i
PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK JAMUR LINGZHI (Ganoderma
lucidum (Ley. ex Fr.) Kar.) PADA SEL KANKER PAYUDARA T47D :
KAJIAN AKTIVITAS SITOTOKSIK, INDUKSI APOPTOSIS DAN
EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN ALFA (RE-α)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Skolastika
NIM : 128114150
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
Prakata
Syukur dan pujian untuk kemuliaan nama-Mu Tuhan atas segala kasih
yang selalu mengalir, sehingga Penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulis
menyadari hanya oleh karena penyertaan dan belas kasih-Mu lewat berbagai pihak
sehingga skripsi ini boleh selesai. Ucapan syukur dan terima kasih Penulis
sampaikan kepada segenap pihak yang telah membantu dalam penyusunan skripsi,
seluruh civitas akademik Universitas Sanata Dharma, khususnya keluarga besar
Program Studi Farmasi.
Syukur dan terima kasih secara khusus Penulis sampaikan kepada Ibu
Damiana Sapta Candrasari S.Si., M.Sc., Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto,
M.Sc. dan Ibu Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., sebagai dosen pembimbing yang
sangat sabar dan selalu mendorong penulis untuk menyelesaikan skripsi ini, juga
kepada Ibu Dr. Yustina Sri Hartini Apt., dan Ibu Dr. Christine Patramurti Apt.,
selaku Dekan dan Kaprodi Fakultas Farmasi yang telah memberikan kesempatan
khusus bagi penulis untuk menyelesaikan perkuliahan di Fakultas Farmasi Sanata
Dharma. Penulis juga bersyukur dan berterima kasih kepada orangtua, saudara
(Celin & Fisher), om dan tante, juga adik-adik yang selalu mendoakan dan
mendukung dalam keadaan apapun, juga kepada keluarga besar Focolare dan
Youth for A United World (Y4UW), keluarga Bapak Widodo, Bapak Paulus
Panjang, dan Ibu Irene yang sudah menjadi orangtua bagi Penulis selama di Jogja,
juga teman-teman OMK Babarsari, K2KAMSY, Para Frater AM, Pater Victor,
Rm. Ignas CICM, Rm Joko Pr., Tirta Svara Choir, Vocason, Interfidei, Valentina,
Xiong, dan seluruh sahabat yang tidak dapat Penulis sebutkan satu persatu.
Penulis sadar bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu
Penulis sangat terbuka akan kritik maupun saran yang mendukung untuk
kemajuan Penulis dan akan mempertanggung-jawabkan segala kekurangan dalam
penulisan skripsi ini. Semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi pembaca.
Yogyakarta, 2 Februari 2019
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
Daftar Isi
Halaman
PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................................. ii
PENGESAHAN SKRIPSI ............................................................................. iii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................ iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI......................... v
PRAKATA ..................................................................................................... vi
DAFTAR ISI .................................................................................................. vii
DAFTAR TABEL .......................................................................................... viii
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... ix
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. x
ABSTRAK ..................................................................................................... xi
ABSTRACT ..................................................................................................... xii
PENDAHULUAN ......................................................................................... 1
METODE PENELITIAN ............................................................................... 3
HASIL & PEMBAHASAN ........................................................................... 9
KESIMPULAN .............................................................................................. 26
SARAN .......................................................................................................... 27
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 27
LAMPIRAN ................................................................................................... 31
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
Daftar Tabel
Halaman
TABEL I Data Uji Sitotoksik .................................................................... 13
TABEL II Hasil Pengamatan Apoptosis Double Staining AO-EB ............. 18
TABEL III Distribusi Ekspresi RE-α ............................................................ 21
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
Daftar Gambar
Halaman
GAMBAR 1. Struktur Molekul ................................................................... 11
GAMBAR 2. Morfologi Sel T47D ............................................................... 12
GAMBAR 3. Proses Pembentukan Formazan .............................................. 12
GAMBAR 4. Kristal Formazan .................................................................... 13
GAMBAR 5. Grafik Polinomial ................................................................... 14
GAMBAR 6. Morfologi Sel T47D Hasil Uji Double Staining AO-EB ....... 19
GAMBAR 7. Morfologi Sel T47D pada Uji Imunositokimia ...................... 21
GAMBAR 8. Jalur Pensinyalan RE-α........................................................... 23
GAMBAR 9. Proses metabolisme tamoxifen ............................................... 23
GAMBAR 10. Pharmacophore-Molecular Docking dari 4-OHT dan 17-β
Estradiol dengan RE-α .......................................................... 24
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
Daftar Lampiran
Halaman
LAMPIRAN 1. Surat Determinasi ................................................................ 30
LAMPIRAN 2. Ethical Clearance ................................................................ 31
LAMPIRAN 3. Pengolahan Data ................................................................. 32
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
ABSTRAK
Kanker payudara menjadi jenis kanker yang mempunyai tingkat insidensi
tertinggi di Indonesia pada tahun 2018 dengan angka kejadian sebesar 58.256
kasus. International Agency for Reasearch on Cancer (IARC) tahun 2018
memprediksi pada tahun 2040, kasus kanker payudara meningkat menjadi 89.512
kasus. Kanker payudara memiliki karakter ekspresi tinggi reseptor estrogen
alfa (RE-α) yang dapat dihambat dengan pengobatan standar yaitu tamoxifen.
Dewasa ini muncul efek samping dan resistensi terhadap pengobatan
tamoxifen. Penelitian sebelumnya menunjukkan ekstrak etanolik jamur lingzhi
memiliki kemampuan sitotoksik terhadap berbagai sel kanker termasuk sel kanker
payudara MCF-7 & MDA-MB-231. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui
pengaruh ekstrak etanolik jamur lingzhi (Ganoderma lucidum (Ley. ex Fr.) Kar.)
pada sel kanker payudara T47D dengan melihat aktivitas sitotoksik, induksi
apoptosis dan ekspresi reseptor estrogen alfa (RE-α). Model sel kanker payudara
yang digunakan adalah sel T47D yang mampu mengekspresikan reseptor estrogen
alfa (RE-α). Uji sitotoksisitas dianalisis menggunakan metode 3-[4,5-
dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dilanjutkan
dengan uji induksi apoptosis dengan metode double staining AO-EB.
Mekanisme molekuler terhadap RE-α dianalisis secara semi-kuantitatif
menggunakan metode imunositokimia.
Ekstrak etanolik jamur lingzhi memiliki kemampuan sitotoksik terhadap
sel kanker payudara T47D dengan IC50 sebesar 284,098 g/mL, dapat
menginduksi apoptosis sebesar 97,8 ± 0,13% dan nekrosis sebesar 0,27 ± 0,01,
tetapi belum mampu menekan ekspresi RE-α, sehingga RE-α masih
terekspresikan sebesar 97-98% dengan level ekspresi RE-α yaitu di level 4+.
Kata kunci: Kanker payudara, RE- α, Ganoderma lucidum, sel T47D.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
ABSTRACT
Breast cancer was a type of cancer with the highest incidence rate in
Indonesia in 2018 with 58,256 number of cases. In 2018, International Agency for
Research on Cancer (IARC) has predicted that in 2040, breast cancer cases will
increase up to 89,512 cases. Breast cancer has the overexpression character of
estrogen alpha receptors (ER-α) which can be inhibited by the standard treatment
namely tamoxifen. However, resistance and side effects against tamoxifen are still
two of the major hurdles in the effective management of breast cancer. Previous
research showed that lingzhi mushroom ethanolic extracts had cytotoxic effect
against various cancer cells including MCF-7 & MDA-MB-231 breast cancer
cells. This study was conducted to determine the effect of lingzhi (Ganoderma
lucidum (Ley. ex Fr.) Kar.) ethanolic extracts on T47D breast cancer cells by
study on cytotoxic activities, apoptotic induction and expression of alpha estrogen
receptors (ER-α). T47D cancer cells were used as a model of cancer cells because
they were able to activate alpha estrogen receptors. Cytotoxicity tests were carried
out using the 3 - [4,5-dimethylthiazol-2-yl] - 2,5 diphenyl tetrazolium bromide
(MTT) method, followed by apoptosis trial by the AO-EB double staining
method. The molecular relationship with ER-α was analyzed semi-quantitatively
using the immunocytochemistry method.
The lingzhi mushroom ethanolic extract demonstrates cytotoxic effect on
T47D breast cancer cells with IC50 value is 284.098 µg / mL, can induce apoptosis
by 97.8 ± 0.13% and necrosis by 0.27 ± 0.01, but has not been able to suppress
ER-α expression, therefore ER-α is still expressed at 97-98% with ER-α
expression level at level 4+.
Keywords: Breast cancer, ER-α, Ganoderma lucidum, T47D cells.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
1. PENDAHULUAN
Prevalensi penyakit kanker di Indonesia semakin meningkat. Berdasarkan
data Riset Kesehatan Dasar (RISKESDAS) tahun 2013, prevalensi kanker di
Indonesia adalah 1,4 per 1.000 penduduk atau sekitar 347.792 orang. Tahun 2018
data RISKESDAS menunjukkan kenaikan angka prevalensi kanker menjadi 1,8
per 1.000 penduduk atau sekitar 447.000 orang (Kemenkes RI, 2018). Menurut
data WHO tahun 2018, kanker payudara merupakan jenis kanker dengan tingkat
insidensi tertinggi di Indonesia sebesar 58.256 kasus dengan angka kematian
sebesar 22.692 orang dan diprediksi pada tahun 2040 akan meningkat menjadi
89.512 kasus (Globocan, 2018).
Jalur pengobatan kanker payudara cukup beragam dengan mekanisme
terjadinya yang cukup kompleks, hal ini menimbulkan banyak efek samping.
Salah satu obat yang sering digunakan adalah tamoxifen dan raloxifene.
Raloxifene hanya disetujui untuk digunakan oleh wanita setelah menopause
sedangkan tamoxifen dapat dipakai baik pada wanita premenopause dan
postmenopause. Tamoxifen memiliki efek samping seperti kelelahan, terbakar,
kanker uterus dan penggumpalan darah (American Cancer Society, 2013).
Oleh karena itu, diperlukan adanya penelitian untuk menemukan suatu senyawa
yang memiliki target aksi lebih spesifik pada sel kanker payudara untuk
meminimalkan efek samping.
Jamur lingzhi (Ganoderma lucidum) dipilih karena telah diteliti
mempunyai khasiat antikanker. Menurut Boh, Berovic, Zhang, Zhi-bin (2007) dan
Zhou et al. (2007) dalam Kao et al. (2013), senyawa aktif utama dalam jamur
lingzhi adalah senyawa golongan triterpen dan polisakarida. Penelitian ini
menunjukkan bahwa senyawa triterpen dan polisakarida dari ekstrak jamur lingzhi
(Ganoderma lucidum) secara langsung menginduksi apoptosis berbagai jenis sel
kanker pada manusia termasuk sel kanker payudara melalui berbagai mekanisme
aksi yaitu menstimulus Cytotoxic T-lymphocytes (CTL), Extracellular matrix
(ECM), menstimulus Natural Killer Cells (NK), Tumor Necrosis Factor (TNF),
menstimulus produksi Interleukin (IL), menghambat Matrix Metalloproteinase-9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
(MMP-9), menghambat aktivasi Protein Kinase C (PKC), menghambat Reactie
Oxygen Species (ROS) melalui aktivitas enzimatik dengan peningkatan anti-
oksidasi, dan menghambat Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF).
Senyawa triterpen yang banyak terdapat dalam jamur lingzhi adalah Ganoderic
acid T, Ganoderic acid D, dan Ganoderiol F (Chen et al., 2010; Yue et al.,
2008; Chang et al., 2006). Ketiga senyawa ini merupakan derivat dari senyawa
lanosterol yang memiliki kemiripan struktur dengan 17-β-estradiol yang
merupakan hormon estrogen alami pada perempuan. Adanya kemiripan struktur
ini diharapkan membuat senyawa triterpen pada jamur lingzhi mampu berikatan
dengan reseptor estrogen alfa (RE-α) pada sel kanker dan menjadi kompetitor
estrogen. Pasien kanker payudara responsif estrogen harus positif merespon
pengobatan dengan antagonis reseptor estrogen alfa (RE-α) dan / atau agonis RE-
β. Pada kasus kanker payudara, ekspresi berlebih RE-α oleh 17-β estradiol
(estrogen alami) menyebabkan peningkatan proliferasi sel yang abnormal dan
memicu terjadinya kanker, karena itu kanker payudara memiliki karakter ekspresi
berlebih reseptor estrogen alfa (RE- α) (Paterni et al., 2014). Oleh karena itu,
perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk membuktikan aktivitas antikanker
ekstrak jamur lingzhi pada sel kanker payudara melalui ekspresi reseptor estrogen
alfa (RE-α).
Penelitian ini didesain untuk mengetahui efek ekstrak etanol jamur
lingzhi terkait kemampuan sitotoksik, induksi apoptosis dan pengaruh pada
ekspresi RE-α sel kanker payudara T47D. Sel kanker payudara yang digunakan
adalah sel kanker T47D yang mampu mengekspresikan RE-α (Holliday dan
Speirs, 2011). Kemampuan senyawa dalam menginduksi apoptosis diuji
menggunakan metode double staining akridin oranye–etidium bromida (AO-EB).
Jalur kematian apoptosis dipilih karena tidak membawa pengaruh pada sel
sekitarnya dan memberikan terapi yang lebih selektif. Pengamatan molekuler sel
dalam menekan ekspresi RE-α dilakukan dengan metode semi-kuantitatif melalui
imunositokimia. Tamoxifen dapat digunakan sebagai obat pembanding dalam
penelitian ini karena obat ini tergolong dalam terapi hormonal yang telah terbukti
mampu menghambat ikatan antara estrogen dengan RE-α.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
2. METODE
2.1.Bahan penelitian
Senyawa uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak etanolik
jamur lingzhi. Sel yang digunakan dalam pengujian ini adalah sel kanker payudara
T47D yang didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran
Universitas Gadjah Mada. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 90%,
metanol pro-analis (Merck), FBS (Fetal Bovine Serum) 10%, FBS 0.5%, Media
Kultur Medium RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 (Gibco), media
kultur medium 199 (Gibco), Tripsin EDTA 0.25%, PBS (Phosphat Buffer Saline),
Fungison (Gibco), Penisilin Streptomisin 1% v/v (Gibco), aqua bidestilata, etanol
96%, natrium bikarbonat, HEPES (N-2-Hidroxy Ethyl Piperazine-N-Ethane
SulfonicAcid) (Sigma Chem), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 10% dalam HCl
0.01 N, DMSO (Merck) 0.5%, biru tripan, eter, etanol (CV. Labora), akuades,
Nolvadex 20 mg (tablet tamoxifen), metanol 70%, reagen MTT 5 mg/mL,
primary monoclonal antibody antiER-α (Thermo Fisher Scientific), biotinylated
universal secondary antibody (Biocare), Mayer Hematoxylin (Dako), xylol,
substrat DAB.
2.2.Alat penelitian
Alat penelitian yang digunakan adalah Treated tissue culture dish diameter
10 cm (Iwaki), 96 well-plate (Nunc), 24 well-plate (Nunc), 6 well-plate (Nunc),
cover slip (Nunc), sentrifuge tube, object-glass, conical tube (Iwaki), eppendorfTM
tube, inkubator CO2 (Heraeus), Laminar air flow/LAF cabinet (Labconco),
mikropipet, yellow-tip, blue-tip, pinset, autoklaf (Hirayama), hemositometer
(Neubauer), ELISA reader (Zeiss MC 80), kamera DSLR Canon EOS 500D,
mikroskop cahaya, rotary evaporator (IKA), mikroskop inverted, neraca digital.
2.3.Tata cara penelitian
2.3.1. Pengumpulan tanaman & determinasi tanaman
Tanaman jamur lingzhi dibeli dari Dipokusumo Farm (Rasmala A4,
Semarang Kota, Jawa Tengah) yang dipanen pada bulan Juni 2015. Jamur lingzhi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
yang telah diperoleh dari Dipokusumo Farm dideterminasi/diidentifikasi di
Laboratorium Sistematika Tumbuhan Fakultas Biologi UGM.
2.3.2. Pembuatan serbuk jamur lingzhi kering
Jamur lingzhi dipisahkan dari akarnya serta pengotor lain seperti tanah
yang menempel. Pencucian jamur lingzhi dilakukan dengan menggunakan air
mengalir sebanyak tiga kali, pencucian dilakukan dengan hati–hati supaya jamur
lingzhi tetap dalam kondisi utuh. Jamur lingzhi yang telah dicuci bersih
dikeringkan pada suhu 30 – 50oC selama 14 hari. Jamur yang telah kering digiling
dan diayak dengan ayakan nomor mesh 12 & 14 sehingga diperoleh serbuk halus
simplisia.
2.3.3. Pembuatan ekstrak etanolik jamur lingzhi
Serbuk simplisia jamur lingzhi sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam
labu alas bulat (LAB) 500 mL. Direfluks selama 2 jam dengan 350 mL etanol
90%. LAB didiamkan sebentar agar serbuk mengendap, lalu difiltrasi. Serbuk
yang tersaring diekstraksi lagi dengan cara yang sama sampai didapatkan filtrat
jernih. Semua filtrat digabungkan lalu dipekatkan dengan rotary evaporator.
Filtrat diambil dan diuapkan pada suhu 80oC. Setiap 10 menit filtrat dalam cawan
porselen ditimbang sampai didapatkan bobot tetap. Diperoleh residu berwarna
cokelat gelap.
2.3.4. Pembuatan larutan uji
Ekstrak total jamur lingzhi (sampel) sebanyak 10 mg dilarutkan ke dalam
100 μL DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel sebesar
100.000 μg/mL. Selanjutnya dibuat 7 seri kadar pengenceran yaitu 5 μg/mL, 10
μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL, 80 μg/mL, 160 μg/mL, dan 320 μg/mL.
Larutan kontrol positif (tamoxifen) dibuat dari 20 tablet Nolvadex yang
tiap tabletnya mengandung 20 mg tamoxifen, ditimbang kemudian digerus hingga
homogen. Sebanyak 10 mg dilarutkan ke dalam DMSO 100 μL, didapatkan
larutan stok kontrol dengan konsentrasi 100.000 μg/mL. Selanjutnya dibuat 7 seri
kadar pengenceran yaitu 0,185 μg/mL (0,5 μM); 0,371 μg/mL (1 μM); 0,743
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
μg/mL (2 μM); 1,486 μg/mL (4 μM); 2,972 μg/mL (8 μM); 5,944 μg/mL (16 μM);
11,888 μg/mL (32 μM).
2.3.5. Uji sitotoksik ekstrak etanolik jamur lingzhi pada sel T47D
2.3.5.1.Perlakuan sel T47D
Sel T47D yang telah diinkubasi selama 24 jam dikeluarkan dari inkubator
dan dipindahkan menuju LAF (Laminar Air Flow), seluruh kegiatan uji sitotoksik
dilakukan di dalam LAF yang sebelumnya telah diberi penyinaran UV (Ultra
Violet). Selanjutnya, seluruh media di dalam well-plate dibuang dan ditiriskan,
lalu segera dipipet 100 μL sampel dari setiap seri kadar dan dimasukkan ke dalam
lubang well-plate, dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Di dalam satu well-plate
yang berisi 96 lubang diisi oleh sampel, kontrol sel, kontrol positif (tamoxifen).
Selanjutnya, sel diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator dan setelah inkubasi
dilakukan pengamatan pada sel yang telah diberi perlakuan sampel di bawah
mikroskop inverter, tidak semua lubang diamati, hanya diambil beberapa lubang
yaitu pada konsentrasi tertinggi, tengah dan terendah, bentuk sel diamati dan
diambil gambar dengan menggunakan kamera DSLR Canon EOS 500D.
2.3.5.2.Metode MTT
Seluruh reagen MTT dipersiapkan dengan cara mencampur 1 mL MTT
dengan 10 mL media komplit (MK) ke dalam conical tube. Media komplit adalah
media yang mengandung faktor pertumbuhan seperti Fetal Bovine Serum (FBS)
dan juga Penisilin-Streptomisin sebagai antibiotik. Selanjutnya, media yang
terdapat pada sel T47D dibuang dengan membalikan plate 180o di atas tempat
pembuangan dengan jarak 10 cm kemudian tekan plate secara perlahan di atas tisu
untuk meniriskan sisa cairan. Larutan PBS dimasukkan sebanyak 100 μL ke
dalam semua sumuran yang telah berisi sel untuk mencuci sisa media yang masih
bercampur dengan sel, kemudian buang PBS dengan cara membalik plate seperti
perlakuan di atas. Ditambahkan reagen MTT yang telah dipersiapkan sebelumnya
sebanyak 100 μL ke setiap sumuran, termasuk kontrol media, dilakukan inkubasi
selama empat jam di dalam inkubator CO2. Setelah itu, diamati kondisi sel dan
kristal formazan yang terbentuk di bawah mikroskop inverted, jika formasan telah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
terbentuk, ditambahkan 100 μL SDS 10% dalam 0,1N HCl. Plate dibungkus
menggunakan alumunium foil dan diinkubasi pada tempat gelap selama semalam
pada suhu kamar (ATCC, 2011).
2.3.5.3.Pembacaan IC50
Absorbansi ditiap sumuran dibaca dengan ELISA reader pada λ= 595 nm.
Data yang diperoleh diolah dengan membuat grafik polynomial antara konsentrasi
versus log %viabilitas menggunakan program Microsoft Excel 2010. Persamaan
polynomial dari grafik konsentrasi versus log %viabilitas digunakan untuk
menghitung IC50. Persentase sel yang hidup (%viabilitas) dihitung dengan rumus:
(Doyle dan Griffiths, 2000).
2.3.6. Uji apoptosis double staining akridin oranye–etidium bromida (AO-
EB)
2.3.6.1.Perlakuan sel
Sel T47D yang sudah 80% konfluen diambil dari inkubator CO2 dan
dipanen. Coverslip dimasukkan ke dalam 24 well-plate menggunakan pinset
dengan hati-hati. Tiap sumuran diisi dengan 1 mL suspensi sel T47D ( dengan
populasi 500.000 – 1.000.000 sel/mL), dan diinkubasi selama 24 jam di dalam
inkubator CO2. Selanjutnya, plate sel yang telah diinkubasi diambil dan
dimasukkan dalam LAF, seluruh media dalam sumuran disedot menggunakan
mikropipet dan dibuang. Selanjutnya dicuci PBS satu kali (1 mL). PBS disedot
kembali menggunakan micropipet dan dibuang. Sebanyak 1 mL sampel pada
konsentrasi IC50 dimasukkan dalam well-plate dan diinkubasi selama 24 jam.
2.3.6.2.Perlakuan double staining AO-EB
Well-plate yang telah diinkubasi dengan sampel diambil dari inkubator.
Media kultur dari tiap sumuran disedot menggunakan micropipet dan dibuang. Sel
pada well-plate dicuci menggunakan PBS sebanyak 1 mL. Kemudian, PBS ditarik
kembali menggunakan mikropipet dan dibuang. Coverslip diambil menggunakan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
pinset dan diletakkan di atas object glass. Sebanyak 10 µL reagen campuran
akridin oranye–etidium bromida (AO-EB) diteteskan di atas coverslip dan diamati
menggunakan mikroskop fluoresen. Hasil didokumentasikan dengan kamera
DSLR Canon EOS 500D.
Pembacaan dan perhitungan sel yang mengalami apoptosis, nekrosis, dan
sel hidup dilakukan oleh 3 orang responden (blind reader). Setiap responden
menghitung jumlah sel yang mengekspresikan apoptosis, nekrosis dan sel hidup di
setiap sampel. Setiap sampel dihitung dalam 3 lapang pandang yang berbeda.
Data persentase apoptosis, nekrosis dari setiap sampel selanjutnya diuji statistik
dengan uji Shapiro Wilk untuk mengetahui normalitas distribusi data tiap
kelompok percobaan. Data yang terdistribusi normal selanjutnya diuji
menggunakan uji F dan uji T menggunakan program Microsoft Excel 2010. Data
yang tidak terdistribusi normal di uji menggunakan uji non-parametrik Kruskal-
Wallis, dan dilanjutkan dengan uji Man-Whitney. Analisis statistik data persentase
apoptosis dan nekrosis bertujuan untuk melihat adanya perbedaan yang bermakna
dari tingkat inisiasi apoptosis dan nekrosis antara kelompok perlakuan (tamoxifen
dan ekstrak jamur lingzhi).
2.3.7. Uji imunositokimia
2.3.7.1.Perhitungan sel
Sel yang berada di dalam cawan petri diberi MK hingga memenuhi
permukaan cawan. MK diambil dan di masukkan dalam conical tube. Cairan sel
diambil sedikit dan dituang di atas kaca preparat untuk menghitung jumLah sel.
Kaca preparat diletakan di atas Haemositometer (alat penghitung sel), kemudian
diamati di atas mikroskop inverter perbesaran 10 kali dan dilakukan penghitungan
dengan bantuan counter. Sel sudah sesuai dengan kriteria apabila jumlahnya
antara 50.000-100.000 sel, jika hasil perhitungan sel sudah sesuai maka
dilanjutkan dengan preparasi sel tersebut. Di masukkan 5 mL MK ke dalam
conical tube yang baru dan ditambahkan 1,25 mL sel dari conical tube awal ke
dalam conical tube yang berisi 5 mL MK.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
2.3.7.2.Subkultur sel & perlakuan imunositokimia
Cover slip dimasukkan ke dalam well plate sesuai dengan jumlah sampel
dan kontrol yang digunakan. Campuran MK dan sel yang ada di conical tube
dimasukkan pada 24 well-plate yang telah diisi coverslip sebanyak 1 mL. Inkubasi
dilakukan selama 24 jam di dalam inkubator CO2.
MK dibuang dan diisi dengan sampel sebanyak 1 mL. Kaca preparat
digunakan untuk meletakkan dua coverslip. Coverslip dipindahkan di atas kaca
preparat yang telah diberi label. Mula–mula dilakukan pencucian dengan PBS
sebanyak dua kali lalu dilakukan fiksasi metanol selama 10 menit. Selanjutnya,
dilakukan pencucian PBS dua kali dan akuades dua kali, lalu dibuat campuran
H2O2 : H2O (1:9). Sebanyak 100 mL campuran H2O2 : H2O diteteskan di atas
coverslip. Kemudian, preparat dicuci dengan PBS sebanyak dua kali. Larutan
blocking ditambahkan 100 mL. Antibodi primer ditambahkan sebanyak 50 mL
dan didiamkan selama satu jam, lalu dibuang. Antibodi sekunder universal
ditambahkan sebanyak 100 mL dan didiamkan selama 20 menit, kemudian
dibuang. Tamoxifen ditambahkan sebanyak 100 mL, didiamkan selama 10 menit
kemudian dibuang. Proses pencucian PBS dilakukan sebanyak dua kali. Sebanyak
100 mL DAB ditambahkan dan didiamkan selama 2 menit. Akuades ditambahkan
untuk mencuci sebanyak dua kali. Perwarna hematoxilin ditambahkan sebanyak
100 mL dan didiamkan selama 5 menit, kembali dicuci akuades dua kali hingga
bersih dan warna biru dari pewarna hilang. Etanol absolut ditambahkan sampai
menggenangi preparat dan langsung dibuang kemudian digenangi xylol dan
kembali langsung dibuang. Coverslip yang ada di atas preparat dikeringkan
selama beberapa menit. Setelah kering, coverslip ditempel di atas object glass
dengan cara memberikan setetes etilen dan diratakan di atas coverslip.
Pengamatan kualitatif dilakukan dengan mengamati warna sel di bawah
mikroskop cahaya. Sel yang berwarna cokelat pada sitoplasma dan/atau pada
nukleus merupakan sel yang mengekpresikan RE-α, sedangkan yang berwarna
biru/ungu tidak mengekspresikan RE-α. Pengamatan semikuantitatif dilakukan
dengan metode scoring system. Preparat diamati pada perbesaran 400x oleh 3
orang responden (blind reader). Setiap responden menghitung jumlah sel yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
mengekspresikan RE-α di setiap preparat. Setiap preparat dihitung dalam 3 lapang
pandang yang berbeda. Scoring system mengikuti Vang et al. (2006) dalam
Panjalu (2015). Persentase ekspresi RE-α (%ekspresi RE-α) dihitung dengan
persamaan:
% E-α= jumlah sel berwarna cokelat
total jumlah sel satu lapang pandang x 100%
Level ekspresi RE-α ditentukan berdasarkan skala persentase ekspresi E-
α yaitu: ≤ 5% (0); 6% – 25% (1+); 26% – 50% (2+); 51% – 75% (3+); 76% –
100% (4+). Data %ekspresi RE-α yang diperoleh selanjutnya dianalisis secara
statistik dengan uji Shapiro Wilk untuk mengetahui normalitas distribusi data tiap
kelompok percobaan. Data yang terdistribusi normal selanjutnya diuji
menggunakan uji F dan uji T menggunakan program Microsoft Excel 2010. Data
yang tidak terdistribusi normal di uji menggunakan uji non-parametrik Kruskal-
Wallis, dan dilanjutkan dengan uji Man-Whitney. Analisis statistik bertujuan
untuk melihat adanya perbedaan yang bermakna dari penekanan ekspresi RE-α
antara kelompok perlakuan (tamoxifen dan ekstrak etanolik jamur lingzhi).
3. HASIL & PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanolik
jamur lingzhi (Ganoderma lucidum (Ley. ex Fr.) Kar.) pada sel kanker payudara
T47D: kajian aktivitas sitotoksik, induksi apoptosis dan ekspresi reseptor estrogen
alfa (RE-α).dengan nilai IC50 ekstrak etanolik jamur lingzhi. IC50 merupakan
konsentrasi yang dapat membunuh 50% populasi sel. Aktivitas sitotoksik ekstrak
etanolik jamur lingzhi dikuantifikasi melalui uji MTT. Kemampuan ekstrak
etanolik jamur lingzhi dalam menginduksi apoptosis dievaluasi secara
semikuantitatif melalui uji double staining akridin oranye–etidium bromida (AO-
EB). Pengujian imunositokimia dilakukan untuk mengidentifikasi regulasi
ekspresi reseptor estrogen alfa (RE-α). Level ekspresi RE-α ditetapkan secara
semikuantitatif dengan metode Scoring system. Tamoxifen digunakan sebagai
kontrol positif karena banyak digunakan sebagai terapi hormonal kanker payudara
yang spesifik untuk reseptor estrogen alfa (RE-α).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan kebenaran tanaman
yang digunakan. Determinasi dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan
Fakultas Biologi Universitas Gajah Mada. Hasil determinasi menunjukkan
identitas tanaman adalah jamur lingzhi dengan spesies Ganoderma lucidum (Ley.
ex Fr.) Kar. dan tergolong ke dalam keluarga Polyporaceae, genus Ganoderma
(Lampiran 1).
Metode ekstraksi yang digunakan mengacu pada paper Gao et al. (2011)
yaitu menggunakan metode refluks. Metode ini cocok digunakan untuk
mengekstraksi serbuk simplisia jamur lingzhi yang memiliki tekstur yang keras
seperti kayu. Pemanasan selama refluks akan mendorong dan memudahkan
substansi yang diinginkan untuk keluar dari matriks. Selama proses refluks
digunakan pelarut etanol 90% yang dapat melarutkan substansi yang diinginkan
yaitu senyawa golongan triterpen dalam jamur lingzhi (Ganoderic acid T,
Ganoderic acid D, dan Ganoderiol F) (Gambar 1). Penggunaan etanol 90% tidak
akan merusak struktur senyawa karena memiliki titik didih lebih rendah dari titik
didih ketiga senyawa tersebut, hal ini juga memudahkan dalam pemisahan pelarut
etanol 90% dari ekstrak jamur lingzhi. Pemisahan dilakukan dengan penguapan
pada suhu 80oC dengan menimbang massa filtrat setiap 10 menit sampai
didapatkan massa yang tetap.
Ganoderic acid T, Ganoderic acid D, dan Ganoderiol F merupakan
derivat dari senyawa lanosterol. Lanosterol merupakan senyawa golongan
triterpenoid tetrasiklik dihasilkan pada hewan dan fungi yang terbuat dari lemak
sterol. Ganoderic acid T, Ganoderic acid D, dan Ganoderiol F memiliki
kemiripan struktur dengan 17-β-estradiol sehingga ketiga senyawa ini diharapkan
juga memiliki kemiripan ligand binding sehingga dapat menjadi inhibitor
kompetitif 17-β-estradiol seperti tamoxifen, akibatnya pembelahan sel
(proliferasi) yang disebabkan oleh ikatan estrogen-reseptor estrogen (E2-RE)
dapat ditekan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
(A) (B)
(C) (D)
Gambar 1. Struktur molekul: (A) Ganoderic acid T. (B) Ganoderic acid D. (C) Ganoderiol F.
(D) 17-β-estradiol (Pubchem, 2015).
3.1.Uji sitotoksik (MTT)
Penelitian ini menggunakan sel kanker payudara T47D karena penelitian
sebelumnya menggunakan sel kanker payudara MCF-7. Adapun perbedaan antara
sel kanker payudara T47D & MCF-7 yaitu pada ekspresi protein mRNA dimana
analisis proteomik menunjukkan perbedaan protein 17β-hydroxysteroid
dehydrogenase (17 β-HSD) tipe 1 dan 12 dan reseptor androgen (RA)
diekspresikan dengan jumlah yang besar pada sel T47D dibanding MCF7. Sel
T47D memiliki bentuk elips yang dapat diamati di bawah mikroskop. Seiring
dengan peningkatan konsentrasi ekstrak etanolik jamur lingzhi dan tamoxifen,
kerapatan pertumbuhan sel T47D semakin menurun dan morfologi sel mengalami
perubahan. Sel mati akan berbentuk bulat, sedangkan sel hidup akan berbentuk
elips memanjang (Gambar 2).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
Gambar 3. Proses perubahan MTT menjadi kristal
formazan (Terry et al., 2013)
Pengujian sitotoksik dilakukan dengan metode kolorimetrik yaitu metode
MTT. Metode ini didasarkan pada perubahan garam tetrazolium [3-94,5-
dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromide] / MTT menjadi kristal
formazan di dalam mitokondria sel hidup yang tidak dapat larut (Gambar 3).
Pada sel mati kristal formazan tidak akan terbentuk (Gambar 4). Pengujian
sitotoksik bertujuan untuk mengetahui tingkat ketoksikan ekstrak etanolik jamur
lingzhi terhadap sel kanker payudara T47D berdasarkan hubungan antara
parameter konsentrasi dengan penurunan %viabilitas sel. Kristal formasan akan
larut ketika diberikan SDS sehingga absorbansi dapat dibaca dan dihasilkan grafik
yang digunakan untuk menghitung IC50. %viabilitas sel merupakan persentase sel
hidup.
(A) (B)
Gambar 2. Morfologi sel T47D. (A). Kontrol sel T47D. (B). Tamoxifen 20µM
Keterangan: Sel T47D hidup
Sel T47D mati
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
(A) (B)
Gambar 4. Kristal formazan. (A). Kristal formazan pada kontrol sel. (B). Kristal formazan pada
perlakuan ekstrak lingzhi 300µg/mL Keterangan: Sel mati tidak menghasilkan kristal formazan
Sel hidup menghasilkan kristal formazan
Metode ini memiliki kelebihan yaitu tidak bersifat radioaktif, bisa
digunakan untuk berbagai jenis sel, dan analisis yang lengkap juga banyak dengan
metode scanning spektrofotometer. Kekurangan metode ini adalah kurang sesuai
untuk banyak jenis sel, beberapa sel yang tidak berproliferasi dapat
memetabolisme MTT dan memberikan hasil yang salah, selain itu jika sel
terkontaminasi oleh mikroplasma juga dapat memberikan hasil yang salah
(Talupula, 2011). Atas dasar prinsip, kekurangan, dan kelebihannya metode ini
Tabel I. Data Uji Sitotoksik dengan Metode MTT
Sampel C (µg/mL) % Viabilitas % Viabilitas ± SD Log % Viabilitas
Tamoxifen
0,185 98,458 98,458 ± 1,736 1,993
0,371 111,024 111,024 ± 5,986 2,045
0,743 110,925 110,925 ± 5,083 2,045
1,486 122,310 122,310 ± 6,959 2,087
2,972 121,686 121,686 ± 5,188 2,085
5,944 107,218 107,218 ± 5891 2,030
11,888 20,538 20,538 ± 1,069 1,313
Lingzhi
5 103,937 103,937 ± 1,834 2,017
10 109,318 109,318 ± 5,078 2,039
20 107,579 107,579 ± 4,424 2,032
40 108,825 108,825 ± 3,688 2,037
80 103,707 103,707 ± 5,915 2,016
160 86,516 86,516 ± 7,799 1,937
320 43,930 43,930 ± 1,997 1,643
% Viabilitas = Mean % viabilitas dari 6 replikasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
sesuai untuk digunakan dalam analisis viabilitas sel kanker T47D yang diberi
ekstrak etanolik jamur lingzhi.
Data pengujian sitotoksik tersaji dalam Tabel I. Berdasarkan data tersebut,
terlihat penurunan %viabilitas seiring dengan bertambahnya konsentrasi ekstrak
etanolik jamur lingzhi, hal yang serupa juga terjadi pada sel T47D yang diberi
perlakuan tamoxifen. Grafik polynomial orde 3 dari konsentrasi vs logaritma
%viabilitas sel T47D digunakan untuk menghitung IC50 karena dapat
menggambarkan perubahan sekecil apapun dari aktivitas proliferasi sel kanker
T47D oleh ekstrak etanolik jamur lingzhi dan tamoxifen (Gambar 5).
A.
B.
Gambar 5. Grafik polynomial konsentrasi vs log %viabilitas sel kanker T47D. (A) Ekstrak
etanolik jamur lingzhi. (B) Tamoxifen
y = 4E-09x3 - 6E-06x2 + 0.0002x + 2.0347 R² = 0.9997
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 50 100 150 200 250 300 350
C vs log%Via Ling-Zhi Poly. (C vs log%Via Ling-Zhi)
y = -0.0003x3 - 0.0041x2 + 0.0359x + 2.0306 R² = 0.9993
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 2 4 6 8 10 12 14
C vs log %Via Tamoxifen Poly. (C vs log %Via Tamoxifen)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
Tujuan dari penentuan IC50 adalah untuk mendapatkan konsentrasi ekstrak
etanolik jamur lingzhi yang dapat mematikan setengah dari populasi sel yang ada.
Penentuan IC50 menggunakan program Microsoft Excel 2010, didapatkan hasil
IC50 dari ekstrak etanolik jamur lingzhi sebesar 284,098 g/mL sedangkan untuk
tamoxifen sebesar 9,856 µg/mL (26,530µM). Pusat data Massachusetts General
Hospital Cancer Center tahun 2019 menulis bahwa IC50 Tamoxifen pada sel
kanker payudara T47D adalah < 2μM (Massachusetts General Hospital Cancer
Center, 2019). Nilai IC50 tamoxifen dalam penelitian ini tidak sesuai dengan
standar nilai IC50 tersebut. Hasil penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh
Bruning et al. (2010) juga Kim dan Ma (2010) dengan nilai IC50 tamoxifen
sebesar 16,150μM dan 13μM juga menunjukkan nilai IC50 lebih besar dari nilai
standar IC50 pada sel kanker payudara T47D.
Kemampuan sitotoksik ekstrak etanolik jamur lingzhi jauh lebih kecil
dibanding tamoxifen, hal ini terlihat dari perbedaan nilai IC50 yang sangat besar.
Suatu ekstrak memiliki kemampuan sitotoksik yang baik menurut American
National Cancer Institute (NIH) yaitu jika IC50 < 30 µg/mL (Sudha et al., 2012).
Nilai IC50 ekstrak etanolik jamur lingzhi > 30 µg/mL, sehingga dapat dikatakan
bahwa kemampuan sitotoksik jamur lingzhi tergolong kurang baik. Ekstrak
etanolik jamur lingzhi berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker karena
menurut Machana (2011) suatu ekstrak dikatakan tidak aktif sebagai antikanker
apabila nilai IC50 > 500 µg/mL. Nilai IC50 yang besar disebabkan oleh kandungan
senyawa dalam jamur lingzhi sangat kompleks, akibatnya antar senyawa dapat
bersifat antagonis, namun hal ini masih perlu dibuktikan (Kao et al., 2013).
Senyawa yang memiliki aktivitas antikanker memiliki persentase yang kecil
dalam ekstrak etanolik jamur lingzhi sehingga isolasi senyawa terpenoid dan
polisakarida dari jamur lingzih dapat dilakukan untuk lebih meningkatkan
aktivitas antikanker dari jamur lingzhi. Penelitian sebelumnya yang dilakukan
oleh Wu et al. (2012) dengan sel yang berbeda menunjukkan nilai IC50 komponen
etanol dan komponen asam dari jamur lingzhi yaitu sebesar 100 µg/mL pada sel
kanker MCF-7 dan 60 µg/mL pada sel kanker MDA-MB-231.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
3.2.Uji apoptosis double staining akridin oranye–etidium bromida (AO-EB)
Apoptosis adalah jenis kematian sel terprogram yang diatur secara
genetika yang mengontrol perkembangan organisme dan jaringan multisel dengan
menghilangkan sel-sel yang berlebihan secara fisiologis, rusak secara fisik, dan
abnormal. Apoptosis ditandai dengan adanya perubahan morfologi, termasuk
penyusutan sel, membran blebbing, kondensasi kromatin, fragmentasi DNA, dan
pembentukan badan apoptosis. Kemanjuran obat antikanker diukur dari
kemampuannya untuk mendeteksi sel kanker dan secara selektif mendorong
apoptosis, hal ini dikarenakan pada nekrosis terjadi kematian sel yang tidak
terkontrol. Sel yang mati dapat membesar dan kemudian pecah atau lisis pada satu
daerah yang mengakibatkan respon inflamasi pada nekrosis sangat tinggi
dibandingkan apoptosis (Liu et. al, 2015).
Apoptosis dapat dideteksi dengan metode pengecatan akridin oranye–
etidium bromida (AO-EB). Metode ini didasarkan pada perbedaan fluorosensi
DNA sel yang hidup dan mati karena pengikatan akridin oranye–etidium bromida.
Akridin oranye akan menembus seluruh bagian sel menyebabkan nukleus akan
tampak berwarna hijau. Sedangkan etidium bromida hanya dapat berinterkalasi
dengan sel yang membrannya sudah rusak menyebabkan nukleus akan berwarna
merah. Pada sel mati warna yang ditimbulkan oleh etidium bromida lebih
dominan jika dibandingkan dengan akridin oranye sehingga nukleus pada sel mati
akan berwarna oranye. Sel hidup dengan membran yang masih utuh memiliki
nukleus dengan warna hijau yang seragam. Etidium bromida dapat masuk ke
dalam sel ketika sel mengalami proses apoptosis dan membran blebbing mulai
terjadi, sehingga memberikan warna oranye. Akridin oranye mengandung kation
sehingga dapat berinteraksi dengan DNA sel hidup yang bersifat anionik
membentuk garam terdisosiasi dan dapat memasuki sel dan mewarnai inti sel
menjadi hijau. Etidium bromida hanya dapat memasuki sel yang mengalami
kerusakan membran dan mewarnai inti sel menjadi merah. Etidium bromida
mengikat dengan cara menyisip di antara ikatan basa pada untai ganda DNA.
Struktur cincin etidium bromida adalah hidrofobik dan mirip dengan struktur
cincin DNA. Etidium bromida dapat membentuk ikatan van der Walls dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
pasangan basa, hal ini menyebabkan etidium mengikat pada daerah hidrofobik
molekul DNA. Etidium bromida merusak pilin ganda (double helix) dan
menghambat replikasi DNA transkripsi, perbaikan DNA, dan rekombinasi.
Etidium bromida juga lebih mendominasi warna yang dihasilkan akridin oranye.
Pewarnaan dengan metode double staining menggunakan akridin oranye dan
etidium bromida dapat membedakan sel yang hidup, sel apoptosis dan sel
nekrosis. Sel hidup akan tampak memiliki inti sel dengan bentuk normal dan
berwarna hijau. Sel yang mengalami apoptosis akan memiliki inti sel berwarna
oranye dengan bentuk terkondensasi atau terfragmentasi. Sel yang mengalami
nekrosis akan tampak berwarna oranye kemerahan yang seragam. Metode double
staining akridin oranye–etidium bromida digunakan karena metode ini ekonomis,
mudah, dan sudah mampu untuk mendeteksi apoptosis serta nekrosis dalam sel
kanker selain itu metode ini dapat memberikan gambaran visual dari sel kanker
yang mengalami early apoptosis, late apoptosis, dan nekrosis (Liu et al., 2015).
Berdasarkan hasil pengecatan pada Tabel II, terlihat bahwa kontrol sel
100 % hidup, hal ini menunjukkan proses preparasi sel berjalan baik sehingga
tidak ada sel yang mati karena stress atau pun karena kesalahan preparasi yang
bisa memberikan hasil yang bias. Sel kanker T47D dengan perlakuan tamoxifen
memiliki angka nekrosis lebih tinggi dibandingkan dengan lingzhi, sebaliknya
angka apoptosis lingzhi lebih tinggi dibandingkan dengan angka apoptosis
tamoxifen. Uji T dengan program Microsoft Excel 2010 dilakukan untuk melihat
perbedaan kemampuan menginduksi apoptosis antara kedua kelompok data
tersebut. Nilai T hitung yang didapatkan sebesar 62,629 > dari nilai t tabel yaitu
2,776 dan nilai p hitung sebesar 3,893 x 10-7
≤ 0,05, sehingga cukup meyakinkan
untuk mengatakan bahwa jumlah sel apoptosis antara lingzhi dan tamoxifen
berbeda sangat signifikan. Ekstrak etanolik jamur lingzhi dapat menginduksi
apoptosis lebih baik dari pada tamoxifen, sedangkan untuk nekrosis tidak ada
perbedaan yang signifikan antara sel kanker T47D yang mengalami nekrosis pada
perlakuan tamoxifen dengan perlakuan ekstrak etanolik jamur lingzhi (t hitung = -
5,684 < t table = 2,776).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Tabel II. Hasil Pengamatan Apoptosis Double Staining Akridin Oranye–Etidium
Bromida (AO-EB) dengan Perlakuan IC50 Ekstrak Etanolik Jamur Lingzhi,
Tamoxifen dan Kontrol Sel
Sample Jenis Kematian Sel
Apoptosis (% ± SD) Nekrosis (% ± SD) Hidup (% ± SD)
Lingzhi 97,37 ± 0,13 0,27 ± 0,01 1,93 ± 0,13
Tamoxifen 42,19 ± 1,52 3,88 ± 0,97 53,93 ± 0,56
Kontrol Sel 0 0 100
Nilai % ± SD jenis kematian sel = Rerata 3 lapang pandang dari 3 pengamat
Hasil pengamatan di bawah mikroskop fluoresen menunjukkan kontrol sel
berwarna hijau merata (Gambar 6A) karena membran sel T47D dalam keadaan
utuh sehingga hanya akridin oranye yang dapat masuk ke dalam sel. Peristiwa
apoptosis terdiri dari tahap early apoptosis, late apoptosis, dan fagositosis. Tahap
early apoptosis ditunjukkan dengan warna hijau terang pada inti sel, hal ini
disebabkan karena terjadinya kondensasi kromatin di inti sel dan sel mulai
mengkerut sehingga integritas dan permeabilitas membrane sel T47D menurun
menyebabkan etidium bromida masuk ke dalam inti sel seperti pada hasil double
staining tamoxifen dengan konsentrasi IC50 (Gambar 6B). Late apoptosis terjadi
karena membran blebbing dan terjadi fragmentasi DNA sel sehingga semakin
banyak etidium bromida yang masuk ke dalam inti sel menghasilkan warna
oranye pada inti sel yang dominan terjadi pada sel T47D dengan perlakuan
ekstrak etanolik jamur lingzhi (Gambar 6C). Sel yang mengalami nekrosis
ditandai dengan warna oranye kemerahan yang merata seperti yang terjadi pada
perlakuan tamoxifen (Gambar 6B).
Ekstrak etanolik jamur lingzhi dapat menginduksi kematian sel melalui
jalur apoptosis lebih baik dibanding tamoxifen, hal ini terjadi karena lingzhi
mengandung senyawa triterpen Ganoderic acid T, Ganoderic acid D, dan
Ganoderiol F, derivat dari senyawa lanosterol yang memiliki kemiripan struktur
dengan 17-β-estradiol yang merupakan hormon estrogen alami perempuan.
Penelitian telah menunjukkan bahwa triterpen menginduksi apoptosis sel kanker
melalui jalur yang bergantung pada mitokondria, diikuti oleh aktivasi caspase
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
cascade. Jalur apoptosis intrinsik, juga dikenal sebagai jalur apoptosis yang
bergantung pada mitokondria, melibatkan penurunan potensi mitokondria, diikuti
oleh pelepasan sitokrom c dari mitokondria. Pelepasan sitokrom c ke dalam
sitosol memicu caspase cascade untuk mengarahkan ke apoptosis. Caspase
cascade meliputi caspase 9 dan caspase 3, dan caspase 7 yang diekspresikan
tinggi pada sel kanker manusia yang diobati dengan triterpen lingzhi (Kao et al.,
2013).
(A) (B)
(C)
Gambar 6. Morfologi sel kanker T47D pada uji double staining AO-EB. (A) Kontrol sel. (B) IC50
tamoxifen sebesar 9,856µg/mL (26,530µM). (C) IC50 ekstrak etanolik jamur lingzhi sebesar
284,098 µg/mL. Keterangan: Sel hidup
Early apoptosis Late apoptosis
Nekrosis
3.3.Uji imunositokimia
Uji imunositokimia dilakukan untuk menentukan level ekspresi reseptor
estrogen alfa (RE-α) pada sel T47D setelah pemberian IC50 ekstrak etanolik jamur
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
lingzhi dan tamoxifen. Imunositokimia merupakan teknik untuk mendeteksi
protein atau antigen spesifik dalam sel dengan mendeteksi reaksi antigen antibodi
dengan bantuan penanda. Penelitian ini menggunakan antibodi primer estrogen
alfa yang akan berikatan dengan reseptor estrogen alfa (RE-α) pada sel kanker
payudara T47D sehingga sel tersebut dapat mengekspresikan estrogen dengan
memberikan warna cokelat ketika diberi pewarna DAB dari reagen
imunositokimia. Penelitian ini menggunakan metode imunositokimia indirect
(tidak langsung) dengan hasil lebih sensitif karena antibodi primer dikenali oleh
antibodi sekunder yang berikatan kovalen dengan marker (sebagai penanda)
sehingga lebih mudah terdeteksi. Kelebihan metode ini adalah morfologi sel dapat
diawetkan sehingga pola pewarnaan sel dapat diamati secara berkesinambungan
dan berbagai jenis antibodi dapat digunakan sebagai pendeteksi, akan tetapi
kekurangan dari metode ini adalah proses yang cukup lama dan rumit juga mahal
dan terbatas pada penilaian semi kuantitatif karena subjektif (Ivell et al., 2014).
Reseptor estrogen alfa (RE-α) dapat berikatan langsung dengan sekuens
spesifik DNA atau secara tidak langsung dengan mengikat faktor transkripsi
lainnya. Selain itu, RE-α dapat mengaktifkan beberapa jalur pensinyalan
(mitogen-activated protein kinase (MAPK), JAK/STAT, SRC atau
phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)) (panah biru) (Gambar 8). Sejalan dengan
aktivasi epidermal growth factor receptor (EGFR) oleh epidermal growth factor
(EGF) atau dimediasi oleh RE-α mengaktifkan MAPK, yang pada gilirannya
dapat memfosforilasi dan mungkin mengaktifkan RE-α. Protein kinase A (PKA)
dan PAK memfosforilasi dan mengaktifkan RE-α (panah merah). cAMP terlibat
dalam aktivasi reseptor RE-α dan dapat diinduksi oleh reseptor membran seperti
GPR30. Selain itu, coactivator dapat berpartisipasi dalam aktivasi RE-α dengan
crosstalk dengan jalur pensinyalan lainnya seperti koaktivator dari coactivator-
related arginine methyltransferase-1 (CARM1) mengaktifkan RE-α melalui
pensinyalan cAMP, yang mengarah ke fosforilasi RE-α. Setelah terfosforilasi, E
dan CARM1 berinteraksi dan dapat mengikat DNA untuk mengatur gen target
(Tanos et al., 2012).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
(A) (B)
(C) (D)
Gambar 7. Morfologi sel T47D pada uji imunositokimia RE-α yang terekspresikan di dalam nukleus
dan sitoplasma. (A) Kontrol sel T47D. (B) Kontrol sel T47D dengan antibodi. (C) IC50 ekstrak etanolik
jamur lingzhi sebesar 284,098 µg/mL. (D) IC50 tamoxifen sebesar 9,856 μg/mL (26,530 µM)
Keterangan: Mengekspresikan RE-α
Tidak mengekspresikan RE-α
Tabel III. Distribusi Ekpresi RE-α pada Sel T47D dengan Perlakuan Konsentrasi
IC50 Ekstrak Etanolik Jamur Lingzhi, Tamoxifen, Kontrol Sel dan Kontrol Sel
dengan Antibodi
Perlakuan % Ekspresi RE-α Level ekspresi
Kontrol Sel 0 0
Kontrol Sel dengan Antibodi 100 4+
Lingzhi 90,37 4+
Tamoxifen 16,26 1+
Skala distribusi pengecatan (% sel positif): 0: ≤ 5% ; 1+ : 6-25% ; 2+ : 26-50% ;
3+ : 51-75% ; 4+ : 76-100%.
% Ekspresi RE-α = Rerata % ekpresi RE-α 3 lapang pandang dari 3 pengamat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Kontrol sel dengan antibodi memiliki sel dengan sitoplasma atau pun
nukleus berwarna cokelat (Gambar 7B). Warna cokelat pada sel terjadi karena
pewarna DAB yang bereaksi dengan H2O2 dari HRP, sehingga menimbulkan
warna cokelat, sedangkan HRP berikatan pada antibodi primer dan antibodi
sekunder yang aktif bekerja pada RE-α. Sel dengan pemberian ekstrak etanolik
jamur lingzhi memiliki warna cokelat di sitoplasma atau pun di nukleus sama
seperti kontrol sel dengan antibodi, hal ini berarti ekstrak etanolik jamur lingzhi
tidak menghambat ikatan antibodi primer (estrogen alfa) dengan RE-α pada sel
T47D, sehingga RE-α tetap diekspresikan. Sel dengan pemberian tamoxifen
didominasi warnah ungu/biru dengan warna cokelat hanya sedikit di sitoplasma
atau di nukleus sel. Distribusi ekspresi RE-α dapat diketahui dan dihitung
menggunakan metode scoring system. Metode ini memberikan gambaran terkait
level ekspresi RE-α dengan menghitung jumlah sel T47D yang mengekspresikan
RE-α dari tiga lapang pandang yang berbeda saat dilakukan pengamatan di bawah
mikroskop (Vang et al., 2006). Mekanisme perhitungan sel dilakukan dengan
blind reader oleh tiga orang pengamat independen untuk menghindari
subyektivitas. Proses perhitungan dibandingkan dengan kontrol sel dengan
antibodi dan tanpa antibodi sehingga perbedaan warna antara sel yang
mengekspresikan RE-α dengan yang tidak mengekspresikan dapat terlihat dengan
jelas.
Data distribusi ekspresi reseptor estrogen alfa (RE-α) menunjukkan
tamoxifen dapat menghambat ekspresi protein estrogen alfa yang dilihat dari
penurunan level ekspresi estrogen alfa sedangkan ekstrak etanolik jamur lingzhi
tidak menunjukkan adanya perubahan level ekspresi (Tabel III). Hasil yang sama
diperkuat oleh hasil uji T yang dilakukan dengan Microsoft Excel 2010, antara
kelompok perlakuan ekstrak etanolik jamur lingzhi dengan tamoxifen dimana
nilai t hitung (12,284) > dari nilai t kritis (2.776) dan nilai p (2,52 x 10-4) ≤ 0.05
sehingga cukup meyakinkan untuk mengatakan bahwa level ekspresi ekstrak
etanolik jamur lingzhi dengan tamoxifen pada sel kanker T47D berbeda
signifikan (Lampiran 3). Tamoxifen merupakan inhibitor kompetitif 17-β
estradiol / E2 untuk berikatan dengan RE-α sehingga dapat menghambat ekspresi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
RE-α termasuk faktor angiogenik dan faktor pertumbuhan yang disekresikan oleh
sel kanker.
Gambar 9. Proses metabolisme tamoxifen menjadi 4-hydroxytamoxifen dan endoxifen oleh enzim
CYP2D6 dan CYP3A4/5 (Jordan, 2007).
Gambar 8. Jalur pensinyalan reseptor estrogen alfa
(RE-α) (Tanos et al., 2012)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Tamoxifen merupakan prodrug yang aktif setelah termetabolisme oleh
enzim CYP2D6 di dalam hati menjadi 4-hydroxytamoxifen (4-OHT). Tamoxifen
juga dapat dimetabolisme oleh enzim CYP3A4/5 menjadi N-desmethyltamoxifen
yang selanjutnya dimetabolisme oleh CYP2D6 menjadi 4-hydroxy-N-
desmethyltamoxifen (endoxifen). Metabolit 4-hydroxytamoxifen juga dapat
dimetabolisme oleh enzim CYP3A4/5 menjadi endoxifen. Kedua metabolit
tamoxifen ini (4-hydroxytamoxifen dan endoxifen) memiliki kemampuan afinitas
yang tinggi dengan reseptor estrogen alfa dan merupakan kompetitor E2 untuk
berikatan dengan ligand binding domain (LBD) (Gambar 9).
Gambar 10. (A) Pharmacophore-Molecular Docking dari 4-OHT dengan RE-α (kode PDB:
3ERT). Gugus hidrofobik, gugus kation, donor ikatan hidrogen dan akseptor ikatan hidrogen
ditunjukkan oleh warna kuning, biru, hijau dan merah. (B) Penggambaran 2D. Menggambarkan
gugus hidrofobik dengan interaksi hidrofobik dengan gugus ikatan dari residu (Muchtaridi et al.,
2017). (C) Pharmacophore-Molecular Docking dari 17-β Estradiol dengan RE-α. Ikatan hidrogen
berwarna kuning, atom oksigen dan nitrogen berwarna merah dan biru (Gonzales et al., 2019).
(C)
(A) (B)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Dua domain transkripsional, AF1 dan AF2, mengikat koaktivator pada
reseptor estrogen dan memulai transkripsi gen. Pengikatan E2 ke RE
menyebabkan aktivasi AF1 dan AF2, tetapi 4-OHT menghambat aktivitas AF2 di
LBD. Antiestrogen harus berikatan dengan rantai samping alkylaminoethoxy
untuk menutup aksi estrogen. Helix-12 dari RE (residu 536-544) memainkan
peran penting dalam menentukan aktivitas agonis atau antagonis sebuah ligand.
Ketika 4-OHT (antagonis) berikatan dengan LBD RE-α, helix-12 menutup jalur
pengenalan ko-aktivator menghasilkan aktivitas antagonis. Fenomena ini terjadi
karena tidak adanya ikatan hidrogen dengan His524 ketika 4-OHT terikat.
Sebaliknya, jika ikatan hidrogen terjadi antara His524 dan estradiol menghasilkan
respon agonis RE-α (Gambar 10).
Kandungan senyawa triterpenoid tetrasiklik pada jamur lingzhi (Gambar
1) yang diharapkan memiliki kemiripan ligand binding dengan 17-β-estradiol
karena kemiripan struktur, ternyata tidak dapat menghambat ekspresi reseptor
estrogen alfa (RE-α) berdasarkan hasil uji imunositokimia. Berdasarkan
pharmacophore RE-α (Gambar 10), diketahui bahwa gugus ikatan dari senyawa
triterpenoid tetrasiklik berada pada posisi yang jauh dari ligand binding RE-α
sehingga senyawa triterpenoid tetrasiklik jamur lingzhi tidak dapat berikatan
mengakibatkan ikatan hidrogen antara His524 dan estradiol tetap terjadi
menghasilkan respon agonis RE-α, tidak terjadi penekanan ekspresi reseptor
estrogen alfa.
Penelitian Jiang et al. (2006), menunjukkan reishimax mengandung
senyawa aktif biologis yang dapat menghambat proliferasi sel kanker MCF-7
disebabkan oleh penurunan ekspresi RE-α, penghambatan transaktivasi E yang
diinduksi estrogen, dan penghambatan aktivasi nuclear factor kappa (NF-κB)
yang distimulasi oleh TNF-α. Reishimax merupakan produk ekstrak Ganoderma
lucidum terstandar dari perusahaan Pharmanex. Perbedaan reishimax dengan
lingzhi yang digunakan dalam penelitian ini adalah reishimax diproduksi di Utah,
USA sedangkan jamur lingzhi dalam penelitian ini diperoleh dari Dipokusuma
Farm Semarang. Reishimax didapatkan melalui proses ekstraksi dengan metode
exclusive multi-step yang dapat meningkatkan hasil dan konsentrasi bahan aktif,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
sedangkan esktrak etanolik lingzhi dalam penelitian ini diperoleh dari satu proses
ekstraksi dengan metode refluks menggunakan teknologi sederhana. Spora jamur
lingzhi merupakan sumber bahan aktif paling tinggi dan banyak mengandung
polisakarida dan triterpen, namun memiliki cangkang yang sangat keras dan
berlapis. Pharmanex menggunakan cracked-spore technology dalam proses
ekstraksi produk reishimax sehingga produk ini menjadi salah satu produk ekstrak
Ganoderma lucidum terstandar dengan kandungan bahan aktif tertinggi di dunia,
sedangkan teknologi ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini jauh lebih
sederhana dibanding teknologi cracked-spore technology yang digunakan oleh
Pharmanex, sehingga kemungkinan dalam penelitian ini bahan aktif yang
terkandung dalam spora jamur lingzhi tidak terekstraksi secara maksimal.
Perbedaan konsentrasi bahan aktif yang terkandung dalam reishimax dengan
ekstrak etanolik Ganoderma lucidum (Ley. ex Fr.) Kar. menyebabkan perbedaan
hasil penekanan terhadap reseptor estrogen alfa.
Penelitian ini membuktikan bahwa aktivitas sitotoksik ekstrak etanolik
jamur lingzhi jauh lebih kecil dibanding tamoxifen, hal ini dapat disebabkan oleh
kandungan senyawa dalam ekstrak yang cukup kompleks. Ekstrak etanolik jamur
lingzhi memiliki kemampuan yang lebih baik dalam menginduksi apoptosis
dibandingkan dengan tamoxifen, namun ekstrak etanolik jamur lingzhi pada sel
kanker T47D tidak menghambat reseptor estrogen alfa. Pemastian perlu dilakukan
untuk penelitian selanjutnya dengan menguji kandungan kimia, uji selektivitas
terhadap sel normal, dan pengujian target spesifik molekuler lain pada sel kanker
payudara.
4. KESIMPULAN
Berdasarkan data yang ada, ekstrak etanolik jamur lingzhi memiliki
kemampuan sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan IC50 sebesar
284,098 g/mL, dapat menginduksi apoptosis sebesar 97,8 ± 0,13% dan nekrosis
sebesar 0,27 ± 0,01, tetapi belum mampu menekan ekspresi RE-α, sehingga RE-α
masih terekspresikan sebesar 97-98% dengan level ekspresi RE-α yaitu di level
4+.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
5. SARAN
Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk meningkatkan aktivitas
sitotoksik salah satunya dengan mengombinasikan dengan obat kanker lainnya
untuk meningkatkan IC50 dan diharapkan dapat membunuh sel kanker melalui
jalur apoptosis juga dapat melakukan fraksinasi ekstrak jamur lingzhi untuk
meningkatkan persentase senyawa yang memiliki aktivitas sitotoksik. Penelitian
untuk mengetahui target molekuler spesifik dari ekstrak etanolik jamur lingzhi
pada sel kanker payudara juga perlu dilakukan. Penggunaan metode double
staining AO-EB dalam pengujian apoptosis dapat dikombinasikan dengan metode
Annexin-V-Fluos untuk mendapatkan nilai persentase apoptosis, nekrosis, dan sel
hidup yang lebih akurat.
DAFTAR PUSTAKA
Aka, J.A., and Lin, S.X., 2012, Comparison of Fungsional Proteomic
Analyses Breast Cancer Cell Lines T47D and MCF7, PLoS ONE,
7(2):e31532.
American Cancer Society, 2013, Breast Cancer, American Cancer Society,
Atlanta.
ATCC, 2011, MTT Cell Proliferation Assay, American Type Culture Collection,
USA.
Bjornstrom, L., and Sjoberg, M., 2005, Mechanisms Estrogen Receptor
Signaling: Convergence of Genomic and Nongenomic Actions on
Target Genes, Molecular Endocrinology, 19(4):833-842.
Boh, B., Berovic, M., Zhang, J., and Zhi-Bin, L., 2007, Ganoderma lucidum and
its pharmaceutically active compounds, Biotechnol Annu Rev., 13:265-
301.
Bruning et al., 2010, Tamoxifen enhances the cytotoxic effects of nelfinavir in
breast cancer cells, Breast Cancer Research, 12:R45.
Chang, U.M., 2006, Ganoderiol F, a ganoderma triterpene, induces senescence
in hepatoma HepG2 cells, Life sciences, 79(12):1129-1139.
Chen, N.H., et al., 2010, Ganoderic acid T inhibits tumor invasion in vitro and in
vivo through inhibition of MMP expression, Pharmacol Rep, 62(1):150-
163.
Covaleda A.M.S., et al., 2008, Influence of Cellular E α/E β atio on the E α-
Agonist Induced Proliferation of Human T47D Breast Cancer Cells,
Toxicological Sciences, 105(2), 303-311.
Deepalakshmi, K., Mirunalini, S., Krishnaveni, M., Arulmozhi, V., 2013, In vitro
and in vivo antioxidant potentials of an ethanolic extract of Ganoderma
lucidum in rat mammary carcinogenesis, Chin J Nat Med., 11(6):621-7.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Direktorat Jenderal P.P. & P.L., 2009, Buku Saku Pencegahan Kanker
Leher Rahim dan Kanker Payudara, Jakarta, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, pp. 1. 11.
Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture: Laboratory
Procedure in Biotechnology, John Wiley and Sons, Singapore, pp . 62-64.
Fathima, A.T., Reenaa, M., 2016, Anticancer and Antibacterial Activity of
Ganoderma lucidum, International Journal of Current Microbiology and
Applied Sciences, 5(10): 891-909.
Gao et al., 2013, Anti-cancer activities of Ganoderma lucidum: active ingredients
and pathways, Functional Foods in Health and Disease, 3(2):48-65.
Gonzales et al., 2019, Homology models of mouse and rat estrogen receptor-α
ligand-binding domain created by in silico mutagenesis of a human
template: Molecular docking with 17β-estradiol, diethylstilbestrol, and
paraben analogs, Computational Toxicology, 10:1-16.
Handayani, S., 2012, Selaginella Active Fractions Induce Apoptosis On
T47D Breast Cancer Cell, Indonesian J. Pharm., 23(1), 48-50.
Hayashi, S.I., et al., 2003, The Expression and Function of Estrogen eceptor α
and β in Human Breast Cancer and Its Clinical Application, Endocrine-
Related Cancer, 10:193-202.
Holliday, D.L., and Speirs, V., 2011, Choosing The Right Cell Line for
Breast Cancer Research, Breast Cancer Research, 13:215.
International Agency for Research on Cancer, WHO, 2015, Estimated
Cancer Incidence, Mortality and Prevalence, tersedia dalam
http://globocan.iarc.fr/diakses tanggal 5 mei 2015.
Istvan, V., Haanen, C., Nakken, H., and Reutelingsperger, C., 1995, A novel assay
for apoptosis Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression
on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V, Journal of
Immunological Methods, 1, 184.
Ivell, et al., 2014, Proper Application of Antibodies for Immunohistochemical
Detection: Antibody Crimes and How to Prevent Them, Endocrinology.
155(3): 676–687.
Javois, L., 1999, Immunocytochemical Methods and Protocol,2nd
Ed., Humana
Press, USA, 3-10.
Jiang et al., 2006, Ganoderma Lucidum Inhibits Proliferation of Human Breast
Cancer Cells by Down-Regulation of Estrogen Receptor and NF-kB
Signaling, International Journal of Oncology, 29:695-703.
Jordan et al., 2007, New insights into the metabolism of tamoxifen and its role in
the treatment and prevention of breast cancer, Steroids, 72(13): 829–842.
Kao et al., 2013, Anti-cancer activities of Ganoderma lucidum: active ingredients
and pathways, Functional Foods in Health and Disease, 3(2):48-65.
Kim and Ma, 2010, Synthesis of 2- and 7- Substituted C19 Steroids Having a
1,4,6-Triene or 1,4-Diene Structure and Their Cytotoxic Effects on T47D
and MDA-MB231 Breast Cancer Cells, Molecules, 15(6), 4408-4422.
Liu et al., 2015, Dual AO/EB Staining to Detect Apoptosis in Osteosarcoma Cells
Compared with Flow Cytometry, Med Sci Monit Basic Res, 21:15–20.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Lumongga, F., 2008, Apoptosis, Departemen Patologi Anatomi Fakultas
Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan, pp. 2-4.
Macey, M., 2007, Flow cytometry: Principles and Applications, Springer Science
& Business Media, Totowa, pp. 1-2.
Machana, S., Weerapreeyakul, N., Barusrux, S., Nonpunya, A., Sripanidkulchai,
B., Thitimetharoch, T., 2011, Cytotoxic and apoptotic effects of six herbal
plants against the human hepatocarcinoma (HepG2) cell line, Chin Med.,
6(1), 1-8.
Massachusetts General Hospital Cancer Center, 2019, Genomics of Drug
Sensitivity in Cancer, tersedia dalam https://www.cancerrxgene.org/
diakses 12 Juni 2019.
Matthews, J., and Gustafsson, J.A. 2003, Estrogen Signaling: A Subtle Balance
Between E α and E β, Molecular Intervention, Volume 3, Issue 5.
Muchtaridi et al., 2017, Molecular Docking and 3D-Pharmacophore Modeling to
Study the Interactions of Chalcone Derivatives with Estrogen Receptor
Alpha, Pharmaceuticals, 1-12.
Neumann, B., and Rossi, M., 2012, Effects of Exemestane on Two-Dimensional
and Three-Dimensional T47D Breast Cancer Cell Cultures, University
of New Haven Summer Undergraduate Research Fellowship, 1-4.
Panjalu, 2015, Efek Antikanker Ekstrak Etanolik Daun Lavender (Lavandula
Officinalis Chaix) Terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui
Penekanan Ekspresi Reseptor Estrogen-α, Skripsi, Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Pubchem, NCBI, 2015, Structure of 17Beta-Estradiol, tersedia dalam
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/diakses tanggal 14 mei 2015.
Pubchem, NCBI, 2015, Structure of Ganoderic Acid D, tersedia dalam
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/diakses tanggal 14 mei 2015.
Pubchem, NCBI, 2015, Structure Of Ganoderic Acid T, tersedia dalam
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/diakses tanggal 14 mei 2015.
Pubchem, NCBI, 2015, Structure of Ganoderiol F, tersedia dalam
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/diakses tanggal 14 mei 2015.
Richard, W., 2010, Immunocytochemistry: A Pratical Guide for Biomedical
Research, Springer, 1-2.
Richard, W., 2011, Control for Immunocytochemistry: An Update, JHC, 59(1), 6-
12.
Roche, 2008, Apoptosis, Cytotoxicity, and Cell Proliferation, 4th
edition, Roche
Diagnostic GmbH, German, pp. 38- 41.
Singh, R., et al., 2014, Taxonomy, physicochemical evaluation and chemical
investigation of Ganoderma applanatum and G. Brownii, International
Journal of Advanced Research, Vol. 2, Issue 5, 702-711.
Strasser, A., O’ Connor, L., and Dixit, V., 2000, Apoptosis Signaling, Annurev.
Biochem., 69 (1), 217- 245.
Suarez-Arroyo., et al., 2013, Anti-tumor effects of Ganoderma lucidum (reishi) in
inflammatory breast cancer in in vivo and in vitro models, PLoS One,
8(2):e57431.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
Sudha, S., et al., 2012, Characterization of cytotoxic compound from marine
sediment derived actinomycete Streptomyces avidinii strain SU4, Asian
Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2(10): 770-773.
Tanos, et al., 2012, ER and PR signaling nodes during mammary gland
development, Breast Cancer Res., 19;14(4):210.
Terry, L., et al., 2013, Cell Viability Assays, Eli Lilly & Company and the
National Center for Advancing Translational Sciences, San Fransisco.
Wan, et al., 2013, Synthesis and Biological Activity of 3-N-Substituted Estrogen
Derivatives as Breast Cancer Agents, Med Chem, 13(9): 1381–1388.
Wu, et al., 2012, Ganoderma lucidum Extract Induces G1 Cell Cycle Arrest, and
Apoptosis in Human Breast Cancer Cells, The American Journal of
Chinese Medicine, 40(3): 631–642.
Yue, Q.X., et al., 2008, Proteomics characterization of the cytotoxicity
mechanism of ganoderic acid D and computer-automated estimation of
the possible drug target network, Mol Cell Proteomics, 7(5):949-961.
Yuen, J.W., and Gohel, M.D., 2005, Anticancer effects of Ganoderma lucidum: a
review of scientific evidence, Nutr Cancer, 53(1):11-17.
Zhou, X.W., et al., 2007, Ganodermataceae: Natural products and their related
pharmacological functions, American Journal of Chinese Medicine,
35(4):559-5.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
LAMPIRAN 1
Surat Keterangan Determinasi Jamur Lingzhi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
LAMPIRAN 2
Ethical Clearance
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
LAMPIRAN 3
Pengolahan data
1. Data MTT
Sampel C
(µg/mL)
% Viabilitas Mean
%Via
SD
%Via
log
%Via CV
1 2 3 4 5 6
Tamoxifen
(TMX)
0,185 99,2126 97,6378 100,7874 95,6693 99,2126 98,2283 98,4580 1,7359 1,9933 1,7631%
0,371 100,9843 107,2835 111,8110 113,7795 114,7638 117,5197 111,0236 5,9863 2,0454 5,3919%
0,743 103,5433 108,0709 111,8110 112,4016 110,8268 118,8976 110,9252 5,0828 2,0450 4,5822%
1,486 112,7953 120,2756 116,7323 127,9528 131,1024 125,0000 122,3097 6,9593 2,0875 5,6899%
2,972 112,9921 127,5591 123,6220 124,8031 118,5039 122,6378 121,6864 5,1879 2,0852 4,2634%
5,944 95,4724 109,2520 107,6772 109,4488 111,6142 109,8425 107,2178 5,8906 2,0303 5,4941%
11,888 11,0236 20,0787 26,3780 20,6693 25,9843 19,8819 20,6693 5,5650 1,3153 26,9239%
Lingzhi
(LZ)
5 101,5748 102,9528 105,9055 102,5591 105,9055 104,7244 103,9370 1,8340 2,0168 1,7645%
10 107,0866 113,5827 115,7480 109,8425 108,2677 101,3780 109,3176 5,0781 2,0387 4,6453%
20 109,0551 113,1890 109,2520 108,8583 104,7244 100,3937 107,5787 4,4241 2,0317 4,1124%
40 103,7402 109,0551 110,4331 113,1890 111,4173 105,1181 108,8255 3,6878 2,0367 3,3887%
80 106,8898 101,1811 102,9528 112,9921 102,9528 95,2756 103,7073 5,9152 2,0158 5,7038%
160 77,5591 86,8110 89,9606 89,1732 97,8346 77,7559 86,5157 7,7986 1,9371 9,0141%
320 43,3071 40,3543 44,8819 44,2913 46,2598 44,4882 43,9304 1,9975 1,6428 4,5469%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
2. Data Double Staining AO-EB Lingzhi
Lapang
Pandang
Jenis Kematian Sel
Pengamat 1 Pengamat 2 Pengamat 3
Apop
(%)
Nek
(%)
Hid
(%)
Apop
(%)
Nek
(%)
Hid
(%)
Apop
(%)
Nek
(%)
Hid
(%)
1 98,67 1,33 0 98,68 1,32 0 98,76 1,24 0
2 98,51 0 1,49 98,45 0 1,55 98,52 0 1,48
3 94,45 0,79 4,76 95,24 0,79 3,97 95,04 0,83 4,13
Rerata 97,21 0,71 2,08 97,46 0,70 1,84 97,44 0,69 1,87
Rerata Tiap Pengamat
Jenis Kematian Sel
Apoptosis (%) Nekrosis (%) Hidup (%)
Pengamat 1 97,21 0,71 2,08
Pengamat 2 97,46 0,70 1,84
Pengamat 3 97,44 0,69 1,87
Rerata Keseluruhan 97,37 ± 0,13 0,27 ± 0,01 1,93 ± 0,13
3. Saphiro Wilk Test Apoptosis Lingzhi
α 0,05
No X Xi Xi - x (Xi - x )2
1 97,21 97,21 -0,16 0,0256
2 97,46 97,44 0,07 0,0049
3 97,44 97,46 0,09 0,0081
x 97,80 D 0,0386
Nilai T
i ai Xi Xn-i+1 Xn-i+1 - Xi ai(Xn-1+1 - Xi) Jumlah [ai(Xn-1+1 - Xi)2 T3
1 0,7071 97,21 97,46 0,25 0,176775 0,0312 0,80957
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
4. Saphiro Wilk Test Nekrosis Lingzhi
α 0,05
No X Xi Xi - x (Xi - x )2
1 0,71 0,69 -0,01 1E-04
2 0,7 0,7 0 0
3 0,69 0,71 0,01 0,0001
x 0,7 D 0,0002
Nilai T
i ai Xi Xn-i+1 Xn-i+1 - Xi ai(Xn-1+1 - Xi) Jumlah [ai(Xn-1+1 - Xi)2 T3
1 0,7071 0,69 0,71 0,02 0,014142 0,0002 0,999981
5. Data Double Staining AO-EB Kontrol Sel
Lapang
Pandang
Jenis Kematian Sel
Pengamat 1 Pengamat 2 Pengamat 3
Apop
(%)
Nek
(%)
Hid
(%)
Apop
(%)
Nek
(%)
Hid
(%)
Apop
(%)
Nek
(%) Hid (%)
1 0 0 100 0 0 100 0 0 100
2 0 0 100 0 0 100 0 0 100
3 0 0 100 0 0 100 0 0 100
Rerata 0 0 100 0 0 100 0 0 100
Rerata Tiap
Pengamat
Jenis Kematian Sel
Apoptosis
(%)
Nekrosis
(%)
Hidup
(%)
Pengamat 1 0 0 100
Pengamat 2 0 0 100
Pengamat 3 0 0 100
Rerata
Keseluruhan 0 0 100
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
6. Data Double Staining AO-EB Tamoxifen
Lapang
Pandang
Jenis Kematian Sel
Pengamat 1 Pengamat 2 Pengamat 3
Apop
(%)
Nek
(%)
Hid
(%)
Apop
(%)
Nek
(%)
Hid
(%)
Apop
(%)
Nek
(%)
Hid
(%)
1 33,34 2,08 64,58 38 0 62 39,22 0 60,78
2 3,37 2,25 94,38 3,66 2,44 93,9 3,37 2,25 94,38
3 84,76 10,48 4,76 88,57 6,67 4,76 85,44 8,74 5,82
Rerata 40,49 4.94 54,57 43,41 3,04 53,55 42,68 3,66 53,66
Rerata Tiap
Pengamat
Jenis Kematian Sel
Apoptosis
(%)
Nekrosis
(%)
Hidup
(%)
Pengamat 1 40,49 4,94 54,57
Pengamat 2 43,41 3,04 53,55
Pengamat 3 42,68 3,66 53,66
Rerata
Keseluruhan
42,19 ±
1,52
3,88 ±
0,97
53,93
± 0,56
7. Saphiro Wilk Test Apoptosis Tamoxifen
α 0,05
No X Xi Xi - x (Xi - x )2
1 40,49 40,49 -1,70333 2,901344
2 43,41 42,68 0,486667 0,236844
3 42,68 43,41 1,216667 1,480278
Rerata 97,8 D 4,618467
Nilai T
i ai Xi Xn-i+1 Xn-i+1 - Xi ai(Xn-1+1 - Xi) Jumlah [ai(Xn-1+1 - Xi)2 T3
1 0,7071 40,49 43,41 2,92 2,064732 4,263118 0,923059
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
8. Saphiro Wilk Test Nekrosis Tamoxifen
α 0,05
No X Xi Xi - x (Xi - x )2
1 4,94 3,04 -0,84 0,7056
2 3,04 3,66 -0,22 0,0484
3 3,66 4,94 1,06 1,1236
Rerata 3,88 D 1,8776
Nilai T
i ai Xi Xn-i+1 Xn-i+1 - Xi ai(Xn-1+1 - Xi) Jumlah [ai(Xn-1+1 - Xi)2 T3
1 0,7071 3,04 4,94 1,9 1,34349 1,804965 0,961315
9. F-Test Double Staining AO-EB Apoptosis Lingzhi dan Tamoxifen
Rerata %Apoptosis
Lingzhi
Rerata %Apoptosis
Tamoxifen
97,21 40,49
97,44 42,68
97,46 43,41
F-Test Two-Sample for Variances
Rerata %Apoptosis
LZ
Rerata %Apoptosis
TMX
Mean 97,37 42,19333333
Variance 0,0193 2,309233333
Observations 3 3
df 2 2
F 0,008357752
P(F<=f) one-tail 0,008288479
F Critical one-
tail 0,052631579
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
10. T-Test Double Staining AO-EB Apoptosis Lingzhi dan Tamoxifen
t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances
Rerata %Apoptosis LZ Rerata %Apoptosis TMX
Mean 97,37 42,19333333
Variance 0,0193 2,309233333
Observations 3 3
Pooled Variance 1,164266667
Hypothesized Mean Difference 0
df 4
t Stat 62,62891069
P(T<=t) one-tail 1,94663E-07
t Critical one-tail 2,131846786
P(T<=t) two-tail 3,89327E-07
t Critical two-tail 2,776445105
11. F-Test Double Staining AO-EB Nekrosis Lingzhi dan Tamoxifen
Rerata %Nekrosis
Lingzhi
Rerata %Nekrosis
Tamoxifen
0,69 3,04
0,7 3,66
0,71 4,94
F-Test Two-Sample for Variances
Rerata %Nekrosis LZ Rerata %Nekrosis TMX
Mean 0,7 3,88
Variance 0,0001 0,9388
Observations 3 3
df 2 2
F 0,000106519
P(F<=f) one-tail 0,000106508
F Critical one-tail 0,052631579
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
12. T-Test Double Staining AO-EB Nekrosis Lingzhi dan Tamoxifen
t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances
Rerata %Nekrosis
LZ Rerata %Nekrosis TMX
Mean 0,7 3,88
Variance 0,0001 0,9388
Observations 3 3
Pooled Variance 0,46945
Hypothesized Mean Difference 0
df 4
t Stat -5,68431423
P(T<=t) one-tail 0,002364416
t Critical one-tail 2,131846786
P(T<=t) two-tail 0,004728832
t Critical two-tail 2,776445105
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
13. Data IHC
Pengamat
% Ekpresi RE-α
KS (%) KS Ab (%) LZ (%) TMX (%)
LP
1
LP
2
LP
3 LP 1 LP 2 LP 3 LP 1 LP 2 LP 3 LP 1 LP 2 LP 3
1 0 (0) 0 (0) 0 (0) 100 (100) 100 (100) 100 (100) 220 (96,07) 207 (92,41) 149 (81,42) 13 (15,12) 15 (21,12) 8 (12,12)
2 0 (0) 0 (0) 0 (0) 100 (100) 100 (100) 100 (100) 224 (97,82) 211 (94,2) 145 (79,23) 13 (15,12) 15 (21,12) 7 (10,61)
3 0 (0) 0 (0) 0 (0) 100 (100) 100 (100) 100 (100) 223 (97,38) 211 (94,2) 142 (77,6) 14 (16,23) 15 (21,12) 9 (13,64)
Total Sel 138 246 284 201 95 256 229 224 183 86 71 66
Rerata %
Ekpresi
RE-α
0% 0% 0% 100% 100% 100% 97,09% 93,60% 79,42% 15,54% 21,12% 12,12%
Level
Ekpresi
RE-α
0 0 0 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 1+ 1+ 1+
Rerata %
Ekpresi
RE-α 3
lapang
pandang
0% 100% 90.04% 16.26%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
14. Saphiro Wilk IHC Lingzhi
α 0,05
No X Xi Xi - x (Xi - x )2
1 97,09 79,42 -10,62 112,71361
2 93,6 93,6 3,56 12,69734
3 79,42 97,09 7,05 49,74951
Xbar 90,04 D 175,16047
Nilai T
i ai Xi Xn-i+1 Xn-i+1 - Xi ai(Xn-1+1 - Xi) Jumlah [ai(Xn-1+1 - Xi)2 T3
1 0,7071 79,42 97,09 17,67 12,494457 156,111456 0,89124823
15. Saphiro Wilk IHC Tamoxifen
α 0,05
No X Xi Xi - x (Xi - x )2
1 15,54 12,12 -4,14 17,1396
2 21,12 15,54 -0,72 0,5184
3 12,12 21,12 4,86 23,6196
Rerata 16,26 D 41,2776
Nilai T
i ai Xi Xn-i+1 Xn-i+1 - Xi ai(Xn-1+1 - Xi) Jumlah [ai(Xn-1+1 - Xi)2 T3
1 0,7071 12,12 21,12 9 6,3639 40,4992232 0,98114288
16. F-Test IHC Lingzhi & Tamoxifen
% Rerata ekspresi RE-α
Lingzhi
% Rerata ekspresi RE-α
Tamoxifen
79,42 12,12
93,6 15,54
97,09 21,12
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
F-Test Two-Sample for Variances
% Rerata ekspresi RE-α
LZ
% Rerata ekspresi
RE-α TMX
Mean 90,03666667 16,26
Variance 87,58023333 20,6388
Observations 3 3
df 2 2
F 4,243475073
P(F<=f) one-tail 0,190713217
F Critical one-tail 19
17. T-Test IHC Lingzhi & Tamoxifen
t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances
% Rerata
ekspresi RE-α
LZ
% Rerata
ekspresi
RE-α
TMX
Mean 90,03666667 16,26
Variance 87,58023333 20,6388
Observations 3 3
Pooled Variance 54,10951667
Hypothesized Mean Difference 0
df 4
t Stat 12,28366126
P(T<=t) one-tail 0,000126142
t Critical one-tail 2,131846786
P(T<=t) two-tail 0,000252285
t Critical two-tail 2,776445105
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Biografi Penulis
Skolastika dilahirkan di Pantilang, 10 Februari 1994,
anak terakhir dari 3 bersaudara dari pasangan Bapak
Amandus dan Ibu Marthina M. Penulis menempuh
pendidikan SD di Sekolah Dasar Negeri 227 Puncak
Malili, Sulawesi-Selatan dari tahun 2000–2006, dan
melanjutkan ke jenjang berikutnya di SMP 1 Malili dari
tahun 2006–2009. Penulis melanjutkan pendidikan di
SMA Negeri 3 Makale, Tana Toraja pada tahun 2009–2012. Pada tahun 2012
penulis melanjutkan pendidikan ke jenjang Strata Satu (S1) di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis memiliki hobi bernyanyi, oleh
karena itu selama menempuh pendidikan di Yogyakarta, penulis bergabung
diberbagai kelompok koor seperti Tirta Svara dan Vocason. Kecintaan pada anak–
anak membawa penulis pada kegiatan pendampingan anak di berbagai paroki dan
komunitas katolik di Yogyakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI