LAMPIRAN
Lampiran 1. Road-map Penelitian
Persiapan Penelitian
Persiapan wadah dan ikan uji
Bak ukuran 40x30x30cm sebanyak 4 buah dicuci,
didesinfeksi, dan dikeringkan
Diletakkan secara acak dan diberi label
Diisi air dengan padat tebar ikan kakap putih 10 ekor/bak.
Adaptasi ikan selama 7 hari
Pencampuran pakan dengan jintan hitam
Pakan buatan ditimbang sebanyak 1 kg.
Serbuk jintan hitam dicampurkan pada pakan, ditambahkan
putih telur sebagai binder dan diaduk.
Pellet dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.
Pelaksanaan Penelitian
Pemberian pakan yang dicampur
imunostimulan
Pakan diberikan selama 42 hari pemeliharaan
Frekuensi 2x/hari, pukul 08.00 dan 16.00 WIB
Uji Tantang
Uji tantang pada hari ke-38
Penyuntikan filtrat VNN ke tubuh semua ikan uji
secara intra peritoneal (i.p) dengan dosis 0,1 ml/ekor.
Pengambilan Darah
Pengambilan sampel darah pada hari ke- 0, 7, 14, 21
dan 4 hari setelah uji tantang
Jarum suntik dan microtube dibilasdengan EDTA 10%
Darah diambil dari 5 ekor ikan, dipilih secara acak
pada setiap bak, lalu disimpan di microtube
Parameter pengamatan
Hematologi
Hematokrit
Total Leukosit
Diferensial Leukosit
Uji Fagositosis
Kualitas Air
Suhu
pH
DO
Salinitas
Analisis Data
Deskriptif
Penyusunan Laporan
Pembuatan Filtrat VNN
Beberapa organ dari kerapu tikus yang positif terserang VNN
Organ tersebut digerus dengan mortar kemudian dimasukkan
dalam mikrotube dan ditambah PBS
Mikrotube disentrifuse dengan keepatan 12000 rpm selama
10 menit kemudian disaring dengan milipore
Filtrat disuntikkan kepada kerapu dengan dosis 0‚ 1ml/ekor
yang sehat untuk diamati gejala terserangnya VNN
Ikan yang menunjukkan gejala diambil organnya untuk dibuat
filtrat kembali dan dapat disimpan dalam freezer -81oC
SR‚ RPS dan MTD
Lampiran 2. Data Pengamatan Darah
1. Total Leukosit
Total Leukosit A1 A2 A3 A4
Pengamatan Hari ke-0 26400 27500 30800 28600
Pengamatan Hari ke-7 29700 30800 31900 33000
Pengamatan Hari ke-14 27500 34100 36300 70400
Pengamatan Hari ke-21 28600 37400 68200 77000
Pengamatan Hari ke-42 30800 66000 79200 91300
2. Diferensial Leukosit
a. Persentase Monosit
Monosit A1 A2 A3 A4
Pengamatan Hari ke-0 3 4 5 3
Pengamatan Hari ke-7 5 6 8 7
Pengamatan Hari ke-14 2 9 10 12
Pengamatan Hari ke-21 4 8 4 8
Pengamatan Hari ke-42 7 11 9 13
b. Persentase Limfosit
Limfosit A1 A2 A3 A4
Pengamatan Hari ke-0 57 59 58 56
Pengamatan Hari ke-7 58 59 64 63
Pengamatan Hari ke-14 57 63 61 60
Pengamatan Hari ke-21 54 64 59 67
Pengamatan Hari ke-42 57 70 63 74
c. Persentase Neutrofil
Neutrofil A1 A2 A3 A4
Pengamatan Hari ke-0 40 37 37 41
Pengamatan Hari ke-7 37 35 28 30
Pengamatan Hari ke-14 41 28 29 28
Pengamatan Hari ke-21 36 28 37 25
Pengamatan Hari ke-42 36 21 32 13
3. Persentase Hematokrit
Hematokrit A1 A2 A3 A4
Pengamatan Hari ke-0 46.15 36.5 33.33 35.39
Pengamatan Hari ke-7 45.93 45.38 46.51 35.72
Pengamatan Hari ke-14 48.98 41.37 48.37 42.62
Pengamatan Hari ke-21 54.54 47.1 36.36 37.16
Pengamatan Hari ke-42 66 59.61 54.71 41.92
61
Lampiran 3. Tahap Pemeriksaan Profil Darah
1. Pengambilan Darah
Jarum suntik dan
mikrotube 1,5 ml disiapkan
Dibilas dengan larutan EDTA
10% sebanyak 1/3 dari darah yang
diambil
Darah ikan diambil
melalui vena caudalis
Darah disimpan dalam
mikrotube 1,5 ml
62
Lampiran 3. Tahap Pemeriksaan Profil Darah
2. Perhitungan Total Leukosit
Kaca penutup dipasang
pada haemacytometer
Dilanjutkan dengan
menghisap larutan turk
hingga skala 11
(pengenceran 1:20)
Haemacytometer dan kaca penutupnya
dibersihkan dengan etanol
Sampel darah dihisap dengan pipet
berskala hingga skala 0,5
Pipet digoyangkan selama 3 menit
agar bercampur homogen
Empat tetesan pertama dibuang
63
Tetesan berikutnya
dimasukkan ke dalam
haemacytometer
Dibiarkan selama 3
menit agar leukosit
mengendap
Bilik hitung diletakkan di
bawah mikroskop
menggunakan perbesaran
lemah
Perhitungan dilakukan pada 4 kotak
besar haemocytometer
64
Lampiran 3. Tahap Pemeriksaan Profil Darah
3. Perhitungan Diferensial Leukosit
Diletakkan setetes darah
kerapu tikus
Kaca pemulas disentuhkan
pada tetesan darah
kemudian digeser
Kaca obyek yang telah diulas darah
dikeringanginkan dan siap diwarnai
Kaca Obyek dibersihkan dengan
etanol
Sediaan apus darah diletakkan di baki
dengan sediaan apus di sebelah atas
65
Sediaan tersebut digenangi dengan
methanol secukupnya selama 5-10 menit
Kemudian dilanjutkan untuk
digenangi dengan giemsa selama 25
menit
Dibilas dengan akuades
dan dikeringkan
Gelas obyek diamati dibawah
mikroskop dengan perbesaran kuat
Berbagai jenis leukosit dihitung sepanjang sediaan
apusan darah dan dihentikan bila jumlahnya
mencapai 100 sel
66
Lampiran 3. Tahap Pemeriksaan Profil Darah
4. Pengukuran Hematokrit
Sampel darah kerapu tikus
disiapkan
Darah disedot dengan
menggunakan tabung
hematokrit
Salah satu bagian ujung tabung
disumbat menggunakan lilin dan
diberi label
Tabung dibungkus dengan tissue dengan
cara digulungkan
67
Dimasukkan ke dalam tabung
valcon
Dimasukkan ke dalam mesin
sentrifuse pada kecepatan 3500
rpm selama 15 menit
Setelah disentrifuse tabung hematokrit diukur
menggunakan penggaris
68
Lampiran 4. Uji Aktivitas Fagositosis
Bakteri yang telah dilemahkan
dan sel darah putih kerapu tikus
dicampurkan ke dalam
microdilution plate dengan
perbandingan 1:1
Dilakukan pipeting agar homogen dan
diinkubasi selama 4 jam
Diambil sekitar 50µl kemudian
diteteskan diatas gelas obyek untuk
di ulas
Dilakukan pewarnaan menggunakan giemsa dan
diamati dibawah mikroskop
69
Lampiran 5. Uji Tantang
Filtrat VNN yang telah diisolasi dari
kerapu tikus
Dilakukan injeksi VNN terhadap kerapu tikus
sebanyak 0,1 ml secara intraperitonial
Ikan dipelihara dan diamati hingga
menunjukkan gejala terinfeksi VNN
70
Lampiran 6. Pembuatan Isolat Bakteri Vibrio alginolyticus yang Dilemahkan
Bakteri dicuci dengan PBS
sebanyak 3 kali
Divortex selama ± 1 menit
Disentrifuse pada 3000 rpm selama
15 menit
Bakteri V. alginolyticus di kultur pada media semi solid atau TSA
Bakteri dipanen dan diinkubasi dengan formalin
1‚5% selama 24 jam
Kepadatan Bakteri dihitung menggunakan standar McFarland
hingga didapat kepadatan 107 sel/ml
71
Lampiran 7. Pembuatan Isolat VNN
Beberapa organ diambil dari ikan yang
positif terinfeksi VNN
Organ tersebut digerus dengan mortar
Organ yang sudah digerus dimasukkan ke dalam
microtube dan ditambahkan dengan PBS steril 1ml
Microtube disentrifuse dengan kecepatan 12000 rpm
selama 10 menit
72
Air hasil saringan diambil
sebanyak 1 ml menggunakan
spuit
Kerapu tikus disuntikkan isolat
VNN secara intraperitonial
Hasil sentrifuse disaring menggunakan milipore
0‚45 µm dan dimasukkan kedalam microtube
Ikan dipelihara dan diamati hingga
muncul gejala klinis serangan VNN
Organ- organ ikan yang terserang VNN diambil dan
dibuat isolat yang lebih banyak untuk disimpan dalam
freezer suhu -81o C