Download - Merck Colunas HPLC
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MERCK NO MUNDO 31/12/06
121_Ricany-Jazlovice, Czech Republic122_Riga, Latvia123_Rio de Janeiro, Brazil124_Riad, Saudi Arabia125_Rockland, USA126_Rome, Italy127_San Diego, USA128_Santiago de Chile, Chile129_São Luis, Brazil130_São Paulo, Brazil131_Savannah, USA132_Schaffhausen, Switzerland133_Schwalbach, Germany134_Semoy, France135_Seoul, South Korea136_Shah Alam, Malaysia137_Shanghai, China138_Singapore, Singapore139_Sofia, Bulgaria140_Spittal, Austria141_Stockholm, Sweden142_Sydney, Australia143_Taipeh, Taiwan144_Taloja, India145_Tallin, Estonia146_Taoyuan, Taiwan147_Tokyo, Japan148_Tunbridge Wells, United Kingdom149_Unterschleissheim, Germany150_Vantaa, Finland151_Vienna, Austria152_Wilna, Lithuania153_Wadeville, South Africa154_Warsaw, Poland155_West Drayton, United Kingdom156_Zagreb, Croatia157_Zug, Switzerland
81_London, United Kingdom82_Lorenskog, Norway83_Lyon, France84_Madison, USA85_Madrid, Spain 86_Mailand, Italy87_Makati-Stadt, Philippines88_Manlleu, Spain 89_Martillac, France90_Mainz, Germany91_Meyzieu, France92_Milwaukee, USA93_Mississauga, Canada94_Modderfontein, South Africa95_Mollet del Vallés, Spain96_Monaco, Monaco97_Montevideo, Uruguay98_Moscow, Russia99_Mumbai, India100_Napa, USA101_Ness-Ziona, Israel102_Netanya, Israel103_Newport, United Kingdom104_Norwood, USA105_Nottingham, United Kingdom106_Oakville, Canada107_Onahama, Japan108_Osaka, Japan109_Oslo, Norway110_Overijse, Belgium111_Palmerston North, New Zealand112_Panama City, Panama113_Paris, France114_Poole, United Kingdom115_Potters Bar, United Kingdom116_Prague, Czech Republic117_Pyongtaek-Shi, South Korea118_Quetta, Pakistan119_Quito, Ecuador120_Reinbek, Germany
41_Durham, USA42_Espoo, Finland43_Mexico City, Mexico44_Etobicoke, Canada45_Feltham, United Kingdom46_Fontenay-sous-Bois, France47_Fourways, South Africa48_Frankfurt a. M., Germany49_Frederiksberg, Denmark50_Geneva, Switzerland51_Gernsheim, Germany52_Gibbstown, USA53_Goa, India54_Grafing, Germany55_Guangzhou, China56_Guatemala City, Guatemala57_Hanoi, Vietnam58_Hauppage, USA59_Hawthorne, USA60_Hellerup, Denmark61_Herzlia-Pituach, Israel62_Ho-Chi-Minh City, Vietnam63_Hohenbrunn, Germany64_Hong Kong, China65_Hull, United Kingdom66_Istanbul, Turkey67_Ivrea, Italy68_Jakarta, Indonesia69_Jeddah, Saudi Arabia70_Karatschi, Pakistan71_Kaunas, Latvia72_Kawagoe City, Japan73_Kilsyth, Australia74_Kuwait City, Kuwait75_Läufelfingen, Switzerland76_Lehrte, Germany77_Les Berges du Lac, Tunisia78_Lima, Peru79_Lisbon, Portugal80_Ljubljana, Slovenia
01_Altdorf, Switzerland02_Amsterdam, Netherlands03_Ardea, Italy04_Athens, Greece05_Atsugi, Japan06_Aubonne, Switzerland07_Auckland, New Zealand08_Bangkok, Thailand09_Bari, Italy10_Barra do Corda, Brazil11_Beijing, China12_Beirut, Lebanon13_Belgrad, Serbia14_Bogotá, Colombia15_Boston, USA16_Bratislava, Slovakia17_Brisbane, Australia18_Brussels, Belgium19_Bucharest, Romania20_Budapest, Hungary21_Buenos Aires, Argentina22_Bunschoten, Netherlands23_Cairo, Egypt24_Calais, France 25_Cambridge, Canada26_Caracas, Venezuela27_Carlos Spegazzini, Argentina28_Casablanca, Morocco29_Chilly-Mazarin, France30_Chilworth, United Kingdom31_Coinsins, Switzerland32_Copenhagen, Denmark33_Corsier-sur-Vevey, Switzerland34_Dammam, Saudi Arabia35_Darmstadt, Germany36_The Hague, Netherlands37_Dietikon, Switzerland38_Dijon, France39_Dubai, United Arab Emirates40_Dublin, Ireland
Page 5
Paulo FellippeDaniel Teixeira
Paulo FellippeAlexandre RosoliaDouglas ViccoGuilherme Carrara
Assistência TécnicaEquipe de Vendas
EQUIPE DE CROMATOGRAFIA
Page 6
DanielColunas HPLC
GuilhermeEquipamento / Validação
AlexandreEquipamento / Rede / Preparativa
DouglasEquipamento / Software
ASSESSORIA TÉCNICA
Page 7
•Parte 1: Introdução a HPLC e princípios básicos
•Parte 2: Seleção de colunas e fase móvel
•Parte 3: Sílica Convencional
•Parte 4: Sílica Ultra-Pura
•Parte 5: Blocos monolíticos
CONTEÚDO DO TREINAMENTO
Page 8
ParteParteParteParte 1 : 1 : 1 : 1 :
IntroduIntroduIntroduIntroduçççção a HPLC e ão a HPLC e ão a HPLC e ão a HPLC e
PrincPrincPrincPrincíííípios Bpios Bpios Bpios Báááásicossicossicossicos
Page 12
Por que separam?
Amarelo é APOLAR: tem mais afinidade pela FASE MÓVEL e elui primeiro
Vermelho é POUCO POLAR: tem menos afinidade pela FASE MÓVEL e elui depois
Azul é POLAR: tem mais afinidade pela FASE ESTACIONÁRIA e elui por último
Fase Estacionária Polar (Sílica)Fase Móvel Apolar (Hexano)
AZ V AM
CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL
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mecanismo:
Retenção por interação da fase estacionária polar com a parte polar da molécula da amostra.
Fase estacionária:
SiO2, Al2O3, -NH2, -CN, -Diol, -NO2
Fase Móvel:
heptano, hexano, ciclohexano, dioxano, metanol
método:
Separação de componentes não polares para médio polares (Hidrocarbonetos e ácidos carboxílicos)
O
OSi
O
H
O
SiO
O
OO
2CH
SiO
O
OO
H
H
H
O
FASE NORMAL
Page 14
Por que separam?
Azul é POLAR: tem mais afinidade pela FASE MÓVEL e elui primeiro
Vermelho é POUCO APOLAR: tem menos afinidade pela FASE MÓVEL e elui depois
Amarelo é APOLAR: tem mais afinidade pela FASE ESTACIONÁRIA e elui por último
Fase Estacionária Apolar (RP18)Fase Móvel Polar (Água)
AM V AZ
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
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mecanismo:
Retenção por interação da fase estacionária não polar (cadeia de hidrocarbonetos) com a fase não polar da molécula da amostra.
Fase estacionária:
n-octadecil (RP-18), n-octil (RP-8), etil (RP-2), Fenil, -NH2, -CN, -Diol, Polimeros hidrofobicos
Fase móvel:
metanol ou acetonitrila / água ou tampão, THF ou dioxano.
H2O
H2O
H2O
CH3OH
CH3OH
2CH OH
O
O
SiO HO
SiO
O
O
O Si
3CH
3CH
SiO
O
O
O Si
3CH
3CH
FASE REVERSA
Page 16
POLAR APOLAR
Água - Metanol - Acetonitrila - Acetona - THF - Hexano
POLARIDADE DA FASE MÓVEL
Page 17
POLAR APOLAR
Sílica – DIOL – NH2 – CN – RP8 – RPselectB – RP18
POLARIDADE DA FASE ESTACIONÁRIA
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Fase Normal Fase Reversa
Polaridade da f.e. � alta � baixa
polaridade da fase móvel � baixa-média � média-alta
ordem de eluição da amostra � menos polar primeiro � mais polar primeiro
Aumento da retenção por
Fase Normal Fase Reversa
� Decréscimo da polaridade da FM � Aumento da polaridade da FM
� Aumento da polaridade da molécula da amostra � Decréscimo da polaridade damolécula da amostra
CARACTERIZAÇÃO
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ParteParteParteParte 2 :2 :2 :2 :
SeleSeleSeleSeleçççção de colunas e ão de colunas e ão de colunas e ão de colunas e
fase mfase mfase mfase móóóóvel vel vel vel
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Terceira Geração (1990): Purospher®
- quase livre de metais pesados (< 5 ppm). Partículas esféricas.
Quarta Geração (2000): Purospher® STAR- partículas esféricas de 3 µm e 5 µm, maior potencial
Primeira Geração (1970): LiChrosorb®
- a primeira coluna para HPLC; partículas irregulares; 1ª fase reversaRP18
Segunda Geração (1980): LiChrospher®, Superspher®
- partículas esféricas de 4 e 5 µm com seletividade otimizada
DESENVOLVIMENTO DE FASES PARTICULADAS
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FaseFase ReversaReversa::
modificação: RP-8, RP-select B, RP-18, -CN, -Diol, -NH2
Estrutura: LiChrosorb®, LiChrospher®, Superspher®, Purospher®,
Purospher® STAR, Chromolith®.
FaseFase Normal:Normal:
modificação: Si, -Diol, -CN, -NH2
Estrutura: LiChrosorb®, LiChrospher®, Superspher®, Purospher®
STAR , Chromolith®.
TIPOS DE RECHEIO
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LiChrosorb®
LiChrospher®
Superspher®
Purospher®
Purospher® STAR
esférico
irregular
Chromolith® monolítico
Tamanho de partícula
ESTRUTURA DO RECHEIO
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Diâmetro
(mm)
Com
pri
men
to (
mm
)
LiChroCART
man
uC
AR
T
Pré-coluna
Hibar
DIMENSÕES FÍSICAS
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• Adaptação do fluxo de trabalho:
4.6mm (1 ml/min) para 4.0mm (x ml/min):
(2.3)2/ (2)2= 1/x 5.29/4= 1/x 5.29x= 4 x= 0.75 ml/min
Economia de 25% de solvente por minuto com separações equivalentes!
INFLUÊNCIA DO DIÂMETRO INTERNO
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O acoplador manu-CART® “4” é utilizado em colunas com 2 mm, 3 mm, 4 mm e 4.6 mm de diâmetro interno.
Os cartuchos podem ter250 mm, 150 mm, 125 mm e 75 mm de comprimento.
É utilizado para pré-colunas de 4-4 e 10-2.
HOLDER MANU-CART
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Montando sem a pré-coluna:
1. Coloque a rosca no cartucho
2. Fixe as duas partes da trava voltadas paradentro e as envolva com a rosca
3. Rosqueie o conector de tubulação
Montando com pré-coluna:
1. Coloque a rosca no cartucho
2. Fixe as partes da trava voltadas para fora
3. Coloque a pré-coluna neste espaço vazioformado
4. Rosqueie o conector de tubulação
MONTANDO UM MANU-CART
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A fase móvel interage físico-quimicamente com as substâncias presentes na amostra e com o enchimento da coluna, assim influenciando de forma decisiva na separação.
Recomendações:• Água usada deve ter alto grau de pureza, grau HPLC tipo LiChrosolv® (vendida pela Merck em embalagens de 1 L), ou água ultra-purificada por equipamentos (EasyPure RT VWR).
• A leitura de resistividade indica somente o teor de íons. Para medir o teor de orgânicos
na água podemos utilizar a técnica de TOC (carbono orgânico total) e eliminá-los com o
uso de equipamentos de purificação com luz UV (oxida orgânicos a CO2 e H2O).
• Não utilizar reagentes de grau técnico, p/síntese, resíduos de pesticidas, p/análise, ou UV em análises com gradiente.• Solventes grau HPLC.
• A maioria dos problemas de análise e com o equipamento tem origem na fase móvel. Porém... Coluna e Equipamento são sempre culpados!
A FASE MÓVEL
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• Água destilada é inadequada.
• Água deve ser grau HPLC.
• Livre de bactérias, utilizando uma filtração de 0,2 µm (brevundimonas diminuta).
• Resistividade de pelo menos 18 megohm/cm.
• Teor de orgânicos < que 20 ppb
• Para evitar o entupimento do filtro de 2µm basta a membrana de 0,45µm.
FILTRAÇÃO DA FASE
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• Membranas de ésteres de celulose usadas na microbiologia servem
somente para filtração de água.
• Membranas de PTFE e celulose regenerada são compatíveis com a
maioria dos solventes orgânicos e com água.
MEMBRANAS DE FILTRAÇÃO
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Relação de Transparência
• Quando a fase móvel não é muito
transparente, diminui a
sensibilidade (pois o detector
precisa subtrair o sinal para zerar a
absorbância) e aumenta o ruído.
• Offset: Indica o quanto o detector
teve que compensar a absorbância
da fase móvel para poder zerar a
linha de base; enfim indica a
qualidade da fase móvel
(transparência).
TRANSPARÊNCIA DA FASE MÓVEL
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Fases móveis saturadas com ar podem resultar em bolhas ou problemas nabomba, noise, drift, assim como outros problemas relacionados ao detector.
0
20
40
60
80
100
120
Aquecimento
Hélio
Vácuo
Ultrassom
OBS: Aquecimento é o modo mais
eficiente de remoção de gases dissolvidos,
mas é inconveniente.
Purga com He é eficiente por
apenas alguns minutos.
Vácuo é menos eficiente, mas
pelo menor custo é usado por muitos.
GASES DISSOLVIDOS
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ParteParteParteParte 3333 : : : :
SSSSíííílica Convencionallica Convencionallica Convencionallica Convencional
Page 33
Terceira Geração (1990): Purospher®
- quase livre de metais pesados (< 5 ppm). Partículas esféricas.
Quarta Geração (2000): Purospher® STAR- partículas esféricas de 3 µm e 5 µm, maior potencial.
Primeira Geração (1970): LiChrosorb®
- a primeira coluna para HPLC; partículas irregulares; 1ª fase reversaRP18.
Segunda Geração (1980): LiChrospher®, Superspher®
- partículas esféricas de 4 e 5 µm com seletividade otimizada.
FASES ESTACIONÁRIAS PARA HPLC
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Sorbents Particlesize(µm)
Poresize(Å)
Porevolume(ml/g)
Spec.surface
area(m2/g)
% C Surfacecoverage(µmol/m2)
Efficiency (N/m)
LiChrosorb® RP-8 5, 10 100 1,0 300 9,5 3,4 55.000, 20.000LiChrosorb® RP-select B 5, 10 60 0,75 300 11,4 4,21 55.000, 20.000LiChrosorb® RP-18 5, 10 100 1,0 300 16,2 3,0 55.000, 20.000LiChrospher® RP-8 5, 10 100 1,25 350 12,5 4,04 55.000, 25.000LiChrospher® RP-8e 5, 10 100 1,25 350 13,0 4,44 55.000, 25.000LiChrospher® RP-select B 5, 10 60 0,9 360 11,5 3,55 55.000, 25.000LiChrospher® RP-18 5, 10 100 1,25 350 21,0 3,61 55.000, 20.000LiChrospher® RP-18e 5, 10 100 1,25 350 21,6 4,09 55.000, 20.000Superspher® RP-8 4 60 1,25 350 12,5 4,04 100.000Superspher® RP-8e 4 60 1,25 350 13,0 4,44 100.000Superspher® RP-select B 4 60 0,9 360 11,5 3,55 100.000Superspher® RP-18 4 100 1,25 350 21,0 3,61 100.000Superspher® RP-18e 4 100 1,25 350 21,6 4,09 100.000
Especificações
SÍLICA GEL MODIFICADA PARA FASE REVERSA
Page 36
Eluent: Methanol / 0.01M phosphate buffer pH 3.0 (2:98, v/v) + 2 ml/l triethylamine
Flow rate: 2 ml/minDetection: UV 270 nmSample: 1. Ascorbic acid;
2. Nicotinic acid; 3. Pyridoxol hydrochloride; 4. Niacin; 5. Thiamin hydrochloride
Eluent: Acetonitrile / Water (70:30)Flow rate: 2 ml/minDetection: UV 220 nmSample: 1. 4,4-DDOH
2. α-Endosulphan 3. 4,4-DDM 4. Heptachlor5. p,p-DDT6. o,p-DDT7. Aldrin
Eluent: Acetonitrile / Water (75:25)Flow rate: 1 ml/minDetection: UV 254 nmSample: 1. Benzene
2. Naphthline3. Fluoren4. Anthracen5. Benzanthracen
Vitaminas
1
2
3
4 5
14 min
Pesticidas1
2
3
45 6
7
14 min
Aromáticos
1
2
3
4
5
14 min
TAMPÃO? TRIETILAMINA?
Page 37
HA A- H+
+ B H+
+
BH+
Compostos Iônicos: Molécula orgânica que contém um ou mais grupos funcionais capazes de comportar-se como ácido ou base na faixa de pH correspondente.
Ácidos ou Bases Fortes: são compostos que ionizam-se completamente na faixa de pH correspondente.
DEFINIÇÕES
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Plotagem em forma de S.
Quando um ácido (HA) ou base (B) ioniza, torna-se muito menos hidrofóbico (mais hidrofílico). Como resultado, sua retenção em fase reversa reduz de 10 a 20 vezes.
Ponto central: pH = pKa, metade dos compostos ionizados.
pKa ± 1.5: toda mudança em retenção com origem no pH ocorre nesta faixa.
pH < 2.5 ou pH > 5.5: composto estácompletamente ionizado ou completamente molecular, e a retenção não altera muito nesta faixa.
99 % BH+
99 % B
FUNÇÃO DE PKA E PH
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Curva de dissociação do ácido benzóico (pKa = 4.2).
Assim, recomenda-se que o pH esteja pelo menos +/- 1 unidade fora do pKa.
Quanto mais afastados estes valores, menores serão os efeitos de pequenas mudanças de composição de fase móvel na retenção.
DISSOCIAÇÃO DE ÁCIDO
Page 41
OH
SiO
SiOSi
OSiO
OH
OH
OH
OH
X Si
CH3
CH3
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
C6H13
OH
SiO
SiO
SiO
SiO
O
OH
O
OH
SiCH3
C18H37
CH3
SiCH3
C18H37
CH3
SiCH3 CH3
CH3
OH
SiO
SiOSi
OSiO
O
O
O
O
SiCH3
CH3
Si
CH3
CH3
Si
CH3
CH3
CH3
Endcapping
Modificação monofuncional
Endcapped
MODIFICAÇÃO MONOFUNCIONAL DE SIO2
“ODS-1”
Page 42
1. Thiourea t0
2. Aniline basic3. Phenol acidic4. 2,3 – Dihydroxynaphthalene chelating5. 4 - Ethylaniline basic6. Diethylphthalate neutral7. N, N – Dimethylaniline basic8. Toluene neutral9. Ethylbenzene neutral
Chromatographic Conditions:
Column:
LiChrospher
RP18e
4 mm x 250 mm
Mobile Phase:
Methanol/Water
58/42 (v/v)
Flow rate:
1.0 mL/min
Temperature:
40°C
Detection:
UV 254nm
TESTE ENGELHARDT
Page 43
Eluent: Methanol / 0.05 M phosphate buffer pH 4.8 (50/50, v/v)
Flow rate: 1ml/minDetection: UV 254 nmSample: 1. Anilin 6. N,N-Dimethylaniline
2. Phenol 7. Toluol3. o-Toloidine 8. Benzoeic acid4. m-Toloidine methylester5. p-Toloidine 9. Ethylbenzene
Eluent: Acetonitrile / Water (75/25, v/v)Flow rate: 1 ml/minDetection: UV 254 nmSample: 1. Benzene
2. Naphthalin3. Fluorene4. Anthracen5. Benzanthracen
Teste Engelhardt
12
3,4,5
6
30 min
Eluent: Methanol / 0.7 mM acetic acidr(2/100, v/v)
Flow rate: 1 ml/minDetection: UV 260 nmSample: 1. Iso nicotinic acid
2. Nicotinic acid3. Iso nicotinic acid amide4. Nicotinic acid amide
1
23
4
5
30 min
Ácido nicotínico + derivados Aromáticos1
2
3
4
30 min
7
8
9
1
RP-8 CONVENCIONAL COM LAVAGEM ÁCIDA
Page 44
Separação de medicamentos (com eluente ácido)
Eluent: Acetonitrile / 0.05 M phosphate buffer pH 4.8 (20/80, g/g)
Flow rate: 1ml/minDetection: UV 220 nmSample: 1. Barbituric acid
2. Codeine phosphate3. Atropinium sulfate4. Papaverine5. Noscapinium chloride6. Diphenhydramine
Eluent: Acetonitrile / phosphate buffer pH 2.3(31.2/86, g/g)
Flow rate: 1 ml/minDetection: UV 220 nmSample: 1. Diphenhydramine
2. MPPH3. Diazepam
Medicamentos
1
2
3
6
30 min
Eluent: Acetonitrile / 0.02 M KH2PO4 pH 4.7 (25/75, v/v)
Flow rate: 2 ml/minDetection: UV 220 nmSample: 1. Atenolol
2. Metaprolol3. Bisoprolol4. Propranolol
1
2
3
30 min
betabloqueadores DMD-Test1
2
3
4
30 min
4
5
1
1 13
RP-8 CONVENCIONAL COM LAVAGEM ÁCIDA
Page 45
ParteParteParteParte 4444 : : : :
SSSSíííílica Ultralica Ultralica Ultralica Ultra----PuraPuraPuraPura
Page 46
SiOSiO22(Na, K, Fe)
[-Si (OH)2 - O -Si (OH)2- O -]n
M2O - nSiO2
Tipo A
M= Na, K, Fe
- Si - O - Si - O -O
- Si - O - Si - O -O
n
SiOSiO22
Tipo B
- Si - O - Si - O -O
- Si - O - Si - O -O
n
Si (OC2H5)4
[-Si (OC2H5)2 - O -Si (OC2H5)2 - O -]n
Método Convencional Método Otimizado
PRODUÇÃO DE SÍLICA GEL
Page 47
TeorTeor de de metaismetais em em µµg/Lg/L
Sódio Cálcio Magnésio Ferro Alumínio
LiChrosorb® 340-400 1300 160-220 20-25 15-20
LiChrospher® 150-250 6-10 4-6 20-40 75-140
Purospher® 1 1 1 3 1Purospher® STAR
DIFERENÇAS
Page 48
Si O H
Si O H
vicinal
SiO H
O Hgeminal
SiO H livreNa +
SiO-
-Fe
2+SiO-
SiO Si Me
OSi
OOO O O
OH
OH OH
OH
Si SiO O SiOSi
O
OH
Mat
rix
Grupos silanolÍons metálicos
SiO
Impurezas metálicas da sílica – pH > 3,0
H
H
H
INFLUÊNCIA DOS METAIS
Page 49
O
O
OH
OH
OH
Purpurin
O
O
OH
OH
Quinizarin
Chromatographic conditions:
Mobile phase: Methanol / 20 mM Phosphate buffer
pH 3,0; 75:25 (v/v)Flow rate: 1.0 ml/minDetection: UV 254 nmTemperature: 30 °CSample: 1.) Purpurin
2.) Quinizarin
Purospher® STAR RP-18 e
RP-18 convencional
0 5 10
0 5 10
1.
2.
2.
AGENTES QUELANTES
Page 50
Modificação bifuncional de SiO2
OH
SiO
SiOSi
OSiO
OH
OH
OH
OH
X SiX
CH3
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
C6H13
OH
Si
O
CH3
OH
SiO
SiOSi
OSiO
O
O
O Si
CH3
Si
CH3
SiO
OSi
CH3
OSi
CH3
OHO
SiCH3
OH
Modificação bifuncional
OTIMIZAÇÃO DA MODIFICAÇÃO FUNCIONAL
“ODS-2”
Page 51
1.
400 20
RP-18 convencional
Piridina (1)
N CH3N
2-Metilpiridina (2)
Chromatographic Conditions:Mobile phase: Methanol / Water
55:45 (v/v)Flow rate: 1.0 ml/minDetection: UV 254 nmTemperature: 35 °C
0 20 40
1
2
Purospher® RP-18 e
INFLUÊNCIA DA DESATIVAÇÃO
Page 52
Column:LiChroCART® 125-4 Purospher® RP-18 e, 5 µm
Mobile phase:Methanol / 0.02 M Phosphate buffer pH 7.6 40:60 (v/v)
Flow rate: 0.5 ml/min
Detection: UV 254 nm
Temperature: 30 °C
Sample: 1.) Uracil2.) Procainamide3.) N - Acetylprocainamide
Aplicação
0 7,5 15
1
2
3
0 7,5 15
1
2
3
Purospher RP-18e
Sílica RP-18 tipo A
PROCAINAMIDAS
Page 53
0
1
12 24 min
2
3
4
5
6
78
9
1. Thiourea t0
2. Aniline basic3. Phenol acidic4. 2,3 – Dihydroxynaphthalene chelating5. 4 - Ethylaniline basic6. Diethylphthalate neutral7. N, N – Dimethylaniline basic8. Toluene neutral9. Ethylbenzene neutral
Chromatographic Conditions:
Column:
Purospher
RP18e
4 mm x 125 mm
Mobile Phase:
Methanol/Water
55/45 (v/v)
Flow rate:
1.0 mL/min
Temperature:
ambient
Detection:
UV 254nm
TESTE ENGELHARDT
Page 55
Purospher STAR HPLC Columns- vantagens e comparação com sorbentesclássicos
QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS
Page 56
Terceira Geração (1990): Purospher®
- quase livre de metais pesados (< 5 ppm). Partículas esféricas.- Excelente simetria de picos.
Quarta Geração (2000): Purospher® STAR- partículas esféricas de 3 µm e 5 µm, maior eficiência de separação.- Seletividade “completa”- Maior estabilidade de pH: 1.5 a 10.5.
Primeira Geração (1970): LiChrosorb®
- a primeira coluna para HPLC; partículas irregulares; 1ª fase reversaRP18.
Segunda Geração (1980): LiChrospher®, Superspher®
- partículas esféricas de 4 e 5 µm com seletividade otimizada.
QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS
Page 57
Caracterização cromatográficaModificação monomérica e polimérica dos silanóis
QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS
“ODS-3”
Page 58
• As colunas a base de sílica normal resistem a um pH entre 2-7,5.
• Abaixo do limite de pH, ocorre hidrólise dos silanóis desativados.
• Acima do limite de pH, temos a solubilidade da sílica.
Purospher - 2.0 a 7.5Purospher Star - 1.5 a 10.5
QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS
Page 59
A: k‘ (Pentyl benzene)
9.59
B: α (Pentyl-/ Butyl benzene)1.51
C: α (Triphenylene/ o-Terphenyl)1.63
D: α (Caffeine/ Phenol)0.44
E: α (Benzylamine/ Phenol; pH7.6) 0.23
F: α (Benzylamine/ Phenol; pH2.7) 0.02
9,0
1,6
6,0
3,01,5
1,4
2,4
1,8
1,2
0,2
0,0
0,4
0,8
0,6
0,3
0,0
0,6
1,0
A
B
C
D
E
F
Seletividade Estérica (C)
Capacidade(A)
Capacidade dos silanóis (D)
Capacidade de troca iônica (E,F)
Hidrofobicidade(B)
Teste de Tanaka
QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS
Page 60
0
10
B
A
C
D
E
F
Purospher® STAR RP-18e, 5µm
Competitor-S
0
10
B
A
C
D
E
F
0
10
B
A
C
D
E
F
0
10
B
A
C
D
E
F
Competitor-Z
Competitor-L Competitor-N
0
10
B
A
C
D
E
F
Competitor-D
0
10
B
A
C
D
E
F
0
10
B
A
C
D
E
F
Competitor-P
Competitor-I
9,0
1,6
6,0
3,01,5
1,4
2,4
1,8
1,2
0,2
0,0
0,4
0,8
0,6
0,3
0,0
0,6
1,0
A
B
C
D
E
F
QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS
Page 62
Colunas de 3µm para separações rápidas com alta performance.Tocoferóis
Mobile phase: Methanol / Water 95:5 (v/v)Flow rate: 1.0 ml/minDetection: UV 280 nmTemperature: 40°CSample: δ - Tocopherol (1), β - Tocopherol (2), α - Tocopherol (3), α - Tocopherol Acetate (4)
0,0 5.0 10.0
1
2
3
4
0,0 15.0 30,0
1
2
3
4
LiChroCART® 55-4 Purospher® STAR RP-18e, 3 µm LiChroCART® 250-4 Purospher® RP-18e, 5 µm
QUARTA GERAÇÃO DE COLUNAS
Page 64
ParteParteParteParte 5555 : : : :
Blocos MonolBlocos MonolBlocos MonolBlocos Monolííííticosticosticosticos
Page 66
1.51463.0001 Chromolith Flash RP-18e (25 x 4.6 mm)1.51450.0001 Chromolith SpeedROD RP-18e (50 x 4.6 mm)1.02129.0001 Chromolith Performance RP-18e (100 x 4.6 mm)
BLOCO MONOLÍTICO
Page 67
Vista de secção axial do bloco
monolítico
Macroporos: 2µµµµmMesoporos: 13 nm
Estrutura porosa bimodal definida
BLOCO MONOLÍTICO
Page 71
• Tipo de sílica: Alta pureza
• Tamanho da partícula: bloco monolítico
• Tamanho do macroporo: 2 µm
• Tamanho do mesoporo: 130 Å (13 nm)
• Área Superficial: 300 m2/g
• Volume de poro: 1 ml/g
• Modificação: RP-18 endcapped
• % de Carbono: 18 %
• Cobertura Superficial: 3.6 mmol/m2
• Estabilidade de pH: 2 – 7.5
• Porosidade Total: >81%
BLOCO MONOLÍTICO
Page 72
Chromolith® Performance
Chromolith® X colunas de material particulado
0
50
100
150
200
250
0 2 4 6 8
Fluxo (mL/ min)
Ret
ropr
essã
o of
erec
ida
(bar
)
Coluna X: 5µµµµmColuna S: 5µµµµmColuna Z: 5µµµµm
BLOCO MONOLÍTICO
Page 74
1 mL/min - 17 bar
5 mL/min - 85 bar
5
1
2
43
9 mL/min - 153 bar
Chromolith® Performance RP-18e100 mm x 4.6 mm
5 ß-Bloqueadores
Mobile Acetonitrile/Phase 0.1% TFA in
water (20(80; v/v)
Flow rate 1-9 ml/minDetection 222 nmSample 1. Atenolol
2. Pindolol3. Metoprolol4. Celiprolol5. Bisoprolol
BLOCO MONOLÍTICO
Page 75
1 mL/min - 17 bar
5 mL/min - 85 bar
9 mL/min - 153 bar
5
1
2
43
1
2
43 5
9 mL/min - 153 bar
12
1.50.0
BLOCO MONOLÍTICO
Page 77
Cortesia de Dr. Thomas E GundersenAS Vitas, Noruega
min0 0.1 0.2 0.3min0 0.1 0.2 0.3
To
col
Alp
ha.
toco
ph
ero
l To
col
Alp
ha.
toco
ph
ero
l
Chromolith Speed ROD 7 ml/min
Chromolith Speed ROD 10 ml/min
BLOCO MONOLÍTICO
Page 78
1. Pressão muito menor = análises mais rápidas
2. Comprimento da coluna não é limitado pela pressão
BLOCO MONOLÍTICO
Page 79
Column Chromolith SpeedROD RP-18e50-4.6mm
Mobile A: Acetonitrilephase B: WaterGradient Time/min %A %B
0,0 10 903,0 50 504,5 50 50
Flow rate 4 mL/minDetection UV 220 nmTemp. ambientInj.Volume 10 µLSample 1. Prednisolone
2. Cortisone3. Nortestosterone4. Estradiol5. Testosterone6. Corticosterone7. Estrone8. Progesterone
0,0 2,0 4,0
1
23
4
5
6
78
min
Picos mal resolvidos???
BLOCO MONOLÍTICO
Page 80
Column 2 colunasChromolith Performance RP-18e100-4.6mm
Mobile A: Acetonitrilephase B: WaterGradient Time/min %A %B
0,0 20 807,0 90 10
Flow rate 3 mL/minDetection UV 220 nmTemp. ambientInj.Volume 10 µLSample 1. Prednisolone
2. Cortisone3. Nortestosterone4. Estradiol5. Testosterone6. Corticosterone7. Estrone8. Progesterone
0,0 3,5 7,0
1
2 3
4
5
6
7
8
min
BLOCO MONOLÍTICO
Page 81
1. Pressão muito menor = análises mais rápidas
2. Comprimento da coluna não é limitado pela pressão= melhor resolução de picos
BLOCO MONOLÍTICO
Page 83
Column Length (mm)
Back pressure (bar)
Plate Number N (Anthracene)
Chromolith Performance 1x 100 30 10.000 Chromolith Performance 2x 200 60 19.000 Chromolith Performance 3x 300 90 27.000 Chromolith Performance 4x 400 120 35.000
Chromolith Performance 5x 500 150 41.000
Particulate 5 µm Competitor X 250 320 16.000 Particulate 5 µm Competitor Z 250 210 17.500 Particulate 5 µm Competitor L 250 220 18.500
Particulate 3.5 µm Competitor X 150 330 11.500 Particulate 3.5 µm Competitor Z 150 260 14.000 Particulate 3.5 µm Competitor L 150 400 19.000
[diâmetro: 4.6 mm, fase móvel: acetonitrila/água (60/40; v/v), fluxo: 3 mL/min, temperatura: 25°C, injeção: 10 µL de antraceno (10 µg/mL)].
BLOCO MONOLÍTICO
Page 85
300 60 min
3
56
1
2
7
4
14 x Chromolith® Performance
100-4.6mm = 1.4 metro
108 000 N/coluna !!!
117 bar
1. Tiuréia, 2. benzeno, 3. tolueno, 4. Etil-, 5. propil-, 6. butil-, 7. pentilbenzeno
ACN/ Água (80/ 20; v/v)
BLOCO MONOLÍTICO
Page 86
1. Pressão muito menor = análises muito mais rápidas
2. Tamanho da coluna não limitado pela pressão= melhor resolução
3. Bloco monolítico de sílica muito resistente
BLOCO MONOLÍTICO
Page 87
1. Pressão muito menor = análises muito mais rápidas
2. Tamanho da coluna não limitado pela pressão= melhor resolução
3. Bloco monolítico de sílica muito resistente= maior vida útil
BLOCO MONOLÍTICO
Page 89
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
No. of injections
Cap
ac
ity
fac
tor
k'
Progesterone
Anthracene
[temparature: 45°C; mobile phase: acetonitrile/water (60/40; v/v); flow rate: 2 mL/min, injection volume: 10 µL]
TEMPERATURA MÁXIMA
Page 94
• “(...) No fim, tudo dá certo... Se ainda não deu certo, éporque não chegou ao fim.”
Trecho retirado de “O Encontro Marcado” (Fernando Sabino).
(11) 9940-0807
(11) 3346-8558
MUITO OBRIGADO PELA ATENÇÃO!