UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica
Propriedades Imunomodulatórias de Peptídeos Miméticos da LDL
Eletronegativa
Felipe Wakasuqui
Trabalho de Conclusão do Curso de
Farmácia-Bioquímica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da
Universidade de São Paulo.
Orientador(a):
Prof.(a). Dr(a) Dulcineia Saes Parra
Abdalla
São Paulo
2017
SUMÁRIO
Pág.
Lista de Abreviaturas .......................................................................... 1
RESUMO .......................................................................................... 3
1. INTRODUÇÃO................................................................................. 4
2. OBJETIVOS.................................................................................... 14
3. MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................... 14
4. RESULTADOS.................................................................................. 23
5. DISCUSSÃO.................................................................................... 31
6. CONCLUSÃO................................................................................... 34
7. BIBLIOGRAFIA................................................................................. 36
8. ANEXOS........................................................................................ 44
1
LISTA DE ABREVIATURAS
ApoB, Apolipoproteína - B 100
CCR2–CCL2 C-C chemokine receptor-like 2- chemokine (C-C motif) ligand 2
CCR5–CCL5 C-C chemokine receptor-like 5- chemokine (C-C motif) ligand 5
CD Cluster of differentiation
CSFE Éster de succinimidil carboxifluoresceína
CX3CR1-
CX3CL1
CX3C chemokine receptor 1 - chemokine (C-X3-C motif) ligand 1
CXCL1 Chemokine (C-X-C motif) ligand 1
DAMP Danger associated molecular patterns
FBS Fetal Bovine Serum/ Soro Fetal Bovino
Fc γ Receptor Fc para gama globulina
FSC-A Forward-scattered light - Area
FSC-H Forward-scattered light - Height
GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
HSP Heat Shock Protein
IgG e IGM Imunoglobulina G e Imunoglobulina M
IL Interleucina
IFN-γ Interferon gama
LDL Low Density Lipoprotein/ Lipoproteína de Baixa Densidade
LFA1 Lymphocyte function-associated antigen 1
2
LPS Lipopolysaccharide/ Endotoxina
LY6Chi Lymphocyte antigen 6 complex high
LY6Clow Lymphocyte antigen 6 complex low
MCP-1 Monocyte chemoattractant protein 1 (CCL2)
MHC II Major histocompatibility complex II
NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NALP3 NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3
NF-κB Nucear Factor – kappa B
PBS Phosphate buffered saline
PDGF Platelet Derivated Growth Factor
PPR Pattern Recognition Receptor
rM-CSF Recombinant macrophage colony-stimulating factor
RMPI Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute 1640
SSC-A Side scatter
TGF- β Transforming Growth Factor - β
TLR Toll-like receptor
TNF Tumour necrosis factor
VLA4 Very Late Antigen-4/ Integrin α4β1
3
RESUMO
Wakasuqui, F. Propriedades Imunomodulatórias de Peptídeos Miméticos da LDL Eletronegativa. 2017. no. 499. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017. Palavras-chave: Peptídeos miméticos, Aterosclerose, Linfócitos, Macrófagos. INTRODUÇÃO: As doenças cardiovasculares, cuja base fisiopatológica é a aterosclerose, são a principal causa de mortalidade no mundo. Na aterosclerose, o endotélio ativado permite a entrada e o acúmulo de lipoproteínas modificados na matriz subendotelial, assim como das células do sistema imune. Os macrófagos reconhecem as partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) modificada acumulada na íntima dos vasos e a internalizam. O acúmulo de ésteres de colesterol nos macrófagos resulta na formação das células espumosas, que posteriormente sofrem apoptose, contribuindo para o acúmulo de lipídios na lesão aterosclerótica. A resposta imune nessa lesão é modulada principalmente pelos macrófagos e linfócitos T, cujas subpopulações desencadearão um efeito protetor ou pró-aterogênico, através da produção de citocinas. Estudos anteriores selecionaram peptídeos miméticos que são reconhecidos pelas porções variáveis de anticorpos monoclonais anti-LDL humana modificada in vivo, denominada LDL eletronegativa. Esses peptídeos têm potenciais aplicações diagnósticas, como antígenos sintéticos e terapêuticas, modulando a resposta imune na aterosclerose. OBJETIVO: Avaliar o efeito dos peptídeos miméticos da LDL eletronegativa sobre a expressão de citocinas em macrófagos e a proliferação de linfócitos. MATERIAIS E MÉTODOS: Avaliou-se por qRT-PCR o efeito de dois peptídeos miméticos (P1 e P2) sobre a expressão gênica de Cd40, Ccl2, Cox2, Il1a, Il1b, Il6, Il10 e Tnfa em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos C57BL/6 e sobre a expressão de CCL2, IL-6, IL-8 e IL-10 em macrófagos humanos derivados de monócitos do sangue periférico de indivíduos saudáveis. O efeito dos peptídeos sobre a proliferação de linfócitos isolados do baço de camundongos C57BL/6 e do sangue humano foi avaliado por meio de citometria de fluxo, utilizando o marcador éster de succinimidil carboxifluoresceína (CSFE) RESULTADOS: Os peptídeos induziram a expressão de citocinas pró-inflamatórias em macrófagos murinos, porém em menor intensidade quando comparados à LDL(-). Os resultados em macrófagos humanos não foram conclusivos. O efeito dos peptídeos sobre a proliferação total de linfócitos não foi significativo. CONCLUSÃO: Os peptídeos miméticos estudados não tem o mesmo potencial pro-inflamatório da LDL(-).
4
1. INTRODUÇÃO
1.1 Aterosclerose
Aterosclerose é uma doença inflamatória crônica caracterizada pela
formação de ateromas nas artérias de médio e largo calibre, especialmente em
áreas de bifurcação do fluxo sanguíneo, onde o sangue assume um fluxo
turbulento. Nestes locais o endotélio está exposto à tensão de cisalhamento e
responde a essa tensão alterando sua transcrição gênica pela ligação de
elementos responsivos ao stress a fatores de transcrição como o NF-κB
(Gimbrone et al., 2000). As células endoteliais ativadas pelos estímulos lesivos
expressam moléculas de adesão para leucócitos em sua superfície. Outros
estímulos lesivos incluem dislipidemias, hipertensão, hiper-homocisteinemia,
diabetes, obesidade, inflamação sistêmica, tabagismo, entre outros (Lusis, 2000).
Ao mesmo tempo ocorrem mudanças na permeabilidade do endotélio, o que
permite a entrada e retenção de partículas de lipoproteína de baixa densidade
(LDL) na matriz celular abaixo da túnica íntima (Tabas et al., 2007) devido a
interações da proteína ApoB100 com os proteoglicanos da matriz (Borén et al.,
1998).
As partículas de LDL modificadas ativam o endotélio e induzem a
expressão de moléculas de adesão para leucócitos, permitindo a entrada de
monócitos circulantes e a posterior diferenciação desses em macrófagos, que
expressam receptores scavenger os quais reconhecem e internalizam a LDL
modificada. Os macrófagos acumulam de forma massiva as partículas de LDL
modificada em seu interior, transformando-se em células espumosas, que morrem
por apoptose e contribuem para o aumento do conteúdo lipídico da lesão. A LDL
em sua forma nativa não gera células espumosas porque é endocitada via
receptor B/E, que é controlado por um feedback negativo que diminui a expressão
do mesmo e impede o acúmulo intracelular de ésteres de colesterol (Kruth et al.,
2002). O aumento das células espumosas no espaço subendotelial forma as
estrias gordurosas, que são as lesões iniciais da aterosclerose. As células
5
espumosas também liberam citocinas e fatores de crescimento, como o PDGF,
que estimulam a migração e proliferação das musculares lisas da túnica média da
artéria para a camada íntima. As células musculares lisas também secretam
elementos da matriz extracelular como colágeno e elastina e formam a cápsula
fibrosa que circunda o núcleo necrótico rico em lipídios das lesões ateroscleróticas
(Libby et al., 2011). A lesão continua a se expandir devido à migração contínua de
células mononucleares da circulação, assim como a entrada de lipoproteínas e a
formação de células espumosas, o que é acompanhado pela proliferação das
células musculares lisas, produção da matriz extracelular e pelo acúmulo de
lipídios. Inicialmente, as lesões crescem para a adventícia até um ponto crítico ser
atingido e após isso, começam a expandir-se e invadir o lúmen. (Lusis, 2000).
A cápsula fibrosa sofre contínua remodelação que pode tornar a placa
susceptível a alterações agudas. O colágeno secretado pelas células musculares
lisas representa o principal componente estrutural da cápsula fibrosa e é
responsável por sua força e estabilidade mecânicas. O colágeno é degradado
principalmente por metaloproteinases secretadas por macrófagos no interior da
placa ateromatosa; enquanto os inibidores teciduais de metaloproteinases,
produzidos por células endoteliais, células musculares lisas e macrófagos,
modulam a atividade das metaloproteinases. (Finn et al., 2010). A inflamação da
placa resulta em um aumento da degradação do colágeno e redução da síntese
de colágeno, assim desestabilizando a integridade da cápsula fibrosa. (Halvorsen
et al., 2008). Diversas outras modificações estruturais podem ocorrer na placa
aterosclerótica como calcificação, ulceração na superfície luminal e hemorragia a
partir de pequenos vasos que se formam na lesão por neoangiogênese e que se
originam da parede de vasos sanguíneos da vasa vasorum da camada adventícia
das artérias (Lusis, 2000).
As principais complicações clínicas da aterosclerose dependerão do
tamanho dos vasos, da estabilidade da própria placa e do grau de degeneração da
parede arterial subjacente. Nos pequenos vasos a estenose aterosclerótica
obstruirá gradualmente a luz dos vasos e causará diminuição crônica da perfusão
6
arterial. Entre as consequências da estenose estão a oclusão mesentérica e
isquêmica do intestino, encefalopatia isquêmica e claudicação intermitente. A
ruptura da placa é o evento clínico mais preocupante, pois a placa que se rompeu
pode levar à trombose vascular aguda e/ou embolia com obstrução distal do vaso,
causando por exemplo um infarto agudo do miocárdio ou um acidente vascular
cerebral. Por fim, a aterosclerose pode levar à destruição da parede vascular
subjacente à placa com formação de aneurisma, ruptura e/ou trombose
secundária (Stary et al., 1995) .
Vale ressaltar a importância do estudo da aterosclerose pois dois de seus
desfechos clínicos, a doença cardíaca isquêmica e o acidente vascular cerebral,
são as principais causas de morte na atualidade, como tem sido indicado pela
Organização Mundial da Saúde nos últimos 15 anos (WHO, 2017).
1.2 LDL eletronegativa
A LDL é uma partícula esférica, com aproximadamente 22nm de diâmetro,
que contém um núcleo apolar de ésteres de colesterol e triglicérides, cercados por
uma monocamada anfipática de fosfolípides e colesterol não esterificado e uma
molécula de apolipoproteína B-100 (Prassl e Laggner, 2009). É a responsável pelo
transporte sérico do colesterol, sendo internalizada por sua ligação aos receptores
de LDL (B/E) presentes na membrana plasmática dos hepatócitos e dos tecidos
periféricos (Braunwald, 1999). As partículas de LDL na circulação não são
homogêneas, e podem formar diversas subclasses baseadas em diferenças de
densidade, tamanho e carga elétrica (Berneis, 2002). As partículas de LDL
também podem sofrer diversas modificações químicas como carbamilação (Shah
et al., 2008), enriquecimento com ácidos graxos não-esterificados (BenıTez et al.,
2002), glicação (Brown et al., 2007), nitração (Peluffo e Radi, 2007), oxidação
(Jun-Jun et al., 2000) e modificações provocadas pela ação enzimática de
lipoxigenases e mieloperoxidases (Hevonoja et al., 2000), gerando diversas
subpopulações de LDL desde a minimamente modificada até a extensivamente
oxidada.
7
Dentre as subfrações de LDL modificada, a LDL eletronegativa (LDL(-)) se
diferencia da forma nativa por ter sua carga superficial negativa aumentada. A
população de LDL(-) também é heterogênea, podendo apresentar variações em
densidade e tamanho, e diferentes graus de eletronegatividade, que pode estar
associada ao seu conteúdo aumentado de ácidos graxos não esterificados
(Sánchez-Quesada et al., 2003), elevado conteúdo de hidroperóxidos (Sevanian et
al., 1997), dienos conjugados e óxidos de colesterol (Chang et al., 1997), e menor
conteúdo de α-tocoferol (Cazzolato et al., 1991). Sua origem não está bem
estabelecida, mas inibição da fosfolipase A2 parece inibir sua formação (Greco et
al., 2009). O mais provável é que não apenas um processo esteja envolvido em
sua formação, mas sim o resultado de sucessivas e diferentes modificações, como
glicação não-enzimática e enriquecimento de ácidos graxos não-esterificados,
além de modificações relacionadas à ação das enzimas fosfolipase A2 e
esfingomielinase (Kovanen e Pentikäinen, 2003).
A LDL(-) diferencia-se das formas mais oxidadas de LDL(-) por ainda ser
reconhecida pelos receptores de LDL (Benítez et al., 2004), apesar da afinidade
diminuída, devido a modificação na apoB-100 (Parasassi et al., 2001) o que
aumenta a meia vida da lipoproteína na circulação e promove um aumento de sua
afinidade por proteoglicanos da matriz extracelular (Estruch et al., 2013). A LDL(-)
apresenta tendência a agregação. A agregação de partículas de LDL(-) aumenta
sua ligação aos proteoglicanos da matriz subendotelial das artérias, sendo
portanto pró-aterogênica (Ivanova et al., 2015).
A LDL(-) é citotóxica para o endotélio, diminuindo a transcrição de FGF-2, o
que pode contribuir para aumento da apoptose (Chen et al., 2003), além de induzir
a inflamação por liberação de IL-6, IL-8, MCP-1, GM-CSF, PDGF-B por
macrófagos (Benítez et al., 2006; De Castellarnau et al., 2007) e aumentar a
expressão de moléculas de adesão de células vasculares induzidas por TNF-α
(Ziouzenkova et al., 2003). A LDL(-) induz ainda a liberação do fator estimulador
de colônias de macrófagos e PDGF-B (De Castellarnau et al., 2007), além de inibir
a síntese de óxido nítrico pela óxido nítrico sintase endotelial (Berliner et al.,
8
1995). Todas essas citocinas pró-inflamatórias contribuem para o processo
aterogênico pelo recrutamento de leucócitos, sua proliferação e a manutenção do
estado pró-inflamatório.
O nível de LDL(-) representa de 1 a 10% da concentração plasmática de
LDL de uma pessoa normal (Benítez et al., 2004), mas encontra-se aumentado em
indivíduos com doenças como diabetes tipos 1 e 2 (SaNchez-Quesada et al.,
2001), hipercolesterolemia familiar (Sánchez-Quesada et al., 1999), síndromes
coronarianas (Oliveira et al., 2006) e em pacientes renais crônicos sob tratamento
de hemodiálise (Lobo et al., 2008). Por estar aumentada nestas situações de
elevado risco cardiovascular, a LDL(-) pode ser considerada um importante
biomarcador e fator de risco para doenças cardiovasculares, assim como um
possível alvo terapêutico (Ivanova et al., 2015). Nosso grupo desenvolveu
anticorpos monoclonais que distinguem a LDL(-) da fração nativa, bem como
imunoensaios validados para sua detecção de forma rápida e direta que poderiam
ser usados na prática clínica (Damasceno et al., 2006; Faulin et al., 2012).
1.3 Macrófagos na aterosclerose
Nas primeiras etapas da aterogênese, o endotélio promove a captura e o
rolamento dos monócitos circulantes através das quimiocinas CCL5 e CXCL1
(Soehnlein et al., 2013) e a adesão através da P-selectina, VCAM1, ICAM1, que
se ligam às integrinas VLA4 e à LFA1 e são importantes para a firme adesão dos
monócitos na superfície luminal do endotélio. A transmigração dos monócitos em
direção à placa é mediada por quimiocinas liberadas pelo endotélio, células
musculares lisas e macrófagos residentes, sendo CCR2–CCL2, CX3CR1-CX3CL1
e CCR5–CCL5, os principais pares quimiocina-receptor responsáveis pela
transmigração (Tacke et al., 2007).
A intensa captura das lipoproteínas pelos macrófagos derivados de monócitos,
tornando-os células espumosas, é um dos primeiros eventos patogênicos na
aterosclerose. Embora os macrófagos possam endocitar as lipoproteínas que
contêm a ApoB100 pelo receptor de LDL, a expressão desse receptor é regulada
9
negativamente pelo excesso de colesterol. O acúmulo de colesterol forma cristais
presentes na placa aterosclerótica, tanto no espaço extracelular quanto no interior
dos macrófagos, os quais podem induzir a ativação do inflamossoma NLRP3, que
resulta no processamento e secreção da IL-1β, que é pró-inflamatória (Duewell et
al., 2010). As diversas formas modificadas da LDL contêm domínios que são
reconhecidos como sinais associados ao perigo (DAMPs) por diferentes
receptores de reconhecimento de padrões moleculares (PRR) das células do
sistema imune. Os macrófagos reconhecem as diversas classes de LDL
modificada através dos receptores scavenger e também pelos receptores Toll-like
(Moore e Tabas, 2011). A LDL(-) é reconhecida principalmente pelo CD14
(Estruch et al., 2013), LOX-1 (Lu et al., 2009), TLR2 e TLR4 (Chávez-Sánchez et
al., 2010). A ativação de CD14, TLR2 e TLR4 induz a produção das citocinas
TNF, IL-1β, IL-6, e IL-10 (Chávez-Sánchez et al., 2010); e a produção de
espécies reativas de oxigênio pela NADPH oxidase 2, através da sinalização via
TLR4 (Bae et al., 2009).
No interior da placa, os macrófagos encontram sinais distintos, que os levarão
a diversas polarizações, formando uma população heterogênea. A sinalização por
TLR pode induzir a polarização para macrófagos M1, que são pró-inflamatórios e
produzem diversas citocinas pró-inflamatórias como IL-6 e IL-12 e espécies
reativas de oxigênio e nitrogênio (Adamson e Leitinger, 2011), enquanto a LDL
oxidada pode levar a polarização M2, que é ateroprotetora, através da ativação de
PPARγ (Gallardo-Soler et al., 2008). Macrófagos M2 têm propriedades anti-
inflamatórias e secretam as citocinas IL-10 e o agonista do receptor de IL-1 em
resposta às citocinas IL-4 e IL-13 de linfócitos Th2 (Bobryshev et al., 2016). No
entanto, essa visão de duas polarizações distintas com propriedades antagônicas
é simplificada pois outras polarizações de macrófagos estão presentes na placa,
como o Mox caracterizado pela expressão aumentada de NRF2 (Kadl et al., 2010).
A origem da polarização dos macrófagos ainda não está completamente
elucidada. Sugere-se que em camundongos os macrófagos M1 possam vir
preferencialmente de monócitos LY6Chi, que são mais pró- inflamatórios, e que
10
macrófagos M2 venham de monócitos LY6Clow, ou derivados de macrófagos M2
residentes no tecido. É provável que os linfócitos TH1 e TH2 secretem fatores
polarizantes. Sabe-se que a população de macrófagos M1 aumenta conforme a
lesão aterosclerótica progride (Khallou-Laschet et al., 2010), enquanto macrófagos
M2 estão envolvidos com a regressão da placa e o reparo tecidual (Bobryshev et
al., 2016). A maior compreensão do fenômeno da polarização de macrófagos pode
levar a terapias que estimulem a polarização M2 e seu efeito ateroprotetor.
Conforme a placa avança, os macrófagos continuam sendo um dos maiores
moduladores do processo aterosclerótico, seja através das secreção de citocinas,
metaloproteinases, espécies reativas de oxigênio, ou mesmo através da sua
eventual morte por apoptose ou necrose, liberando conteúdo lipídico e fator
tecidual, que irá formar o material pró-trombótico no interior da placa (Moore et al.,
2013), além de apresentarem antígenos para os linfócitos T através do complexo
MHC II.
1.4 Linfócitos na aterosclerose
Aproximadamente 10% dos linfócitos T em placas ateroscleróticas humanas
podem reconhecer LDL oxidada através da apresentação de antígenos via MHC
classe II (Andersson et al., 2010). A apresentação de antígenos ocorre
principalmente através de células dendríticas imaturas que internalizam antígenos
relacionados ao processo aterosclerótico e os levam aos linfonodos e baço onde
induzem o priming nos linfócitos T naive. Após a ativação desses linfócitos,
poucos clones se expandem dentro da lesão, o que é compatível com a baixa
expansão que ocorre no sangue periférico (Andersson et al., 2010). Diversos
antígenos próprios ou microbianos estão relacionados com a ativação dos
linfócitos T no processo aterosclerótico, entre os mais importantes auto antígenos
estão a LDL modificada (Stemme et al., 1995), as proteínas de choque térmico
(HSPs) e a glicoproteína β2 (George et al., 1999).
Os diferentes tipos de linfócitos têm papeis muito diferentes no processo
aterosclerótico, que será descrito adiante. Os linfócitos T CD4+ são tão
11
importantes para a lesão, que sua inativação por anticorpos monoclonais anti-
CD4+ reduzem a lesão em até 70% em modelos murinos (Lichtman, 2013). Há
diversos padrões de resposta das células T CD4, cada um tendo um efeito
diferente no processo aterogênico. As células Th1 produzem principalmente INF-γ,
um potente ativador de macrófagos que contribui para o aumento da lesão, pois
recrutam outros macrófagos para a placa, aumentando a expressão do complexo
MHC classe II e a captura de lipídios das lipoproteínas pelos macrófagos (Leon e
Zuckerman, 2005). O IFN-γ pode desestabilizar a placa através da diminuição da
infiltração e proliferação de células musculares lisas, reduzindo a síntese de
colágeno, além do aumento da produção de enzimas que degradam a matriz
extracelular, potencializando a ruptura da placa (Mclaren e Ramji, 2009).
A resposta por linfócitos Th2 conduz a vias pró e antiaterogênicas. Seu efeito
pró-inflamatório deve-se à expressão da citocina IL-4, que tem efeitos como
ativação de mastócitos, redução da produção de colágeno e aumento das
proteases elastase e metaloproteinase-12, que degradam a matriz extracelular, o
que desestabiliza a placa, além de digerir elementos estruturais da parede da
artéria o que pode provocar um aneurisma (Andersson, 2010). Em contraste, a
síntese da IL-5 pelos linfócitos Th2 tem um efeito protetor, pois ela estimula
linfócitos B1a que expressam mais IgM, conhecida como anticorpo natural, pois
reconhece epítopos resultantes da oxidação da LDL e favorece o clearence
desses autoantígenos sem promover inflamação (Binder, 2010). A classe das
imunoglobulinas IgG, secretadas por linfócitos B2, está comumente associado a
processos pró-aterogênicos, por mediarem a captura de imunocomplexos através
do receptor Fcγ dos macrófagos. Essa captura mediada por Fcγ resulta em
ativação celular, liberação de citocinas pró-inflamatórias, metaloproteinases,
espécies reativas de oxigênio e na regulação positiva dos receptores de LDL
(Wang et al., 2012). Entretanto, diversos candidatos à vacina para aterosclerose
aumentam o nível de IgG (Tse et al., 2013; Gisterå et al., 2017), portanto seus
efeitos podem depender de sua especificidade, subclasse e capacidade de formar
imunocomplexos (Le Borgne et al., 2015).
12
Todos os tipos de linfócitos Treg têm um efeito ateroprotetor, exercendo
atividade imunoregulatória e supressiva através de vários mecanismos, entre os
quais a secreção de IL-10, TGF- β e inibição mediada por contato (Ketelhuth e
Hansson, 2016).
Os linfócitos T CD8+ tem um papel na vulnerabilidade da placa, pois levam à
apoptose de macrófagos, células de músculo liso, células endoteliais o que, por
sua vez, aumenta a formação de núcleo necrótico e aumenta ainda mais a
inflamação via TNF-α (Kyaw T et al, 2013). No entanto, o papel dos linfócitos T
CD8+ como ateroprotetor ou pró aterogênico ainda não é claro, assim como dos
linfócitos Th17 e dos linfócitos da imunidade inata γδ, NK e NKT (Hedrick, 2015;
Ketelhuth e Hansson, 2016).
1.5 Peptideos mimotopos e suas aplicações
Peptídeos mimotopos são sequências de aminoácidos que mimetizam um
epítopo de um antígeno. Como esses peptídeos são reconhecidos por receptores
de células B, eles tem semelhança com a estrutura 3D do epítopo, mas não
necessariamente homologia, podendo mimetizar não só antígenos protéicos, mas
também lipídeos e carboidratos (Kimura et al., 2015).
O método utilizado para seleção dos peptídeos mimotopos é o chamado
‘’phage display’’, no qual sequências aleatórias de DNA são inseridas no gene do
capsídeo proteíco de um vírus filamentoso como o M13. Quando a capsula viral é
expressa, os aminoácidos do gene ficam fundidos aos aminoácidos do capsídeo e
o fago pode então apresentar os aminoácidos da sequência de interesse na
superfície. Devido à acessibilidade, a sequência de aminoácidos incorporados aos
fagos comporta-se como se estivessem livres, permitindo seu reconhecimento por
estruturas biológicas. São montados então diversos tipos de fagos apresentando
diversas sequências diferentes, normalmente com 5 a 20 aminoácidos para formar
uma biblioteca. Há dois tipos de bibliotecas de fagos: as de sequências lineares e
as cíclicas, nas cíclicas a sequência da região randomizada é flanqueada por duas
cisteínas para manter a conformação do peptídeo por meio das pontes dissulfeto.
13
Os fagos com alta afinidade pelo anticorpo são isolados do restante da biblitoeca
por meio da seleção por afinidade, em que o anticorpo é incubado com a
biblioteca de fagos, realizando-se uma lavagem para remover os fagos não
ligados. Os fagos ligados ao anticorpo são eluídos posteriorente utilizando-se um
tampão ácido. Estes fagos que se ligaram ao anticorpo são amplificados em E. coli
e são submetidos a outro processo de seleção por afinidade. Ao final de várias
etapas, os clones de fagos que se ligam fortemente ao anticorpo são obtidos, e
tem sua sequência de DNA sequenciada para determinar os peptídeos com alta
afinidade pelo anticorpo (Smith & Petrenko, 1997); (Matsubara, 2012).
Os peptídeos utilizados neste trabalho são epítopos da porção da
apolipoproteína B-100 modificada reconhecida pela porção variável de dois
anticorpos monoclonais anti-LDL(-) humana desenvolvidos no laboratório da Profa
Dra Dulcineia SP Abdalla. Para o mapeamento dos epítopos utilizou-se bibliotecas
de peptídeos apresentadas por fagos construídas pelo Prof. Dr. Ricardo José
Giordano do Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da USP. Os
peptídeos selecionados possuem a sequência CX8C, ou seja, são oito
aminoácidos com cisteínas nas extremidades. Depositou-se o pedido de patente
desses peptídeos sob o número de registro BR 1020131063, em 30 de abril de
2013 com o título “Peptídeos Sintéticos Miméticos a LDL, seu Processo de
Produção e seus Usos”, depositado no Instituto Nacional da Propriedade Industrial
(INPI).
Peptídeos mimotopos possuem muitas aplicações. Na área da pesquisa
esses peptídeos são úteis para identificação dos domínios de uma proteína
importantes para o reconhecimento pelo anticorpo, o que proporciona informações
adicionais sobre a estrutura e atividade do antígeno. Peptídeos mimotopos
também tem aplicações diagnósticas, substituindo o antígeno natural em ensaios
clínicos (Deroo e Muller, 2001). Isso é particularmente útil para montagem de
curvas de calibração e controles positivos em kits diagnósticos para detecção de
LDL(-) em doenças como a aterosclerose, em que o antígeno necessita ser
purificado do sangue humano. Outra importante aplicação dos peptídeos
14
mimotopos é como antígeno em vacinas. Por substituírem uma proteína complexa
por um pequeno peptídeo que mantêm uma atividade biológica, mimotopos têm o
potencial de substituir a proteína original na formulação de vacinas, mas para isso
sua imunogenicidade precisa ser confirmada (Deroo e Muller, 2001). Peptídeos
miméticos da ApoB 100 já estão sendo estudados como vacinas, e têm se
mostrado efetivos em reduzir a aterosclerose em camundongos, reduzindo a placa
aterosclerótica, gerando resposta imune Th2 e aumentando a população de
linfócitos Treg (Pierides et al., 2013; Kimura et al., 2015).
2. OBJETIVO(S)
O objetivo geral deste trabalho foi investigar as ações de peptídeos miméticos da
LDL eletronegativa sobre macrófagos e linfócitos. Para tanto foram analisados os
efeitos dos peptídeos P1 e P2 miméticos da LDL eletronegativa sobre:
• Expressão de Cd40, Ccl2, Cox2, Il1a, Il1b, Il6, Il10 e Tnfa em macrófagos
murinos derivados da medula óssea, por meio de qRT-PCR
• Proliferação de linfócitos murinos obtidos do baço, por citometria de fluxo
utilizando CSFE.
• Expressão das citocinas IL-6, CCL2 e IL-10 em macrófagos humanos
derivados de monócitos do sangue periférico de voluntários, por meio de qRT-
PCR.
• Proliferação de linfócitos humanos obtidos de sangue periférico, por
citometria de fluxo utilizando CSFE.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1-Obtenção e Diferenciação de Macrófagos Medulares Murinos
Protocolo baseado em ‘’Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and
Applications’’. (Weischenfeldt e Porse, 2008). Utilizaram-se camundongos machos
C57BL/6, saudáveis, com idade aproximada de 60 dias e peso aproximado de 20
g. Para eutanásia foram anestesiados com uma dose de 50 µL de cloridrato de
15
xilazina (2,0 g/100 mL na dose de 5 mg/Kg) mais 50 µL de cloridrato de cetamina
(1,0 g/10 mL na dose de 10 mg/Kg). Após a perda da consciência, os animais
foram eutanasiados por deslocamento cervical. Este protocolo foi aprovado pela
Comissão de Ética no Uso Animais da Faculdade de Ciências Farmacêuticas,
Protocolo CEUA/FCF/438.
Após a eutanásia, o fêmur e a tíbia foram higienicamente removidos,
lavados com álcool 70ºGL, e transportados para um fluxo laminar. O fêmur e a
tíbia tiveram suas epífises clivadas para exposição da medula óssea. Uma seringa
de 5mL com agulha de seringa de 1mL (com calibre de 13 mm x 0,38 mm) cheia
de meio de cultura RMPI 10% FBS foi utilizada para extração da medula,
utilizando 2,5mL de meio por osso. O material celular obtido foi colocado em tubos
cônicos de 50mL e homogeneizado com pipeta Pasteur. Após isso, as amostras
foram transferidas para tubos cônicos de 15mL e centrifugadas a 1200 rpm por 8
minutos a 4ºC. Então, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi
ressuspendido em 1mL de tampão de lise de eritrócitos (155 mM NH4Cl; 10 mM
KHCO3; 0,1 mM Na2EDTA; pH 7,4). Após a ressuspenção, 4 mL de solução de
lise foram acrescidos e as células foram centrifugadas novamente por 8 minutos a
1200 rpm. O sobrenadante foi mais uma vez desprezado e 10mL de meio de
cultura RPMI foram adicionados ao precipitado que foi ressupendido.
Realizou-se a contagem celular em câmara de Neubauer utilizando 10 µL
da amostra diluídos em 90µL de 0,1% de azul de Tripan. Feita a contagem, as
células foram novamente centrifugadas por 8 minutos a 1200 rpm, ressuspendidas
em meio RPMI e plaqueadas em placas de seis poços, colocando 8x105 células
por poço, além de pequenas alíquotas da suspensão celular com
aproximadamente 2x105 células, terem sido colocadas em uma placa de cultura
pequena para posteriormente servir para confirmação por citometria.
Essas placas foram incubadas em estufa a 37ºC e 5% de CO2 por 7 dias. O
meio foi trocado a cada 2-3 dias. Houve dois meios de diferenciação distintos: o
meio condicionado de fibroblastos L929 (WEISCHENFELDT et al, 2008), e RPMI
com 10% de soro fetal bovino contendo rM-CSF murino (Preprotech Catalog
16
Number: 300-25) na concentração de 20ng/mL. Em cada poço foram colocados
2mL de um desses meios. As placas foram cuidadosamente separadas e
identificadas. A mudança de fenótipo foi acompanhada através de microscopia e
as células foram utilizadas a partir do sétimo dia, após confirmação de sua
diferenciação por citometria de fluxo utilizando o anticorpo F4/80-PE-Cy5
(Ebioscience, #15-4801-82) titulado a 1:1000.
3.2-Tratamento com Peptídeos Miméticos P1 e P2
Depois de confirmada a diferenciação, os macrófagos que estavam nas
placas de 6 poços passaram por sincronização do ciclo celular através do
carenciamento com RPMI com 1% FBS durante 24 horas.
Após o carenciamento iniciou-se o tratamento com 500 μL de RPMI com
10% FBS com peptídeos P1 ou P2, ou LDL(-) nas concentrações de 100, 50, 25
ou 12,5 µg/mL, ou LPS na concentração de 10μg/mL ou PBS.
Estes tratamentos foram utilizados tanto para as células diferenciadas com
meio condicionado de L929 quanto para as células diferenciadas com o rM-CSF.
Após as 3 horas de tratamento, procedeu-se a extração de RNA.
3.3-Extração de RNA
RNA total foi extraído utilizando o reagente TRIzol (Life Technologies) segundo
especificações do fabricante. A quantificação do RNA extraído foi em
espectrofotômetro BioTeck e considerados de boa qualidade os RNAs que
apresentaram uma razão da absorbância em 260/280nm com valores próximos de
2
3.4-Construção dos cDNAs
Para a síntese de cDNA seguiu-se o protocolo do produto SuperScript®
VILO Master Mix. Foram utilizados 2 μg de RNA total de cada amostra. Os tubos
foram incubados por 5 min a 65°C, 120 min a 50º C e 5 min a 95ºC em um
17
termociclador. Após a reação, os tubos foram colocados imediatamente em gelo e
armazenados a -20ºC.
3.5-Reação de PCR Real Time
Para as reações de real time PCR (qRT-PCR) foram utilizados 1,0 μL de
cDNA, 0,4 μL da mistura de um dos pares de primers forward e reverse de cada
gene da tabela abaixo, 3,6 μL de água miliQ estéril e 5,0 μL de SYBR Green
Master Mix (Applied Biosystems®), por poço.
O ensaio qRT-PCR foi realizado no aparelho 7500 FAST (Applied
Biosystems®) nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95°C por 15 min,
seguido de 40 ciclos de desnaturação a 95°C por 15 segundos, anelamento dos
primers e extensão a 60°C por 60 segundos. Cada amostra foi feita em duplicata.
A análise dos dados resultantes das reações de real-time PCR foi feita pelo
método Delta-Delta Ct (ΔΔCt) (Livak e Schmittgen, 2001) .
Genes Primer Forward Primer Reverse
Cd40 CTGGACAAGCTGTGAGGATAAG TAGAGAAACACCCCGAAAATG
Ccl2 TGAGTAGGCTGGAGAGCTACAA ATGTCTGGACCCATTCCTTC
Cox2 TGGTGCCTGGTCTGATGATG GTGGTAACCGCTCAGGTGTTG
Il1a CTGCAGTCCATAACCCATGAT TGACAAACTTCTGCCTGACG
Il1b TTCCCATTAGACAACTGCACTAC GTCGTTGCTTGGTTCTCCTT
Il6 TGTGCAATGGCAATTCTGAT ACCAGAGGAAATTTTCAATAGGC
Il10 GTACAGCCGGGAAGACAATAA GCATTAAGGAGTCGGTTAGCA
Tnfa GGTGCCTATGTCTCAGCCTC CACTTGGTGGTTTGCTACGA
Gapdh TCCACTCACGGCAAATTCAACG TAGACTCCACGACATACTCAGC
Tabela 1. Genes murinos avaliados por PCR-Real Time e as sequências de nucleotídeos dos primers utilizados para
detecção da expressão gênica.
18
3.6-Obtenção de Linfócitos Murinos
Os camundongos machos C57BL/6, saudáveis, com idade aproximada de
60 dias e peso aproximado de 20 g foram anestesiados com uma dose de 50 µL
de cloridrato de xilasina (2,0 g/100 mL na dose de 5 mg/Kg) mais 50 µL de
cloridrato de cetamina (1,0 g/10 mL na dose de 10 mg/Kg). Após a perda da
consciência, os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical. O baço foi
removido em condições higiênicas e transportado para um fluxo laminar. O baço
foi macerado, e seus pedaços foram tamisados contra um cell strain, um filtro de
nylon de 70 μm. Foram adicionados 10 mL de RPMI livre de soro e as células
foram centrifugadas a 300g durante 7 minutos a 4ºC, o sobrenadante foi
descartado e as células ressuspendidas em 5 mL de tampão de lise de eritrócitos
(155 mM NH4Cl; 10 mM KHCO3; 0,1 mM Na2EDTA; pH 7,4).
Após 5 minutos de incubação, foram adicionados 25 mL de RPMI e as
células foram centrifugadas a 300g durante 7 minutos a 4ºC. O sedimento foi
ressuspendido em 5 mL de RPMI e as células foram contadas em câmara de
Neubauer.
3.7- Ensaio de Proliferação de Linfócitos Totais
Ao volume de células ressuspendido em RPMI com 10% FBS aquecido a
37°C, foi adicionado volume suficiente do mesmo meio para deixar 2x105 células a
cada 100μL. Após isso foi adicionado CFSE suficiente para a concentração final
de 2,5μM. As células foram homogeneizadas vigorosamente e incubadas à
temperatura ambiente por 10 minutos, protegidas da luz, com homogeneizações
subsequentes a cada 2 minutos. As células foram centrifugadas e lavadas com
RPMI. A eficiência da marcação foi confirmada no dia por citometria de fluxo em
um citômetro BD FACS Canto (Lyons et al., 2001; Quah e Parish, 2010)
Foram incubadas 100 μL (2 x 105 células marcadas com CFSE) por poço
em placas de 96 poços. A essas adicionou-se 100 μL de soluções RPMI com 10%
FBS com diferentes estímulos: Concanavalina A (controle positivo de proliferação
de linfócito T) nas concentrações de 2,5; 5,0 e 10 μg/mL, LPS (controle positivo
19
para proliferação de linfócito B) nas concentrações de 1,0; 10 e 100 μg/mL, LDL
eletronegativa, peptídeo 1 e 2 nas concentrações de 10,0; 20,0 e 60,0 μg/mL
As placas foram incubadas por 5 dias em estufa à 37ºC com 5% CO2. Após
isso as células foram centrifugadas 300g durante 7 minutos a 4ºC e
ressuspendidas em 100 μL de PBS para análise por citometria de fluxo.
3.8 – Análise da Proliferação Celular Utilizando Software FlowJo
Para a análise da proliferação dos linfócitos utilizou-se o software de
citometria FlowJo para tratamentos dos dados adquiridos pelo equipamento de
citometria BD FACS Canto. Em cada amostra utilizou-se inicialmente os canais
FSC-H e FSC-A. Esses dois parâmetros tem uma relação diretamente
proporcional e unitária para as células que passam sozinhas pelo detector. Então
criou-se um gate para selecionar as células cuja relação FSC-H/FSC-A fosse
aproximadamente unitária, e estas foram consideradas como singlets.
Após isso, utilizando o gate dos singlets, mudaram-se os canais para SSC-
A relacionado à granulosidade das células, e FSC-A se relaciona ao tamanho.
Como os linfócitos são agranulares e tem um tamanho relativamente grande entre
as células não aderentes, eles formam uma banda que se destaca da população
total. Então foi criado um gate para selecionar apenas as células consideradas
linfócitos.
Por fim a população de linfócitos tem a sua proliferação calculada através
do decaimento da mediana da fluorescência, baseada na fluorescência das
células marcadas com CSFE sem estímulo. As células que não se proliferam têm
a mesma intensidade de fluorescência que o controle marcado, e são a geração
zero. As outras gerações são formadas em razão de meio da mediana da
fluorescência inicial, e a porcentagem de linfócitos em cada geração é calculada
pelo programa (Roederer, 2011).
20
3.9– Obtenção de Sangue Periférico Humano.
Indivíduos voluntários adultos recrutados na Universidade de São Paulo foram
convidados para participar do estudo através da coleta de sangue. Foram
considerados saudáveis após a análise da sua resposta a um questionário escrito
sobre seu estado geral de saúde. Por meio da coleta de sangue a vácuo,
utilizando escalpes para coleta múltipla, coletou-se até 50 mL de sangue, através
de uma veia cubital, seguindo as recomendações da Sociedade Brasileira de
Patologia Clínica /Medicina Laboratorial para coleta de sangue venoso (2010).
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas, Número CAAE 23181114.3.0000.0067.
3.10- Obtenção e Diferenciação de Monócitos a partir do Sangue Periférico
Humano
Em fluxo laminar adicionou-se 15 mL do meio Lymphocyte Separate
Medium a dois tubos Leucosep vazios por voluntário, os quais foram centrifugados
à 100 rpm por 20 segundos. O sangue foi dispensado igualmente entre os dois
tubos Leucosep e o volume foi completado para 50 mL com PBS- EDTA 0,5M. O
material foi centrifugado a 800g, por 15 minutos, à temperatura ambiente e em
desaceleração lenta. Após isso o plasma foi descartado e retirou-se a camada de
leucócitos, ao qual foi adicionada a um tubo cônico de 50 mL. O volume foi
preenchido para 50 mL com PBS-EDTA 0,5M e o tubo foi centrífugado a 500g por
5min a temperatura ambiente. O sobrenadante foi aspirado cuidadosamente e o
precipitado foi ressuspendido em PBS-EDTA 0,5M. Foi realizado por mais duas
vezes a etapa de lavagem com PBS- EDTA e a centrifugação.
Após essa etapa, o precipitado foi ressuspendido em 2 mL de PBS e
adicionou-se 25μL de CD14 Dynabeads®, previamente lavadas em PBS conforme
o manual. Foram adicionados 8 mL de PBS ao tubo e centrifugou-se a 300g, 8
minutos, 4°C. O sobrenadante foi descartado para retirar as beads que não se
Iigaram. O precipitado foi ressuspendido novamente em 8mL e repetiu-se a
centrifugação. O pellet foi ressuspendido em 2ml de PBS e a partir desse ponto
21
seguiu-se integralmente o protocolo das Dynabeads® CD14 (Life Technologies
Catalog number: 11149D) para seleção positiva das células CD14+ (monócitos).
Após a obtenção das células CD14+, 10 µL da amostra foram diluídos em
90µL em azul de Tripan a 0,1% para prosseguir a contagem de células em câmara
de Neubauer. Feita a contagem, foram ressuspendidas em meio Macrophage-
SFM (Life Technologies Catalog number: 12065-074) contendo 50ng/mL de M-
CSF humano recombinante (Preprotech Catalog Number: 300-25) em analogia ao
tratamento dos macrófagos murinos e foram plaqueadas diretamente em placas
de seis poços, colocando 8x105 células por poço. Estas placas foram incubadas
em estufa a 37ºC e 5% de CO2 por 4 dias. Após o 4º dia as células diferenciaram-
se em macrófagos maduros, o que foi confirmado pela mudança morfológica. As
células foram posteriormente cultivadas em meio RPMI com 10% FBS até o
momento do seu tratamento.
3.11- Tratamentos com Peptídeos Miméticos e Análise da Expressão Gênica.
O meio foi trocado após o 4º dia, e as células foram então cultivadas em RPMI
com 10% FBS. Após isso seguiu-se o passo 3.2, mudando apenas os estímulos,
que agora são peptídeos P1 ou P2, nas concentrações de 100 e 50µg/mL, LDL(-)
na concentração de 50µg/mL para controle positivo, e PBS. Posteriormente, as
etapas 3.3, 3.4 e 3.5 foram seguidas integralmente.
3.12- Obtenção de Linfócitos a partir do Sangue Periférico Humano
Após a obtenção do sangue periférico humano, como descrito em 3.10,
seguiu-se o protocolo da solução Histopaque®-1077 (Sigma Aldrich) que é uma
solução com densidade ajustada para 1.077 g/mL, que facilita a separação das
células mononucleadas do sangue total.
22
Genes Primer Forward Primer Reverse
CICLOFILINA ATGGTCAACCCCACCGTGT TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC
CCL2 CCCCAGTCACCTGCTGTTAT CCCCAGTCACCTGCTGTTAT
GAPDH GAGTCAACGGATTTGGTCGT GAGTCAACGGATTTGGTCGT
IL10 TGCCTTCAGCAGAGTGAAGA TGCCTTCAGCAGAGTGAAGA
IL6 TGTTGCCTGCTGCCTTCCCT TGTTGCCTGCTGCCTTCCCT
IL8 TGTGTGAAGGTGCAGTTTTG ATTTCTGTGTTGGCGCAGT
S18 GTAACCCGTTGAACCCCATT CCATCCAATCGGTAGTAGCG
Tabela 2. Genes humanos avaliados por PCR-Real Time e as sequências de nucleotídeos dos primers utilizados para
detecção da expressão gênica.
3.13- Ensaio de Proliferação de Linfócitos
Após a obtenção das células mononucleadas do sangue periférico, estas
seguiram as etapas descritas em 3.8. A única alteração foi que no lugar da
concanavalina A para controle positivo de proliferação de linfócito T utilizou-se o
anticorpo anti CD3 humano nas concentrações de 5,0; 7,5 e 10 μg/mL. Por fim, a
proliferação foi analisada como descrito em 3.8.
3.14- Análise Estatística
Os dados foram analisados utilizando-se GraphPad InStat software. Foi
utilizado o teste estatístico One-way Anova para observar a variação entre grupos
de tratamento, seguido do pós-teste de Tukey, um teste multivariado que mostra
se há ou não diferença entre as médias dos grupos de tratamento, dentro de um
intervalo de confiança, utilizando um nível de significância de 0.05.
23
4. RESULTADOS
4.1 – Efeito dos peptídeos miméticos da apo B100 da LDL(-) sobre a
expressão gênica de marcadores inflamatórios em macrófagos murinos
Primeiramente foi feita a comparação da expressão dos genes avaliados
nos macrófagos murinos diferenciados com o meio condicionado de células L929
e com o meio contendo o M-CSF recombinante após 3h de tratamento. A
utilização de M-CSF recombinante mostrou um padrão de expressão gênica mais
responsivo e dose resposta-dependente, conforme pode ser visto nos resultados a
seguir.
A)
Cd40 (L929)
LPS 10
LDL(-) 1
2,5
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12,5
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12,5
P2 25
P2 50
P2 100
0
2
4
6
8
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
B)
Cd40 (rM-CSF)
LPS 10
LDL(-) 1
2
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
10
20
3050
100
150
200
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 1: Expressão gênica relativa do Cd40 em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de L929, em
B o meio com M-CSF recombinante.
A)
Ccl2 (L929)
LPS 10
LDL(-) 1
2,5
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12,5
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12,5
P2 25
P2 50
P2 100
0
2
4
6
8
10
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
B)
Ccl2 (rM-CSF)
LPS 10
LDL(-) 1
2,5
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
10
20
30
100
200
300
400
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 2: Expressão gênica relativa do Ccl2 em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de células
L929, em B o meio com M-CSF recombinante.
24
A)
Cox2 (L929)
LPS 10
LDL(-) 1
2,5
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12,5
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12,5
P2 25
P2 50
P2 100
0
50
100
150
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
B)
Cox2 (rM-CSF)
LPS 10
LDL(-) 1
2,5
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
1
2
3
4
20
40
60
80
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 3: Expressão gênica relativa do Cox2 em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de células
L929, em B o meio com M-CSF recombinante.
A)
Il1b (L929)
LPS 10
LDL(-) 1
2,5
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12,5
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12,5
P2 25
P2 50
P2 100
0
10
20
30
40
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
B)
Il1b (rM-CSF)
LPS 10
LDL(-) 1
2,5
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
20
40
60
100
200
300
400
500
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 4: Expressão gênica relativa do Il1b em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de células
L929, em B o meio com M-CSF recombinante. Em A não houve replicata do experimento, por isso as barras não
apresentam o desvio padrão.
A)
Il6 (L929)
LPS 10
LDL(-) 1
2,5
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12,5
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12,5
P2 25
P2 50
P2 100
0
100
200
300
400
500
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
B)
Il6 (rMCSF)
LPS 10
LDL 12
LDL 25
LDL 50
LDL 100
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
2
4
6
8
10
500
1000
1500
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 5: Expressão gênica relativa do Il6 em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de células
L929, em B o meio com M-CSF recombinante.
25
A)
Il10 (L929)
LPS 10
LDL(-) 1
2,5
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12,5
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12,5
P2 25
P2 50
P2 100
0
1
2
3
4
5
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
B)
Il10 (rM-CSF)
LPS 10
LDL(-) 1
2,5
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
5
10
15
20
25
50
100
150
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 6: Expressão gênica relativa de Il10 em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de células
L929, em B o meio com M-CSF recombinante.
A)
Tnfa (L929)
LPS 10
LDL(-) 12,5
LDL(-) 25
LDL(-) 50
LDL(-) 100
P1 12,5P1 25
P1 50
P1 100
P2 12,5P2 25
P2 50
P2 1000
2
4
6
8
Tratamento ug/mL
Expr
essã
o G
ênic
a R
elat
iva
B)
Tnfa (rMCSF)
LPS 10
LDL(-) 1
2,5
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
2
4
6
8
10
50
100
150
Tratamento ug/mL
Expr
essã
o G
ênic
a R
elat
iva
Figura 7: Expressão gênica relativa de Tnfa em macrófagos murinos. Em A foi utilizado o meio condicionado de células
L929, em B o meio com M-CSF recombinante.
Com os dados obtidos percebe-se claramente que o meio contendo M-CSF
recombinante é mais adequando ao estudo da expressão gênica, pois como dito
anteriormente, apresenta uma resposta linear às diferentes concentrações
testadas, além de o controle positivo LPS ter a maior resposta, como esperado. O
meio com M-CSF também mostrou uma diferença da transcrição gênica relativa
entre os estímulos no curto período de tratamento. Os resultados obtidos em 3 e
14 hs estão exibidos a seguir, em gráficos com mesma escala para facilitar a
comparação.
26
A)
Cd40 (rM-CSF) 3h
LPS
LDL(-)12
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
5
10
15
20
25
100
200
300
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
B)
Cd40 (rM-CSF) 14h
LPS
LDL(-)12
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
10
20
3050
100
150
200
250
300
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 8: Expressão gênica relativa de Cd40 em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h
(A) ou 14 h(B).
A)
Ccl2 (rM-CSF) 3h
LPS
LDL(-)12
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
10
20
30
100
200
300
400
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
B)
Ccl2 (rM-CSF) 14h
LPS 10
LDL 12
LDL 25
LDL 50
LDL 100
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
10
20
30
100
200
300
400
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 9: Expressão gênica relativa de Ccl2 em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h
(A) ou 14 h (B).
A)
Cox2 (r-MCSF) 3h
LPS 10
LDL 12,5
LDL 25
LDL 50
LDL 100
P1 12,5
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12,5
P2 25
P2 50
P2 100
0
2
4
6
8
10
50
100
150
200
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
B)
Cox2 (r-MCSF) 14h
LPS
LDL(-)12
LDL(-) 25
LDL(-) 50
LDL(-) 100
P1 12P1 25
P1 50
P1 100P2 12
P2 25P2 50
P2 1000
5
10
15
50
100
150
200
Tratamento ug/mL
Expr
essã
o R
elat
iva
Figura 10: Expressão gênica relativa de Cox2 em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h
(A) ou 14 h (B).
27
A)
Il1a (r-MCSF) 3h
LPS
LDL(-)12
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
10
20
30
40
50
200
400
600
800
1000
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
B)
Il1a (r-MCSF) 14h
LPS
LDL(-)12
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
20
40
60
200
400
600
800
1000
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 11: Expressão gênica relativa de Il1a em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h
(A) ou 14 h (B).
A)
Il1b (r-MCSF) 3h
LPS 10
LDL 12,5
LDL 25
LDL 50
LDL 100
P1 12,5
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12,5
P2 25
P2 50
P2 100
0
50
100
150
200200
400
600
800
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
B)
Il1b (r-MCSF) 14h
LPS
LDL(-)12
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
50
100
150
200
400
600
800
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 12: Expressão gênica relativa de Il1b em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h
(A) ou 14 h (B).
A)
Il6 (r-MCSF) 3h
LPS
LDL(-)
12
LDL(-)
25
LDL(-)
50
LDL(-)
100
P1 12
P1 25
P1 50
P1 10
0
P2 12
P2 25
P2 50
P2 10
0
0
100
200
300
400
2000
4000
6000
Tratamento ug/mL
Exp
ressão
Gên
ica R
ela
tiva
B)
Il6 (r-MCSF) 14h
LPS
LDL(-)12
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
100
200
300
400
2000
4000
6000
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 13: Expressão gênica relativa de Il6 em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h
(A) ou 14 h (B).
28
A)
Il10 (rM-CSF) 3h
LPS 10
LDL(-) 1
2,5
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
5
10
15
20
25
50
100
150
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
B)
Il10 (rM-CSF) 14h
LPS
LDL(-)12
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
10
20
30
40
50
100
150
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 14: Expressão gênica relativa de Il10 em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h
(A) ou 14 h (B).
A)
Tnfa (rMCSF) 3h
LPS
LDL(-)12
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
2
4
6
8
10
50
100
150
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
B)
Tnfa (rMCSF) 14h
LPS
LDL(-)12
LDL(-) 2
5
LDL(-) 5
0
LDL(-) 1
00
P1 12
P1 25
P1 50
P1 100
P2 12
P2 25
P2 50
P2 100
0
2
4
6
8
10
50
100
150
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 15: Expressão gênica relativa de Tnfa em macrófagos murinos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h
(A) ou 14 h(B).
Observa-se que a expressão gênica relativa decai com o tempo para a
maioria dos estímulos, especialmente para a LDL eletronegativa. Baseado nestes
dados se escolheu o tempo de 3h para o tratamento dos macrófagos humanos.
Os dados obtidos também mostram que os peptídeos tem um efeito pouco
pronunciado sobre a expressão gênica quando comparados com a LDL(-). Os
peptídeos induziram aumento da expressão em no máximo 10x o basal para a
grande maioria dos genes, enquanto a LDL(-) chega a patamares muito maiores.
Isto demonstra que apesar dos peptídeos, em especial o P2, mimetizarem a ação
29
pró-inflamatória da LDL (-), outros componentes da partícula dessa lipoproteína
atuam sinergicamente para ampliar o efeito.
Infelizmente não foi realizada uma amostragem suficiente para permitir a
análise através do teste estatístico ANOVA, então os dados mostram a tendência,
mas não conseguem demonstrar a diferença estatística.
4.2 – Efeito dos peptídeos mimotopos sobre a proliferação de linfócitos
murinos.
A avaliação da proliferação foi feita conforme descrita anteriormente
(Roederer, 2011). Dentre os vários índices para calcular a proliferação descritos,
escolheu-se o ‘’fraction diluted’’, que se relaciona com a fração de células que se
dividem na cultura pelo menos uma vez sobre as células totais, e fornece uma
ideia geral sobre a proliferação da população celular.
Proliferação de Linfócitos
Basal
ConA 2,5 ug
ConA 5 ug
ConA 10 ugLPS 1
LPS 10
LPS 100
LDL(-) 10
LDL(-) 20
LDL(-) 60P1 10
P1 20P1 60
P2 10P2 20
P2 600
20
40
60
80
100
*** ***
***
***
Tratamento ug/mL
% d
e cé
lula
s qu
e pr
olife
rara
m
Figura 16: Ensaio de proliferação de linfócitos murinos totais: porcentagem de células que proliferaram com os diferentes
tratamentos. *** p <0,0001 comparado ao basal. Teste ANOVA, pós teste Tuckey.
Os dados mostram que tanto os peptídeos miméticos como a LDL(-) não
induzem a proliferação de linfócitos murinos. Nem mesmo LPS em concentrações
mais baixas funciona como um controle positivo adequado nesse ensaio.
30
4.3 – Efeito dos peptídeos miméticos da LDL(-) sobre a expressão gênica de
citocinas em macrófagos humanos
Avaliou-se o efeito dos peptídeos P1 e P2 e da LDL(-) sobre os macrófagos
obtidos a partir das células mononucleares isoladas do sangue periférico de
doadores saudáveis.
Considerando-se os resultados obtidos com os macrófagos murinos,
escolheu-se o tempo de 3h para o tratamento dos macrófagos humanos porque foi
o que apresentou maior variação da transcrição gênica induzida pelos peptídeos
em relação à LDL(-). Devido à menor quantidade de células obtidas dessa matriz
foram avaliadas apenas as concentrações de peptídeos mais relevantes e a
concentração de 50 μg/mL de LDL(-), substituindo o controle positivo de LPS.
Ccl2 (rM-CSF) 3h
LDL(-) 5
0
P1 100
P1 50
P2 100
P2 50
0
1
2
3
4
Tratamento ug/mL
Exp
ressão
Gên
ica R
ela
tiva
Il8 (rM-CSF) 3h
LDL(-) 5
0
P1 100
P1 50
P2 100
P2 50
0
1
2
3
4
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Il6 (rM-CSF) 3h
LDL(-) 5
0
P1 100
P1 50
P2 100
P2 50
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Il10 (rM-CSF) 3h
LDL(-) 5
0
P1 100
P1 50
P2 100
P2 50
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Tratamento ug/mL
Exp
ress
ão G
ênic
a R
elat
iva
Figura 17: Expressão gênica relativa de CCL2 em macrófagos humanos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h. Sem diferença estatística entre os grupos.
Figura 20: Expressão gênica relativa de IL10 em macrófagos humanos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h. Sem diferença estatística entre os grupos.
Figura 19: Expressão gênica relativa de IL6 em macrófagos humanos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h. Sem diferença estatística entre os grupos.
Figura 18: Expressão gênica relativa de IL8 em macrófagos humanos. As células foram incubadas com os estímulos por 3h. Sem diferença estatística entre os grupos.
31
Os resultados mostraram que não houve diferença significativa entre os
grupos para nenhum dos genes avaliados, indicando um fraco efeito pró-
inflamatório nos macrófagos humanos, tanto da lipoproteína como dos peptídeos.
4.4 – Efeito dos peptídeos mimotopos sobre a proliferação de linfócitos
humanos.
O ensaio de proliferação de linfócitos humanos mostrou-se bastante
parecido com o ensaio de proliferação murino, exceto que novamente o LPS não
se mostrou um bom controle positivo, mesmo em uma concentração mais alta.
Assim como ocorreu nos linfócitos murinos, não se observou efeito dos
peptídeos ou da LDL(-) sobre a proliferação de linfócitos humanos nas
concentrações utilizadas.
Proliferação de Linfócitos
Basal
AntiCD3 5ug
AntiCD3 7,5ug
AntiCD3 10ug
LPS 1
LPS 10
LPS 100
LDL(-) 10
LDL(-) 20
LDL(-) 60P1 10
P1 20P1 60
P2 10P2 20
P2 600.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 *** ***
***
***
Tratamento ug/mL
% d
e cé
lulas
que
pro
lifera
ram
Figura 21: Ensaio de proliferação de linfócitos humanos totais: porcentagem de células que proliferaram com os diferentes
tratamentos. *** p <0,0001. Teste ANOVA, pós teste Tuckey.
5. DISCUSSÃO
Os peptídeos miméticosotopos da LDL(-) são uma promissora ferramenta
pois são epítopos peptídicos que representam uma região antigênica da apo B100
da LDL(-) . Os microdominíos que os peptídeos mimetizam pode ser formados
pelas modificações sofridas por esta partícula, tais como, glicosilação, proteólise,
oxidação, dentre outras, ou seja, sítios já existentes na apo B100 que assumam
uma conformação diferente após a partícula de LDL sofrer estas modificações,
não sendo expostos na LDL nativa. Esses microdomínios (determinantes
32
antigênicos) podem permitir a orientação precisa da resposta imune, o que
poderia ter aplicações terapêutica ou preventiva na aterosclerose.
Os dados da literatura são claros quanto ao poder inflamatório da LDL(-),
mas o foco deste trabalho foi descobrir o potencial dos peptídeos mimotopos
como miméticos da ação da LDL(-) em macrófagos e em linfócitos. Conforme foi
observado nos ensaios de expressâo gênica em macrófagos murinos, o melhor
meio de diferenciação foi o meio contendo apenas o fator estimulador de colônias
de macrófagos recombinante no lugar do meio condicionado das células L929. Os
fibroblastos da linhagem L929 além do M-CSF também secretam outros fatores,
como o GM-CSF (Englen et al., 1995). As linhagens de macrófagos obtidas com
GM-CSF e o M-CSF diferem no seu perfil de produção de citocinas e atividades de
fatores de transcrição (Fleetwood et al., 2007; Lacey et al., 2012; Jaguin et al.,
2013), polarizando os macrófagos preferencialmente para M1 e M2,
respecitvamente. Com isso percebe-se que o meio condicionado de células L929
gera uma população heterogênea, cuja resposta a estímulos é difícil de se
interpretar. Além disso, o meio condicionado de células L929, por ser obtido do
sobrenadante de uma cultura celular apresenta maior variabilidade quanto à
concentração destes fatores de crescimento, além de outras possíveis moléculas
que possam interferir na diferenciação. Devido a isso escolheu-se o M-CSFr como
fator de diferenciação, além do fato do M-CSF polarizar os macrófagos
principalmente para M0 e M2a (Gleissner, 2012). A população M0 é menos
especializada, o que é muito interessante para mostrar o efeito dos peptídeos
sobre macrófagos que já não estão predispostos a um padrão de resposta.
Os resultados obtidos com os macrófagos murinos indicam que os
peptídeos são muito menos pró-inflamatórios que a LDL(-), baseado nos genes
escolhidos Cd40, Ccl2, Cox2, Il1a, Il1b, Il6, Il10 e Tnfa. O gene Cd40 codifica uma
molécula co-estimulatória importante para a imunidade inata e adaptativa (Tedgui
e Mallat, 2006; Andersson et al., 2010). A baixa expressão desse gene mostra que
o P1 não estimularia os macrófagos para a apresentação de antígenos aos
linfócitos T, mas que o P2 em concentrações mais elevadas (100 ug/mL) tem este
33
potencial embora seja sendo menos imunogênico que a partícula de LDL(-) A
mesma tendência se observa para o gene Ccl2, que é de uma proteína
quimiotática para monócitos, mostrando-se que o P1 não tem efeito indutor mas
que o P2 tem menor potencial de recrutamento de células imunes comparado à
partícula de LDL(-). Os genes Il1a, Il1b, Il6 e Tnfa codificam potentes citocinas
promotoras da inflamação (Tedgui e Mallat, 2006; Andersson et al., 2010). Embora
haja uma discrepância entre a intensidade de indução da expressão destes genes
pela LDL(-) e os peptídeos, o P2 em concentração mais elevada mostra potencial
indutor para IL1a e Il1b. Por fim, nem os peptídeos nem a LDL(-) mostraram
grande potencial na expressão da citocina anti-inflamatória IL-10.
Posteriormente para o grupo será importante analisar também a expressão
gênica de citocinas Th2, como IL-4, IL-5 e IL-13 e analisar a expressão proteica
induzida pelos peptídeos. A expressão proteica tem maior relevância biológica,
pois diversos mecanismos podem atenuar a quantidade de RNA mensageiros
produzidos durante a expressão gênica.
Os dados relativos à expressão gênica em macrófagos humanos mostram
claramente que o tempo de tratamento foi muito curto para se observar o efeito
dos peptídeos, uma vez que nem o controle positivo de LDL(-) mostrou
significativa alteração em relação à condição basal. Para se investigar o efeito
desses peptídeos em células humanas deverá ser utilizado um tempo de
tratamento mais longo.
O ensaio de proliferação de linfócitos murinos mostrou que a LDL(-) não
induz proliferação nos linfócitos totais, não tendo havido diferença estatística em
relação ao controle. Apesar de ter domínios que poderiam atuar como padrões
moleculares associados ao perigo, a LDL(-) não induziu a proliferação de linfócitos
in vitro, o que não exclui outros efeitos imunogênicos in vivo. Os resultados da
expressão gênica mostraram que a LDL(-) induziu a expressão de CD40, embora
mas não tenha ocorrido proliferação no ensaio. A literatura confirma que peptídeos
da ApoB100 não induzem a proliferação in vivo de linfócitos esplênicos em
34
camundongos não imunizados, possivelmente devido ao baixo número de
linfócitos auto reativos (Hermansson et al., 2010).
Deverá ser melhor investigado se alguma subpopulação específica de
linfócitos seria responsiva aos peptídeos uma vez que não foi utilizado um
marcador específico para os diferentes tipos de linfócitos. Algumas das
populações específicas de linfócitos T CD4+ ou CD8+, assim como as de linfócitos
B (CD19+), podem ter tido uma proliferação que não foi percebida por estar
mascarada pela população total o que seria relevante considerando-se que cada
população tem um papel importante na aterosclerose. Portanto, será importante
para o grupo mapear posteriormente as subpopulações de linfócitos e ver como os
peptídeos interagem com essas subpopulações, e qual o perfil de resposta que os
peptídeos induzem para uma melhor compreensão da ação desses mimotopos.
Outros estudos já mostraram a importância do baço como órgão ateroprotetor. As
subpopulações de linfócitos B esplênicas contendo os receptores de células B
com região variável de cadeia pesada Vh5 e Vh7, reativos à fostatidilcolina,
proliferam quando estimulados com lipídeos oxidados, contidos em células
apoptóticas ou LDL oxidada. Estes lipídeos oxidados induzem a ativação do
inflamassoma NALP3, e ativação da caspase-1, e a produção de anticorpos
ateroprotetores.(Grasset et al., 2015)
Os resultados da proliferação de linfócitos humanos foram semelhantes ao
que ocorreu com os linfócitos murinos, não se observando efeitos da LDL(-) e dos
peptídeos miméticos. As mesmas considerações podem ser feitas sobre o que foi
comentado para os linfócitos murinos, mas se deve levar em conta as diferenças
da matriz, já que enquanto o baço contém uma grande quantidade de linfócitos B
maduros, chegando a 55% da população de células do baço murino, sem contar
as hemáceas (Pellegrini et al., 2007), enquanto a porcentagem de linfócitos B no
sangue periférico humano é baixa, sendo até 7% dos leucócitos, enquanto os
linfócitos T representam de 7% a 24% (StemCellTechnologie, 2014). Isso explica
porque o LPS que era o controle positivo dos linfócitos B não se mostrou efetivo
em um ensaio que não diferencia os subtipos de linfócitos.
35
Referente ao possível uso dos peptídeos como antígenos em vacinas para
aterosclerose muito ainda precisa ser estudado. Os peptídeos precisam
demonstrar capacidade de estimular mecanismos ateroprotetores como estimular
resposta imune Th2, linfócitos Treg, secreção de IgM e polarização para
macrófagos M2, além de diminuir a progressão da placa aterosclerótica em
modelos murinos e em outras espécies. Trabalhos recentes mostraram que
imunização com peptídeos da ApoB100 restritos ao complexo MHC II têm efeito
ateroprotetor pois aumenta o nível de mRNA codificante para IL-10 (Tse et al.,
2013), induz aumentos significantes de IL-10 nos leucócitos peritoneais, e
expande a população peritoneal de linfócitos regulatórios FoxP3+ e mais que
triplica os linfócitos regulatórios CCR5+FoxP3+ (Kimura et al., 2017), e aumenta
os níveis de IgG (Tse et al., 2013; Gisterå et al., 2017), além de diminuírem o
tamanho da lesão aterosclerótica.
Por fim, além de possíveis antígenos, os peptídeos miméticos continuam
ferramentas promissoras para o estudo da aterosclerose. Outros estudos do grupo
estão investigando o potencial desses peptídeos como radiofármacos para
diagnóstico por imagem, e como antígenos sintéticos nos imunoensaios para
detecção de LDL modificada, eliminando a necessidade do isolamento contínuo
dessa lipoproteína a partir da plasmo humano.
6. CONCLUSÃO
Conclui-se que os peptídeos apresentam diferentes perfis de indução de
citocinas pró-inflamatórias, sendo que o P2 tem maior potencial como um peptídeo
mimético da LDL(-) em macrófagos, enquanto o P1 não apresenta atividade pró-
inflamatória. Diversas aplicações podem ser propostas para esses peptídeos, mas
seus efeitos sobre as células do sistema imune precisam ser melhor elucidados.
Espera-se que no futuro eles possam ajudar a combater essa grande causa de
mortalidade e morbidade que é a aterosclerose, mas até lá há um longo caminho a
ser trilhado.
36
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Aluno: Felipe Wakasuqui 29/03/2017 Orientadora: Dulcinéia Saes Parra Abdalla 29/03/2017
8. ANEXOS
Aprovação da Comissão de Ética no uso de Animais, Protocolo CEUA/FCF/438,
página 44
Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, Número CAAE 23181114.3.0000.0067, página 45 a 47.
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