Stirling W, Xu Y, Xu X, Qui D, Mandir AS, Dawson TM, Copeland NG,
Jenkins NA, Price DL: Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson's disease-
56
linked Ala-53 --> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein
aggregation in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA 99: 8968-8973, 2002
Lim Y, Kehm VM, Li C, Trojanowski JQ, Lee VM: Forebrain overexpression of alpha-
synuclein leads to early postnatal hippocampal neuron loss and synaptic disruption. Exp
Neurol 221: 86-97, 2010
Lim Y, Kehm VM, Lee EB, Soper JH, Li C, Trojanowski JQ, Lee VM: alpha-Syn
suppression reverses synaptic and memory defects in a mouse model of dementia with
Lewy bodies. J Neurosci 31: 10076-10087, 2011
Lin X, Parisiadou L, Sgobio C, Liu G, Yu J, Sun L, Shim H, Gu XL, Luo J, Long CX,
Ding J, Mateo Y, Sullivan PH, Wu LG, Goldstein DS, Lovinger D, Cai H: Conditional
expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain
dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of
transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci 32: 9248-9264, 2012
Martin LJ, Pan Y, Price AC, Sterling W, Copeland NG, Jenkins NA, Price DL, Lee
MK: Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal
mitochondrial degeneration and cell death. J Neurosci 26: 41-50, 2006
Masliah E, Rockenstein E, Veinbergs I, Mallory M, Hashimoto M, Takeda A, Sagara Y,
Sisk A, Mucke L: Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein
mice: implications for neurodegenerative disorders. Science 287: 1265-1269, 2000
Masliah E, Rockenstein E, Mante M, Crews L, Spencer B, Adame A, Patrick C, Trejo
M, Ubhi K, Rohn TT, Mueller-Steiner S, Seubert P, Barbour R, McConlogue L, Buttini
M, Games D, Schenk D: Passive immunization reduces behavioral and
neuropathological deficits in an alpha-synuclein transgenic model of Lewy body
disease. PLoS One 6: e19338, 2011
Mijatovic J, Airavaara M, Planken A, Auvinen P, Raasmaja A, Piepponen TP,
Costantini F, Ahtee L, Saarma M: Constitutive Ret activity in knock-in multiple
endocrine neoplasia type B mice induces profound elevation of brain dopamine
concentration via enhanced synthesis and increases the number of TH-positive cells in
the substantia nigra. J Neurosci 27: 4799-4809, 2007
Myöhänen TT, Venäläinen JI, Garcia-Horsman JA, Piltonen M, Männistö PT: Cellular
and subcellular distribution of rat brain prolyl oligopeptidase and its association with
specific neuronal neurotransmitters. J Comp Neurol 507: 1694-1708, 2008
Myöhänen TT, Hannula MJ, Van Elzen R, Gerard M, Van Der Veken P, Garcia-
Horsman JA, Baekelandt V, Männistö PT, Lambeir AM: A prolyl oligopeptidase
inhibitor, KYP-2047, reduces alpha-synuclein protein levels and aggregates in cellular
and animal models of Parkinson's disease. Br J Pharmacol 166: 1097-1113, 2012
57
Narhi L, Wood SJ, Steavenson S, Jiang Y, Wu GM, Anafi D, Kaufman SA, Martin F,
Sitney K, Denis P, Louis JC, Wypych J, Biere AL, Citron M: Both familial Parkinson's
disease mutations accelerate alpha-synuclein aggregation. J Biol Chem 274: 9843-9846,
1999
Neumann M, Kahle PJ, Giasson BI, Ozmen L, Borroni E, Spooren W, Müller V, Odoy
S, Fujiwara H, Hasegawa M, Iwatsubo T, Trojanowski JQ, Kretzschmar HA, Haass C:
Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged
transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies. J
Clin Invest 110: 1429-1439, 2002
Nuber S, Petrasch-Parwez E, Winner B, Winkler J, von Hörsten S, Schmidt T, Boy J,
Kuhn M, Nguyen HP, Teismann P, Schulz JB, Neumann M, Pichler BJ, Reischl G,
Holzmann C, Schmitt I, Bornemann A, Kuhn W, Zimmermann F, Servadio A, Riess O:
Neurodegeneration and motor dysfunction in a conditional model of Parkinson's
disease. J Neurosci 28: 2471-2484, 2008
Olanow CW, Stern MB, Sethi K: The scientific and clinical basis for the treatment of
Parkinson disease (2009). Neurology 72: S1-136, 2009
Ono K, Ikemoto M, Kawarabayashi T, Ikeda M, Nishinakagawa T, Hosokawa M, Shoji
M, Takahashi M, Nakashima M: A chemical chaperone, sodium 4-phenylbutyric acid,
attenuates the pathogenic potency in human alpha-synuclein A30P + A53T transgenic
mice. Parkinsonism Relat Disord 15: 649-654, 2009
Piltonen M, Savolainen M, Patrikainen S, Baekelandt V, Myöhänen TT, Männistö PT:
Comparison of motor performance, brain biochemistry and histology of two A30P
alpha-synuclein transgenic mouse strains. Neuroscience 231: 157-168, 2013
Polymeropoulos MH, Lavedan C, Leroy E, Ide SE, Dehejia A, Dutra A, Pike B, Root H,
Rubenstein J, Boyer R, Stenroos ES, Chandrasekharappa S, Athanassiadou A,
Papapetropoulos T, Johnson WG, Lazzarini AM, Duvoisin RC, Di Iorio G, Golbe LI,
Nussbaum RL: Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with
Parkinson's disease. Science 276: 2045-2047, 1997
Rapti K, Louis-Jeune V, Kohlbrenner E, Ishikawa K, Ladage D, Zolotukhin S, Hajjar
RJ, Weber T: Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of
commonly used animal models. Mol Ther 20: 73-83, 2012
Richfield EK, Thiruchelvam MJ, Cory-Slechta DA, Wuertzer C, Gainetdinov RR,
Caron MG, Di Monte DA, Federoff HJ: Behavioral and neurochemical effects of wild-
type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp Neurol 175: 35-48,
2002
Rockenstein E, Mallory M, Hashimoto M, Song D, Shults CW, Lang I, Masliah E:
Differential neuropathological alterations in transgenic mice expressing alpha-synuclein
58
from the platelet-derived growth factor and Thy-1 promoters. J Neurosci Res 68: 568-
578, 2002
Rockenstein E, Schwach G, Ingolic E, Adame A, Crews L, Mante M, Pfragner R,
Schreiner E, Windisch M, Masliah E: Lysosomal pathology associated with alpha-
synuclein accumulation in transgenic models using an eGFP fusion protein. J Neurosci
Res 80: 247-259, 2005
Schneider L, Zhang J: Lysosomal function in macromolecular homeostasis and
bioenergetics in Parkinson's disease. Mol Neurodegener 5: 14-1326-5-14, 2010
Shelkovnikova TA, Ustyugov AA, Millership S, Peters O, Anichtchik O, Spillantini
MG, Buchman VL, Bachurin SO, Ninkina NN: Dimebon does not ameliorate
pathological changes caused by expression of truncated (1-120) human alpha-synuclein
in dopaminergic neurons of transgenic mice. Neurodegener Dis 8: 430-437, 2011
Shulman JM, De Jager PL, Feany MB: Parkinson's disease: genetics and pathogenesis.
Annu Rev Pathol 6: 193-222, 2011
Singleton AB, Farrer M, Johnson J, Singleton A, Hague S, Kachergus J, Hulihan M,
Peuralinna T, Dutra A, Nussbaum R, Lincoln S, Crawley A, Hanson M, Maraganore D,
Adler C, Cookson MR, Muenter M, Baptista M, Miller D, Blancato J, Hardy J, Gwinn-
Hardy K: alpha-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science 302:
841, 2003
Sotiriou E, Vassilatis DK, Vila M, Stefanis L: Selective noradrenergic vulnerability in
alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging 31: 2103-2114, 2010
Spencer B, Potkar R, Trejo M, Rockenstein E, Patrick C, Gindi R, Adame A, Wyss-
Coray T, Masliah E: Beclin 1 gene transfer activates autophagy and ameliorates the
neurodegenerative pathology in alpha-synuclein models of Parkinson's and Lewy body
diseases. J Neurosci 29: 13578-13588, 2009
Spillantini MG, Goedert M: The alpha-synucleinopathies: Parkinson's disease, dementia
with Lewy bodies, and multiple system atrophy. Ann NY Acad Sci 920: 16-27, 2000
Spillantini MG, Divane A, Goedert M: Assignment of human alpha-synuclein (SNCA)
and beta-synuclein (SNCB) genes to chromosomes 4q21 and 5q35. Genomics 27: 379-
381, 1995
Spillantini MG, Crowther RA, Jakes R, Hasegawa M, Goedert M: alpha-Synuclein in
filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with
lewy bodies. Proc Natl Acad Sci USA 95: 6469-6473, 1998
St Martin JL, Klucken J, Outeiro TF, Nguyen P, Keller-McGandy C, Cantuti-Castelvetri
I, Grammatopoulos TN, Standaert DG, Hyman BT, McLean PJ: Dopaminergic neuron
59
loss and up-regulation of chaperone protein mRNA induced by targeted over-expression
of alpha-synuclein in mouse substantia nigra. J Neurochem 100: 1449-1457, 2007
Su H, Huang Y, Takagawa J, Barcena A, Arakawa-Hoyt J, Ye J, Grossman W, Kan
YW: AAV serotype-1 mediates early onset of gene expression in mouse hearts and
results in better therapeutic effect. Gene Ther 13: 1495-1502, 2006
Surguchov A: Molecular and cellular biology of synucleins. Int Rev Cell Mol Biol 270:
225-317, 2008
Thiruchelvam MJ, Powers JM, Cory-Slechta DA, Richfield EK: Risk factors for
dopaminergic neuron loss in human alpha-synuclein transgenic mice. Eur J Neurosci
19: 845-854, 2004
Tofaris GK, Garcia Reitböck P, Humby T, Lambourne SL, O'Connell M, Ghetti B,
Gossage H, Emson PC, Wilkinson LS, Goedert M, Spillantini MG: Pathological
changes in dopaminergic nerve cells of the substantia nigra and olfactory bulb in mice
transgenic for truncated human alpha-synuclein(1-120): implications for Lewy body
disorders. J Neurosci 26: 3942-3950, 2006
Toide K, Iwamoto Y, Fujiwara T, Abe H: JTP-4819: a novel prolyl endopeptidase
inhibitor with potential as a cognitive enhancer. J Pharmacol Exp Ther 274: 1370-1378,
1995
Ulusoy A, Björklund T, Buck K, Kirik D: Dysregulated dopamine storage increases the
vulnerability to alpha-synuclein in nigral neurons. Neurobiol Dis 47: 367-377, 2012
Unger EL, Eve DJ, Perez XA, Reichenbach DK, Xu Y, Lee MK, Andrews AM:
Locomotor hyperactivity and alterations in dopamine neurotransmission are associated
with overexpression of A53T mutant human alpha-synuclein in mice. Neurobiol Dis 21:
431-443, 2006
Uversky VN: Neuropathology, biochemistry, and biophysics of alpha-synuclein
aggregation. J Neurochem 103: 17-37, 2007
van der Putten H, Wiederhold KH, Probst A, Barbieri S, Mistl C, Danner S, Kauffmann
S, Hofele K, Spooren WP, Ruegg MA, Lin S, Caroni P, Sommer B, Tolnay M, Bilbe G:
Neuropathology in mice expressing human alpha-synuclein. J Neurosci 20: 6021-6029,
2000
Venäläinen JI, Juvonen RO, Forsberg MM, Garcia-Horsman A, Poso A, Wallen EA,
Gynther J, Männistö PT: Substrate-dependent, non-hyperbolic kinetics of pig brain
prolyl oligopeptidase and its tight binding inhibition by JTP-4819. Biochem Pharmacol
64: 463-471, 2002
60
Wakamatsu M, Ishii A, Iwata S, Sakagami J, Ukai Y, Ono M, Kanbe D, Muramatsu S,
Kobayashi K, Iwatsubo T, Yoshimoto M: Selective loss of nigral dopamine neurons
induced by overexpression of truncated human alpha-synuclein in mice. Neurobiol
Aging 29: 574-585, 2008
Waxman EA, Giasson BI: Molecular mechanisms of alpha-synuclein
neurodegeneration. Biochim Biophys Acta 1792: 616-624, 2009
Wu N, Joshi PR, Cepeda C, Masliah E, Levine MS: Alpha-synuclein overexpression in
mice alters synaptic communication in the corticostriatal pathway. J Neurosci Res 88:
1764-1776, 2010
Xiao W, Chirmule N, Berta SC, McCullough B, Gao G, Wilson JM: Gene therapy
vectors based on adeno-associated virus type 1. J Virol 73: 3994-4003, 1999
Yavich L, Oksman M, Tanila H, Kerokoski P, Hiltunen M, van Groen T, Puoliväli J,
Männistö PT, Garcia-Horsman A, MacDonald E, Beyreuther K, Hartmann T, Jäkälä P:
Locomotor activity and evoked dopamine release are reduced in mice overexpressing
A30P-mutated human alpha-synuclein. Neurobiol Dis 20: 303-313, 2005
Zarranz JJ, Alegre J, Gómez-Esteban JC, Lezcano E, Ros R, Ampuero I, Vidal L,
Hoenicka J, Rodriguez O, Atarés B, Llorens V, Gomez Tortosa E, del Ser T, Muñoz
DG, de Yebenes JG: The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and
Lewy body dementia. Ann Neurol 55: 164-173, 2004
Zhou W, Freed CR: Tyrosine-to-cysteine modification of human alpha-synuclein
enhances protein aggregation and cellular toxicity. J Biol Chem 279: 10128-10135,
2004
Zhou W, Milder JB, Freed CR: Transgenic mice overexpressing tyrosine-to-cysteine
mutant human alpha-synuclein: a progressive neurodegenerative model of diffuse Lewy
body disease. J Biol Chem 283: 9863-9870, 2008