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IMUNOLOGIA
ManualdeapoioàsSessõesLaboratoriais
2019
CarlosSinogas
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ÍNDICEPROCEDIMENTOSDESEGURANÇA.........................................................................................................................................3
Riscoquímico/radiológico/biológico.......................................................................................................................3 RegrasePlaneamento..........................................................................................................................................................4 Procedimentosgerais...........................................................................................................................................................5
REGISTOSERELATÓRIOS............................................................................................................................................................6 ANTICORPOSMONOCLONAIS....................................................................................................................................................7
Introdução.................................................................................................................................................................................7 Imunização................................................................................................................................................................................7 FusãoCelular............................................................................................................................................................................8 SeleçãoMetabólicaeSeleçãoImunológica.................................................................................................................8 ClonagemePreservaçãodasCélulasProdutoras.....................................................................................................9 CaraterizaçãoePurificaçãodeAnticorposMonoclonais......................................................................................9 EsquemageralparaaobtençãodeAnticorposMonoclonais............................................................................10
PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS..............................................................................................................................................11 1. PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES..............................................................................................................11 2. CALIBRAÇÃODEMICROPIPETAS.........................................................................................................................16 3. TESTEÀIMUNIDADENATURAL...........................................................................................................................19 4. IMUNIZAÇÃOARTIFICIAL........................................................................................................................................22 5. RECOLHADESANGUE................................................................................................................................................23 PreparaçãodoSoro.............................................................................................................................................................23 PreparaçãodeEritrócitos.................................................................................................................................................24
6. OBSERVAÇÃODECÉLULASSANGUÍNEAS(Humanas)................................................................................25 7. PURIFICAÇÃODEIMUNOGLOBULINAS–Precipitaçãodiferencial........................................................26 8. IMUNOPRECIPITAÇÃO-Qualitativa....................................................................................................................27 Testedoanel..........................................................................................................................................................................27 Testeemlâmina....................................................................................................................................................................28
9. IMUNOPRECIPITAÇÃO–Quantitativa.................................................................................................................29 Curvadeprecipitação.........................................................................................................................................................29 Nefelometria...........................................................................................................................................................................30
10. IMUNODIFUSÃO............................................................................................................................................................31 Imunodifusãosimples........................................................................................................................................................31 Imunodifusãodupla(Ouchterlony)..............................................................................................................................32
11. HEMAGLUTINAÇÃO.....................................................................................................................................................33 12. TESTEIMUNOCROMATOGRÁFICO(Rápido)...................................................................................................34 13. IMUNOELECTROFORESE..........................................................................................................................................35 14. ELISA(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay).............................................................................................36 “Checkerboard"....................................................................................................................................................................36 Teste...........................................................................................................................................................................................39 RepresentaçãoesquemáticadeumaELISA..............................................................................................................42
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PROCEDIMENTOSDESEGURANÇAOtrabalholaboratorialemImunologiaenvolvetrêstiposprincipaisderiscoqueimportaconsiderar.Oriscoquímico,oriscobiológicoeoriscoradiológico.Quasetodosospaísestêmregrasprópriasparaabordarestetipodequestõesquesecolocamàexperimentaçãolaboratorial.Tambémoslaboratóriosondeotrabalhosedesenvolveadoptampráticasapropriadasaotipodetrabalhoqueaísedesenvolve.
Nãosepretendendodiscutiremdetalheosprocedimentosdesegurançalegalmenteexigíveis,apontam-seapenasalgumasregrasgeraisepráticaslaboratoriaisaseradoptadas.
Apesardequalquerdostrêsriscosindicadoscolocaremproblemasespeciais,querequeremprecauçõesdetipodiferente,existeumconjuntodeprecauçõeseprocedimentosdesegurançaaplicáveisatodosequedeverãoserobservadosnotrabalholaboratorialdoâmbitodaimunologia.
Asregrasqueadianteselistamconstituemumquadrogeralnoqualosprocedimentosespecializados,decorrentesdassituaçõesparticularesqueseindicam,deverãoserenquadrados.
Riscoquímico/radiológico/biológicoOsprodutosquímicosempreguesnosensaiosimunológicosdistribuem-sepordiversostiposassociadosadiferentesriscosparaooperador.Quandoapropriado,osriscosconhecidosdosreagentesaempregarserãoindicados,devendoentãoseradoptadasasregrasespecíficasmaisaconselhadas,comosejaousodeluvasouóculos,trabalhoemhotte,etc.
AspráticasprevistasnoâmbitodestadisciplinanãofarãousogeneralizadodereagentesperigososoudegranderiscoconhecidoparaaSaúdeHumana.
Detodososriscosassociadoscomostrabalhosdeimunologia,omaisemotivo,quenãonecessariamenteomaissério,éaradioatividade.Aocontráriodosoutrosreagentesquímicos,oscompostosradioativos,porestefato,nãopodemservistosesãoisentosdecheiro,nãosemanifestandoosseusefeitosnoimediato.Asregrasparaamanipulaçãodeprodutosradioativossãobastantemaisrigorosasetornam-semuitomaisrestritivasaotrabalhoadesenvolver.Àsexigênciasparamanipulaçãodestesprodutosnotrabalho,acrescemprocedimentosparticularesparaaeliminaçãodosresíduosemonitorizaçãodaspessoaseambientesenvolvidos.
Ostrabalhosaexecutarnoâmbitodestadisciplinanãofarãousodereagentesououtroscompostosradioativos.
Todasasamostrasdeprodutosbiológicosdevemserconsideradaspotencialmenteinfecciosas,emparticularasquesãoprovenientesdoHomem,emqueumaeventualbarreiradeespécienatransmissãodosagentesinfecciososnãoexiste.Asoutrasespéciesanimaismaisusadasemtrabalhosdeimunologia,oscoelhos,oscaprinoseosroedores,sãomamíferosafastadosdoHomemquenãorepresentamqualquerameaçasignificativaparaaspessoasquetrabalhamnoslaboratóriosdeimunologia.
Emqualquerdoscasosconvémterpresentequeasprincipaisviasdetransmissãodeinfecçõesocorrememgolpesabertosououtrassoluçõesdecontinuidadenapeledasmãosdooperador,porpicadacomagulhascontaminadasouporinalaçãodeaerossóis.Époristoqueéfortementerecomendadoque,quandosetratedetrabalhodiretocomamostrasbiológicas,nãoexistamgolpesnasmãosdooperadorquenãotenhamsidopreviamenteprotegidoseconvenientementeimpermeabilizados.
Otrabalhoadesenvolvernaspráticasdadisciplinanãofarãousodesorosououtrosmateriaisbiológicosdeorigemhumana,casoemqueprecauçõesespeciaisteriamdesertomadasparaminimizaroriscodeassociadoaosagentesinfecciosostransmissíveispelosanguehumano,comoosagentesdaSIDAoudasHepatites.Emtodoocasoésempreaconselhávelconsiderartodososmateriaisbiológicosaempregarcomopotencialmenteinfecciososparaooperadoreadoptaraspráticasmaisadequadasaocenáriodo"piorcaso".
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AdicionalmenteháqueconsiderarqueotrabalhopráticodecorreránolaboratóriodeMicrobiologia,ondemicrorganismosdediferentestipossãomanipuladosporoutraspessoas.Apossibilidadedecontaminaçãodassuperfícieseoutrosmateriaistambémdeveráserconsiderada.
RegrasePlaneamentoParaalémdosriscosparaooperador,queatrássereferem,asexperiênciasqueserealizarãosãocertamentenovidadeparaalgunsdosestudantes,comexperiêncialaboratoriallimitadaerotinasdeboaspráticaslaboratoriaisnãoestabelecidas.Importa,porisso,prevenir.
Éboapráticaobservar,cumprirefazercumprirasregras,procedimentosecomportamentosqueseindicam:
Bata
Ousodeumabatacomprida,limpaedevidamenteajustadaaocorpoéindispensávelsemprequeseopereemlaboratório.Abataprotegeooperadoreoseuvestuáriodeeventuaisacidentes.Idealmenteabatadeveráserusadaapenasnolaboratório,sendovestidaàentradaedespidaàsaída.Destaforma,alémdeprotegeroexperimentador,abataminimizaotransportedepotenciaisagentesinfecciososparaoexteriordolaboratório.
Mãos
Àentradaeàsaídadolaboratórioéprecisolavarbemasmãoscomabundanteáguaesabão,tambémparaminimizarpotenciaiscontaminaçõescruzadas.Dependentedotipodeprodutosamanipular,ousodeluvasimpermeáveis,máscarasououtrasproteções,poderáserexigível.Mesmoquandonormalmentenãorecomendado,ousodeluvaspoderásernecessárioemsituaçõesdesoluçãodecontinuidadenapeledasmãosdooperador.
Comerebeber
Éexpressamenteproibidocomer,beber,fumar,manipularlentesdecontatoouaplicarcosméticosduranteaexecuçãodeexperiênciaslaboratoriais.Usarsemprepipetasmecânicas,nuncapipetarcomaboca.Éaconselháveladquirirohábitodemanterasmãoslongedaboca.
Bancadadetrabalho
Olocaldetrabalhodeveráestarsempredevidamentelimpo,paraoqueseimpõeprocederàlimpezadabancadaantesdeiniciadosostrabalhos,paranãopermitiracontaminaçãodasprópriasexperiênciascommicrorganismosdesessõesanteriores,edepoisdasmanipulaçõesterminadasparaminimizarapotencialpropagaçãodeagentesinfecciososcontaminantesdosmateriaisbiológicoscomqueseoperou.
Livrosecadernos
Sóépermitidolevarparaabancadaomaterialdeapoioestritamenteindispensávelàexecuçãodotrabalho,comooprotocoloexperimental,umblocodenotasouumcadernoeumlápis.Todososrestantespertencesdooperador,comopastas,casacosousacosdeverãoseracondicionadosemlocalpróprio,antesdeiniciadaaexperimentação.
Materiais
Todooequipamentoematerialdelaboratórioamovível,utilizadoduranteaexperimentação,deveráserrepostonolocalindicadodepoisdeconcluídaasuautilização.Particularmenteosmateriaisquetenhamcontatadocomamostrasdeorigembiológicadeverãoserrejeitadosemlocalpróprioparadescontaminação.
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Acidentes
Qualqueracidentedeveráserdeimediatoreportadoaoresponsávelpelasessãodetrabalho.Líquidosououtromaterialbiológico,inadvertidamentetransferidosparaforadoscontentoresaquesedestinamdeverãoserdeimediatodesinfectadoscomoapoiodoresponsável.
Planeamento
Nãoiniciarqualquerexperiênciasemoconvenienteplaneamento.Oconhecimentoecompreensãopréviosdosprocedimentosexperimentais,grelhasadequadaspararegistodosresultadoseaefetivadisponibilidadedetodososrecursosmateriaisnecessáriosconstituemelementosimportantesparaosucessodasexperiências.Otempo"perdido"numplaneamentoinicialélargamentecompensadopeloníveldaaprendizagemconseguidoepelaprevençãodanecessidadederepetiçãodeexperiênciaseventualmentebloqueadas.
ProcedimentosgeraisTodososprocedimentosdeverãoserefetuadostendoemmenteaminimizaçãodacontaminaçãodomaterialemusoeaformaçãodeaerossóisourespingos,numaperspectivadeproteçãodoprópriooperadoredeterceiros.Maisimportantequeumconjuntoderegrasaobedeceréapresençadebomsensonostrabalhosarealizar.Émuitoimportanteusaracabeçaantesdasmãos.
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REGISTOSERELATÓRIOSÉconvenienteusarumblocooucadernopararegistodetodasasocorrênciasedosresultadosdaexperimentação.Sugere-seousodecadernodelaboratório,depreferênciacomfolhasnãoamovíveis,paraquenãosejameliminadasnotasouregistosconsideradosirrelevantesnaaltura,comosucedecomfrequênciaquandosepassamosapontamentos"alimpo",masdegrandeutilidadeparaconsultafuturaparaeventualrepetiçãodaexperiência.Origorepormenordosregistosefetuadosfacilitarãoaaprendizagem,ainterpretaçãodosresultadosobtidosearedaçãoposteriordorelatóriodotrabalho.
Umqualquerrelatóriodeumaexperiêncialaboratorialdeverádocumentardeformatãocompletaquantopossíveloprocedimentoexecutadoeosresultadosobtidos.Paraalémdissodeverásertambémobjectivodorelatorredigirumdocumentocompreensívelparaoleitoresusceptíveldeapoiaraeventualrepetiçãodamesmaexperiênciaemidênticascondições.Paraaelaboraçãodosrelatóriossugerem-se,comoorientação,asseguintessecções:
Título Identificadordoconteúdodorelatório
Resumo Pequenotextodequeconstemosobjectivosalmejadoseasconclusõesobtidas
Objectivo Razãodeserdotrabalhorealizado
Introdução Dadosconhecidosquejustificamarealizaçãodaexperiênciarelatada
Palavras-chave Termosdiretamenterelacionadoscomotrabalho
Materialereagentes
Listagemexaustivadoequipamento,reagenteseoutromaterialusado
Protocoloexperimental
Marchageraldosprocedimentosaplicados.Deverãoserrelatadososprocedimentosconcretosexecutados,comreferênciaaeventuaisdesviosrelativamenteaoprocedimentorecomendado/descrito
Resultados Registodasobservaçõesefetuadasedosdadosrecolhidos
Discussão Comentáriocríticoaosresultadosobtidos
Conclusão Descriçãodocumprimentoouincumprimentodoobjectivo,decorrentedosresultadosobtidos
Notacrítica Comentárioàglobalidadedaexperiência,comrecomendaçõesparaasuarepetiçãoououtrasconsideradasadequadas
Bibliografia Referênciasconsultadasouutilizadasparaarealizaçãodotrabalho
Dependentedotipodotrabalhoexecutado,daformadorelatórioedasensibilidadedorelator,algumasdassecçõesdescritaspoderãoserfundidas,como"Resultadosediscussão"ou"Discussãoeconclusões",porexemplo
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ANTICORPOSMONOCLONAIS
IntroduçãoAnticorposmonoclonaissãoimunoglobulinashomogéneascomespecificidadedefinida,possíveisdeproduziremlargasquantidades.PodemserobtidasporimortalizaçãodelinfócitosB,clonadoseexpandidosemculturascelularescontínuas(anticorposmonoclonaispropriamenteditos)ouporrecombinaçãodeDNA,expressonoutraslinhascelulareseucarióticas(anticorposmonoclonais“engineered”).
Em1975KöhlereMilsteindescobrirameempregarampelaprimeiravezatecnologiadoshibridomas:fizeramcombinaromaterialgenéticodecélulasnormaisprodutorasdeanticorposcomodecélulasdeorigemmalignadamesmalinhagem.Iniciaramentãoumanovametodologiaquedesdeentãonãoparoudeevoluireconduziuaodesenvolvimentodatecnologiaparaaproduçãodequantidadesvirtualmenteinesgotáveisdeanticorposcomníveisdepurezanuncaantesatingidos.Trata-sedeumatecnologiadeaplicaçãohorizontalemtodasasáreascientíficasdaBiologia,cujoimpactosóécomparávelaodatecnologiadarecombinaçãodoDNA.
OsanticorpossãoproteínasproduzidasporlinfócitosB,destinadasaintervirnosprocessosdedefesaimunitáriadosorganismossuperiores:asimunoglobulinas.Têmcomoprincipalcaraterística,numaperspectivadeaplicaçãocientífica/biotecnológica,acapacidadedeseligaremaoantigénioquereconhecem.Atualmente,paraasuaobtenção,recorre-sequaseexclusivamenteàchamadatecnologiadoshibridomasparaapreparaçãodeanticorposmonoclonais.
Oshibridomassão,comoonomeindica,célulashíbridas,imortalizadasemculturadetecidos,produtorasdeanticorposmonoclonaiscomespecificidadeúnicaepré-determinadapeloprocessodasuapreparação.
Noprocessoclássicoparaaobtençãodehibridomasutilizam-secélulasdebaçodemurganhosimunizadoscomoantigénioquesepretendereconhecer.Esteslinfócitosativadossãofundidoscomcélulasdemielomadamesmaorigemanimal,mutantesnãoprodutoresdeimunoglobulinas,napresençadepolietilenoglicol.Ascélulasentãofundidassãocultivadasemmeioseletivo(contendoHAT)emcondiçõesquedeterminamapenasasobrevivênciadoshíbridosformadosentrelinfócitosecélulasdemieloma.Oshibridomascomascaraterísticaspretendidas,nomeadamentenoqueserefereàespecificidadeantigénica,taxasdeproduçãoecrescimentoetipodeimunoglobulinasãoselecionadospormétodosimuno-enzimáticosepreservadosporclonagemecongelamento.Acaraterizaçãodoanticorpoproduzidoeodesenvolvimentodoprocessoparaasuaproduçãoemlargaescaladependemdosobjectivosfinaisdoinvestigador.
ImunizaçãoOprocessodeimunizaçãodestina-seaconseguirlinfócitosBativadosparaparticiparnafusãocelular.Aespécieanimaleórgãosdondepodemserobtidos(baço,timo,nóduloslinfáticos,sangueperiférico),bemcomoosprotocolosdeimunizaçãodoanimaldependemdaorigemdoantigénio,dasuaimunogenicidadeedodestinoadaraosanticorposapreparar.
OmurganhoBalb/C,espécieanimaldereferência,éaquemaisfrequentementeéutilizadanaobtençãodeanticorposmonoclonais,porsetratardeumanimalpequeno,defácilmanutençãoemanipulaçãonolaboratório,comumsistemaimunitáriobastantebemconhecidoeparaoqualexistemdisponíveislinhascelularesdemielomaadequadasàobtençãodehibridomashistocompatíveiseenxertáveisnoanimal.
Oesquemadeimunizaçãoaadoptardependetambémdotipoeorigemdoantigénioedotipodeanticorpospretendidos.EmgeralumaadministraçãoúnicadeantigénionomurganhoconduzàobtençãodeumamaiorpercentagemdeIgMrelativamenteaIgG.Noqueserefereaoslinfócitosprodutoresespecíficosobtêm-seemmaiorabundâncianobaçonasequênciademúltiplasadministraçõesdeantigénio.Paraantigéniossolúveisdeelevadopesomolecular,éregraproceder-seaumaimunizaçãoemdosesrepetidasdeantigénio,separadasentresicercadetrêssemanasaummês.
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Aeficáciadoprocessodeimunizaçãoéavaliada2semanasapósumadasúltimasadministrações,poranálisedotítulodosorodoanimalemanticorposcapazesdereconheceroantigénio.AexpansãoclonaldoslinfócitosB,induzidapelapresençadoantigénio,determinaumaconcentraçãomáximadaquelascélulas,produtorasdeanticorposespecíficos,nobaçodoanimal2a3diasapósaadministraçãodoantigénio.
Paraoutrotipodeantigénios,previsivelmenteeliminadosdoorganismopormecanismosemqueosistemaimunitárionãodesempenhaopapelprincipal,comosãooscasosdemoléculashidrofóbicas,hidrofílicasdebaixopesomolecularoufracaantigenicidade,énecessáriorecorreràadiçãodeoutroscompostosqueiniciemarespostaimunitária(haptenos,“carriers”).
FusãoCelularAfusãoentreascélulasdeumamistura,destinadaaimortalizaroslinfócitosprodutoresdeanticorpos,podeocorrerespontaneamente,mascomumamuitobaixaprobabilidade.Paraaumentaressaprobabilidadeintroduzem-seoutrosagentesnamisturadecélulas.
Ascélulasdobaçodosanimaisimunizadossãorecolhidasemisturadascomcélulasdemieloma,damesmaespécieanimal,nãoprodutorasdeanticorposeportadorasdasmutaçõesHGPRT-ouTK-.Ascélulasdamistura,quandonapresençadeagentesfusogénicos,comoproteínasdovírusSendai,PEGoucampoeléctrico(electrofusão,electroporação),fundemosseusconteúdos,determinandooaparecimentodehíbridosintra-einterespecíficos.Aimortalizaçãodoslinfócitos,emparticularquandosetratadecélulasdeorigemhumana,podetambémserconseguidaportransformaçãocomvírustumorigénicos(EBV).
SeleçãoMetabólicaeSeleçãoImunológicaApósoprocessodefusãoobtém-seumamisturadecélulasdediversostipos:linfócitosecélulasdemielomanãointervenientesemqualquerfusão,híbridosresultantesdafusãodemaisdeumlinfócito,híbridosresultantesdafusãodemaisdeumacélulademielomaehíbridosresultantesdafusãodecélulasdemielomacomlinfócitos.Nascondiçõesdeculturasubsequentesnãosobrevivemoslinfócitosoriginaiseoshíbridosentrelinfócitos,pornãoteremcapacidadeparacresceremculturanaausênciadosconvenientesfatoresdecrescimento.Ascélulasdemielomaeoshíbridosresultantesdefusõesentreestastambémnãopoderãosobreviver,dadoque,apesardepossuíremacapacidadedecresceremcultura,sãoportadorasdemutaçõesdasenzimasHGPRToudaTKe,napresençadeaminopterina,nãoconseguemsintetizarosprecursoresparaasíntesedoDNA.Sópodemcresceremculturaoshíbridosentrecélulasdemielomaelinfócitosquehajamadquiridoacapacidadedecresceremcultura,dosprimeiros,eacapacidadedesintetizarosprecursoresdoDNAatravésdasviasmetabólicasqueutilizamaHGPRTeaTK,provenientesdoslinfócitos.Sãooshibridomas.
Osmétodosimunológicosparaadeteção,quantificaçãoecaraterizaçãodasimunoglobulinasincluemaimunoprecipitação,ensaiosimuno-enzimáticos,imuno-radiométricosedeimuno-fluorescênciaecromatografias.Particularmentenoqueserefereàseleçãoinicialdoshibridomasresultantesdafusãoimpõe-seaadopçãodemétodosderápidaexecução,aplicáveisacentenasdeamostrasedecustosreduzidos.
Deentreoshibridomasresultantes,háqueidentificaraslinhascelularesprodutorasdeanticorposespecíficosdoantigénio.OsmétodosmaisfrequentementeutilizadosnestaseleçãoimunológicasãoaELISA("EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay"),RIA("RadioImmunoAssay"),IRMA("ImmunoRadio-MetricAssay"ou"Sandwich")eImuno-fluorescência.Ométododeprimeiraescolha,aELISA,baseia-senumafixaçãodoantigénioaumsuportesólidoseguidadoreconhecimentodestepelosanticorposproduzidospeloshibridomas.Apresençadosanticorposespecíficoséreveladaporoutrosanticorpos,específicosdaespécie(domíniosconstantesdasimunoglobulinas),econjugadoscomenzimascapazesdealterarascaraterísticascromáticasdeumsubstrato.Sãoselecionadasasculturascujossobrenadantesapresentemreaçãoenzimáticapositivanoensaio.
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IMUNOLOGIA2018/19 9
ClonagemePreservaçãodasCélulasProdutorasUmavezidentificadasasculturasprodutorasdosanticorposconvenientesháquepreservá-lase,frequentemente,caraterizá-lasantesdasuautilizaçãoparaaproduçãodosanticorposmonoclonais.
Apartirdomomentoemquepelaseleçãoimunológicasãodetectadoshibridomasprodutores,estasculturasdeverãosercongeladas,mesmoantesdaclonagem,paraevitarasuaperda.
Sendooshibridomascélulaspoliploides,têmumatendêncianaturalparasegregaroscromossomasquepossuememexcesso,razãopelaqualseriaconvenientemanterumapressãoseletivaparapreservaroDNAresponsávelpelasíntesedosanticorpos.Nãoexistindoqualquerantibióticooumetabolitoquepossaexercerestapressãoseletiva,amanutençãodaexpressãoéconseguidaatravésdaclonagem,processoparaisolamentoeexpansãodeumaculturaapartirdeumasócélula.
Ométodomaisexpeditoparaaclonagemdoshibridomaséaclonagempordiluiçãolimite,emqueaculturaédiluídaedistribuídapormicroplacasemconcentraçõesinferioresaumacélulaporpoço.Outrosmétodos,comoaclonagememagarosesãomenosfrequentementeutilizadosporquemaislaboriosos.
Oshibridomas,talcomooutrascélulaseucarióticasestabelecidasemcultura,podemconservar-seporcongelaçãoemazotolíquido,ondesemantémviáveisduranteváriosanos.
CaraterizaçãoePurificaçãodeAnticorposMonoclonaisAcaraterizaçãodoanticorpoobtidoconstituiumrequisitoessencialparaasuaconvenienteutilização.
Aisotipagem,queconsistenadeterminaçãodotipodeimunoglobulinapresente,obtêm-seporreaçãoimunológicacomanticorposdeoutraespécieanimalespecíficosdosdiferentestiposdecadeiasconstantesdemurganho(IgA,IgM,IgG1,IgG2,...).
Aespecificidadeepitópicarelativadediferentesmonoclonaiscontraomesmoantigéniodetermina-seporensaioimunológicoemquecomumaquantidadefixadadeantigéniosefazemreagirmisturasdeanticorposemdiferentespercentagensrelativas.Doisanticorposreconhecerãodiferentesepitoposseumamisturadosdoisoriginaumsinalsuperioraodequalquerdelesisolado,nasaturaçãodoantigénio.
Tambémaafinidaderelativadeumanticorpoparaoantigéniopoderáserrelevante.Determina-sefazendoreagiroantigénio,radioativamentemarcado,comumadeterminadaquantidadedeanticorpo.Oantigéniofixadoporunidadedemassadoanticorporefleteaafinidadeentreosdois,nascondiçõesexperimentaisusadas.Estaquantidadedeantigénio,quandoreferidaaunidadedevolumedosobrenadantedaculturadorespectivohibridoma,constituiumindicativodaprodutividadedestacultura.
Oconhecimentodascaraterísticasfísico-químicas,comoamassamoleculare/ouopontoisoeléctricopoderãoserimportantesparaodesenhodorespectivoprocessodepurificação.
Partindodelinhascelularesdehibridomasprodutores,osanticorposmonoclonaispodemobter-seporculturadecélulas“invitro”epurificaçãoapartirdosobrenadante(comrendimentosdaordemdos100µg/mL)ouapartirdeascitesesorosdeanimaisportadoresdetumoresinduzidospelainjeçãodosrespectivoshibridomas(rendimentosdaordemdos2mg/mL).
Sãométodosdeeleiçãoparaapurificaçãodeanticorposmonoclonaisascromatografiasdeafinidade,nomeadamentecomaProteínaASepharose,sesetratardeimunoglobulinastipoG,oucomoantigéniofixadoaumsuportesólido.
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IMUNOLOGIA2018/19 10
EsquemageralparaaobtençãodeAnticorposMonoclonais
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PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS
1. PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES
Introdução
Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhosexperimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.
Porqueseobservacomfrequênciaalgumainabilidadeinicialdosestudantesparaamanipulaçãoadequadadasmicropipetas,paraumraciocíniooperacionalsobrediluições(emespecialquandoexpressasempotênciasde10)enasformasdeprepararsoluçõestituladas,introduz-seestetrabalhopreliminar.
Materialereagentes
¾ Soluçãosaturadadeazul-de-metileno¾ Águadestilada¾ Micropipetasdiversas¾ Microtubos¾ Espectrofotómetro
Procedimento(porgrupo)
Diluiçõesdecimais
1. Marquemicrotubosde1a82. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8Solvente(mL) 0 1,35 1,35 1,35 1,35 1,35 1,35 1,5Corante(mL) 1,5 0,15 0 0 0 0 0 0Soluçãoprecedente(mL) 0 0 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0Diluição(10x)
3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõesa600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,
namesmacuvete.Últimaamostra:controlo).
Diluiçõescentesimal
1. Marquetubosdeensaiode1a62. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:
Tubo 1 2 3 4 5 6Solvente(µL) 0 1500 1500 1500 1500 1500Corante(µL) 1500 15 0 0 0 0Soluçãoprecedente(µL) 0 0 15 15 15 0Diluição(10x)
3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos
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5. Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,namesmacuvete.Últimaamostra:controlo)
Diluiçõesdetrêsemtrês
1. Marquetubosdeensaiode1a10)2. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Solvente(mL) 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1,5Corante(mL) 1,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0Soluçãoprecedente(mL) 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0Diluição(10x)
3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Registeasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamais
diluídaparaamaisconcentrada,namesmacuvete)
Diluiçãoúnica(TPC)
¾ Considerandosotrabalhosanteriores,desenheumprotocoloparaarealizaçãodetesteadiluiçõesmilesimais.¾ Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenofaçaoscálculosparaprocederàpreparaçãode5mLde
cadaumadasseguintessoluções,indicandoosvolumesausar:a. Diluiçãode5x102b. Diluiçãode5x10-2
Preparaçãodesoluções(TPC)
¾ Pretendendo-seobter100mLdecadaumadassoluçõesqueselistam,indiqueasquantidadesdeprodutosamisturarparaasuapreparaçãonolaboratório:
a. NaOH0,1Nb. SO4H20,1Nc. NaCl0,1Md. NaCl100mMe. Glicerol10%(fórmulaC3H8O3)f. Glucose10%(fórmulaC6H12O6)g. Etanol70%(fórmulaC2H6O2)
Pesosatómicos:H=1;C=12;O=16;Na=23;S=32;Cl=35.
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RegistodeObservaçõeseResultados
PIPETAGENSEDILUIÇÕES
Operador: Data: ____/____/____
Diluiçõesdecimais
Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações
1 2 3 4 5 6 7 8
Diluiçõescentesimais
Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações
1 2 3 4 5 6
Diluiçõesdetrêsemtrês Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentração
calculada Observações
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
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Gráfico
Observações:
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SOLUÇÕES
Operador: Data: ____/____/____
Componentes Peso/volume
Diluição5X102
Diluição5X10-2
NaOH0,1N(100mL)
H2SO40,1N(100mL)
NaCl0,1M(100mL)
NaCl100mM(100mL)
Glicerol10%(100mL)
Glucose10%(100mL)
Etanol70%(100mL)
Observações
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2. CALIBRAÇÃODEMICROPIPETAS
Introdução
Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhosexperimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.
Autilizaçãofrequentedaspipetasdisponíveisnolaboratórioporestudantessemexperiêncialevaautilizaçõesincorretasdonderesultaquealgunsdosvolumesindicadosnosvisoresnãocoincidamcomasquantidadesmedidas.Nestecontextoéimportanteconheceraformadecalibrarasmicropipetasausar.
Materialereagentes
¾ Águadestilada¾ Micropipetasdiversasepontas¾ Microtubos,coposdeboémia¾ Balançadeprecisão
Procedimento(porgrupo)
Ajustedevolume(5µL)
1. Utilizeumapipetade20µL2. Ajusteoindicadordevolumeaos5µL3. Pipete,nabalança,paratubocalibrado5µL4. Observeopesoindicado5. Sesuperioraos5mg,reduzaovolumeindicadonapipetaerepita3.e4.6. Seinferioraos5mg,aumenteovolumeindicadonapipetaerepita3.e4.7. Quandoaquantidadedeáguadestiladapesadaforde5mg,anoteaindicaçãodevolumeque,na
pipeta,correspondeaos5µL.
Ajustedevolume(50µL)
1. Utilizeumapipetade200µL2. Repitaospassosdoprocedimentoanterior(de1.a7.)paraamassade50mg(correspondentea
50µL)
Ajustedevolume(500µL)
1. Utilizeumapipetade1000µL2. Repitaospassosdoprocedimentoinicial(de1.a7.)paraamassade500mg(correspondentea
500µL)
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Calibraçãodepipeta(200µL)
1. Meça,nabalança,umvolumede10µLparacopotarado.Anoteopeso2. Repitamaisduasvezesestadeterminação3. Repitaospontos1e2paraosvolumesde20µL;50µL;100µL;150µLe200µL4. Façamédiasdecadaconjuntodetrêspesagenshomólogas5. Desenheográficodecalibraçãodapipeta,fazendocorresponderosvolumesindicadosnovisor
comospesosavaliados.
NB
Osprocedimentosparaoutrosvolumesououtraspipetassãoidênticos.
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RegistodeobservaçõeseResultados
CALIBRAÇÃODEPIPETAS
Operador: Data: ____/____/____
Calibraçãodepipeta20 µL
Volume Peso1 Peso2 Peso3 Média Observações
1µL
2µL
5µL
10µL
15µL
20µL
Calibraçãodepipeta200µL
Volume Peso1 Peso2 Peso3 Média Observações
10µL
20µL
50µL
100µL
150µL
200µL
Calibraçãodepipeta1000µL
Volume Peso1 Peso2 Peso3 Média Observações
50µL
100µL
200µL
500µL
750µL
1000
µL
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3. TESTEÀIMUNIDADENATURAL
Materialereagentes
¾ SuspensãodeMicrococos¾ Sorofisiológicoestéril¾ Lisozimapó¾ Espectrofotómetroetubos¾ Pipetasemicropipetas¾ Placasdepetricomagarnutritivo
Procedimentoexperimental
TesteàLisozima(1grupoporturma)1. Preparar8diluiçõesdecimaisdelisozima,emmicrotubos:
Tubo L0 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10Lisozimapó(mg) 100 Amostraanterior(µL) - 100 100 100 100 100 100 100 100 100 -Sorofisiológico(µL) 1000 900 900 900 900 900 900 900 900 900 900Diluição 2. Rejeitar100µLdadiluiçãodotuboL93. Adicionaracadatubo2mLdesuspensãobacteriana4. Homogeneizarcompipeta,evitandoespuma5. Lereregistarosvaloresdaabsorvênciadecadaamostraa540nm(tempo0)6. Incubara37ºC7. Repetirleituradoespectrofotómetroacada10minutos.8. Expressarosresultadosemgráfico.
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TesteàSaliva(restantesgruposdaturma)1. Recolhercercade2.5mLdesalivaemplacadepetriesterilizada2. Preparardiluiçõesdecimaisdesaliva,emmicrotubos:Tubo S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6Saliva(µL) 1000 Amostraanterior(µL) - 100 100 100 100 100 -Sorofisiológico(µL) - 900 900 900 900 900 900Diluição 3. Rejeitar100µLdadiluiçãodotuboS54. Adicionaracadatubo2mLdesuspensãobacteriana5. Homogeneizarcompipeta,evitandoespuma6. Avaliarmortebacterianaporcultura:
a. Tomarparaeppendorfsnovos100µLdostubospar(S0;S2;S4;S6);b. Incubara37ºCdurante30minutosc. Inocularporespalhamentoemplacadeagarnutritivo;d. Incubara37ºCdurante,pelomenosumanoite;e. Contarcolónias
7. Avaliaramortebacterianapordensitometria:a. Lereregistarosvaloresdaabsorvênciadecadadiluição(S0;S1;S2;S3;S4;S5;S6)a
540nm(tempo0)b. Incubara37ºCc. Repetirleituradoespectrofotómetroacada10minutos.
8. Expressarresultadosemgráfico.9. Avaliaraconcentraçãorelativadebactericidinasnasalivaporcomparaçãocomocontrolopositivo
delisozima
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IMUNOLOGIA2018/19 21
Registoderesultados
TESTEÀIMUNIDADENATURAL
LISOZIMA Absorvência
Tempo(min)
L0 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10
0
10
20
30
40
SALIVA Absorvência
Tempo(min)
S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6
0
10
20
30
40
Crescimentobacteriano(nºcolónias)
S0 S2 S4 S6
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 22
4. IMUNIZAÇÃOARTIFICIAL
Materialereagentes
¾ Galinhas¾ Excipienteoleoso(AdjuvantedeFreund,Parafinalíquida)¾ Soluçãodeantigénio(BSAa10mg/mLemSF)¾ Seringaseagulhashipodérmicas
Procedimentoexperimental
Preparaçãodaemulsãoparaimunização
1. Adicionar5mLdesoluçãodeantigénioemtubodeensaio2. Adicionar5mLdeadjuvanteoleoso3. Misturarvigorosamente,comauxíliodeumaseringacomagulha4. Verificaroestadodaemulsãocomumagotasobreasuperfíciedeáguafria
(nãodevemisturar-sedeimediato)
Imunização
Dia1 Recolheramostradesangueparateste
Injetar1mLdeemulsãoporviasubcutâneaemdiversospontos(4a6picadas)
Dia15 Recolheramostradesangueparateste
Dia30 Recolheramostradesangueparateste
Repetirainjeçãodamesmaquantidadedeantigénioemulsionadoemadjuvanteincompleto
Dia45 Recolhersangueparaanálise
Dia60 Recolhersangueparaanálise
Registartodososdadosdeidentificaçãodosanimais,volumesdesangueesoro,datasdasoperaçõeseoutrasocorrências
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 23
5. RECOLHADESANGUE
PreparaçãodoSoro
Materialereagentes.
¾ Animaisimunizadose/ounãoimunizados(galinhas)¾ Seringasestéreis¾ Centrífuga¾ Microtubos¾ Azidadesódioa10%
Procedimentoexperimental
1. Picaraveiajugularouaveiadaasaetomaramostradesangueporaspiração(máximo2mL)2. Compensaroanimalcomsorofisiológicoestéril,senecessário3. Marcarotuboehomogeneizarosanguerecolhido.4. Aguardarde20a30minutosatemperaturaambiente5. Arrefecernofrigoríficodurante1hora6. Centrifugar4000rpmdurante10min7. Pipetaraté1mLdesoroporcadamicrotubodevidamenteidentificado8. Adicionarazidadesódioa0,02%final(sock100X)9. Conservarcongeladoa-20ºC.
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 24
PreparaçãodeEritrócitos
MaterialeReagentes
¾ Soluçãoanticoagulante(ACD):o Acidocítrico–4.0g/Lo Citratodesódio–22,6g/Lo D-Glucose–22.0g/L)o Autoclavar
¾ PBS-A¾ Seringas(2,5mL)eagulhaspararecolhadesangue¾ Centrífugadebaixarotação
Procedimentoexperimental
1. Pipetar300µLdesoluçãoACDparatubosEppendorf(2porgalinha)2. Tomarosanguevenosodaveiajugularoudaasadagalinha(até2,0mLporave)3. Removeragulhadaseringa4. AdicionarimediatamenteacadatuboACDcercade0,9mLdesangue5. Homogeneizarsuavementeporrotação6. Transferirosangueparatubodecentrífugacontendo10mLdePBS-A(pipetaPasteur)7. Centrifugar500gX10minutos8. Removerosobrenadante9. Lavarmaisduasvezesascélulascom10mLdePBS-A,homogeneizandosuavemente10. Ressuspenderosedimentodecélulascom5mLdePBS-A11. Avaliarhematócrito(10%v/v)12. Conservara4ºC
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 25
6. OBSERVAÇÃODECÉLULASSANGUÍNEAS(HUMANAS)
ColoraçãodeWright
Materialereagentes
¾ Sanguetotalcapilar,fresco¾ SoluçãodeWright(corante)¾ Soluçãotampão(6.63gKH2PO4;2.56gNa2HPO4;H2Oad.1L)¾ Lâminasdemicroscópionovas(lavadasedesengorduradas)
Procedimentoexperimental(individual)
(Trabalhoindividualaefetuarcomoprópriosangue)1. ColocarIgotadesanguefrescoa1/3daextremidadedalâmina2. Espalharuniformementeaamostracomauxíliodeoutralâmina(veresquema)3. Deixarsecaraoar4. CobriroesfregaçocomsoluçãocorantedeWright5. Deixaratuardurante2minutos6. Adicionarigualvolumedesoluçãotampão7. Homogeneizarmovimentandoocorantecomjactodeardepipeta8. Deixaratuardurante3a4minutos
(asmargensdeverãoapresentarumacoravermelhadaeocentroumbrilhometálicoesverdeado)9. Removerocoranteporlavagememáguacorrente.Lavaralâminacomáguadestilada10. Deixarsecaraoar.Observaraomicroscópio.Registarobservações,desenhandoeidentificandoos
diferentestiposdecélulas
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 26
7. PURIFICAÇÃODEIMUNOGLOBULINAS–PRECIPITAÇÃODIFERENCIAL
MaterialeReagentes
¾ Soroapurificar¾ SoluçãosaturadadeSulfatodeamónioemágua¾ PBS-A(pH7,2)
o 0,8%NaClo 0,02%KH2PO4o 0,144%Na2HPO4.2.H2O
¾ Microtubos¾ Mangadediálise
Procedimentoexperimental(porgrupo)
1. Pipetar500µLdesoroapurificarparamicrotubo2. Adicionar400µLdesulfatodeamóniosaturado(40-45%)3. Misturareconservarnogelodurante30minutos4. Centrifugar5minnaeppendorf5. Pipetarerejeitarosobrenadante6. Escorrerbemotubo7. Dissolverosedimentocom250µLdePBS8. DialisarcontraPBS-Acontendo0,02%deazidadesódio,pelomenosduranteumanoite9. Recuperaroconteúdodamangadediálise10. Congelara-20ºC.
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 27
8. IMUNOPRECIPITAÇÃO-QUALITATIVA
Testedoanel
MaterialeReagentes
¾ Soroatestar¾ Imunoglobulinaspurificadas¾ Soluçãodeantigénio¾ Glicerola10%¾ Microtubosdeensaioemvidro¾ Micropipetas
Procedimentoexperimental
1. Equilibrartodasassoluçõesetubosa37ºC2. Pipetar200µLdesoroatestare/ouimunoglobulinasparaofundodotubo3. Adicionar20µLdeglicerol,homogeneizandocomapipeta4. Pipetar200µLdesoluçãodeantigénioparaasuperfíciedosoro,cuidadosamenteesemmisturar
asfases5. Incubara37ºCdurante30minutosa1hora6. Observaraformaçãodeumprecipitadoemanelnazonadainterfaceentreasduassoluções
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 28
Testeemlâmina
MaterialeReagentes
¾ Soroatestar¾ Imunoglobulinaspurificadas¾ Soluçãodeantigénio¾ Lâminasdemicroscópio¾ Micropipetas
Procedimentoexperimental
1. Equilibrartodasassoluçõeselâminasa37ºC2. PipetarIgotadesoluçãodeantigénionocentrodeumalâmina3. PipetarIgotadesoroatestarsobreagotaprecedente4. Repetircomasimunoglobulinaspurificadas5. Incubara37ºCdurante30minutosa1hora6. Observaraformaçãodeprecipitado7. Registarobservação
Observações
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9. IMUNOPRECIPITAÇÃO–QUANTITATIVA
Curvadeprecipitação
MaterialeReagentes
¾ Soroatestar¾ Soluçãodeantigénio(1mg/mL)¾ PBS-A¾ Microtubos¾ Micropipetas
Procedimentoexperimental
1. Preparardiluiçõesdosoro:10-0,3X10-1,10-1,3X10-2,10-2,3X10-3,PBS2. Pipetar200µLdecadadiluiçãodossorosatestarparacadatubo3. Adicionaracadatubo200µLdesoluçãodeantigénio4. Misturarnovortex5. Incubaremestufaa37ºCduranteumahora6. Centrifugar2minutos7. Observareregistarosníveisdeprecipitadovisívelemcadatubo8. Decantarosobrenadante.9. Escorreresecarosedimento10. Pesarossedimentosapesoconstante11. Quantificarotítulodosoropeladeterminaçãodopontodeequivalênciadorelativamenteao
antigénio
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 30
Nefelometria
MaterialeReagentes
¾ SoroatestarouImunoglobulinaspurificadas¾ Soluçãodeantigénio(BSA)1mg/ml¾ PBS-A¾ Microtuboseppendorf¾ Micropipetas
Procedimentoexperimental
1. Marcar5tuboseppendorfde1a52. Pipetar200µLdesoroatestarparatubo13. Pipetar100µLdesoroatestarparatubo24. Adicionar200µLdePBS-A.Homogeneizar5. Transferir100µLdasoluçãodotubo2paraotubo36. Adicionar200µLdePBS-A.Homogeneizar7. Transferir100µLdasoluçãodotubo3paraotubo48. Adicionar200µLdePBS-A.Homogeneizar9. Transferir100µLdasoluçãodotubo4paraotubo510. Adicionar200µLdePBS-A.Homogeneizar11. Removererejeitar100µLdasoluçãodotubo512. Adicionar200µLdePBS-Aaotubo613. Adicionaracadatubo800µLdesoluçãodeantigénio14. Homogeneizar.15. Incubara37ºCpor30minutos16. LeraDOdetodosostubos17. Registarosdados.18. Avaliaropontodeequilíbrioecalcularotítulorelativodossoro
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 31
10. IMUNODIFUSÃO
Imunodifusãosimples
MaterialeReagentes
¾ SorosatestarouImunoglobulinaspurificadas
¾ Soluçãodeantigénioa10mg/mL¾ AgarouAgarosetipoV(ouII)¾ Azidadesódio10%
¾ SoluçãocorantedeCoomasie(0.25%deazuldeCoomasieemsoluçãodescorante)
¾ Soluçãodescorante(ácidoacéticoglacial-10%,metanol-50%)
¾ Lâminasdemicroscópio
Procedimentoexperimental
1. Preparaçãodogela. Pesar0.1gdeagarouagaroseparaerlenmeyerb. Adicionar9mLdePBS.Fundiremfornodemicro-ondasc. Arrefeceracercade50ºC.Adicionar50µLdeazidaa10%d. Adicionar1mLdesoluçãodeantigénio.Homogeneizar.e. Aplicarcuidadosamenteemcadalâminaumaquantidadequepermitaumaalturade
±2a3mm(5mLporlâminademicroscópio)f. Deixarsolidificarsobresuperfíciehorizontalg. CompipetaPasteurtruncadaperfuraraagarose(~1,5mmØ)em3locais
equidistantesecentrados.Removeroagarcortadoporaspiração2. Ensaio
a. Distribuirasamostrasdesorosouimunoglobulinasatestarpelosorifícios(~15µLporpoço)
b. Cobriralâminacomfilmeplásticotransparentec. Incubaremestufaa37ºC,emcâmarahúmida,durante,pelomenos,1hora
3. Observaraprecipitação.Registaredesenharasobservações4. Coloração(senecessário)
a. CorarogelcomazuldeCoomasieb. Diferenciaremsoluçãodescorante.LavaremPBSc. Observareregistarosresultados
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 32
Imunodifusãodupla(Ouchterlony)
MaterialeReagentes
¾ SorosatestarouImunoglobulinaspurificadas
¾ Soluçãodeantigénio10mg/mL¾ AgarouAgarosetipoV(ouII)¾ Azidadesódio10%
¾ SoluçãocorantedeCoomasie(0.25%deazuldeCoomasieemsoluçãodescorante)
¾ Soluçãodescorante(ácidoacéticoglacial-10%,metanol-50%)
¾ Lâminasdemicroscópio
Procedimentoexperimental
1. Preparaçãodogela. Pesar0.1gdeagarouagaroseb. Adicionar10mLdePBS.Fundiremfornodemicro-ondasc. Arrefeceracercade50ºC.Adicionar50µLdeazidaa10%d. Aplicarcuidadosamenteemcadalâmina5mLdegel(±5mmdealtura)e. Deixarsolidificarsobresuperfíciehorizontalf. Perfuraraagarose,conformeàilustração(empontosequidistanteseseparadosde1
cmdoorifíciocentral).Aspiraroagarcortadocompipeta.2. Ensaio
a. Encheroorifíciocentralcomsoluçãodeantigéniob. Colocaremcadaumdosoutrosorifíciosvolumesiguaisdesoroatestare
imunoglobulinaspurificadas(nãodiluídoediluídoa1:10)c. Cobrirlâminacomfilmeplásticotransparented. Incubaremestufaa37ºC,emcâmarahúmida,durante,pelomenos,1hora
3. Observarlinhasdeprecipitação.Registaredesenharasobservações4. Coloração
a. CorarogelcomazuldeCoomasieb. Diferenciaremsoluçãodescorante.LavaremPBSc. Secaroagarcompapelabsorvente(compressãoprolongadacommúltiplascamadas
deabsorvente)5. Observareregistarosresultados
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 33
11. HEMAGLUTINAÇÃO
MaterialeReagentes
¾ Eritrócitosdegalinhalavados¾ Sorosatestar¾ Soluçãodeantigénio(10mg/mL)¾ PBS-A¾ Tubosdevidropequenosdefundoredondo
Procedimentoexperimental
1. Ressuspendersuavementeoseritrócitoslavados;2. Tomar1mLdesuspensãohomogéneaparatudodecentrífuga;3. Centrifugar500GX10minutos;4. Removererejeitarosobrenadante;5. Ressuspenderascélulascom1mLdePBS-A6. Porcadasoroatestar,marcar4tubosedistribuir:
1 2 3 4
PBS-A(µL) 200 100 100 -Suspensãodeeritrócitoslavados(µL) 200 200 200 200Soluçãoantigénio(µL) - - 100 100Soroatestar - 100 - 100
Controlocélulas
Controlosoro
Controloantigénio TESTE
7. Agitarsuavementeostubosparamisturaroconteúdo8. Repousaratemperaturaambienteatéàsedimentaçãodascélulas(verificarsedimentação
completaemtubo1)9. Observareregistarosresultadosemtodosostubos
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 34
12. TESTEIMUNOCROMATOGRÁFICO(RÁPIDO)
MaterialeReagentes
¾ Amostraatestar¾ Dispositivoimunocromatográficodescartável
Procedimentoexperimental
1. Tomarodispositivoedeixaraqueceràtemperaturaambiente2. AplicarIIIgotasdaamostraaestudarnorecetáculodaamostra3. Observaramigraçãodaamostrapelamatriz4. Observaraformaçãodeumaouduasbandascoradas5. Registaraobservação
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 35
13. IMUNOELETROFORESE
MaterialeReagentes
¾ Soroatestar¾ Soluçãodeantigénioa
10mg/mL¾ AgarouAgarosetipoV
(ouII)¾ Azidadesódio10%¾ Barbitaldesódio
(Veronal)0,2M
¾ Tampãobarbital(2X):- Barbitaldesódio0,2
M-50mL- HCl0,2M-6,0mL- H2Odestiladaad100
mLpH8,6
¾ SoluçãocorantedeCoomasie(0.25%deazuldeCoomasieemsoluçãodescorante)
¾ Soluçãodescoranteo Ác.acéticoglacial-10%o Metanol-50%
¾ Lâminasdemicroscópio
Procedimentoexperimental
Preparaçãodogel
1. Pesar0.15gdeagarlavadoouagaroseparaerlenmeyer2. Adicionar5mLdeáguadestilada.Fundiremfornodemicro-ondas.Arrefeceracercade50ºC3. Adicionar5mLdeT.Barbital2X.Misturar.4. Posicionarperpendicularmenteàlâminaopenteparaformaçãodospoçosdeaplicação5. Aplicaremcadalâmina5mLdesoluçãodeagar1,5%6. Deixarsolidificarsobresuperfíciehorizontal.Removeropente
Eletroforese
1. Adicionaracadaamostradesoro20%deglicerol50%2. EncherosdepósitosdoselétrodoseospoçosdogelcomT.Barbital3. Aplicaraamostradesoroatestarsobotampãodebarbitalemcadapoço4. Colocaralâminanatinadeeletroforese.5. FazeraspontesentreoselétrodoseogelcompapeldefiltroembebidonoT.Barbital6. Cobriralâminacomlarfilm,sembolhasdear7. Aplicaracorrenteelétrica(8mAporlâmina)durante30minutos8. Removeralâminaecorar
Coloração
1. CorarogelcomazuldeCoomasie2. Diferenciaremsoluçãodescorante.3. LavaremPBS4. Observareregistarosresultados
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 36
14. ELISA(ENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAY)
“Checkerboard"
Materialereagentes
¾ MicroplacasparaELISA(2X8poços)
¾ Soluçãodeantigénioa10mg/mL(BSA)
¾ Soroatestar¾ 2°.Anticorpo
Soroanti-galinhaconjugadocomperoxidase(diluídoemTampãodebloqueio1:5000)
¾ TampãodeFixaçãopH9,6-0,159%Na2CO3-0,293%NaHCO3-0,02%NaN3
¾ TampãodeBloqueio-5%LeiteempódesnatadoemPBS-A
¾ TampãodeLavagempH7,2-0,8%NaCl-0,02%KH2PO4-0,144%Na2HPO4.2.H2O-0,05%Tween20
¾ TampãodeSubstratopH5,0-1,118%Na2HPO4-0,56%Ácidocítrico
¾ SoluçãoOPD(extemp.)OPD(O-fenileno-diamina)-20mgH2O2-10μlTampãodesubstrato--60mL
¾ 4NH2SO4
Procedimentoexperimental
1. Marcar8tuboseppendorf(1a8)2. Fazerdiluições:
Tubo(filas) 1 2 3 4 5 6 7 8Tampãodefixação(mL) 1 1 1 1 1 1 1 1Antigénio–BSA10mg/mL(mL) 0,5 - - - - - - -Soluçãoprecedente(mL) - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -
3. Usartodosospoços(de1a8)detrêsfilas(A...H)deumamicroplaca4. Distribuir100µLdecadadiluiçãoparaorespectivopoçodecadaumadastrêsfilasdamicroplaca
(exemplo:colunasA,B,C;poçosdasfilas1a8)5. Anotarasdiluiçõesdeantigéniodecadapoçoutilizado6. Incubar4ºCdurante,pelomenos,24horas,aoabrigodadissecação7. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez8. Fazerasdiluiçõesdosoroausar:
Tubo(colunas) A B CTampãodebloqueio(μl) - 900 900Soroatestar(μl) 1000 100 -Soluçãoprecedente(μl) - - 100
9. Distribuir100µLdecadatuboparaospoçosrespectivosdastrêscolunasdamicroplaca10. Incubar37ºCdurante30minutos(oua4ºCduranteumanoite),aoabrigodadissecação11. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez12. Distribuir100µLdasoluçãodo2ºAnticorpoporcadapoçodamicroplacautilizado(Cadagrupo
utilizadiferentessoluçõesdiluídas-1:1000;1:2000;1:5000;1:7500;1:10000)13. Incubar37ºCdurante30minutos,aoabrigodadissecação14. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez
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IMUNOLOGIA2018/19 37
15. Adicionar200µLdesoluçãoOPDacadapoço16. Incubar37ºCdurante15min,aoabrigodadissecaçãoenoescuro,observandoatéaosurgimento
decornalgunsdospoços17. Adicionar50µLdeH2SO4emcadapoço18. Observareregistarasintensidadesdecorrelativas(cadaelementodogrupofazumaleitura
autónoma)19. Estabeleceramédiadasleiturasefetuadasparacadapoço20. DefinirasmelhoresconcentraçõesdeantigénioeanticorpoausarnotestedeELISAarealizarcom
ossorosdecadagrupo
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IMUNOLOGIA2018/19 38
Registoderesultados
Concentraçõesdeantigénio/soro(0a++++)
1 2 3 4 5 6 7 8
Soro 1
Coluna
1:10
1:100
1 1:3 1:9 1:27 1:81 1:243 1:729 0
Antigénio
Concentraçõesdeantigénio/soro(0a++++)
1 2 3 4 5 6 7 8
Soro 1
Coluna
1:10
1:100
1 1:3 1:9 1:27 1:81 1:243 1:729 0
Antigénio
Concentraçõesdeantigénio/soro(0a++++)
1 2 3 4 5 6 7 8
Soro 1
Coluna
1:10
1:100
1 1:3 1:9 1:27 1:81 1:243 1:729 0
Antigénio
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 39
Teste
Materialereagentes
(osmesmosqueparaCheckerboard)¾ Soroatestar¾ Soluçãodeantigénioa10mg/mL¾ Soroatestar¾ 2ºAnticorpo-GACIG-HRPO
Diluircadasoluçãodeacordocomosresultadosdaexperiênciaanterior
Procedimentoexperimental
1. Diluiroantigéniodeacordocomaavaliaçãoefetuadano“checkerboard”.2. Distribuir100µLdesoluçãodeantigénioporpoçodemicroplaca3. Incubar4ºCdurante,pelomenos24horas,aoabrigodadissecação4. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez5. Distribuir200µLdeTampãodeBloqueioporpoço.6. Incubardurante30minutosa37ºC7. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez8. Preparardiluiçõessequenciaisde3em3decadasoroatestar:Amostra(poço) 1(B) 2(C) 3(D) 4(E) 5(F) 6(G) 7(H)T.Bloqueio 120 120 120 120 120 120 120Soroatestar - 60 Diluiçãoanterior - - 60 60 60 60 609. NospoçosdafilaAaplicar100µLdeTampãodebloqueio10. NospoçosdafilasBaHaplicar100µLdasdiluiçõesdosoroatestar(conformetabela)11. Fazerréplicas(repetirpassos8a10emcolunasdiferentes)12. Incubar37ºCdurante1hora(oua4ºCduranteumanoite),aoabrigodadissecação13. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez14. Distribuir100µLdasoluçãodiluídado2°.Anticorpoporcadapoçodamicroplaca15. Incubar37ºCdurante1hora(oua4ºCduranteumanoite),aoabrigodadissecação16. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando
durante3mindecadavez17. Adicionar200µLdesoluçãoOPDacadapoço18. Incubar37ºCdurante15min,aoabrigodadissecaçãoenoescuro,atéaoaparecimentodecor
nalgunspoços19. Adicionar50µLdeH2SO4porpoço20. Observareregistarasintensidadesdecorrelativas(cadaelementodogrupofazumaleitura
autónoma)21. Estabeleceramédiadasleiturasefetuadasparacadapoço22. Avaliartítuloaproximadodosoro(últimadiluiçãopositivadiferentedocontrolonegativo)
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IMUNOLOGIA2018/19 40
Registoderesultados
Resultadosobservados(de++++a0)–OPERADOR1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Resultadosobservados(de++++a0)–OPERADOR2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Observações
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IMUNOLOGIA2018/19 41
Resultadosobservados(de++++a0)–OPERADOR3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
MÉDIADOSRESULTADOS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Amostra:_________________________
Títulosdossoros.
Pré-imune
15dias
30dias
45dias
60dias
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IMUNOLOGIA2018/19 42
RepresentaçãoesquemáticadeumaELISA
CarlosSinogas