简介
产品 含量 浓度 储存 稳定性
100 µl
200 µl
500 µl
SYBR® Green I 、SYBR® Green II
各 50 ml,以及 SYBR® 滤光片
10,000×
· ≤–20°C
· 干燥
· 避光
如果直接储存
在 DMSO 中,
染料可在 6 个
月至 1 年内稳
定。
SYBR® Green I 核酸凝胶染料
Molecular Probes SYBR® Green I 核酸凝胶染料是目前检
测琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中双链DNA (dsDNA) 的最
灵敏的染料之一。在 300 nm 的透射光下,低至60 pg 的
dsDNA 条带也能被 SYBR® Green I 染料检测。利用 254 nm 紫外反射光源 (顶置光源) 照射、宝丽来 667 黑白无涂层
胶片,以及 SYBR® 滤光片 (S7569) ,能在 SYBR® Green I 染色的凝胶上检测到低至 20 pg 的单一条带1。这种灵敏度
比传统 300 nm 透射光下的溴化乙锭 (EB) 染色至少高了25 倍 (图 1) 。我们还发现 SYBR® Green I 染料对于检测寡核
苷酸也非常灵敏,能在 5% 的聚丙烯酰胺凝胶上检测低至
1-2 ng 的合成 24 聚体,比溴化乙锭的灵敏度高了 50-100
倍2。
SYBR® Green I 染料检测单链 DNA 和 RNA 的灵敏度就稍
低一些 (利用 254 nm 顶置光源照射大约能检测 100-300 pg的条带),使之成为复杂溶液中检测 dsDNA 的理想选择
—特别是复杂溶液中的 ssDNA 或 RNA 可能会掩盖结果的
时候,如凋亡特有的连续梯度条带 apoptosis ladders3。
SYBR® Green I 染料检测凝胶中核酸的非凡灵敏度归因于独
特的染料性质。SYBR® Green I 染料表现出超强的 DNA 亲和
力,与 DNA 结合后荧光的显著增强——至少比溴化乙锭高出
一个数量级。同时,DNA/SYBR® Green I 复合物的荧光量子
SYBR® Green I
核酸凝胶染料 (CS7561)
SYBR® Green I
核酸凝胶染料 (CS7562)
SYBR® Green I
核酸凝胶染料 (CS7563)
SYBR® Green
核酸凝胶染料起始套装 (S7580)
标记的次数:500 ml 足够染约 100 块 mini 胶。
近似的荧光最大激发/发射波长:290,380,497/520 nm,与 DNA 结合
产率 (~0.8) 比 DNA / 溴化乙锭 (~0.15) 高了 5 倍多。SYBR® Green I 染料在琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中迅速渗透,在缺
乏 DNA 时背景荧光可以忽略,让染色步骤快速,而照相之
前也无需脱色。
SYBR® Green I 染料的超高灵敏度使之在多种 DNA 量有限
的应用,例如低循环数及少量目标 DNA 的扩增产物检
测 4;低拷贝 DNA 和 RNA 载体以及来自低细胞数培养物
的粘粒、质粒和噬菌体 DNA 的检测和限制性分析;核酸
酶保护和条带转移分析产物的检测中格外有用。SYBR ® Green I 染料的极佳灵敏度让它在某些应用中甚至能取代放
射性同位素5-8。
由于 SYBR® Green I 染料的 DNA 结合力强,它能在电泳前 (预染) ,以及电泳后 (后染) 对 DNA 进行染色9,也可
以对毛细管电泳分离的 DNA 进行染色10,11。倒胶时可以预
先加入 SYBR® Green I 染料以预制凝胶 (预染) ;但我们发
现 后 染 的 灵 敏 度 最 高 。 此 外 , 我 们 的 研 究 人 员 还 发 现
SYBR® Green I 染料与 DNA 的结合不会抑制多种常见的限
制性内切酶的活性,包括 Hind III 和 EcoR I1,2,也不会干
扰 Southern 杂交分析。
开始实验之前
·在你打开管盖之前,管子应完全回暖至室温,以确保 DMSO 彻底解冻和溶液均一。为了避免损失染料,可在离心机中
短暂离心解冻的染料,让 DMSO 溶液汇集在管底。为了方便,染料应分装成多个小份并冻存。小份的染料将更快熔解。
·试剂盒未提供的必需材料
·TE、TBE 或 TAE 缓冲液
·可选:乙醇,在去除 SYBR® Green I 染料时用于沉淀 DNA
操作与处理
独立实验室进行的艾姆斯试验 (Ames test) 表明 SYBR® Green I 核酸凝胶染料的致突变性明显比溴化乙锭要低得多12。然
而,我们必须警告用户注意,目前还没有关于 SYBR® Green I 染料对人体的致突变性或毒性的数据。由于这种试剂能与核
酸结合,它应当被看作是潜在的诱变剂,在使用时应小心谨慎。在处理 DMSO 储存液时应特别小心,因为 DMSO 能促进
有机分子进入组织。染料的废弃处理应符合当地的规定。
光谱特性
SYBR® Green I 染料的最大激发波长为 497 nm,但是在 ~290 nm 和 ~380 nm 处有二级激发峰 (图 2)。与 DNA 结合的
SYBR® Green I 染料的荧光发射集中在 520 nm。这些光谱特性让 SYBR® Green I 染料适用于多种凝胶检测仪,从紫外
反射 (上紫外) 和透射仪 (下紫外) 到氩离子激光器和水银灯激发的凝胶扫描仪。
图1. 梯度稀释的 φX174 RF DNA 被 HaeIII 限制性内切酶切割,并在 5% 的聚
丙烯酰胺凝胶上电泳。凝胶包含了 DNA 片断的相同 3 倍梯度稀释。A 图展
示的凝胶是用 SYBR® Green I 核酸凝胶染料 (储存液 1:10,000 稀释) 染色 30
分钟,没有脱色。B 图展示的凝胶是用 5 µg/ml 溴化乙锭染色 30 分钟,然
后脱色 30 分钟。SYBR® Green I 染色的凝胶在 254 nm 紫外反射光源下激发,
而溴化乙锭染色的凝胶用 300 nm 透射光激发 (Fotodyne Foto/UV 450 紫外
透射仪)。尽管 SYBR® Green I 染色的凝胶也能在 300 nm 下激发,但 254 nm 的紫外反射光源产生的条带灵敏度最高。两种凝胶都用宝丽来 667 黑
白胶片来拍照,使用的滤光片分别为 SYBR® Green 凝胶染料滤光片 (SYBR® Green I 染色的凝胶) 或溴化乙锭凝胶染料滤光片 (溴化乙锭染色的
凝胶) 。
实验步骤
电泳后的DNA 染色1. 在琼脂糖或非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。
·TBE (89 mM Tris 碱、89 mM 硼酸、1 mM EDTA,pH8) 和 TAE (40 mM Tris-乙酸、1 mM EDTA,pH8) 缓冲液都适合
于 SYBR® Green I 染色。
2. 将 SYBR® Green I 试剂储存液进行 1:10,000 倍稀释。
·染料可用 TE (10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA,pH8.0)、TBE 或 TAE 缓冲液来稀释。
SYBR® Green I 试剂的染色是 pH 敏感的。为了获得最佳的灵敏度,应确认在染色温度下染色液的 pH 值在 7.5 到 8.0 之间 (pH 8.0 更佳)。
·用水配制的染色液不如用缓冲液配制的稳定,为了确保最大的染色灵敏度,必须在 24 小时内使用。此外,用 pH 低 于 7.5 或高于 8.0 的缓冲液配制的染色液也不太稳定,染色效率有所下降。
3. 染色液要覆盖凝胶,在室温孵育 10-40 分钟。
·使用塑料的容器,如 Rubbermaid Servin 的三明治储存盒或吸头盒的盖子。请勿使用玻璃容器,因为它会吸附染色液
中的很多染料。
·让染色容器避光,可在上面覆盖铝箔或置于暗处。
·在室温下轻柔摇动凝胶。
·凝胶厚度及琼脂糖或聚丙烯酰胺的比例不同,染色时间将有所不同。
·无需脱色。
·染色液可在暗处 (最好是冷藏) 放置一个星期或更久,重复使用最多四次。
·我们推荐用塑料而不是玻璃容器来储存染色溶液,因为染料会吸附到玻璃表面。
预制的 SYBR® Green I 凝胶临灌胶之前将 SYBR® Green I 储存液按 1:10,000 的比例稀释到凝胶溶液中,预制成含有 SYBR® Green I 染料的琼脂糖或非
变性聚丙烯酰胺凝胶。预制的 SYBR® Green I 凝胶的 DNA 检测下限 (大约为 30-40 pg / 条带) 可能略高于电泳后染色 (< 20 pg /条带)。此外,在 SYBR® Green I 凝胶中的 DNA 片断迁移率明显比无染料凝胶中的相同片断慢。
图2. 与双链 DNA 结合的 SYBR® Green I 核酸凝胶染料的荧光激发和发射光谱。
在电泳之前进行 DNA 染色一般而言,DNA 在电泳前与染料的 1:10,000 稀释液 (在 TE、TBE 或 TAE 中) 至少孵育 15 分钟。我们用 1:10,000 的 SYBR® Green I 染料稀释液对 1 µg 的分子量标准 DNA 进行染色,总体积为 16 µl。我们并未在条带迁移分析中检验过 SYBR® Green I 染料作为 DNA 模板的预染标记,尽管它在此应用中应该有用。关于在电泳前如何进行 DNA 染色的常规方
法,详见参考文献 4 和 5。在这些参考文献中,特定应用中的步骤可能还需要优化。
凝胶成像·紫外或蓝光透射仪或紫外顶置光源直射。
·可在紫外或蓝光光源下轻松地观察到用 SYBR® Green I 染料染色的 DNA。
·254 nm 的紫外反射光源将比 300 nm 的透射光具有更高的灵敏度。注意:在每次使用后都要用去离子水和软布 (比如
粗棉布) 来清洁透射仪的表面,这一点很重要。否则,荧光染料,如 SYPRO® 染料、SYBR® 染料和溴化乙锭,将在玻璃
表面累积,并产生高的背景荧光。
·为了在宝丽来 667 黑白胶片上获得更佳的灵敏度,SYBR® Green I 染色的凝胶应该通过 Molecular Probes SYBR® 滤光
片 (S7569) 来照相。其他的很多黄色或绿色的明胶或玻璃纸滤光片 (从柯达及其他照相设备供应商处购买的) 也能用于照
相,但大部分的灵敏度会有所下降。用于溴化乙锭染色凝胶成像的红/黄色滤光片,则不能用于 SYBR® Green I 染色的凝
胶。对于手提式照相机或 CCD 照相机的滤光片,请联系你的仪器制造商。
染色的凝胶的背景荧光基本可以忽略,在检测少量 DNA 时允许长时间的胶片曝光。对于 300 nm 透射光,我们一般用普
通宝丽来相机的 4.5 光圈曝光 1-2 秒。对于 254 nm 的紫外反射光源 (尤其是手提灯),曝光大约需要持续 1-1.5 分钟以
获得最大的灵敏度。
·我们的检测极限是根据 FOTODyne FOTO/UV 450 紫外透射仪加上宝丽来 667 黑白胶片所获得的结果。一般而言,摄像
机和 CCD 照相机与黑白胶片有着不同的光谱响应,因此表现出不同的灵敏度。
激光扫描仪·SYBR® Green I 染色的 DNA 也能通过配置 450、473、488 或 532 nm 发射波长的激光成像系统来成像。对于 SYBR® Green I 适用的最佳滤光片组合,请联系你的仪器制造商。
·从双链 DNA 中去除 SYBR® Green I。
·我们发现通过简单的乙醇沉淀能从双链 DNA 中除去 99% 以上的 SYBR® Green I 染料。将 SYBR® Green I 染色的 DNA 移至 100 mM NaCl 中,并加入 2.5 倍体积的无水或 95% 乙醇。在冰上孵育约 20 分钟,在 4°C 的离心机上至少离心 10 分钟。去除乙醇,并用 70% 的乙醇洗涤沉淀。让乙醇挥发,并用TE 来重悬双链 DNA。
企业名称:上海立菲生物技术有限公司 (原上海英骏生物技术有限公司)工厂地址:北京经济技术开发区荣昌东街7号隆盛工业园203邮编:100176技术支持热线:800 820 8982 或 400 820 8982技术支持邮箱:[email protected]
Biophys J 66, A159 (1994); 2. Biomed Products 19, 68 (1994); 3. Proc Natl Acad Sci USA 94, 12419 (1997); 4. J Virol Methods 55, 153 (1995); 5. FASEB J 10, A1128, abstract #751 (1996); 6. Methods Cell Sci 17, 1 (1995); 7. Biotechniques 23, 1029 (1997); 8. Nucleic Acids Res 25, 2945 (1997); 9. Methods Enzymol 217, 414 (1993); 10. Clin Chem 43, 267 (1997); 11. Biotechniques 22, 1107 (1997); 12. Mutat Res 439, 37 (1999).
参考文献
仅限于科研使用,请勿用于动物或人类的疾病诊断及治疗。