• Describir y discutir los méritos de los métodos directos e indirectos utilizados para el diagnóstico de infecciones animales
• Evaluar sus características para las condiciones del control de la infección
Objetivos
Razones diagnóstico
• Salud, producción y comercio mundial demanda plataformas rápidas de alerta, capacidad global y armonización diagnóstica
• Prevenir, detectar y controlar enfermedades animales
• Tecnologías de detección como base para la salud global “una salud”
Aspectos de importancia para el control
• Conocimiento de la enfermedad• Diagnóstico correcto• Acción sobre animales positivos?• Vacunación ?
CONCEPTOS FUNDAMENTALES
• Conocer las características de infección, virulencia, patogenicidad y capacidad de transmisión del agente
• Mecanismo de infección y respuesta inmune protectora
• Interpretar resultados diagnósticos de la enfermedad
La tecnología diagnóstica pretende…..
• Detectar la presencia o ausencia de un patógeno y su subsecuente identificación y caracterización
• Detectar el efecto patológico, o la respuesta inmune a la infección por un patógeno en particular
• Fácil?? Sensible, seguro, reproducible…..
Métodos diagnóstico aceptados*
• Validado
• Sensible
• Especifico
• Rápido
• Simple
• Barato y
eventualmente automatizado para evaluar gran número de muestras
*
Diagnóstico Directo: Identificación Agente
a. Cultivo, Aislamiento y caracterización
b. Identificación de componentes (proteína)• Inmunohistoquímica
• Inmunodetección de proteínas, Captura Elisa
• Inmunoensayos (radioinmunoensayo. IFA y Elisa cuantitativo)
• Inmunocromatografía (flujo lateral)
• Proteómica
c. Identificación de ácido nucleico específico• PCR y rt-PCR
• Polimorfismos RLFP y otros basados en DNA (huella digital)
• Sondas DNA y tecnología de microarreglo, DNA
• Extracción de ácido nucleico (muestras específicas)
Detección de ácido nucleicos
PCR
Paso 1. DenaturaciónDNA
Paso 2. DNA templado
Las sondas se unen solo si complementarias a la muestra de DNA
Paso 3. Elongado
Elongación en presencia de polimerasa
Cantidad de DNA específicose duplica en cada ciclohasta que eventualmente se hace detectable
Pasos esenciales
PCR variantes
Ventajas
• Obtención de copias múltiples de un gen específico
• Muy poca cantidad de muestra
• DNA parcialmente degradado (parafina)
Limitantes
• Limitación del tamaño de fragmento a amplificar
• No es cuantitativo
• Posibilidad de contaminación Especificidad
Anidado; competitiva; RT-PCR a partir de mRNA: cDNA; cuantitativa; RFLP polimorfismo genético……
RT-PCR
• El RT-PCR se ha convertido en la herramienta central del diagnóstico de enfermedades de animales productivos
• En función de su comportamiento será la base del diagnóstico molecular para la erradicación y control de la epizootias futuras
• Aftosa, NDV, Peste porcina clásica, Lengua azul, Influenza aviar, IBR, DVB,…….
Microarreglo
• Detección simultanea de secuencias múltiples (20.000 o mas) de RNA o DNA (organismos) en una muestra en el mismo sitio (10µm) eje: 70 nucleótidos.
• Sensibilidad baja para algunos agentes
• Validación debe utilizar muestras clínicas para evaluar sensibilidad comparativa a PCR.
• Early, rapid and sensitive veterinary molecular diagnostics -Real Time PCR applications
• Pestana, E., Belak, S., Diallo, A., Crowther, J.R., Viljoen, G.J. 1st Edition., 2010, XIV, 310 p. Hardcover, ISBN 978-90-481-3131-0
Visión futura del diagnóstico veterinario
• Punto de inflexión en el balance entre cliente, costo y mejorar su desempeño
• Nuevo estándar de oro? beneficio para el cliente
• Utilidad, fortalezas y debilidades, aplicación exitosa de los resultados generados
• Secuenciación, la utilización de microfluidos y la metagenómica
WAVLD. 2013, 2015
Visión futura del diagnóstico veterinario
• PCR, migrará del laboratorio a la clínica
• Valor de la información generada
• Laboratorios relaciones con rango de expertos en materias como epidemiología, medicina, salud de hato, y manejo
• Meta proveer resultados no solamente individuales sino ser parte de formular soluciones
Implicaciones de las nuevas tecnologías
• Detección y caracterización de patógenos a las 24 horas de un brote, 25 años atrás???
• Diferenciación entre cepas de un mismo virus • Secuencia de ácido nucleico permite conocer capacidad
de causar enfermedad• Alta sensibilidad, los resultados positivos deben ser
cuidadosamente considerados con respecto a su validez • Desarrollo y uso ha sobrepasado la validación,
estandarización y estándares • Hace este resultado sentido biológico ?
• Aglutinación
• Inhibición de hemaglutinación
• Inmunodifusión en gel de agar
• Fijación de complemento
• Elisa indirecta (iELISA)
• Elisa competitiva (cELISA)
• Elisa de bloqueo (bELISA)
• Inmunoadsorción (Inmunoblot)
• Inmuno-Fluorescencia
Diagnóstico indirecto detección de anticuerpos
Metodologías recientes para medición de anticuerpos
• Pruebas rápidas e in situ
• Biosensores
• Bioluminometría
• Fluorescencia polarizada
• Quemoluminiscencia
• Cromatográfia de flujo lateral
VALOR DE LAS PRUEBAS SEROLOGICAS
Indicativo de infección
Óptimo
. Suero pareado (2-3 semanas)
. Conversión Negativo-Positivo
. Aumento título (4X)
Considerar
. Inmunidad pasiva-aborto
. Historia de vacunación
CARACTERÍSTICAS DESEABLES
Economía en reactivos (Ag/Ac)
Sensibilidad y Especificidad óptimas
Prueba estandarizada y valorada en la especie de trabajo
Reproducible, sencilla, libre de inespecificidades
Equipo y reactivos necesarios de fácil consecución
Antígenos libres de riesgo biológico.
Prueba validada con respecto a la referencia
La validez de las pruebas serológicas depende…
Calidad del manejo y almacenamiento de la muestra
Especificidad y Sensibilidad de la prueba
Calidad de las pruebas estadísticas empleadas en evaluación
GUÍAS PARA SELECCIONAR UNA PRUEBA DIAGNÓSTICA
Comparación con la prueba de Referencia
Controles positivos y negativos representativos
Evaluación bajo condiciones similares a la prueba
Existen valores normales?
Se emplea sola o como parte de una batería
Existe evidencia de que mejorará el resultado.
Factores a evaluar en Interpretación • Frecuencia de ocurrencia de la infección en la
población, momento de infección no detectada posteriormente todos positivos IBR, DVB…
• Duración de la reacción serológica causada por la infección, variación agente, inmunización o infección, anamnesis
• Inmunotolerancia, negativo no representativo de infección, DVB, Brucella
• Variación prueba serológica, títulos, isotipos…
• Estatus vacunal, antígeno, adyuvante, especie, individuo, anterior exposición, resistencia….
Prueba serológica ideal
* Detectar infección en período deincubación. Alta sensibilidad.
* No influencia de anticuerpos inespecíficos.Alta especificidad.
* Capacidad para detectar portadorescrónicos. Alta sensibilidad.
* Diferenciar vacunados de infectados. Altaespecificidad.
CRITERIOS PARA INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS SEROLÓGICAS
• SENSIBILIDAD
• ESPECIFICIDAD
• VALOR PREDECIBLE
• SEGURIDAD
• PRECISIÓN
• COEFICIENTE DE VARIACIÓN
Una buena prueba?
INFECTADO LIBRE
+
-
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
Falso negativo
Falso positivo
Sensibilidad diagnóstica• La sensibilidad de una técnica es la probabilidad
que esta produzca un resultado positivo verdadero cuando se usa en una población infectada (comparada con un estándar de referencia)
• Formula
Sensibilidad D = TP/TP+FN
Especificidad diagnóstica
• La especificidad de una técnica es la probabilidad que esta produzca un resultado negativo verdadero cuando se usa en una población no infectada (comparada con un estándar de referencia)
• FormulaEspecificidad D = TN/FP+TN
• El valor predictivo positivo de una prueba es la probabilidad que un animal este infectado cuando un resultado positivo se obtiene.
• En la practica los valores predictivos solo deben ser calculados de estudios de cohorte o estudios que reflejen legítimamente el numero de animales en esta población que son infectados con la enfermedad de interés en ese momento
• Predictivo pos = TP/ TP+FP
• El valor predictivo negativo de una prueba es la probabilidad que un animal no este infectado cuando un resultado negativo se obtiene.
• Esta medida de seguridad debe usarse solamente si la prevalencia esta disponible de los datos
• Predictivo Neg= TN/TN+FN
• VALIDACION
Animal infectado
Probabilidad de obtener resultado positivoen la prueba. Sensibilidad
Animal libre de la infección
Probabilidad de obtener resultadonegativo en la prueba. Especificidad
• INTERPRETACION
Animal positivo en la prueba
Probabilidad de estar infectado: Valorpredictivo de positivo
Animal negativo en la prueba
Probabilidad de libre: Valor predictivo denegativo
• CONSTANTE
• VARIABLE
SEGÚN
PREVALENCIA
Una Prueba Validada....
Consistentemente provee resultados queidentifican animales como positivos o negativos
Predice el estado de infección del animal dentrode un grado predeterminado de certeza
Variables que afectan el comportamiento de una prueba
De la muestra: Biológicos y externos
Del sistema o prueba
Exactitud analítica
De los resultados
Sen-D
Esp-D
Prevalencia de la población blanco
Repetibilidad y Reproducibilidad
Repetibilidad grado de coincidencia deresultados entre corridas de prueba en unmismo laboratorio
Coeficiente de variabilidad no debeexceder 10%
Reproducibilidad es el grado de coincidenciade resultados entre laboratorios
Coeficiente de variabilidad no debeexceder 15%
Animales de Referencia
Estado de infección conocido, bajo que estándar. Positivo y negativo
Probarlos en la nueva prueba y determinar corte
Cuantos animales de referencia? (Tablas) SnD< 300. EsD <1000
Representativos?
Cinética de Ac, isotipos y cantidad
Definición Punto De Corte
Distribución defrecuencias enanimales de referencia
Seleccionar punto decorte
Visual-percentiles
Calcular Sn-D y Es-D
Definiciones
Seguridad: habilidad de una prueba para dar una respuesta correcta.
Confiable: segura y precisa.
Coeficiente de variabilidad: desviación estándar (DE)/media x 100%.
Eficacia: Porcentaje de animales clasificados correctamente con un método determinado.
Positivo verdadero: Animal enfermo correctamente clasificado por la técnica.
Positivo falso: Animal incorrectamente clasificado por la técnica empleada.
Tamiz Intermedio Confirmativa
Especificidad Baja Media Alta
Sensibilidad Alta Media Baja
Antígeno sLPS sLPS P(A/M), sLPS
Dil. suero 1/50 1/200 1/50
Conjugado IgG(L&P) IgG1 Común
Tipo iELISA iELISA CELISA
Estrategia de condiciones para la selección de Elisa Brucelosis
Tamizado Intermedia Confirmatoria
Especificidad Baja Media Alta
Sensibilidad Alta Media Baja
Prueba ARB 2ME FC
Buferada RIV
Tarjeta
MRT
iELISA, FP iELISA CELISA
Estrategia para la selección de técnicas para Brucelosis
• Herpesvirus bovino Tipo I (BHV-1). • Clínica: (1) vías respiratorias (2) oculares (3) abortos (4)
genitales (5) cerebro (6) generalizada en terneros recién nacidos. Subtipos 1,2,y 3
• Distribución secreciones, ocular, nasal, genital• Persistencia, portador, Inmunosupresión• Detectar, monitorar y eliminar• Serología, SN, Elisa pE, pB, DIVA• Vacuna?? Deleción
Rinotraqueitis Infecciosa Bovina (IBR)
Diagnóstico Infección por IBR
• Aislamiento a partir de material infeccioso, en cultivos celulares MDBK, BTC, inclusiones intranucleares e inmunofluorescencia
• Inmunofluorescencia y peroxidasa en cortes histológicos de tejidos
• Serología inmunoenzimáticas (ELISA) o seroneutralización, sueros pareados
• Efecto citopático sobre macrófagos alveolares y otras células epiteliales de las vías respiratorias altas
• Prevención: Aplicación de vacunas inactivadas inmunogénicasconstituyen el mejor método, por la seguridad que ofrecen. Las vacunas de virus modificados pueden remotamente producir enfermedad al difundir el virus
Rinotraqueitis infecciosa bovina
• Vacunas a virus vivo modificado o atenuado y a virus muerto para su inoculación vía parenteral o intranasal
• Dadas las características de los Herpesvirus, su utilización debe ser cuidadosamente evaluada.
• Las muertas o muy atenuadas vía IN podrían ser aplicadas en animales preñados pero otras pueden causar aborto. Las IN pueden inducir anticuerpos locales en poco tiempo, 3 días, pueden ser útiles en protección parcial ante una evidencia de brote.
• Dos dosis de vacuna muerta pueden ser empleadas para inducir inmunidad protectora.
Oferta diagnóstica
• Detectar antígeno
• Detectar Anticuerpos a diferentes antígenos
• gB con monoclonal para Elisa Bloqueo
• Diferenciar cepas RT-PCR
• Diferenciar vacunado de infectado DIVA
• Pestivirus, familia Flavivirus, genotipos 1 y2, CPE • Infección aguda inaparente con signos transitorios de fiebre,
leucopenia, 3-7 días postinfección, diarrea y baja producción • Preñadas resultar en infección fetal o transplacentaria• Fetos abortados, momificados, nacidos muertos o nacer con
anormalidades severas • Terneros inmunotolerantes, con viremia persistente (PI)
fuente de transmisión del virus, enfermedad de las mucosas extensas erosiones en la mucosa oral y gastrointestinal
• Efecto inmunosupresor que predispone a los animales a la infección por otros microorganismos
Diarrea Viral Bovina (BVDV)
Diagnóstico en detección del virus para prevención y control de BVD
1) Identificación y eliminación de animals infectadospersistentemente (PI)
2) Aumento de inmunidad mediante vacunación3) Implementar medidas de bioseguridad
Indispensable apoyo de laboratorioKit de RT-PCR aprobado para BVDV
• Determinar si un animal ha sido infectado algunavez con el virus
• Determinar si un ternero tiene anticuerposcalostrales
• Determinar si el animal está inmunizadoapropiadamnete
• Determinar si el animal tiene infección aguda• Determinar si el ternero se ha infectado in utero
Utilidad de la serología para diagnóstico de BVDV
• Inmunohistoquímica o fluorescencia enmuestras de piel de oreja (muesca)
• Elisa para antígeno en suero, piel o muestra individual de suero
• RT-PCR en sangre, leche o piel de oreja• Dudas?? gp E2 y ERNS o “atipicas” o
pestivirus “HoBi-like” BVDV tipo 3
Tipos de pruebas para detectar animales PI
Pruebas para detección de infección por DVBPrueba Detección
AntígenoSensibilidad Cepa Tiempo Costo
Aislamiento No virus infeccioso
Alta (1UFP/ml)
No 2-14 días Alto
Fluorescencia Si Alta Posible 1-2 días Moderado
Histoquímica Si Alta Posible 2-4 días Alto
Elisa Captura Si Baja Posible 2-6 horas Bajo
RT-PCR Si Alta Posible 1-2 días Moderado/Alto
SN-Ac Si Alta Posible 2-4 días Moderado
Elisa-Ac Si Moderada Posible 4-6 horas Bajo
Oferta diagnóstica
• Detectar antígeno
• Detectar Anticuerpos a diferentes antígenos p80 (NS3)
• gB con monoclonal para Elisa Bloqueo
• Diferenciar cepas
• Diferenciar vacunado de infectado DIVA
LEUCOSIS BOVINA ENZOOTICA (BLV)
Retrovirus Oncornaviridae Subgrupo C; Género Delta-Retrovirus subfamiliaOrthoretrovirinae
• Infección subclínica cualquier edad, incluye fase embrionaria
• Linfocitosis 30-70%
• Linfosarcoma 5-10% (Tumores), muerte súbita
• Provirus integrado, infección latente
• Inmunodeficiencia?
Exposición al virus deLeucosis bovina enzoótica
No infección Infecciónseroconversión
InfecciónPersistente Linfocitosis
Persistente
Linfoma
DETECCIÓN DE ANTÍGENO
CULTIVO DE LEUCOCITOS
• Visualización por microscopía electrónica
• Formación de sincitios (PO714)
Detección por reacción inmunológica
• Inmunofluorescencia
• Radioinmunoensayo
• Infectividad por formación de sincitios
• Inmunoperoxidasa para p24
• Inmunodifusión en gel
RESPUESTA HUMORAL A BLV
• Relación niveles de anticuerpos y protección
• Antígenos estructurales solubles gp51 y p24
• Antígenos de membrana
• Infección y replicación en linfocitos B
• Anticuerpos pasivos (6-7 meses)
DETECCIÓN DE ANTICUERPOS• Fijación de complemento
• Inmunodifusión doble, gp51, p24
• Inmuno-blot p24
• Contraelectro-osmoforesis
• Neutralización viral-Inhibición de formación desincitios
• Inmunofluorescencia
• Radio inmunoensayo, p24
• Ensayo inmunoenzimático ELISA p24, gp51
INMUNODIFUSIÓN DOBLE EN GEL (AGID)
• Simple y económica
• Antígenos gp51 y p24
• Sueros controles referencia OIE E1 y E4
• Multi-especie
• Sensibilidad y Especificidad 96.4% y 94.6%
Ensayo inmunoenzimático (ELISA)
• Suero y leche
• Objetiva, automatizada
• Antígeno gp51 o p24 indirecta o captura Anticuerpos monoclonales
• Mayor sensibilidad y especificidad
Diagnóstico por PCR
Máxima sensibilidad, amplificación de DNA provirus (105 a 106 células)
Gag, pol, env
2.1-kb m RNA tax-rex
PCR e hibridación, 10-5 ug DNA sensibilidad
8.26 kb 340bp 5’ homología entre cepas de diferente procedencia
Diagnóstico individual por PCR
• Terneros con anticuerpos calostrales
• Tumor diferenciación entre esporádica y enzootica-linfoma infeccioso
• Tejido tumoral sospechoso colectado en matadero
• Infección reciente, antes de desarrollo de anticuerpos
ELISA débil positivo
• Tamiz sistemático previo a introducción a centros de inseminación/producción vacunas
Transmisión de la Neosporosis bovina
Exogena Endógena
quiste
En tejido
ooquiste
aborto
Ciclo selvático Infección persistente
Comida
agua
Infección primariaCrías infectadas
Vía principal Vía secundaria
Oferta diagnóstica
• Elisa indirecta anticuerpos, leche, suero
• Elisa antígeno?
• qPCR MCA, prueba tamiz para diferentes coccidias, basado en 18s rDNA, colorante fluorescente y Tm para diferenciar
• Detecta, identifica y diferencia DNA de coccidias de varias especies,
ganado, porcinos, caninos y felinos WAVDL
Conclusiones
• Conocimiento del agente infeccioso• Selección diagnóstica con base en técnicas validadas• Amplia oferta diagnóstica• Desarrollo tecnológico en constante avance