Sintezna biologija
od spreminjanja celične signalizacije do novih materialov
Roman Jerala
Kemijski inštitutFKKT UL
Kaj je sintezna biologija
• Načrtovanje in ustvarjanje novih bioloških funkcij in sistemov
• Inženiring bioloških sistemov
• “Celična tovarna“
Sintezna biologija kot biološko inženirstvo
Vede o življenju
BiotehnologijaGenetikaMikrobiologijaMolekulska medicina Molekulska biologija...
InženirstvoRačunalništvo...
sinteznabiologija
Dva temeljna pristopa sintezne biologije
Modularna osnova sintezne biologije
•Spreminjanje obstoječih bioloških sistemov
•Rekonstrukcija novih bioloških sistemov:
•Tvorba celotnega genoma•Sestavljanje najmanjših sistemov, ki se lahko podvajajo
Hierarhična zgradba in modularnost
geni, proteini
biokemijske reakcije
mreže biokemijskih reakcij
celice
tkiva, organizmi
elektronski elementi
vezja
moduli
računalniki
računalniška omrežja
BioBricks (BioKocke) kot modularni gradniki:- regulatorna zaporedja- zapisi za proteine
DNK kot navodilo za izvajanje celičnega programa
Modularna osnova sintezne biologije
2001 Določitev človeškega genoma
Določanje zaporedij DNK
Do 2011 načrtujejo določiti 1000 genomov 60x več kot v 25 letih skupaj
Poznamo genome >700 mikroorganizmov, >800 v delu
Rob Carlson The Pace and Proliferation of Biological Technologies
1980 1985 1990 1995 2000 2005 20100,01
0,1
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
bp/$
year
gel: 3 bio $
capillary: 50 mio $
polony: 50 k$
lig. 5 k$
Church 2009
cost for human genome
Napredek zadnjih let:
10x povečanje/leto
Kemijska sinteza genov
Avtomatska sinteza določenega nukleotidnega zaporedja
1985 prvi sintetični gen v tedanji Jugoslaviji pr. 300 nukleotidov – danes ga za 250 € dobimo v dveh tednih
Danes s pomočjo robotov lahko sestavimo DNK velikosti več 10,000 nt
kemijska sintezaoligonukleotidov
parjenje
povezovanje
vstavitev v plazmid
vnos vcelico
Področja uporabe sintezne biologije
• diagnostika in zdravljenje bolezni• obnovljivi viri energije • novi materiali & bionanomateriali• procesiranje informacij• biosenzorji in bioremediacija okolja...
Sinteza zdravila proti malariji
artemisinin
250 milijonov okuženih1 milijon žrtev letno
Izolacija iz enoletnega pelina
visoka cena
Sintezna biologija za pripravo zdravil
Prenos biosintezne poti v bakterije pomočjo sintezne biologije
Sintezna biologija za pripravo zdravil
Obnovljivi viri energije iz biomase
CO2
celuloza sladkorji
gorivo
biomasa iz rastlin
pretvorba z mikroorganizmi
encimi
Sintezna biologija za obnovljive vire energije
Priprava goriva iz rastlinske biomase v bakterijah
Steen Nature 2010
Uporaba celic za procesiranje informacij
• DNK vsebuje gostoto informacije ~1 bit/nm3, kar je bistveno več kot obstoječi elektronski mediji
• DNK omogoči izvajanje logičnih operacij
Bio-fotolitografija
slikanje z bakterijami, bakterije se razporedijo glede na osvetljenost plošče
Sinhrona bakterijska uraDanino, Nature 2010
Bakterijski števec Friedland, Science 2009
Aktivacija celične signalizacije s svetlobo
Levskaya, Nature 2009
Dosežki sintezne biologije na Kemijskem inštitutu
• Sintezna imunologija:– Spreminjanje celične
signalizacije – detekcija virusa, spreminjanje celičnega odziva
– Priprava cepiv nove generacije
• Bionanotehnologija:– Priprava
nanomaterialov na osnovi DNK in peptidov
iGEMmednarodno tekmovanje gensko
spremenjenih strojev• 2004: srečanje petih ameriških ekip (MIT, BU,
Caltech, UT Austin, Princeton)
• 2005: prvo mednarodno srečanje: 13 ekip, 2 evropski (ETH in Cambridge), ni formalnih nagrad in sodnikov
• 2006: 37 ekip iz vsega sveta
• 2007: 54 ekip
• 2008: 84 ekip
• 2009: 121 ekip
Sodelujočih na iGEM: 8/10 najboljših; vse 3 nemške univerze med prvo stoterico.
Udeležba najuglednejših svetovnih univerz na iGEM
Projekt 2006 – zmanjšanje pretiranega imunskega odziva
Osnovni koncept:zmanjšanje pretiranega celičnega odziva
Sepso sproži pretiran vnetni odziv, ki ga sprožijo sestavine patigenih bakterij
200,000 žrtev letno v EU,ni učinkovitega zdravila
OkužbaCel
ični
odz
ivzmanjšanje odziva
Signalna pot TLR – odziv na bakterijsko infekcijo
NFκBP65
IκBα
NFκB P65/50
IKKβIKKγ
IKKα
MyD
88
DD
IRAK
TIR domena
DD domena
TRAF6TRAF6
TAB
2
Kinase
IRA
K1 P
P
PP
TAK1P
TAB1PTAK1
P
TAB1 P
PPTRAF6
Kinase
IRA
K1M
yD88
DD
MyD
88
DD
Kinase
IRA
K4
Kinase
IRA
K1
TRAF6
Uev1AUbc13
TAB2TAK1
P
P
TAB1 P
razgradnja
TRAF6
Uev1AUbc13
TAB2TAK1
P
P
TAB1P
MEKK3MEKK3
TLR
PAMPTLR TLR
jedro
Povzročitev imunskega odziva zaradi okužbe
vnetni posredniki
signalnaveriga
Model z dodano negativno povratno zanko
vnetni posredniki
signalnaveriga
zaviralec zaustavi pretiran odziv
Simuliran in eksperimentalno izmerjen odziv celic
Slovenska ekipa je v prvem nastopu osvojila Grand Prize.
detekcija virusne okužbe, ki je neobčutljiva za mutacije
Slovenski iGEM projekt 2007
Zdravila proti virusu HIV
Virus hitro mutira in postane odporen na zdravila
Problemi antivirusnih zdravil
Celice okužene z občutljivimi (rdeča) inodpornimi virusi HIV (zelena) pacienta z AIDS-om.
Mutacije!10 – 20% ljudi okuženih s HIV v Evropi in ZDA je okuženih z mutiranimi virusi
HAART – terapija s kombinacijo več zdravil
Cena
Doživljenska terapija
Stranski učinki zdravil
http://www.rhodes.edu/biology/glindquester/viruses/pagespass/hiv/attachment.jpg
FUNKCIJA 1:Vezava virusa povzroči heterodimerizacijo receptorja
Heterodimere lahko zaznamo preko cepljenih proteinov
• Cepljen ubikvitin– cepitev z lastno proteazo, ki je
specifična za ubikvitin– cepi na C-koncu ubikvitina
• Cepljena proteaza tobačnega virusa (TEV) protease system – cepi na zelo definiranem mestu
Virusni senzor na osnovi dimerizacije
CD4
prepisovanje protivirusnih obrambnih genov (e.g. interferon, ApoBec...)
fuzija receptorja z deli TEV proteaze
HIV-I virus
cepitev membranskega sidra (TEV substrate
CCR5
aktivirana TEV proteaza
T7 RNAPNLS signal
premik v jedro
Testiranje na celičnih kulturah pokaže uspešno delovanje
kontrola + gp120 + psevdovirus
Membranskalokalizacija
Citosolnalokalizacija
Citosolna lokalizacija
Povezava dveh korakov: aktivacija celic na osnovi TEV-T7
kontrola + gp120 + HIV psevdovirus
FUNKCIJA 2: aktivnost HIV proteaze
HIV proteaza prepozna specifičnomesto za cepitev:
SQNY↓PIVQ
aktivnost HIV proteaze se pojavi v poznem stadiju okužbe.
Sistem za zaznavanje virusa na osnovi aktivnosti HIV proteaze
prepisovanje obrambnih protivirusnih genov (e.g. interferon, ApoBec...)
T7 RNAP
T7 RNAP
substrat za HIV proteazoHIV-I proteaza
NLS signal
premik v jedro
membransko sidro
HIV proteaza povzroči premik fluorescentnega reporterja v jedro
kontrola + HIV proteaza
lokacija na membrani
lokacija v jedru
Aktivacija celic na osnovi aktivnosti HIV proteaze
kontrola + HIV proteaza
Ogled spletne strani iz 78 držav
http://parts.mit.edu/igem07/index.php/Ljubljana
Odmevnost projekta v svetu
Odmevi
Sintetično cepivo proti bakteriji Helicobacter pylori
iGEM2008
Helicobacter pylori• Stopnja okuženosti po svetu je
okrog 50 %
• Poglavitni vzrok želodčne razjede ter raka na želodcu
• 7 milijonov obolelih vsako leto, >600,000 žrtev, v Sloveniji >400 primerov želodčnega raka letno
• Na voljo še ni učinkovitega cepiva
NFκBP50/52
E. coli
Aktivacija celice:•kemokini•citokini•interferon...
Izogibanje imunskega sistema
Flagelin
H. pylori
TLR5 ne prepozna flagelina H. pylori
FlagelinTLR5
Himerni flagelin
Brez aktivacije
H. pylori FlaAE. coli FliC Himerni flagelin
Antigene lastnosti, protitelesa, T-celični odziv
Aktivacija prirojene imunosti
Sestava sintetičnega cepiva
Variabilna domena flagelina H.pylori
H. pylori antigen(npr. UreB)
proteinski antigeni (aktivacija adaptivne imunosti)
Aktivacija prirojene imunosti (TLR5)
prirojen imunski odziv
pridobljen imunski odziv (proti antigenom H.pylori)
Priprava treh oblik cepiva
Proteinsko cepivo
Modificirane bakterijeDNK cepivo
CMV-HF-UreB..Antigen
HFss
CMV
Celični in humoralni imunski odziv
Prezentacija antigena, aktivacija citokinov, ... DC, makrofagi…
activationNFκBP50/52
TLR5
himerni flagelin-H. pylori antigen
DNK cepivo
Tkivo
DNKcepivo
Himerni flagelin se mora izločiti, daaktivira TLR5.
Transaktivacija TLR5 prekoizločenega flagelina sosednjih celic.
Cell, cotransfected with TLR5and DNK vaccine
DNK cepivo - rezultati
Učinkovitost cepiva in vivo
Močna imunoreaktivnost seruma imuniziranih miši (HF-MULTI).
Serum imuniziranih živali (MULTI) prepozna žive bakterije
0
0,5
1
1,5
2
2,5
62,5 250 1000 4000 16000
IgG
(OD
450
nm
)
redčitve
immunized mice
Relative flourescence intensity
Relative flourescence intensity
3 tedni!
neg. kontrola
Sekundarna protitelesa na H. pylori
HF-serum na H. pylori
[Nanomateriali]
Biološki sistemi so nanosistemi,ki dejansko delujejo !
Ali znamo sestaviti novenanostroje in nanostrukture ?
Nanomateriali imajo številne prednosti.Večinoma so pripravljeni iz anorganskih ali organskih materialov enega tipa – relativno enostavne strukture.
[kontrola sestavljanja struktur iz DNK]
S pomočjo parjenja baz lahko kontrolirano povezujemo verige DNK
[geometrijski liki iz DNK]
Rothemund, Nature 2006He et al., Nature 2008, ChemComun 2006
[bolj kompleksne sestavljene strukture]
[Nano zemljevid Slovenije iz DNK]
100 nm
Miha Jerala, Gimnazija VičIva Hafner Bratkovič, KI
Sestavljen iz 7249 nt dolgega DNK genoma bakteriofaga M13 ter 227 sintetičnih oligonukleotidov
[primerjava DNK in polipeptidov kot gradnikov nanostruktur]
DNK polipeptidivsebuje 4 nukleotide s podobnimi
lastnostmi -vsebujejo 20 AK z različnimi
kemijskimi lastnostmi +se lahko zvije v določene 3D
strukture +/-se lahko zvijejo v določene 3D
strukture +v naravi shranjuje informacije
-v naravi gradijo strukture in
funkcionalne “naprave” +lahko se programira (W-C bazni pari)
+
informacija kodira strukturo na
kompleksen način -
intro
[obvite polipeptidne vijačnice kot gradniki]
obvite vijačnice s paralelno ali antiparalelno orientacijo
stabilnost in specifičnost parjenja –izbrani AK ostanki na določenih mestih ponovitev heptad = dva zavoja vijačnice
1 nm/heptado
Stabilizira: hidrofobni AK ostanki na
mestih a in d – tvorba jedra nasprotni naboji na mestih
e in g
Destabilizira: ostanki polarnih AK (Asn) na
mestih a ali d enak naboj na mestih e in g
Mesta b, c in f: poljuben izbor aminokislin – uvedemo želene funkcije
[interakcije: načrtovanje stabilnosti obvitih vijačnic]
[kaj lahko sestavimo z obvitimi vijačnicami? ]
Z uporabo peptidov, sestavljenih iz dveh vrst komplementarnih vijačnic, lahko sestavimo le linearne strukture: tvorba fibril.
[uporaba treh segmentov namesto dveh ]
Za tvorbo 2D ali 3D struktur potrebujemo vsaj 3 različne, med seboj komplementarne vijačne segmente.
[kombinacija oligomerizacijske domene inobvite vijačnice]
oligomerizacijska domena (≥3) + segment, ki tvori antiparalelno obvito vijačnico
mreža s porami , definiranimi z dolžino in lastnostmi segmenta, ki tvori obvito vijačnico
segment, ki tvori antiparalelno obvito vijačnico
gradnik:
p53 tetramerizacijska domena
[sestavljanje proteinske mreže]
[sestavljanje proteinske mreže]
Pore: velikost pore določa dolžina segmenta, ki tvori obvito vijačnico kemijske lastnosti pore določajo AK ostanki na povšini obvite vijačnice
[sestavljanje proteinske mreže]
Pore: velikost pore določa dolžina segmenta, ki tvori obvito vijačnico kemijske lastnosti pore določajo ak ostanki na povšini obvite vijačnice
[ultrafiltracija čez polipeptidno membrano]
Odstranjevanje virusov:
Only 0.22um PVDF Filter
0.22um PVDF Filter with protein membrane
PVDF filter with 0.22 um pores
PVDF filter with 0.22 um pores
Proteinmembrane
Možnosti uporabe: naprave za filtracijo in ločevanje, kataliza.
[gradniki za tvorbo 2D in 3D struktur]
a b a’
+ heterodimer
a a’
b
2x homodimer
Samosestavljanje: 1 paralno homodimerni in 2 heterodimerna segmenta
[kako sestaviti kocko iz ene vrste polipeptidov?]
a b a’
[samosestavljanje v heksagonalno mrežo – gradniki so enaki kot pri kocki]
a b a’
[druge kombinacije: segmenti iz treh ali več obvitih vijačnic]
Primer: trije homodimeri se lahko zvijejo v tetraeder, kocko ali planarno mrežo
A B C
C – antiparalelni homodimeriiz obvitih vijačnic: segment C-C
B– antiparalelni homodimeriiz obvitih vijačnic: segment B-B
A – antiparalelni homodimeriiz obvitih vijačnic: segment A-A
[eksperimentalni rezultati]
190 200 210 220 230 240 250 260-60-40-20
020406080
100120140
P1 P2 P1+P2
Ellip
ticity
(mde
g)
Wavelength (nm)
P1 P2
P1-P2 heterodimer
Le pari heterodimernih vijačnih segmentov lahko tvorijo obvite vijačnice.
200 210 220 230 240 250 260
-10
-5
0
5
10
Elli
ptic
ity (m
deg)
Wavelength (nm)
K2:P1 GCN P2
[samosestavljiva polipeptidna mreža]
napoved
Posnetek TEM: samosestavljen K2
rezultat !!!
[nanokocka sestavljena iz peptidov]
Posnetek TEM: samosestavljena struktura iz peptida K2 pri nizki koncentraciji
To je prvi primer mrež ali 3D struktur, zgrajenih na osnovi obvitih vijačnic!
Ozka grla SBOrodjaBolj zmogljiva kemijska sinteza (rezvoj 2.generacije
DNK sintetizatorjev)Modularnost, standardizacijaAvtomatizacija sestavljanja genomov (laboratorij na
čipu)
Razumevanje osnov delovanja bioloških sistemov
Razumevanje celice kot kompleksnega sistema (sistemska biologija)
Razumevanje zvitja proteinov in njihovih interakcij
Prihodnost sintezne biologije
• Aplikacije v bližnji prihodnosti– obnovljivi viri energije– napredni (nano)biomateriali– medicinske aplikacije– industrijska biosinteza
• Raziskave bioloških sistemov s sintezno biologijo– Sinteza celotnih genomov bakterij in njihova aktivacija– Identifikacija minimalnega genoma– de novo programiranje genoma
[think outside the box !]
Meje potencialov uporabe sintezne biologije v nanotehnologiji postavljajo samo naše razumevanjenaravnih principov in ustvarjalnost.
Σ
Škatla je šele začetek...
Nominacija Team Slovenija za World Technology Award
Pretekli dobitniki:
Craig Venter, Sir John Sulston, Tim Berners Lee, Mark Zuckerberg,Michael Graetzel, Burt Rutan,
Google, Sony, Genentech,IBM, Space-X, Weizmanov inštitut…
Ekipe 2006-2009
MentorjiMojca Benčina (KI), Monika Ciglič (KI), Karolina Ivičak (KI), Nina Pirher (KI), Gabriela Panter
(KI), Mateja Manček Keber (KI), Marko Dolinar(FKKT), Simon Horvat (BF), Roman Jerala (KI, FKKT)
2008Eva Čeh, BFVid Kočar, FKKTKatja Kolar, FKKTAna Lasič, MFJan Lonzarić, FKKTJerneja Mori, BFAnže Smole, BF
2006Monika Ciglič, BFOta Fekonja, BFJernej Kovač, FKKTAlja Oblak, BFJelka Pohar, BFMatej Skočaj, BFRok Tkavc, BF
2007Marko Bitenc, BFPeter Cimermančič, FKKTRok Gaber, BFSaša Jereb , FKKTKatja Kolar, FKKTAnja Korenčič, FKKTAndrej Ondračka, FKKT
2008Sabina Božič, FKKTNika Debeljak, BFTibor Doles, BFUrška Jelerčič;FMFAnja Lukan, FKKTŠpela Miklavič, BFMarko Verce, BF