Merck Colunas HPLC

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<p>Avanos Tecnolgicos</p> <p>Colunas HPLCPage 1</p> <p>MERCK EM DARMSTADT 300.000 QUILOS/ANO DE SLICA PARA CROMATOGRAFIA</p> <p>Page 2</p> <p>MERCK NO MUNDO 31/12/06</p> <p>01_Altdorf, Switzerland 02_Amsterdam, Netherlands 03_Ardea, Italy 04_Athens, Greece 05_Atsugi, Japan 06_Aubonne, Switzerland 07_Auckland, New Zealand 08_Bangkok, Thailand 09_Bari, Italy 10_Barra do Corda, Brazil 11_Beijing, China 12_Beirut, Lebanon 13_Belgrad, Serbia 14_Bogot, Colombia 15_Boston, USA 16_Bratislava, Slovakia 17_Brisbane, Australia 18_Brussels, Belgium 19_Bucharest, Romania 20_Budapest, Hungary 21_Buenos Aires, Argentina 22_Bunschoten, Netherlands 23_Cairo, Egypt 24_Calais, France 25_Cambridge, Canada 26_Caracas, Venezuela 27_Carlos Spegazzini, Argentina 28_Casablanca, Morocco 29_Chilly-Mazarin, France 30_Chilworth, United Kingdom 31_Coinsins, Switzerland 32_Copenhagen, Denmark 33_Corsier-sur-Vevey, Switzerland 34_Dammam, Saudi Arabia 35_Darmstadt, Germany 36_The Hague, Netherlands 37_Dietikon, Switzerland 38_Dijon, France 39_Dubai, United Arab Emirates 40_Dublin, Ireland</p> <p>41_Durham, USA 42_Espoo, Finland 43_Mexico City, Mexico 44_Etobicoke, Canada 45_Feltham, United Kingdom 46_Fontenay-sous-Bois, France 47_Fourways, South Africa 48_Frankfurt a. M., Germany 49_Frederiksberg, Denmark 50_Geneva, Switzerland 51_Gernsheim, Germany 52_Gibbstown, USA 53_Goa, India 54_Grafing, Germany 55_Guangzhou, China 56_Guatemala City, Guatemala 57_Hanoi, Vietnam 58_Hauppage, USA 59_Hawthorne, USA 60_Hellerup, Denmark 61_Herzlia-Pituach, Israel 62_Ho-Chi-Minh City, Vietnam 63_Hohenbrunn, Germany 64_Hong Kong, China 65_Hull, United Kingdom 66_Istanbul, Turkey 67_Ivrea, Italy 68_Jakarta, Indonesia 69_Jeddah, Saudi Arabia 70_Karatschi, Pakistan 71_Kaunas, Latvia 72_Kawagoe City, Japan 73_Kilsyth, Australia 74_Kuwait City, Kuwait 75_Lufelfingen, Switzerland 76_Lehrte, Germany 77_Les Berges du Lac, Tunisia 78_Lima, Peru 79_Lisbon, Portugal 80_Ljubljana, Slovenia</p> <p>81_London, United Kingdom 82_Lorenskog, Norway 83_Lyon, France 84_Madison, USA 85_Madrid, Spain 86_Mailand, Italy 87_Makati-Stadt, Philippines 88_Manlleu, Spain 89_Martillac, France 90_Mainz, Germany 91_Meyzieu, France 92_Milwaukee, USA 93_Mississauga, Canada 94_Modderfontein, South Africa 95_Mollet del Valls, Spain 96_Monaco, Monaco 97_Montevideo, Uruguay 98_Moscow, Russia 99_Mumbai, India 100_Napa, USA 101_Ness-Ziona, Israel 102_Netanya, Israel 103_Newport, United Kingdom 104_Norwood, USA 105_Nottingham, United Kingdom 106_Oakville, Canada 107_Onahama, Japan 108_Osaka, Japan 109_Oslo, Norway 110_Overijse, Belgium 111_Palmerston North, New Zealand 112_Panama City, Panama 113_Paris, France 114_Poole, United Kingdom 115_Potters Bar, United Kingdom 116_Prague, Czech Republic 117_Pyongtaek-Shi, South Korea 118_Quetta, Pakistan 119_Quito, Ecuador 120_Reinbek, Germany</p> <p>121_Ricany-Jazlovice, Czech Republic 122_Riga, Latvia 123_Rio de Janeiro, Brazil 124_Riad, Saudi Arabia 125_Rockland, USA 126_Rome, Italy 127_San Diego, USA 128_Santiago de Chile, Chile 129_So Luis, Brazil 130_So Paulo, Brazil 131_Savannah, USA 132_Schaffhausen, Switzerland 133_Schwalbach, Germany 134_Semoy, France 135_Seoul, South Korea 136_Shah Alam, Malaysia 137_Shanghai, China 138_Singapore, Singapore 139_Sofia, Bulgaria 140_Spittal, Austria 141_Stockholm, Sweden 142_Sydney, Australia 143_Taipeh, Taiwan 144_Taloja, India 145_Tallin, Estonia 146_Taoyuan, Taiwan 147_Tokyo, Japan 148_Tunbridge Wells, United Kingdom 149_Unterschleissheim, Germany 150_Vantaa, Finland 151_Vienna, Austria 152_Wilna, Lithuania 153_Wadeville, South Africa 154_Warsaw, Poland 155_West Drayton, United Kingdom 156_Zagreb, Croatia 157_Zug, Switzerland</p> <p>Page 3</p> <p>UNIVERSO MERCK</p> <p>Page 4</p> <p>EQUIPE DE CROMATOGRAFIA Assistncia Tcnica Equipe de Vendas Paulo Fellippe Daniel Teixeira Paulo Fellippe Alexandre Rosolia Douglas Vicco Guilherme Carrara</p> <p>Page 5</p> <p>ASSESSORIA TCNICA Guilherme Equipamento / Validao Alexandre Equipamento / Rede / Preparativa</p> <p>Daniel Colunas HPLC Douglas Equipamento / Software</p> <p>Page 6</p> <p>CONTEDO DO TREINAMENTO</p> <p>Parte 1: Parte 2: Parte 3: Parte 4: Parte 5:</p> <p>Introduo a HPLC e princpios bsicos Seleo de colunas e fase mvel Slica Convencional Slica Ultra-Pura Blocos monolticos</p> <p>Page 7</p> <p>Parte 1 : Introdu Introduo a HPLC e Princ B Princpios Bsicos</p> <p>Page 8</p> <p>COMO TUDO COMEOU</p> <p>Medalha Tswett, recebida pela Merck KgaA em 1980.Page 9</p> <p>A FUNO DA COLUNA</p> <p>Page 10</p> <p>A ADSORO QUMICA</p> <p>Page 11</p> <p>CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL</p> <p>Fase Estacionria Fase Mvel</p> <p>Polar (Slica) Apolar (Hexano)</p> <p>AZ</p> <p>V</p> <p>AM</p> <p>Por que separam?Amarelo APOLAR: tem mais afinidade pela FASE MVEL e elui primeiro Vermelho POUCO POLAR: tem menos afinidade pela FASE MVEL e elui depois Azul POLAR: tem mais afinidade pela FASE ESTACIONRIA e elui por ltimoPage 12</p> <p>FASE NORMAL</p> <p>mecanismo: Reteno por interao da fase estacionria polar com a parte polar da molcula da amostra. Fase estacionria: SiO2, Al2O3, -NH2, -CN, -Diol, -NO2 Fase Mvel: heptano, hexano, ciclohexano, dioxano, metanol mtodo: Separao de componentes no polares para mdio polares (Hidrocarbonetos e cidos carboxlicos) O O O O Si O H O O O Si O H Si O H O CH 2</p> <p>H</p> <p>Page 13</p> <p>CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA</p> <p>Fase Estacionria Fase Mvel</p> <p>Apolar (RP18) Polar (gua)</p> <p>AM</p> <p>V</p> <p>AZ</p> <p>Por que separam?Azul POLAR: tem mais afinidade pela FASE MVEL e elui primeiro Vermelho POUCO APOLAR: tem menos afinidade pela FASE MVEL e elui depois Amarelo APOLAR: tem mais afinidade pela FASE ESTACIONRIA e elui por ltimoPage 14</p> <p>FASE REVERSA</p> <p>mecanismo: Reteno por interao da fase estacionria no polar (cadeia de hidrocarbonetos) com a fase no polar da molcula da amostra. Fase estacionria: n-octadecil (RP-18), n-octil (RP-8), etil (RP-2), Fenil, -NH2, CN, -Diol, Polimeros hidrofobicos Fase mvel: metanol ou acetonitrila / gua ou tampo, THF ou dioxano.O O O O Si O O O O Si O Si O CH Si CH H CH Si CH 3 3 3 3</p> <p>H2O</p> <p>CH3OH</p> <p>H2O</p> <p>CH</p> <p>2</p> <p>OH</p> <p>CH3OH</p> <p>H2O</p> <p>Page 15</p> <p>POLARIDADE DA FASE MVEL</p> <p>POLAR</p> <p>APOLAR</p> <p>gua - Metanol - Acetonitrila - Acetona - THF - Hexano</p> <p>Page 16</p> <p>POLARIDADE DA FASE ESTACIONRIA</p> <p>POLAR</p> <p>APOLAR</p> <p>Slica DIOL NH2 CN RP8 RPselectB RP18</p> <p>Page 17</p> <p>CARACTERIZAOFase Normal Polaridade da f.e. polaridade da fase mvel ordem de eluio da amostra alta baixa-mdia menos polar primeiro Fase Reversa baixa mdia-alta mais polar primeiro</p> <p>Aumento da reteno porFase Normal Decrscimo da polaridade da FM Aumento da polaridade da molcula da amostra Fase Reversa Aumento da polaridade da FM Decrscimo da polaridade da molcula da amostraPage 18</p> <p>Parte 2 : Seleo de colunas e Sele fase mvel m</p> <p>Page 19</p> <p>DESENVOLVIMENTO DE FASES PARTICULADASPrimeira Gerao (1970): LiChrosorb- a primeira coluna para HPLC; partculas irregulares; 1 fase reversa RP18</p> <p>Segunda Gerao (1980): LiChrospher,</p> <p>Superspher</p> <p>- partculas esfricas de 4 e 5 m com seletividade otimizada</p> <p>Terceira Gerao (1990): Purospher- quase livre de metais pesados (&lt; 5 ppm). Partculas esfricas.</p> <p>Quarta Gerao (2000): Purospher STAR- partculas esfricas de 3 m e 5 m, maior potencial</p> <p>Page 20</p> <p>TIPOS DE RECHEIO</p> <p>Fase Reversa:modificao: RP-8, RP-select B, RP-18, -CN, -Diol, -NH2 Estrutura: LiChrosorb, LiChrospher, Superspher, Purospher, Purospher STAR, Chromolith.</p> <p>Fase Normal:modificao: Si, -Diol, -CN, -NH2 Estrutura: LiChrosorb, LiChrospher, Superspher, Purospher STAR , Chromolith.</p> <p>Page 21</p> <p>ESTRUTURA DO RECHEIO</p> <p>LiChrosorb</p> <p>irregular</p> <p>Tamanho de partcula LiChrospher Superspher Purospher Purospher STAR</p> <p>esfrico</p> <p>Chromolith</p> <p>monolticoPage 22</p> <p>DIMENSES FSICAS</p> <p>Hibar</p> <p>LiChroCARTPage 23</p> <p>Comprimento (mm)</p> <p>Pr-coluna manuCART</p> <p>Dimetro (mm)</p> <p>INFLUNCIA DO DIMETRO INTERNO Adaptao do fluxo de trabalho: 4.6mm (1 ml/min) para 4.0mm (x ml/min): (2.3)2/ (2)2= 1/x 5.29/4= 1/x 5.29x= 4 x= 0.75 ml/min Economia de 25% de solvente por minuto com separaes equivalentes!</p> <p>Page 24</p> <p>HOLDER MANU-CART O acoplador manuCART 4 utilizado em colunas com 2 mm, 3 mm, 4 mm e 4.6 mm de dimetro interno. Os cartuchos podem ter 250 mm, 150 mm, 125 mm e 75 mm de comprimento. utilizado para prcolunas de 4-4 e 10-2.</p> <p>Page 25</p> <p>MONTANDO UM MANU-CART</p> <p>Montando sem a pr-coluna: 1. Coloque a rosca no cartucho 2. Fixe as duas partes da trava voltadas para dentro e as envolva com a rosca 3. Rosqueie o conector de tubulao Montando com pr-coluna: 1. Coloque a rosca no cartucho 2. Fixe as partes da trava voltadas para fora 3. Coloque a pr-coluna neste espao vazio formado 4. Rosqueie o conector de tubulaoPage 26</p> <p>A FASE MVELA fase mvel interage fsico-quimicamente com as substncias presentes na amostra e com o enchimento da coluna, assim influenciando de forma decisiva na separao. Recomendaes: gua usada deve ter alto grau de pureza, grau HPLC tipo LiChrosolv (vendida pela Merck em embalagens de 1 L), ou gua ultra-purificada por equipamentos (EasyPure RT VWR). A leitura de resistividade indica somente o teor de ons. Para medir o teor de orgnicos na gua podemos utilizar a tcnica de TOC (carbono orgnico total) e elimin-los com o uso de equipamentos de purificao com luz UV (oxida orgnicos a CO2 e H2O). No utilizar reagentes de grau tcnico, p/sntese, resduos de pesticidas, p/anlise, ou UV em anlises com gradiente. Solventes grau HPLC. A maioria dos problemas de anlise e com o equipamento tem origem na fase mvel. Porm... Coluna e Equipamento so sempre culpados!Page 27</p> <p>FILTRAO DA FASE</p> <p>gua destilada inadequada. gua deve ser grau HPLC. Livre de bactrias, utilizando uma filtrao de 0,2 m (brevundimonas diminuta). Resistividade de pelo menos 18 megohm/cm. Teor de orgnicos &lt; que 20 ppb Para evitar o entupimento do filtro de 2m basta a membrana de 0,45m.</p> <p>Page 28</p> <p>MEMBRANAS DE FILTRAO</p> <p>Membranas de steres de celulose usadas na microbiologia servem somente para filtrao de gua. Membranas de PTFE e celulose regenerada so compatveis com a maioria dos solventes orgnicos e com gua.</p> <p>Page 29</p> <p>TRANSPARNCIA DA FASE MVEL</p> <p>Relao de Transparncia Quando a fase mvel no muito transparente, diminui a sensibilidade (pois o detector precisa subtrair o sinal para zerar a absorbncia) e aumenta o rudo. Offset: Indica o quanto o detector teve que compensar a absorbncia da fase mvel para poder zerar a linha de base; enfim indica a qualidade da fase mvel (transparncia).</p> <p>Page 30</p> <p>GASES DISSOLVIDOS</p> <p>Fases mveis saturadas com ar podem resultar em bolhas ou problemas na bomba, noise, drift, assim como outros problemas relacionados ao detector.</p> <p>120 100 80 60 40 20 0Aquecimento Hlio Vcuo Ultrassom</p> <p>OBS: Aquecimento o modo mais eficiente de remoo de gases dissolvidos, mas inconveniente. Purga com He eficiente por apenas alguns minutos. Vcuo menos eficiente, mas pelo menor custo usado por muitos.</p> <p>Page 31</p> <p>Parte 3 : Slica Convencional</p> <p>Page 32</p> <p>FASES ESTACIONRIAS PARA HPLCPrimeira Gerao (1970): LiChrosorb- a primeira coluna para HPLC; partculas irregulares; 1 fase reversa RP18.</p> <p>Segunda Gerao (1980): LiChrospher, Superspher- partculas esfricas de 4 e 5 m com seletividade otimizada.</p> <p>Terceira Gerao (1990): Purospher- quase livre de metais pesados (&lt; 5 ppm). Partculas esfricas.</p> <p>Quarta Gerao (2000): Purospher STAR- partculas esfricas de 3 m e 5 m, maior potencial.</p> <p>Page 33</p> <p>ESTRUTURA DOS MATERIAIS</p> <p>10 </p> <p>LiChrosorb </p> <p>1</p> <p>10 </p> <p>LiChrospher Superspher </p> <p>1</p> <p>Page 34</p> <p>SLICA GEL MODIFICADA PARA FASE REVERSA EspecificaesSorbents Particle size (m) 5, 10 5, 10 5, 10 5, 10 5, 10 5, 10 5, 10 5, 10 4 4 4 4 4 Pore Pore Spec. size volume surface () (ml/g) area (m2/g) 100 1,0 300 60 0,75 300 100 1,0 300 100 1,25 350 100 1,25 350 60 0,9 360 100 1,25 350 100 1,25 350 60 1,25 350 60 1,25 350 60 0,9 360 100 1,25 350 100 1,25 350 %C Surface Efficiency (N/m) coverage (mol/m2) 3,4 4,21 3,0 4,04 4,44 3,55 3,61 4,09 4,04 4,44 3,55 3,61 4,09 55.000, 20.000 55.000, 20.000 55.000, 20.000 55.000, 25.000 55.000, 25.000 55.000, 25.000 55.000, 20.000 55.000, 20.000 100.000 100.000 100.000 100.000 100.000</p> <p>LiChrosorb RP-8 LiChrosorb RP-select B LiChrosorb RP-18 LiChrospher RP-8 LiChrospher RP-8e LiChrospher RP-select B LiChrospher RP-18 LiChrospher RP-18e Superspher RP-8 Superspher RP-8e Superspher RP-select B Superspher RP-18 Superspher RP-18e</p> <p>9,5 11,4 16,2 12,5 13,0 11,5 21,0 21,6 12,5 13,0 11,5 21,0 21,6</p> <p>Page 35</p> <p>TAMPO? TRIETILAMINA?</p> <p>2 3</p> <p>Vitaminas</p> <p>1</p> <p>Pesticidas</p> <p>Aromticos 3</p> <p>3 1 4 5 4 2</p> <p>1</p> <p>4</p> <p>5 6 714 min</p> <p>2 5</p> <p>14 min</p> <p>14 min</p> <p>Eluent:</p> <p>Methanol / 0.01M phosphate buffer pH 3.0 (2:98, v/v) + 2 ml/l triethylamine Flow rate: 2 ml/min Detection: UV 270 nm Sample: 1. Ascorbic acid; 2. Nicotinic acid; 3. Pyridoxol hydrochloride; 4. Niacin; 5. Thiamin hydrochloride</p> <p>Eluent: Flow rate: Detection: Sample:</p> <p>Acetonitrile / Water (70:30) 2 ml/min UV 220 nm 1. 4,4-DDOH 2. -Endosulphan 3. 4,4-DDM 4. Heptachlor 5. p,p-DDT 6. o,p-DDT 7. Aldrin</p> <p>Eluent: Flow rate: Detection: Sample:</p> <p>Acetonitrile / Water (75:25) 1 ml/min UV 254 nm 1. Benzene 2. Naphthline 3. Fluoren 4. Anthracen 5. Benzanthracen</p> <p>Page 36</p> <p>DEFINIES</p> <p>Compostos Inicos: Molcula orgnica que contm um ou mais grupos funcionais capazes de comportar-se como cido ou base na faixa de pH correspondente. cidos ou Bases Fortes: so compostos que ionizam-se completamente na faixa de pH correspondente.</p> <p>HA B + H+</p> <p>A- + H+ BH+</p> <p>Page 37</p> <p>FUNO DE PKA E PH 99 % BPlotagem em forma de S. Quando um cido (HA) ou base (B) ioniza, torna-se muito menos hidrofbico (mais hidroflico). Como resultado, sua reteno em fase reversa reduz de 10 a 20 vezes.</p> <p>Ponto central: pH = pKa, metade dos compostos ionizados. pKa 1.5: toda mudana em reteno com origem no pH ocorre nesta faixa. pH &lt; 2.5 ou pH &gt; 5.5: composto est completamente ionizado ou completamente molecular, e a reteno no altera muito nesta faixa.</p> <p>99 % BH+</p> <p>Page 38</p> <p>DISSOCIAO DE CIDO</p> <p>Curva de dissociao do cido benzico (pKa = 4.2).</p> <p>Assim, recomenda-se que o pH esteja pelo menos +/- 1 unidade fora do pKa.</p> <p>Quanto mais afastados estes valores, menores sero os efeitos de pequenas mudanas de composio de fase mvel na reteno.</p> <p>Page 39</p> <p>TAMPO PARA FASE REVERSA</p> <p>Page 40</p> <p>MODIFICAO MONOFUNCIONAL DE SIO2</p> <p>OH Si OH O Si O Si O Si O OH OH OH CH3 CH2</p> <p>X</p> <p>CH2 CH2 CH2</p> <p>CH2</p> <p>CH2 CH2 CH2</p> <p>CH2 CH2</p> <p>Si CH3</p> <p>CH2 C6H13 CH2</p> <p>Modificao monofuncional</p> <p>O H Si</p> <p>O</p> <p>C3 H O Si C18H37 C3 H</p> <p>O H</p> <p>CH3</p> <p>Endcapping</p> <p>H Si O O O O Si Si O C3 H Si C18H37 C3 H</p> <p>O Si Si CH3 CH3 O Si CH3 Si O CH3 O Si O O Si O O CH3 Si</p> <p>Endcapped</p> <p>O H</p> <p>CH3 CH3</p> <p>Si CH3 C3 H</p> <p>ODS-1Page 41</p> <p>TESTE ENGELHARDT1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Thiourea Aniline Phenol 2,3 Dihydroxynaphthalene 4 - Ethylaniline Diethylphthalate N, N Dimethylaniline Toluene Ethylbenzene</p> <p>t0basic acidic chelating basic neutral basic neutral neutral Chromatographic Conditions:Column: LiChrospher RP18e 4 mm x 250 mm Mobile Phase: Methanol/Water 58/42 (v/v) Flow rate: 1.0 mL/min Temperature: 40 C Detection: UV 254nm</p> <p>Page 42</p> <p>RP-8...</p>