Dr. Juan María Torres Trillo Laboratorio de Biología Molecular y Celular de Priones. Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA).
Valdeolmos (Madrid)
Ratones transgénicos como modelo de estudio de los priones
Encefalopatías espongiformes
Enfermedades neurológicas con tiempos de incubación muy largos
Clínica
Alteraciones neurologicas
disfunción motora (ataxia)
demencia
Anatomía patológica
Etiología
Infecciosa
Genética
Esporádica
Enfermedades de los priones
Gliosis Vacuolization Tejido encefalico Depositos PrP
H & E GFAP PrPSc
Encefalopatías espongiformes de mamíferos
Enfermedad
Kuru
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD)
iatrogénica
esporádica
familiar
Enfermedad de Gertsmann.Sträussler-
Scheinker (GSS)
Insomnio familiar fatal (FFI)
Angiopatía amiloide cerebral (CAA)
Nueva variante de la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (vCJD)
Scrapie
Encefalopatía transmisible del visón(TME)
Encefalopatía espongiforme bovina (BSE)
Enfermedad de desgaste crónico (CWD)
Encefalopatia espongiforme felina(FSE)
Encefalopatía espongiforme
de ungulados exóticos (EUE)
Huésped natural
Hombre
Hombre
Hombre
Hombre
Hombre
Hombre
Oveja, Cabra
Visón
Vaca
Reno, Alce
Gato doméstico
Felinos superiores
Nyala, Kudu mayor
Etiología
Infección
Infección
Esporadica
Mutación en PrP
Mutación en PrP
Mutación en PrP
Mutación en PrP
Infección
Infección
Infección
Infección
Infección
Infección
Infección
Infección
Prnp: estructura génica
ORF
E1 E2 E3
762 nt
20 kb
2 kb
Sialoglicoproteína
254 aa
27,921 (Pm)
9,4 (pI)
(ratón)
hamster
hombre
ratón
•Alta identidad entre especies
•Expresión ubicua
209 aa 22 23
producto de traducción primario
octarepeticiones
péptido señal señal C-terminal
181 197 231
209 aa
CHO CHO
GPI
PrPC madura (33-35)
maduración
Biosíntesis de PrPC y PrPSc
Source: Weissman et al. Int J. Exp. Path (1996) 77, 283-293
PrPSc (33-35)
209 aa
CHO CHO
GPI
transformación
PrPSc
PrPC
21
30
PrPSc PrPC - + - + PK
transformación
proteasa
proteasa
PrPSc (33-35)
220 aa
Insoluble
150 aa
PrPSc (27-30)
PrPC (33-35)
220 aa
octarepeticiones
Soluble
CARACTERISTICAS BIOQUÍMICAS ISOFORMAS PrPC y PrPSc
•Partial PK resistance (PrPres/ PrP27-30) •Insoluble in non-ionic detergents •resistance to heat and chemicals •tendency to form aggregates •High environmental resistance
PrPC PrPSc
PrPC PrPSc
muy lento rápido rápido
Models for PrPC to PrPSc transformation
Fuente: Weissman et al. Int J. Exp. Path (1996) 77, 283-293
??
Denaturalizatión-renaturalización model
Modelo de polimerización nucleada
Prion transmission -Prion species barrier concept
Mouse prion Hamster prion
Disease/dead
140/150 days
(100%)
Disease/dead
370/400 days
(60%)
Disease/dead
140/150 days
(100%)
Disease/dead
140/150 days
(100%)
Bovine prion
No disease
>700 days
(0%)
Disease/dead
200/250 days
(100%)
Supposed Species
prion
No disease
>700 days
(0%)
No disease
>700 days
(0%)
Infección en un hospedador heterólogo
Inoculación
Acumulación y
muerte
La PrPSc resultante:
•es de la especie de animal receptor.
•mantiene algunas característica de
origen.
Tiempo de incubación largo
Mo-PrPC gen
Bo-PrPC gen
Bo-PrPC
Bo-PrPSc
Bo-PrPC
gen
Bo-PrPC Bo-PrPSc
Ratones transgénicos como modelo para el estudio de las EETs
E1 E2 E3
ORF
E2 E1
ORF
E3
Microinjection of one-cell embryos
from females PrP-/- null mice
Genration of transgenic mice expressing PrPC from other species
PrP allele Mouse line name Level expression
Bovine-wt BoPrP-Tg110 8 (+/+)
Bovine-5 OR 5OR-BoPrP-Tg008 1 (+/+)
Bovine-7 OR 7OR-BoPrP-Tg007 4 (+/+)
Bovine-10 OR 10OR-BoPrP-Tg012 0.5 (+/-)
Bovine-113L 113L-BoPrP-Tg037 1 (+/-)
Goat-wt wt-GoPrP-Tg501 2 (+/+)
wt-GoPrP-Tg500 1 (+/-)
Goat-222K 222K-GoPrP-Tg516 1.5 (+/-)
Goat-222K 222K-GoPrP-Tg515 2 (+/+)
Goat-142M 142M-GoPrP-Tg541 1 (+/-)
Goat-154H 154H-GoPrP-Tg563 0.25 (+/-)
Goat-211Q 211Q-GoPrP-Tg580 0.5 (+/-)
Porcine-wt PoPrP-Tg001 4 (+/+)
Vole-wt volePrP-Tg407 1 (+/+)
Human-M129 M129-HuPrP-Tg340 4 (+/+)
Human-V129 V129-HuPrP-Tg361 4 (+/+)
Human-V129 V129-HuPrP-Tg362 8 (+/+)
Human-117V 117V-HuPrP-Tg301 2 (+/-)
Human-178N 178N-HuPrP-Tg333 2 (+/-)
Human-200K 200K-HuPrP-Tg313 2 (+/-)
•Bioensayos de alta sensibilidad para la detección de priones: •Detección de priones en productos y procesos (fármacos, vacunas, hemoderivados, etc.).
•Determinación de la infectividad en diferentes órganos y tejidos de animales infectados.
•Dispersión de la infectividad en órganos periféricos (BSE vs Scrapie; CJD vs vCJD).
•Evaluación de estrategias terapéuticas contra EETs. •Implantación de células madre modificadas genéticamente
•Estudio de los procesos moleculares implicados en la replicación y
en la patogénesis de los priones. •Mutaciones en la PrP responsables de las EETs genéticas
•Mutaciones puntuales en la PrP aumenta la susceptibilidad a la infección con priones
exógenos.
•Mecanismo/s de inducción de la patología.
•Estudio de la transmisión y la barrera de transmisión de los
priones. •Evaluación de la capacidad de transmisión de las diferentes cepas de priones en otras especies y
en particular al hombre.
•Determinación de los elementos moleculares que determinan la barrera de especie y la
“virulencia” de las distintas cepas de priones.
Ratones transgénicos como modelo para el estudio de las EETs
Genetic spongiform encephalopathy Polymorphism and pathogenic mutation.
INSERCIONES
Y
DELECIONES
P102L
A117V D178N
E200K
F198S
M129V
GSS
S S CHO CHO Repeticiones
octapéptido
(184) (200)
ATG
0,7 Kb
GPI
STOP
FFI CJD
Mutaciones puntuales aumentan la susceptibilidad a la enfermedad
espontanea.
Desarrollo de modelos de EET expontanea
Mutación
Hipótesis de trabajo: Mutaciones puntuales
en la PrPC bovina pueden aumentar la
susceptibilidad a la transformación
expontanea de la PrPC en PrPSc
Acumulación y
muerte
Objetivo:
1. Estudiar los elementos moleculares
implicados en la patogenesis.
Transgenic mouse Expression
levels*
Survival
time
bo6ORTg 8 x >650
bo10ORTg029+/+ 0.5 x >650
bo10ORTg012+/+ 1 x 500
bo10ORTg006+/- 4 x 180
* Refered to bovine brain equivalent.
Transgenic mice expressing 10OR-PrP develops a spontaneous but not
transmissible disease
Mice showed motor
impairment with
ataxia mainly affecting
the hind limbs and
also had breeding
difficulties
Wt-6OR-PrP-Tg
10OR-PrP-Tg
Transgenic mice expressing bo113L-PrP develops a spontaneous
disease which is transmissible
113L
113P
BoPrPTg-110
113LBoPrPTg-037
Transgenic mouse line Transgene expressiona Onset clinical signs
(days ± SEM)
Death
(days ± SEM)
113LBoPrPTg-037+/- 3x 272±33 345±49
113LBoPrPTg-037+/+ 6x 187±18 223±47
BoPrPTg-110+/-(b) 4x 562±38 631±52
BoPrPTg-110+/+(b) 8x 581±41 667±39
Non-Tg (prnp-/-) 0x 614±26 656±30
Table 2. Onset of clinical signs and survival times for transgenic mice expressing different levels of the mutant
113LBoPrP or wild type BoPrP
A B C D
E F G H
S P
BoPrP-Tg110 113LBoPrP-Tg037
S P
PK - - + - - +
19.3
27.1
35.8
Infectivity of 113LBoPrP-Tg037 mice brain homogenates in BoPrP-Tg110
Transgenic mice expressing bo113L-PrP develops a spontaneous disease
which is transmissible
Inocula Mean survival time in days ± sem (n/n0)
a
1st passage 2nd passage 3rd passage
113LBoPrP-Tg037b
(179 days old) 330 (1/5) 272±38 (6/6) 252±23(6/6)
113LBoPrP-Tg037-poolc
(150-250 days old) 322, 406 (2/6) 291±23 (6/6) 255±14 (7/7)
wtBoPrP-Tg110-pool
(500-600 days old) >650 (0/12) >650 (0/12) na
Normal mouse brain
(500-600 days old) >650 (0/12) >650 (0/12) na
Classical BSE-Cd
(VLAPG817/00) 295 ± 12 (6/6) 265± 35 (6/6) na
Atypical BSE-He
(CASO 03-2095) 292 ± 5 (6/6) 296 ± 7 (6/6) na
Atypical BSE-Lf
(02.2528) 207 ± 7 (6/6) 199 ± 1 (6/6) na
113L-BSE
P3 P2 P1 BS
E-C
(P
1)
BS
E-L
(P
1)
BS
E-H
(P
1)
9A2 mAb
12B2 mAb
Saf84 mAb
R145 mAb
20
29
20
29
20
29
20
29
MW
A B C D
Fig
ure
8
E
Torres et al., 2012 (submited).
Conclusions
• A single amino acid change in the bovine PrP is sufficient to induce the spontaneous
generation of an infectious prion disease supporting the hypothesis of a spontaneous/genetic
origin for the epidemic BSE agent.
• These observations support the view that a variety of prion strains might spontaneously
emerge in host displaying random genetic PrP mutations.
• All these consideration allow us hypothesizing that the BSE epidemic could have begun
by a random genetic mutation able to generate de novo infectious prions which were included
in meat and bone meal fed to cattle and then broadly expanded in cattle population. If that is
the case then there are implications for the beef industry. Concentrating on keeping out
infected cows should not be the only strategy since spontaneous/genetic cases of BSE will
appear. The important point is to prevent the multiplication via cattle cannibalism of those
spontaneous cases that occur.
Toxica Aggregate (+)
PKres (+/-)
Transmissible (-)
PrPSc Aggregate (+++)
PKres (+++)
Transmissible (+++)
Conclusions
Bo-PrPC
113LBo-PrPC
10OR-PrPC
Toxica Aggregate (+)
PKres (+/-)
Transmissible (+)
No Toxica Aggregate (-)
PKres (-)
Transmissible (-)
Otros modelos de encefalopatías genéticas
A117V D178N
E200K
GSS
CJD
FFI
S S CHO CHO Repeticiones
octapéptido
Péptido
señal
(184) (200)
Hu-PRP ATG
Anclaje
GPI
STOP
Modelo Transgén
Línea
Niveles
Expresión
Edad de
aparición de
signos
CONTROL Wild type Hu-PrP 340 4x >600
CJD E200K (CJD) 313 2x 310-360
FFI D178N (FFI) 331 2x 290-330
GSS A117V (GSS) 307 2x 280-340
•Bioensayos de alta sensibilidad para la detección de priones: •Detección de priones en productos y procesos (fármacos, vacunas, hemoderivados, etc.).
•Determinación de la infectividad en diferentes órganos y tejidos de animales infectados.
•Dispersión de la infectividad en órganos periféricos (BSE vs Scrapie; CJD vs vCJD).
•Evaluación de estrategias terapéuticas contra EETs. •Implantación de células madre modificadas genéticamente
•Estudio de los procesos moleculares implicados en la replicación y
en la patogénesis de los priones. •Mutaciones en la PrP responsables de las EETs genéticas
•Mutaciones puntuales en la PrP aumenta la susceptibilidad a la infección con priones
exógenos.
•Mecanismo/s de inducción de la patología.
•Estudio de la transmisión y la barrera de transmisión de los
priones. •Evaluación de la capacidad de transmisión de las diferentes cepas de priones en otras especies y
en particular al hombre.
•Determinación de los elementos moleculares que determinan la barrera de especie y la
“virulencia” de las distintas cepas de priones.
Ratones transgénicos como modelo para el estudio de las EETs
• Infección: Ingestión mucosa intestinal placas de Peyer
sistema linfoide
SNC SNP
• Alteraciones histopatológicas
Transmisión de los priones
Prion strain concept
Tiempos de supervivencia
En una misma especie se pueden encontrar cepas de priones con características biológicas,
histopatológicas y bioquímicas diferenciales que se mantienen a lo largo de los pases.
190 dpi 190 dpi
310 dpi 310 dpi
Histopatología Bioquímica
distinct phenotypes: -incubation times -clinical signs -histopathological lesion profiles -PrPSc deposition patterns -biochemical characteristics: glycoprofile PrPres size PK resistance stability to denaturing agents
Survival time Histopathology Biochemical properties
TgOv
190 dpi
TgOv
190 dpi
A
B TgOv
350 dpi
TgOv
350 dpi
Isolate
PrP transgenic mice for strain typing
30
20
MW
Biochemical characteristics: PrPres electrophoretic mobility, PrPres glycoprofile,
PrPSc PK sensitivity profile.
Histopathological characteristics: lesion profile and PrPres distribution pattern.
Biological properties: Survival time, clinical signs
�
Conclusions: •A important diversity of Scrapie
strain can be identified in sheep.
•This diversity is not associated
neither to genotype nor to PrPres
type present in the original isolate.
•The cross-species transmission of
the scrapie isolates tested can lead to
different outcomes which may vary
according to the strain involved. The
passaging of prions into foreign
species can lead to either
conservation of strain phenotype or
emergence of a variant strain with
unprecedented properties.
Strains diversity in sheep scrapie as analized in tg mice
Evolution of Scrapie strains in a bovine PrP background. (Scrapie as origin of epidemic BSE?)
30
20
MW
Ps21 (Atypical Sc) Ps48 (Clasical Sc)
A B
Conclusions: •Scrapie isolates propagated in
tgBov show phenotypic features
different to BSE.
BS
E L
/tg
Ov
BS
E /
tgO
v
tgBov mice
30-
20-
BSE L BSE
L-type BSE (BSE-L) as origin of epidemic BSE
Conclusions: •Ovine BSE recover its atypical
phenotypic features when
propagated in a bovine PrP
background.
BSE
1 2 3 4 5 6 7
BSE-H (07-644 )
in Tg110 mice BSE-C
BSE-H
(07-644)
20
29
A
BSE-H
(07-644)
BSE-H
(03-440)
BSE-H
(03-2095)
BSE-H
(02-2695)
BSE-H
(45)
292±12
6/6
H-type PrPres
6/6
C-like PrPres
6/6
H-type PrPres
292±5
9/12
H-type PrPres
330±14
3/12
C-like PrPres
322±21
8/10
H-type PrPres
307±9
2/10
C-like PrPres
278±12
280±8
7/7
H-type PrPres 7/7
C-like PrPres
278±6 284±6
6/6
H-type PrPres
346±6
6/6
H-type PrPres
274±3
296±7 302±8 298±10
6/6
H-type PrPres
6/6
H-type PrPres
6/6
H-type PrPres
Classical
BSE-C*
100%
C-type PrPres
303±10
100%
C-type PrPres
290±19
H-type BSE (BSE-H) as origin of epidemic BSE
BSE-H (02-2695)
in Tg110 mice BSE-C
BSE-H
(02-2695)
1 2 3 4 5 6
20
29
B
1 2 3 4 5 6 7
BSE-H (07-644 )
in Tg110 mice BSE-C
BSE-H
(07-644)
20
29
A BSE-H (02-2695)
in Tg110 mice BSE-C
BSE-H
(02-2695)
1 2 3 4 5 6
20
29
B
BSEH
(H-type PrPres)
BSEH
(C-type PrPres) Epidemic BSE
H-type BSE (BSE-H) as origin of epidemic BSE
Conclusions: •These findings emphasize the potential capacity of prion diversification during propagation, even in the
absence of species barrier, and represent the first experimental demonstration of the capability of an
atypical, presumably sporadic, bovine prion to acquire epidemic BSE-like properties during propagation in
a homologous bovine PrP context.
•Our observations are consistent with the view that the epidemic BSE agent could have originated from an
endogenous cattle prion.
FACTORES IMPLICADOS EN LA TRANSMISION
DE LOS PRIONES
•Magnitud del inóculo
•Ruta de inoculación
•Factores genéticos
•La susceptibilidad está modulada por el
polimorfismos en el gen PrP.
•Otros factores geneticos???
•Barrera de especie
•Barrera de cepa
especies barrier/strain barrier
Susceptibilidad/Resistencia genética a scrapie
Proteina PrP
CHO CHO
GPI 136 154 171
A R Q
V H R
3’ 5
PrP ORF
PrP genetic risk groups in goats and their in vivo and in vitro modelling
PrP allele Founder
code
Mouse line name Level expression
hemizygosis homozygosis
WT J201 wt-GoPrP-Tg501 1x 2x
J200 wt-GoPrP-Tg500 1x
222K J5 222K-GoPrP-Tg515 1x 2x
142M J401 142M-GoPrP-Tg541 1x
154H J603 154H-GoPrP-Tg563 0.25x
211Q J800 211Q-GoPrP-Tg580 0.5x
Table 2. Selected transgenic mouse lines expressing several Goat-PrP alleles
Subtask 1.3.2. Challenges to test the susceptibility of goat-PrP
transgenic mice to prion infection
Group I : Cattle BSE isolate (as used in WP2, source INRA (P2))
Group II : Goat-passaged BSE isolates from WP2.
Group III: Goat-passaged BSE isolates from a previous IAH (P3) study
Grupo IV: Goat Scrapie Isolates (as used in WP2 (P2))
Group V: Atypical goat scrapie isolate (supplied by (P8 or P9)
Group VI: Goat Scrapie isolate from an outbreak where the allele carrying K at codon 222 seems to confers resistance to scrapie
Groups of isolates:
Cattle-BSE 0 BSE0/Goat
CH0064 BSE/Goat IAH Goat-Sc F10 Goat-Sc S2
Goat-Sc I15§
(atypical)
Group I Group II Group III Group IV Group IV Group V
TgGo 501 wt
(+/+, 2x) 357±9 100% 346±16 100% 328±3 100% 238±10* 100% 228±15 100% >585
TgGo 500 wt
(+/-, 1x) 583±57 100% 497±31 100% 484±34 100% 465±19 100% 449±62 100% >650
TgGo 516 (222K)
(+/-, 1x) >650 0% 519±42 100% 478±31 100% >650 0% >650 0% >650
TgGo 541 (142M)
(+/-, 1x) 535±26*100% 521±46 100% 537±65 100% 515±16 100% 560±50* 100% >585
Tg Go 563 (154H)
(+/-, 0.25x) >650 0% >650 0% 582 1/6 >650 0% >650 0% >650
Tg Go 580 211Q
(+/-, 0.5x) >560 >650 0% >560 >470 >650 0% >470
Table 2. Challenges to test the susceptibility of goat-PrP transgenic mice to prion infection. *Some mice still alive
Human polymorphism and prion susceptibility
INSERCIONES
Y
DELECIONES M129V
S S CHO CHO Repeticiones
octapéptido
(184) (200)
ATG
0,7 Kb
GPI
STOP
Isolates Mean survival time in days ± sem (n/n0)
a
M129-HuPrP-Tg340 mice V129-HuPrP-Tg650 mice
vCJD 595 ±82 (6/6) >700 (0/7)
Ca-BSE 739 (1/6) >700 (0/7)
Sh-BSE0 615 ± 84 (6/6) >700 (0/7)
Go-BSE1 695 ± 22 (6/6) >700 (0/7)
sCJD (type I) 198±8 (6/6) 276 ±22 (6/6)
FACTORES IMPLICADOS EN LA TRANSMISION
DE LOS PRIONES
•Magnitud del inóculo
•Ruta de inoculación
•Factores genéticos
•La susceptibilidad está modulada por el
polimorfismos en el gen PrP…..
•Otros factores geneticos???
•Barrera de especie
•Barrera de cepa
especies barrier/strain barrier…
Limitaciones fundamentales en el control de las EETs
•Tiempos de incubación de la enfermedad muy largos (meses o años)
•Ausencia de un método de diagnostico eficaz durante la fase
subclínica.
•Baja sensibilidad de los métodos de detección de PrPRes comparada
con la elevada infectividad de los priones.
•Desconocimiento de la capacidad de transmisión de las diferentes
cepas de priones en otras especies y en particular al hombre.
•Desconocimiento de los elementos que determinan la barrera de
especie y la “virulencia” de las distintas cepas de priones.
Limitaciones fundamentales en el análisis de riesgos
Limitaciones en el conocimiento de la biología del agente
•Naturaleza del agente causal
•Mecanismo y dinámicas de replicación y de transmisión.
? �
Strain barrier vs. Species barrier
•Desconocimiento de la capacidad de transmisión de las diferentes cepas de priones en
otras especies y en particular al hombre.
•Desconocimiento de los elementos que determinan la barrera de especie y la “virulencia”
de las distintas cepas de priones.
Limitaciones fundamentales en el análisis de riesgos
Strain barrier vs. Species barrier
-La susceptibilidad de una especie a un prion procedente de otra especie depende de la
cepa inoculada.
-Distintas cepas de priones con idéntica secuencia (mismo origen) pueden mostrar
diferente capacidad de infección en un mismo hospedador.
�
Strain barrier vs. Species barrier
-La susceptibilidad de una especie a un prion procedente de otra especie depende de la cepa inoculada.
-Distintas cepas de priones con idéntica secuencia (mismo origen) pueden mostrar diferente capacidad de
infección en un mismo hospedador.
�
BSE-C
BSE-L
BSE-H
739 (1/6)
629±35 (6/6)
>700 (0/6)
Strain barrier vs. Species barrier
-La susceptibilidad de una especie a un prion procedente de otra especie depende de la cepa inoculada.
-Distintas cepas de priones con idéntica secuencia (mismo origen) pueden mostrar diferente capacidad de
infección en un mismo hospedador.
�
vCJD
sCJD-T1
sCJD-T2
284±13(6/6)
>700 (0/6)
>700 (0/6)
vC
JD
sCJD
-T1
sCJD
-T2
542±
42 (
6/6
)
>700 (
0/6
)
>700 (
0/6
)
Scrapie BSE
�
?
?
Others species
?
?
?
vCJD
sCJD
?
•Strains evolution
•Strains relations
•Transmission barrier
Scrapie BSE vCJD
?
?
Others species
? �
?
?
•Strains relations
•Transmission barrier
•Strains evolution
BSE agent evolution induced by trans-species passage: toward deciphering the Prion transmission barrier phenomenon
J.C. Espinosa1, O. Andréoletti2, M.E. Herva1, E. Alamillo1,
D. Padilla, C. Lacroux2, M. Groschup3 and J.M. Torres1
1 Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA), 28130 Valdeolmos, Madrid (Spain).
2 UMR INRA-ENVT 1225, Interactions Hôte Agent Pathogène, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse, Toulouse, France
3 FLIINEID, Insel Riems, Germany.
Objectives and experimental designing
Characterisation of BSE prions after propagation in host expressing PrP from different
species
Ca-BSE
Sheep-BSE Porcine-BSE Murine-BSE
Pig-BSE
Sheep
Scrapie
Mouse
RML
Histopathological characteristics: lesion profile and PrPres distribution pattern.
Biological properties: Transmission in several mouse models
Biochemical characteristics: PrPres electrophoretic mobility, differential PrPres reactivity against
monoclonal antibody, PrPres glycoprofile, PrPSc PK sensitivity profile.
Molecular and patho-biological properties has been analysed in all the generated BSE-derived prion in
comparison to the original BSE prion as well as to other non related prion strain as control. These BSE-derived
prions will allow us to analyse those properties associated to the prion strain versus those depending on the PrP
amino acid sequence.
�
ARQ
Bovine-BSE Ovine-BSE
ARQ
�
Mouse-BSE
Objectives and experimental designing
Characterisation of BSE prions after propagation in host expressing PrP from different
species
Ca-BSE
Sheep-BSE Porcine-BSE Murine-BSE
Pig-BSE
Sheep
Scrapie
Mouse
RML
�
ARQ
Bovine-BSE Ovine-BSE
ARQ
�
Mouse-BSE
•El agente de la BSE retiene ciertas propiedades bioquímicas cuando pasa a otras especies.
•El único factor que modula las propiedades bioquímicas del agente de la BSE cuando se adapta a otra especie es la
secuencia de la PrP, no interviniendo otros factores genéticos del huésped, ni los niveles de expresión de la PrP.
20 20
30 30
20 20
30 30
MW
Sha31
12B2
MW
•El agente de la BSE retiene ciertas propiedades bioquímicas
cuando pasa a otras especies
12B2
SHEEP...WGQPHGGGGWGQGGSHSQWNKPSKP….
BOVINE..WGQPHGGGGWGQGGTHGQWNKPSKP….
12B2 Sha 31
Cattle-BSE - +
BSE-derived
Scrapie, RML + +
- +
20 20
30 30
20 20
30 30
MW
Sha31
12B2
MW
•El único factor que modula las propiedades bioquímicas del agente de la BSE cuando se adapta a otra especie es la
secuencia de la PrP, no interviniendo otros factores genéticos del huésped, ni los niveles de expresión de la PrP.
PK PK PK
220 aa
Sha31
Transmission in BoPrP-Tg110 mice of BSE-derived prions.
Ovine
Scrapie
Mouse
RML MuTg
BSE
Su
rviv
al
tim
e (
Da
ys
po
st-
ino
cu
lati
on
)
0
100
200
500
400
300
Cattle
BSE
100 %
100 %
100 %
OvTg
BSE
100 %
100 %
PoTg
BSE
100 %
100 %
1st passage
2nd passage
100 %
<7
0 %
>60
0 d
pi
65
%
>
60
0 d
pi
BoTg
BSE
100 %
100 %
•La barrera de transmisión está modulada por propiedades de la cepa de prion
(dependientes de conformación) mas que por las diferencias en la secuencia de la PrP.
Ca-BSE
Sheep-BSE Porcine-BSE Murine-BSE
Pig-BSE
Sheep
Scrapie
Mouse
RML
�
ARQ
Bovine-BSE Ovine-BSE
ARQ
�
Mouse-BSE
Mouse
BSE
100 %
Sheep
BSE
100 %
100 %
Pig
BSE
100 %
100 %
100 %
Lack of transmission barrier in BoPrP-Tg110
High transmission
barrier
Transmission in BoPrP-Tg110 mice of BSE-derived prions.
•Cuando BSE pasa por otras especies puede sufrir alteraciones persistentes de sus propiedades
biológicas. Estas alteraciones solo dependen de la secuencia de la PrP del huésped por el que ha
pasado y no de otros factores genéticos.
MuTg
BSE
Su
rviv
al
tim
e (
Da
ys
po
st-
ino
cu
lati
on
)
0
100
200
500
400
300
Cattle
BSE
100 %
100 %
100 %
OvTg
BSE
100 %
100 %
PoTg
BSE
100 %
100 %
1st passage
2nd passage
100 %
BoTg
BSE
100 %
100 %
Ca-BSE
Sheep-BSE Porcine-BSE Murine-BSE
Pig-BSE
�
ARQ
Bovine-BSE Ovine-BSE
�
Mouse-BSE
Mouse
BSE
100 %
Sheep
BSE
100 %
100 %
Pig
BSE
100 %
100 %
100 %
Figure 2. Comparison of electrophoretic profiles and antibody labeling of PrPres detected with Sha31 (A), 12B2 (B) and 9A2 (C) mAbs. Original
BSE5 inoculum (lane 1), BSE5 infected BoPrP-Tg110 mice (lane 2), BSE5 in BoPrP-Tg110 mice second passage (lane 3). BSE/Sheep (lane 4),
BSE/Sheep in BoPrP-Tg110 mice (lane 5), BSE/Sheep in BoPrP-Tg110 mice second passage (lane 6), scrapie field isolate SC-UCD-99 (lane7),
SC-UCD-99 in BoPrP-Tg110 mice (lane 8), SC-UCD-99 in BoPrP-Tg110 mice second passage (lane 9), scrapie field isolate Langlade (lane 10),
scrapie field isolate SC-N662-97 (lane 11). Panels A, B and C were loaded with the same quantities of extracted PrPres of each sample. MW,
molecular weight given in kilodaltons. D. Schematic representation of PrPres fragments yields according to mAbs reactivity. Arrows indicate
Proteinase K cleavage points as predicted by PeptideCuter program at EXPASY server (http://us.expasy.org/). Numbers reflect sheep PrP
sequence positions. Continue lines represent main PrPres fragments and discontinue lines PrPres fragments found as a minority
Las modificaciones biológicas observadas no se ven reflejadas ni en las
propiedades bioquímicas de su PrPres ni en la histopatológía producida en
ratones BoPrP-Tg110
Similar PrPres electrophoretic mobility
No significant differences in glycoprofiles
Slight or null reactivity with mAb 12B2
Catt
el-
BS
E
Hu
man
-BS
E
(vC
JD
)
20
30
kDa
20
30
M Bo
vin
e-B
SE
Mo
use
-BS
E
Po
rcin
e-B
SE
Sh
ee
p-B
SE
Ovin
e-B
SE
Sha31
12B2
Cerebelum Striatum
Brain stem Hippocampus
A unique and similar lesion profile
Similar PrPd distribution pattern
Inoculated BoPrP-Tg110 mice
• La barrera de transmisión está modulada por propiedades de la cepa de prion
(dependientes de conformación) mas que por las diferencias en la secuencia de la PrP.
•Cuando BSE pasa por otras especies puede sufrir alteraciones persistentes de sus
propiedades biológicas sin verse alteradas otras propiedades especificas de la cepa de
prion.
•Aunque el cambio radical de un prion cuando pasa una barrera de transmisión es un
fenómeno conocido, la posibilidad de una evolución biológica y la generación de
diversidad dentro de un “cluster” de cepas representa un nuevo concepto en el campo de
los priones.
Evolución de BSE en la transmission inter-especies
(Resumen)
•La EEB ovino infecta los ratones BoPrP-Tg110 con una mayor virulencia (reducidos tiempos de
incubación) que la EEB bovina original. Este incremento de virulencia es mantenido a lo largo de los
pases, lo que sugiere que este agente ha cambiado sus propiedades biológicas al pasar por la oveja.
BSE
303±10 (100%) 290±19 (100%)
560±26 (70%) 491±17 (65%)
>600 (100%)
289±15 (100%) SC-UCD-99
SC-LANGLADE
SC-N662-97
SCRAPIE
ARQ/ARQ
Transmission in BoPrP-Tg110 mice of sheep adapted BSE prions
291±20 (100%)
ARQ/ARQ
234±5 (100%) 234±3 (100%) 228±3 (100%)
El incremento de virulencia de la EEB ovina también es extensible a otras especies
Ca-BSE
>650 (0%)
>650 (0%)
475 9 (17%)
>650 (19%)
269 23 (100%)
198 4 (100%)
191 6 (100%)
197 4 (100%)
Transmission in PoPrP-Tg001 mice of several prion strain
BSE1
BSE1/boTg
BSE2
BSE0
Sh-BSE
458 11 (100%) 162 3 (100%)
�
�
�
�
30
20
30
20
MW MW
BSE
Sh-BSE
Transmission in HuPrP-Tga340 mice of sheep adapted BSE prions
SCRAPIE
ARQ/ARQ
El incremento de virulencia de la EEB ovina es también extensible a la especie humana
Sheep-BSE showed an increased virulence when compared to the
original cattle BSE isolate in human-PrP mouse suggesting an
alteration of BSE prions by the passage in sheep.
>700 (0%)
>700 (0%)
615±119 (100%) 564 ± 39 (5/5)
568 ± 65 (85%)
>700 (0%)
In progress
sCJD
vCJD
217±14 (100%) 180±30 (100%)
625±71 (100%) 595±82 (100%)
Isolates
Mean survival time in days ± sem (n/n0)a
HuPrP-Tg340 mice
Ca-BSE2 491 – 707 (0/9)
Ca-BSE2/TgBov 475 – 795 (0/5)
Ca-BSE2/TgOv 596 ± 92 (3/3)
Ca-BSE0 739 (1/6)
Ca-BSE0/TgBov 474 – 749 (0/4)
Sh-BSE0 615 ± 84 (6/6)
Sh-BSE0/TgBov 455 – 647 (0/6)
Sh-BSE0/TgOv 619 ± 47 (4/4)
Go-BSE1 695 ± 22 (7/7)
Go-BSE1/TgBovc 506 – 844 (0/8)
Ca-BSE
Sh-BSE
TgBov
TgBov
TgOv
TgBov
TgOv
Ca-BSE
Go-BSE
TgBov
The increased susceptibility of human PrP mice to Sheep is strongly related to the
ovine PrP primary sequence rather than to other host species-specific factors.