Molekularbiologische Indikatoren für Besatzdichtestress bei Regenbogenforellen und Ostseeschnäpeln
ALEXANDER REBL
7. Büsumer Fischtag
2
Optimale Besatzdichten in der Aquakultur
01Konventionelle Aquakultur Ökologische Fischzucht:
ähnliche Regelung der Besatzdichte
Überbesatz?
Soziale Hierarchie,Aggressionen
Unterbesatz?
Schwarm‐Intelligenz, „Sicherheit“
Stress durch Isolation vom Schwarm
Konkurrenz um Nahrungsquelle
Optimaler Besatz
3
Optimale Besatzdichten in der Aquakultur
01
TierwohlRessourcenschonung
Wirtschaftlichkeit
Hintergrund
Verbrauchermeinung
4
01
“The Progressive Fish-Culturist” 1970Hintergrund
5
“Tierwohl” ist abhängig von der Besatzdichte
Fisch in Aquakultur bei bis zu 1000‐fach höherenDichten als unter natürlichen Umständen gehalten
das beeinflusst oft produktionsrelevante Eigenschaften:
beeinträchtigtesWachstum(1), verminderte Futteraufnahme(2), erhöhter Stresshormon‐Spiegel(3),erhöhte Anfälligkeit gegenüber Krankheiten(4)
1 ‐ Rowland et al., 2006; 2 ‐ Papoutsoglou et al., 1998; 3 ‐Webster and Marketon, 2008; 4 ‐ Aluru and Vijayan, 2009; 5 ‐ Laursen et al., 2013; 6 ‐ Cowx, 2005; 7‐ Boujar et al., 2002; 8 ‐ Person‐Le Ruyet et al., 2008
01
konkrete Begrenzungen für minimale und maximale Besatzdichte sind noch immer nichtdefiniert(5)
‐ Vorschlag für mögliche Obergrenze : 40 kg Forellen/m³ (6)
‐ andere Studien zeigten dagegen, dass Dichten > 100 kg/m³ das Tierwohl nicht beeinträchtigen(7,8)
Hintergrund
6
Wie kann Haltungsstress aufgedeckt werden?
01
Hintergrund
Meiste Untersuchungen zu Stress in Fischen: Ansätze zur Analyse vorausgewählter Parameter
Ziel unserer Untersuchungen: Identifizierung neuerund Validierung bekannterTier‐basierter Biomarker und Ableitung von indikativen Funktionspfaden
Funktionspfade, die Besatzdichtestressbeschreiben, sind derzeit nicht bekannt
7
02
Versuch 1
Versuch 2
Niedrig ModeratErhöht/Hoch
400 L
Methoden
Besatzdichte-Experimente
Besatzdichten
9 Tage
Kreislaufsysteme• Wasseraustausch: 0.5 x pro Stunde• Brackwasser : 2.5–6 psu• Wasserbehandlung: Kiesfilter,
“Moving Bed Biofilm”,UV‐Bestrahlung
• Temperatur: 18.8–20.5 °C• Sauerstoff: 9.8–12.9 mg/l• pH: 7.2–7.4• Hell:dunkel‐Periode 17.5:6.5• Futter: Trockenpellets (12 h/d)
Keine Sterblichkeiten, Krankheiten odertechnischen Probleme während des Versuchs
10 kg/m3 30 kg/m3 60‐130 kg/m3
Coregonus maraena Oncorhynchus mykiss
8
02
Methoden
Probenahme und Microarray-Experimente
Coregonus maraena Oncorhynchus mykiss
Reviews: 1 ‐ Harper & Wolf, 2009; 2 ‐ Silbergeld, 1974
Probenahme:
• Niere und Leber sind Schlüsselorganeder Stressantwort(1)
• Niere: Sekretion von Hormonen, die Stress‐Funktionspfade induzieren
• Leber: wichtigstes metabolischesOrgan für Energielieferung
• Blut: klassische Plasmaparameterwerden routinemäßig bei Stress erfasst(2)
Microarray‐Experimente:Messung der Aktivität von Genen
eines von 60.000 „Genen“
Gene Expression Omnibus Datenbank:
GSE76543 (Schnäpel)GSE74332 (Forelle)
9
Methoden
Reproduzierbarkeit mit unterschiedlichen Methoden
Quantitative PCR: Überprüfung der Microarray‐Ergebnisse 7 ausgewählte Gene + 3 Normalisierungsgene
02
Profile zu den gewählten Genen zeigen eine hohe Übereinstimmung beider Methoden
Oncorhynchus mykissCoregonus maraena
LightCycler® 96LightCycler® 96
10
03
A
Besatzdichten zeigen bestimmte Genaktivierungsmuster
Satz unterschiedlich exprimierter Gene in der Leber von Schnäpelnist besonders groß bei hoher Dichte im Vergleich zur moderaten Dichte
ErgebnisseLeberLeber
korrigierter p‐value < .05 and absoluter FC > 1.5
Hoher Besatz
Niedriger Besatz
vs.Erhöhter Besatz Moderater Besatz
11
03
A B
Besatzdichten zeigen bestimmte Genaktivierungsmuster
Bei “nicht‐optimaler” Besatzdichte im Vergleich zum moderaten BesatzAnzahl der unterschiedlich exprimierten Gene in der Niere war deutlich höherals in der Leber von Schnäpeln
Schnittmenge von 53 Genen in Niere und Leber beiHochbesatz reguliert
ErgebnisseLeberLeberLeber Niere
Niere
korrigierter p‐value < .05 and absoluter FC > 1.5
Hoher Besatz
Niedriger Besatz
vs.Erhöhter Besatz Moderater Besatz
12
Funktionspfad p‐value SD Regulierte GeneAktiviert in der Leber:
ERK/MAPK signaling 1.5E‐4 HD 11 (187)p53 signaling 4.0E‐3 HD 6 (98)JAK/Stat signaling 2.5E‐2 HD 4 (72)p38 MAP kinase signaling 3.4E‐2 HD 5 (117)
Aktiviert in der Niere:Glycolysis 2.2E‐4 ED 11 (25)Glycolysis 3.8E‐10 HD 4 (25)Glucocorticoid receptor signaling 5.5E‐4 ED 11 (275)Glucocorticoid receptor signaling 3.1E‐6 HD 28 (275)Gluconeogenesis 3.3E‐3 ED 3 (25)Gluconeogenesis 7.6E‐9 HD 10 (25)mTOR signaling 2.7E‐2 ED 6 (188)mTOR signaling 1.5E‐3 ED 16 (188)Glycogen degradation 1.4E‐5 HD 5 (12)JAK/Stat signaling 2.7E‐4 HD 10 (72)SAPK/JNK signaling 6.1E‐4 HD 11 (94)p38 MAP kinase signaling 3.6E‐3 HD 10 (117)Glutamate degradation 3.9E‐3 HD 2 (3)HIF1‐alpha signaling 4.0E‐3 HD 10 (102)Ascorbate recycling 4.8E‐2 ED 1 (4)
Hohe Besatzdichten aktivieren Stress-Funktionspfade
03
Ergebnisse
13
Funktionspfad p‐value SD Regulierte GeneAktiviert in der Leber:
ERK/MAPK signaling 1.5E‐4 HD 11 (187)p53 signaling 4.0E‐3 HD 6 (98)JAK/Stat signaling 2.5E‐2 HD 4 (72)p38 MAP kinase signaling 3.4E‐2 HD 5 (117)
Aktiviert in der Niere:Glycolysis 2.2E‐4 ED 11 (25)Glycolysis 3.8E‐10 HD 4 (25)Glucocorticoid receptor signaling 5.5E‐4 ED 11 (275)Glucocorticoid receptor signaling 3.1E‐6 HD 28 (275)Gluconeogenesis 3.3E‐3 ED 3 (25)Gluconeogenesis 7.6E‐9 HD 10 (25)mTOR signaling 2.7E‐2 ED 6 (188)mTOR signaling 1.5E‐3 ED 16 (188)Glycogen degradation 1.4E‐5 HD 5 (12)JAK/Stat signaling 2.7E‐4 HD 10 (72)SAPK/JNK signaling 6.1E‐4 HD 11 (94)p38 MAP kinase signaling 3.6E‐3 HD 10 (117)Glutamate degradation 3.9E‐3 HD 2 (3)HIF1‐alpha signaling 4.0E‐3 HD 10 (102)Ascorbate recycling 4.8E‐2 ED 1 (4)
Hohe Besatzdichten aktivieren Stress-Funktionspfade
Signalpfade der Stress‐aktivierten Proteinkinase
Signalpfade der “Stress‐kinase” p38
Effektorpfad zur Energielieferung
Effektorpfad zu antioxidativen Funktionen
03
Ergebnisse
14
Hohe Besatzdichten aktivieren ImmunpfadeAktivierte Pfade p‐value SD Regulierte Gene
Aktiviert in der Leber:Acute‐phase response signaling 1.3E‐10 HD 18 (169)Protein kinase C‐θ signaling in T lymphocytes 4.0E‐6 HD 11 (118)Interleukin‐6 signaling 1.2E‐5 HD 10 (116)Complement system 1.9E‐5 HD 7 (37)Phosphoinositide 3‐kinase signaling in B lymphocytes 2.8E‐5 HD 10 (128)iCOS‐iCOSL signaling in T helper cells 4.2E‐5 HD 9 (108)B cell receptor signaling 8.0E‐5 HD 11 (174)CD28 signaling in T helper cells 8.6E‐5 HD 9 (118)
Aktiviert in der Niere:Production of nitric oxide and reactive oxygen species in macrophages 1.3E‐5 ED 11 (180)Production of nitric oxide and reactive oxygen species in macrophages 9.3E‐9 HD 25 (180)Phagocytosis in macrophages and monocytes 1.7E‐5 ED 8 (93)Phagocytosis in macrophages and monocytes 5.7E‐9 HD 18 (93)fMLP (N‐formyl‐methionyl‐leucyl‐phenylalanine) signaling in neutrophils 5.1E‐5 ED 8 (108)fMLP signaling in neutrophils 1.9E‐9 HD 20 (108)Interleukin‐8 signaling 8.5E‐5 ED 10 (184)Interleukin‐8 signaling 1.5E‐8 HD 25 (184)CD28 signaling in T helper cells 5.1E‐8 HD 19 (118)Leukocyte extravasation signaling 6.4E‐8 HD 25 (198)Tec kinase signaling 2.7E‐7 HD 21 (157)High‐mobility group protein B1 signaling 7.3E‐6 HD 15 (120)B cell receptor signaling 2.0E‐5 HD 19 (174)Acute‐phase response signaling 4.6E‐5 HD 17 (169)Chemokine signaling 4.8E‐5 HD 11 (71)Role of pattern recognition receptors in recognition of bacteria and viruses 5.5E‐5 HD 14 (126)Interleukin‐6 signaling 8.3E‐5 HD 13 (116)
03
Ergebnisse
15
03
Immun- und Stresspfade verzahnen sich bei hohem Besatz
IL1
Zentrale Position von Interleukin‐1 –ein stark vernetzter Faktor
Gene und Funktionswege, die gemeinsam in Leber und Niere von gestressten Schnäpeln aktiviert sind
• IL1B spielt eine prominente Rolle bei der Regulation stress‐aktivierter Immunantworten(1,2)
1 ‐Metz et al., 2006; 2 ‐ Aluru and Vijayan, 2009;3 ‐ Cairns et al., 2008; 4 ‐Momoda et al., 2007; 5 ‐Wiseman et al., 2007
Ergebnisse
• die Antwort des Immunsystems auf Stress ist konserviert (3,4,5)
16
Antikörper erkennen Leukozytenpopulationen in Lachsfischen
MAb 30MAb 42 MAb 1.14 MAb N2
03
Ergebnisse
SatzfunktionalerAntikörper fürForelle und Schnäpel
Hypothese: Bei höheren Besatzdichten zirkulieren bestimmte Immunzelltypen im Blut
17
Immunzell-Populationen verändern sich mit der Besatzdichte
der Anteil myeloider Zellen steigt von 8 % auf 51 % mit steigender Besatzdichte
die Anzahl myeloider Zellen steigt, aber die Anzahl der Thrombozyten und auch der B‐Zellen reduziert sich mitsteigender Besatzdichte
03Morphologie ‐ kleine, nichtgranulierte versus größere, granulierte Zellen:
Satz kreuzreagierender Antikörper:
Ergebnisse
Moderater Besatz
Hoher Besatz
Moderater Besatz
Hoher Besatz
Moderater Besatz
Hoher Besatz
Moderater Besatz
Hoher Besatz
FACS: Fluoreszenz-aktivierteZellsortierung
18
03
Besatzdichte-Stress erhöht die phagozytotische Aktivität
Funktionspfad p‐value SD Beteiligte GeneAktiviert in der Leber:
Phagozytose in Macrophagen und Monozyten 1.7E‐5 ED 8 (93)Phagozytose in Macrophagen und Monozyten 5.7E‐9 HD 18 (93)
Ergebnisse
Moderater Besatz
Hoher Besatz
Moderater Besatz
Hoher Besatz
19
Zusammenfassung: Besatzdichtestress im Schnäpel
Bei höheren Besatzdichten sind im Schnäpel sehr viele Gene in Leber und Niere aktiviert.
Ein Großteil dieser Gene ist an stress‐ und immunrelevanten Funktionspfaden beteiligt, das deutet längerfristig auf Immunsuppression hin:„conserved transcriptional response to adversity” (1)
04
Zusammenfassung I
1 ‐ Irwin and Cole, 2011
20
03
Erhöhte Besatzdichten bewirken ähnliche Genaktivitäten in der Leber
Anzahl der bei erhöhten Besatzdichten regulierten Gene war in der Leber von Forellen und Schnäpeln ähnlichverglichen mit Forellen unter “optimalen” Besatzdichten
↑ 2↑ 1 ↑ 8↓ 4 ↓ 41 ↓ 38
Forelle Leber
Erhöhter Besatz
Hoher Besatz
Aber: geringere Anzahl positiv regulierter Gene
Ergebnisse
Schnäpel Leber
korrigierter p‐value < .05 and absoluter FC > 2
21
03 nur ein Gen wurde bei hohen Besatzdichten in der Niere von Forellen aktiviert
verglichen mit Forellen unter “optimalen” Besatzdichten
korrigierter p‐value < .05 and absoluter FC > 2
↑ 1 Forelle Niere
Hoher Besatz
kodiert die Glycogenphosphorylase
katalysiert und reguliert den Abbauvon Glycogen zu Glucose‐1‐phosphat:Bereitstellung von Energie!
Erhöhte Besatzdichten bewirken kaum Veränderungen in der Forellen-NiereErgebnisse
Schnäpel Niere
22
03
Erhöhte Besatzdichten erhöhen den Blutzuckerspiegel in Forellen
Plasma‐Analyse
Ergebnisse
Nicht der Cortisol‐, aber der Blutzucker‐spiegel zeigtensignifikanteVeränderungen:
Blutzucker
23
Gedämpft in der Leber:Protein ubiquitination pathway 1.23E‐05 HD 8 (255)
2.09E‐02 ED 3 (255)Cholesterol biosynthesis 2.20E‐04 HD 3 (28)
4.88E‐07 ED 3 (28)mTOR signaling 1.21E‐03 HD 5 (188)
9.30E‐03 ED 3 (188)Retinol biosynthesis 8.54E‐03 HD 2 (33)
2.63E‐03 ED 2 (33)PI3K/AKT signaling 1.53E‐02 HD 3 (123)
3.27E‐02 ED 3 (123)Glutathione biosynthesis 1.26E‐02 HD 1 (3)
4.64E‐03 ED 1 (3)
Erhöhte Besatzdichten dämpfen viele Funktionspfade in Forellen
Aktivierte Pfade p‐value SD Beteiligte GeneAktiviert in der Leber:
HIF1 alpha signaling 2.00E‐02 HD 3 (102)
03
Ergebnisse
24
Lachsfisch‐Art
Besatzdichte[kg/m3]
Dauer des Experiments
Potenzieller Stressor Regu‐lation
Gewebe Referenz
O. myk 40, 80 9 months Fin damage ↑ Dorsal, caudal, pectoral fin North et al., 2006
O. myk 75, 120 84 days Fin damage ↑ Dorsal, pectoral fin Person‐Le Ruyet et al., 2008S. sal 30 10 weeks ALP, alkaline phosphatase ↑ Blood Liu et al., 2015O. myk 45 1 month Cholesterol ↓ Blood plasma Yarahmadi et al., 2014O. myk 40, 80 9 months Cortisol ↓ Blood plasma North et al., 2006O. myk 120 2 weeks Cortisol ↑ Blood plasma Person‐Le Ruyet et al., 2008S. sal 30 10 weeks Cortisol ↑ Blood plasma Liu et al., 2015S. fon 120 1 month FBP1, fructose‐1,6‐bisphosphatase ↑ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 20, 25, 30 2 months G6PD, glucose‐6‐phosphate dehydogenase ↑ Kidney Aksakal et al., 2011S. fon 120 1 month G6PD ↓ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 30 2 months G6PD ↓ Liver, muscle, gill Aksakal et al., 2011S. fon 120 1 month GK, glycerol kinase ↑ Liver Vijayan et al., 1990S. fon 120 1 month Glucose ↓ Blood plasma Vijayan et al., 1990O. myk 45 1 month Glucose ↑ Blood plasma Yarahmadi et al., 2014S. fon 120 1 month Glycogen ↓ Liver Vijayan et al., 1990S. fon 120 1 month GPD1, glycerol‐3‐phosphate dehydrogenase 1 ↑ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 25, 30 2 months GR, glutathione reductase ↓ Liver, muscle, gill Aksakal et al., 2011S. fon 120 1 month HADH, hydroxyacyl‐CoA dehydrogenase ↑ Liver Vijayan et al., 1990S. fon 120 1 month HK1, hexokinase ↓ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 25, 30 2 months HSP70, heat shock protein, 70 kDa ↑ Muscle Aksakal et al., 2011S. sal 30 10 weeks IgM, immunoglobulin M ↓ Blood Liu et al., 2015S. sal 30 10 weeks Maleic dialdehyde ↑ Blood plasma Liu et al., 2015S. fon 120 1 month PFKM, phosphofructokinase ↑ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 20, 25, 30 2 months PGD, phosphogluconate dehydrogenase ↑ Kidney Aksakal et al., 2011O. myk 25, 30 2 months PGD ↓ Liver, muscle, gill Aksakal et al., 2011O. myk 45 1 month Triglyceride ↓ Blood plasma Yarahmadi et al., 2014
Widersprüchliche Biomarker in Lachsfischen
03
Diskussion
25
Lachsfisch‐Art
Besatzdichte[kg/m3]
Dauer des Experiments
Potenzieller Stressor Regu‐lation
Gewebe Referenz
O. myk 40, 80 9 months Fin damage ↑ Dorsal, caudal, pectoral fin North et al., 2006
O. myk 75, 120 84 days Fin damage ↑ Dorsal, pectoral fin Person‐Le Ruyet et al., 2008S. sal 30 10 weeks ALP, alkaline phosphatase ↑ Blood Liu et al., 2015O. myk 45 1 month Cholesterol ↓ Blood plasma Yarahmadi et al., 2014O. myk 40, 80 9 months Cortisol ↓ Blood plasma North et al., 2006O. myk 120 2 weeks Cortisol ↑ Blood plasma Person‐Le Ruyet et al., 2008S. sal 30 10 weeks Cortisol ↑ Blood plasma Liu et al., 2015S. fon 120 1 month FBP1, fructose‐1,6‐bisphosphatase ↑ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 20, 25, 30 2 months G6PD, glucose‐6‐phosphate dehydogenase ↑ Kidney Aksakal et al., 2011S. fon 120 1 month G6PD ↓ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 30 2 months G6PD ↓ Liver, muscle, gill Aksakal et al., 2011S. fon 120 1 month GK, glycerol kinase ↑ Liver Vijayan et al., 1990S. fon 120 1 month Glucose ↓ Blood plasma Vijayan et al., 1990O. myk 45 1 month Glucose ↑ Blood plasma Yarahmadi et al., 2014S. fon 120 1 month Glycogen ↓ Liver Vijayan et al., 1990S. fon 120 1 month GPD1, glycerol‐3‐phosphate dehydrogenase 1 ↑ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 25, 30 2 months GR, glutathione reductase ↓ Liver, muscle, gill Aksakal et al., 2011S. fon 120 1 month HADH, hydroxyacyl‐CoA dehydrogenase ↑ Liver Vijayan et al., 1990S. fon 120 1 month HK1, hexokinase ↓ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 25, 30 2 months HSP70, heat shock protein, 70 kDa ↑ Muscle Aksakal et al., 2011S. sal 30 10 weeks IgM, immunoglobulin M ↓ Blood Liu et al., 2015S. sal 30 10 weeks Maleic dialdehyde ↑ Blood plasma Liu et al., 2015S. fon 120 1 month PFKM, phosphofructokinase ↑ Liver Vijayan et al., 1990O. myk 20, 25, 30 2 months PGD, phosphogluconate dehydrogenase ↑ Kidney Aksakal et al., 2011O. myk 25, 30 2 months PGD ↓ Liver, muscle, gill Aksakal et al., 2011O. myk 45 1 month Triglyceride ↓ Blood plasma Yarahmadi et al., 2014
Widersprüchliche Biomarker in Lachsfischen
03
Cortisol‐Spiegel steigt (Person‐Le Ruyet et al., 2008; Pickering & Pottinger, 1987; Pickering et al., 1991),sinkt (Leatherland & Cho, 1985; North et al., 2006; Procarione et al., 1999)oder bleibt konstant (Kebus et al., 1992; Leatherland, 1993) mit steigender Besatzdichte in Lachsfischen
Blutzucker‐Spiegel steigt (Trenzado et al., 2006; Yarahmadi et al., 2014),sinkt (Vijayan et al., 1990)oder bleibt konstant (Laidley & Leatherland, 1988; Melotti et al., 2010) mit steigender Besatzdichte in Lachsfischen
Hitze‐Schock‐Protein‐70‐mRNA‐Konzentration steigt (Aksakal et al., 2011),sinkt (Alves et al., 2010; Salas‐Leiton et al., 2010)oder bleibt konstant (Zarate & Bradley, 2003) mit steigender Besatzdichte in Lachsfischen
Diskussion
26
04
Zusammenfassung II
Schlussfolgerungen
1 ‐ Barton, 2002 (Review); 2 ‐ Barton and Schreck, 1987; 3 ‐ Jentoft et al., 2005
Besatzdichte wird als maßgeblicher Stressorin der Aquakultur betrachtet(1), der Physiologie und Tierwohl beeinträchtigt.
Dank generationenwährender Zucht ist die Stressempfänglichkeit von Regenbogenforellen recht gering (2,3).
Schnäpel sind relativ neu als Zuchtfischeetabliert (seit 1990er Jahren in Finnland) und daherwesentlich empfindlicher gegenüber Stress.
optimal für Forellenzucht: höhere Dichte > 60 kg/m3
optimal für Schnäpelzucht: geringere Dichte unter 30 kg/m3
27
05
Danke:DAN
KE!
Carsten Kühn, Ralf Bochert, Peter Luftund den Mitarbeitern der LFA‐MV
Bernd Köllner, Tomáš Korytář
Gefördert durch denEuropäischen Fischereifondsund das Ministerium fürLandwirtschaft, Umwelt und VerbraucherschutzMecklenburg‐Vorpommern
Leibniz-Institut für Nutztierbiologie FBN
Wilhelm-Stahl-Allee 218196 Dummerstorf
05
DANKE!
Danke für Ihre Aufmerksamkeit!