Étude du transporteur MRP1 : caractérisation des NBD,
et étude de modulateurs conduisant à la mort des cellules surexprimant le transporteur
Soutenance de thèse de
M. Thomas PERROTTON
Directeur de thèse : Dr. Hélène CORTAY
14 Décembre 2007 – 14h30
Laboratoire des Protéines de Résistance aux Agents Chimiothérapeutiques
Dr. Attilio DI PIETRO
Institut de Biologie et Chimie des Protéines
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 2
SOMMAIRE
II. RESULTATS
1. Caractérisation fonctionnelle des NBD2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil
sur MRP13. Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil
III. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
I. RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
1. Le cancer : un enjeux sociétal et économique2. Le phénotype de résistance des cancers3. Les transporteurs ABC4. Le transporteur de multiples drogues MRP15. Les modulateurs de MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 3
I. RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
1. Le cancer : un enjeux sociétal et économique2. Le phénotype de résistance des cancers3. Les transporteurs ABC4. Le transporteur de multiples drogues MRP15. Les modulateurs de MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 4
1. Le cancer : un enjeu sociétal et économique
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 5
TYPE DE COUTSEVALUATION
(k€)
Impacts immédiats et indirects de la maladie
Impact de la maladie sur la vie des personnesAnnées potentielles de vie perdues (en années)
~ 2 300 000
Perte de productionPerte de productivité du fait d’arrêts maladiePerte de productivité du fait de mortalité
527 81116 921 070
Coûts de la lutte contre le cancer pour l’État et l’Assurance Maladie
Le coût des soins 10 886 190
Politique de prévention primaire à la lutte contre les cancersTabacAlcoolNutrition/exercice physique
120 000
Dépistages organisésCancer du seinCancer colorectal
247 900
Recherche publique 670 000
« Analyse économique des
coûts du cancer en France », Institut
national du cancer, 10 avril 2007
(dossier de presse)
1. Le cancer : un enjeu sociétal et économique
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 6
2. Le phénotype de résistance des cancers
1. Inactivation moléculaire
2. Anomalies de réponses (apoptose, augmentation de la réparation de l’ADN)
3. Altération de la cible moléculaire (ADN topoisomérases)
4. Efflux actif en dehors de la cellule (transporteurs ABC)
Un échec majeur des chimiothérapies, dû au traitement par des médicaments
Résistance croisée à de nombreux agents chimiothérapeutiques
1
22
3
4
2
4
1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 7
3. Les transporteurs ABC
Généralités
Une très large famille de protéines
Présents des microorganismes à l’Homme
Une séquence hautement conservée : ATP Binding Cassette
Une classification unique (HUGO) : → homologie structurale
Trois transporteurs ABC impliqués dans le phénotype MDR:
P-gp/ABCB1 (Glycoprotéine-P)
MRP1/ABCC1 (Multidrug Resistance Protein 1)
BCRP/ABCG2 (Breast Cancer Resistance Protein)
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 8
Transporteur Nomenclature MaladieMDR1, MRP1, BCRP ABCB1, ABCC1, ABCG2 Cancer
CFTR ABCC7 Mucoviscidose
ABC1 ABCA1Maladie de Tangier et déficience familiale en
HDL
MRP2 ABCC2Syndrome de Dubin-
Johnson
SUR1, SUR2 ABCC8, ABCC9Hyperinsulinisme
familial
Les pathologies associées aux transporteurs ABC
Des transporteurs impliqués dans de nombreuses fonctions physiologiques
Des mutations associant souvent ces transporteurs à des maladies
3. Les transporteurs ABC
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 9
Topologie générale des transporteurs ABC
Une topologie générale
• 2 domaines transmembranaires (TMD) : reconnaissent les substrats
• 2 domaines de fixation des nucléotides (NBD) : fournissent l’énergie
3. Les transporteurs ABC
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 10
Des motifs inclus dans les NBD très conservés
• Motif A de Walker
• Motif B de Walker
• Motif C, signature des ABC
Les domaines de fixation des nucléotides ou NBD
3. Les transporteurs ABC
1
1
23
2
3
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 11
Higgins CF, et al. (2004)Nat Struct Mol Biol 11(10):918-26
Les différentes étapes du transport d’un substrat par un transporteur ABC
3. Les transporteurs ABC
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 12
4. Le transporteur de multiples drogues MRP1
TMD1 TMD2 TMD3
NBD1 NBD2
Une topologie originale de MRP1
Un domaine transmembranaire supplémentaire en position N-terminale
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 13
Des NBD originaux au fonctionnement asymétrique
Des différences structurales
Une asymétrie fonctionnelle des NBD de MRP1
La structure de NBD1 a été résolue
Ramaen O, et al. (2006) J Mol Biol 359:940-949
Conformation non productive
du site catalytique
Peut expliquer la régulation entre
NBD1 et NBD2
4. Le transporteur de multiples drogues MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 14
Composés ExemplesAntinéoplasiques methotrexate, doxorubicine, étoposide, vincristine, vinblastine,
paclitaxel
Antiviraux Saquinavir, ritonavir
Antibiotiques Difloxacine, grepafloxacine
Metalloïdes Arsénite, arséniate, antimoine
Sondes fluorescentes Calcéine, Fluo-3, BCECF, SNARF
Toxines Aflatoxine B1
Conjugués à des glucuronides
Etoposide-Gluc
Conjugués au GSH Leucotriène C4, prostaglandine A2-SG
Conjugués à des glucuronides
17β-Estradiol-17-β-D-Gluc, glucuronosylbilirubine
Conjugués à des sulfates Estrone-3-sulfate
Peptides GSH, GSSG
Médicamentsxénobiotiques
Médicaments xénobiotiques
conjugués
Composés naturels
Une grande diversité de substrats transportés
4. Le transporteur de multiples drogues MRP1
Transports d’anions organiques
transports de substrats conjugués: GSH, glucuronates, sulfonates
Co-transport de substrats avec du GSH
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 15
NBD1 NBD2
Extracellulaire
Intracellulaire
ATP
ADP+Pi
1. Transport du GSH et du GSSG
2. Transport du LTC4
3. Transport de l’estrone sulfate
4. Transport de la vincristine
5. Effet du vérapamil
NBD1NBD1 NBD2NBD2
Différents mécanisme de
transport
Vérapamil
GSHGSH
GSSG
VincristineLTC4
Estrone sulfate
GSH
GSH
4. Le transporteur de multiples drogues MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 16
5. Les modulateurs de MRP1
Classe des composés Composés
Analogues des leucotriènes MK571
Stéroïdes ZK112993, LY329146
Bloqueurs de canaux calciques Vérapamil, PAK-104P, nicardipine, NIK 250
Nucléotides antisens ISIS-7597
Cyclosporines Cyclosporine A, PSC833
Flavonoïdes Génistéine, quercitine
Divers Probénécide, VX-710, MS-209, difloxacine, GF109203X, indométhacine, dipyridamole, LY415975
Un objectif : contrecarrer la chimiorésistance
Une stratégie : inhiber le transporteur
Des solutions : flavonoïdes et vérapamil
Pourquoi rechercher des modulateurs pour MRP1?
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 17
Caractériser la fonctionnalité et l’implication des NBD vis-à-vis des nucléotides, substrats et modulateurs
Étudier les énantiomères du vérapamil, comprendre leur activité
Déterminer de nouvelles structures efficaces, et comprendre pourquoi
LES OBJECTIFS DE CES TRAVAUX
Mieux comprendre le fonctionnement moléculaire de MRP1
Analyser une nouvelle stratégie de lutte contre la chimiorésistance
induite par MRP1
Améliorer les modulateurs actifs
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 18
I. RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
1. Le cancer : un enjeux sociétal et économique2. Le phénotype de résistance des cancers3. Les transporteurs ABC4. Le transporteur de multiples drogues MRP15. Les modulateurs de MRP1
II. RESULTATS
1. Caractérisation fonctionnelle des NBD2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil
sur MRP13. Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 19
II. RESULTATS
1. Caractérisation fonctionnelle des NBD
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 20
1. Caractérisation fonctionnelle des NBD
Asymétrie fonctionnelle des NBD de MRP1
Rôle de cette asymétrie encore inconnue
Changements conformationnels induits par l’ATP sur les NBD : transfert d’information vers les TMD
Interaction de flavonoïdes avec les NBD de MRP1
Généralités
Trompier D, et al. (2003) Cell Mol Life Sci. 60(10):2164-77
Conseil G, et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 18;95(17):9831-6
Interaction des substrats et modulateurs sur les
NBD?
Propriété de fixation des nucléotides sur les NBD
?
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 21
8N 3AXP (µM)
0 100 200 3000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
mol
pro
be /
mol
pro
téin
e
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
F0
/F
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
F0
/F
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
F0
/F
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
F0
/F
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
Nucléotides et NBD : interaction et modifications conformationnelles
○ NBD2 8-azido-[α-32P]ATP
NBD2 8-azido-[α-32P]ADP
● NBD1 8-azido-[α-32P]ATP
▲ NBD1 8-azido-[α-32P]ADP
● NBD seul
■ + ATP-Mg
▲+ ADP-Mg
NBD1 NBD2
Fort marquage par l’ATP sur NBD1,
faible pour l’ADP
Faible marquage sur NBD2
L’ATP et l‘ADP modifie
l’accessibilité des Trp
de NBD1
Seul l’ADP modifie
l’accessibilité de NBD2
1. Caractérisation fonctionnelle des NBD
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 22
MK571 (µM)
0 5 10 15 20 25
Att
énua
tion
de f
luo
resc
ence
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
MK571 (µM)
0 5 10 15 20 25
Att
énua
tion
de f
luo
resc
ence
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
LTC4 (µM)
0 2 4 6
Att
énua
tion
de f
luo
resc
ence
(%
)
60
70
80
90
100
110
LTC4 (µM)
0 2 4 6
Att
énua
tion
de f
luo
resc
ence
(%
)
60
70
80
90
100
110
Fixation du LTC4 et du MK571
● NBD1
■ NBD2
● NBD1
■ NBD2
Fixation du LTC4 sur les deux NBD
Fixation du MK571 sur les deux NBD
NBD1 Kd = 5.8 ± 0.4 µM NBD2 Kd = 8.2 ± 0.7 µM
NBD1 Kd = 6.0 ± 1.3 µM
NBD2 Kd = 3.9 ± 1.6 µM
1. Caractérisation fonctionnelle des NBD
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 23
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
F0/
F
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
F0/
F
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1/MK571 (µM)-1
-0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
1/At
ténu
atio
n de
fluo
resc
ence
(%)
-1
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
1/MK571 (µM)-1
-0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
1/At
ténu
atio
n de
fluo
resc
ence
(%)
-1
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
1/MK571 (µM)-1
-0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
1/A
tténu
atio
n de
fluo
resc
ence
(%)
-1
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
1/MK571 (µM)-1
-0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
1/A
tténu
atio
n de
fluo
resc
ence
(%)
-1
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12A B
Les NBD et le NMeOHI2
● NBD1 seul
■ 30 µM NMeOHI2
▲30 µM NMeOHI2
+ 2 mM ATP-Mg
NBD1 NBD2
● NBD seul
■ 10 µM NMeOHI2
▲30 µM NMeOHI2
Modification de l’accessibilité des Trp de NBD1 par le NMeOHI2
Modification différente de l’ATP
Interaction au même site que le MK571
1. Caractérisation fonctionnelle des NBD
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 24
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
F0/
F
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
F0/
F
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5F
0/F
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5F
0/F
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
Changements conformationnels induits par les substrats et modulateurs
○ NBD seul
■ 30 μM docetaxel
▲ 30 μM vincristine
▼ 30 μM vinblastine
◊ 5 mM GSH
□ 5 μM LTC4
NBD1 NBD2
Tous les composés modifient l’accessibilité des Trp de NBD1
Seuls le GSH et le LTC4 modifient l’accessibilité des Trp de NBD2
1. Caractérisation fonctionnelle des NBD
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 25
Conclusions résultats 1
NBD1 NBD2NBD2ATPATP
ATPATP
LTC4MK571
NMeOHI2
LTC4MK571
NMeOHI2
VincristineVinblastine
GSHLTC4
VincristineVinblastine
GSHLTC4
LTC4MK571
NMeOHI2
LTC4MK571
NMeOHI2
GSHLTC4
GSHLTC4
InteractionInteraction InteractionInteraction
ModificationsConformationnelles
ModificationsConformationnelles
ModificationsConformationnelles
ModificationsConformationnelles
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 26
Conclusions résultats 1
Les nucléotides et les NBD:
→ Comportement intrinsèque asymétrique vis-à-vis des nucléotides
→ Changements conformationnels pouvant expliquer le rôle de chaque NBD dans le mécanisme catalytique
→ Les domaines recombinants sont fonctionnels
Les substrats/modulateurs et les NBD:
→ Participation des NBD à la fixation des substrats et modulateurs?
→ Validation par d’autres techniques (photomarquage, mutagenèse, …)
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 27
II. RESULTATS
1. Caractérisation fonctionnelle des NBD
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 28
*
Un dérivé diphénylalkylamine
Inhibiteur des canaux calciques de type L (cœur)
Utilisation en thérapeutique: hypertension, arythmie
L’énantiomère S est pharmacologiquement efficace
L’énantiomère S est beaucoup plus vite métabolisé
Le vérapamil
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 29
Trompier D, et al. (2004) Cancer Res 64:4950-4956
Vérapamil
Fuite massive du GSH intracellulaire Mort des cellules surexprimant MRP1 par apoptose
Effet du vérapamil sur MRP1
Low DW, et al. (2000) J Pharmacol Exp Ther 293(2):530-8
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
Vérapamil
Cellules
BHK-21
Cellules
BHK-MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 30
Vérapamil: inhibiteur de référence de la glycoprotéine -P
Même activité des énantiomères sur la glycoprotéine-P
Les énantiomères : 60 milliards de dollars dépensés chaque année aux USA
Effet physiologique différentiel des énantiomères de molécules
ThalidomideThalidomide IbuprofèneIbuprofène
Le vérapamil et ses énantiomères
et sur MRP1
…?
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 31
Seul le S-verapamil induit une cytotoxicité des cellules BHK-MRP1
Cytotoxicité des énantiomères du vérapamil
Verapamil (µM)
0 10 20 30 40
Via
bilit
é ce
llula
ire (
%)
0
20
40
60
80
100
Verapamil (µM)
0 10 20 30 40
Via
bilit
é ce
llula
ire (
%)
0
20
40
60
80
100
○ vérapamil +/-
□ vérapamil S
vérapamil R
● vérapamil +/-
■ vérapamil S
▲ vérapamil R
BHK-21
BHK-21-MRP1
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 32
Temps d'incubation (min)
0 20 40 60 80 100 120 140
Glu
tath
ion
intr
acel
lula
ire t
otal
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
Temps d'incubation (min)
0 20 40 60 80 100 120 140
Glu
tath
ion
intr
acel
lula
ire t
otal
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
○ 10 µM vérapamil +/-
□ 5 µM vérapamil S
5 µM vérapamil R
● 10 µM vérapamil +/-
■ 5 µM vérapamil S
5 µM vérapamil R
BHK-21
BHK-21-MRP1
Effet des énantiomères du vérapamil sur le transport de GSH par MRP1
L’effet du S-vérapamil est plus fort en absence de l’énantiomère R
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 33
1/S-verapamil (µM)-1
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,51/ G
luta
thio
n in
trac
ellu
laire
tota
l (nm
ol/m
g)-1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
1/S-verapamil (µM)-1
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,51/ G
luta
thio
n in
trac
ellu
laire
tota
l (nm
ol/m
g)-1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
● 0 µM vérapamil R
■ 2 µM vérapamil R
▲ 4 µM vérapamil R
BHK-21-MRP1
Effet du R-vérapamil sur l’activité du S-vérapamil
Inhibition de type mixte de l’isomère R sur l’activité de l’isomère S
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 34
Effet des énantiomères du vérapamil sur le transport de calcéine
Contrôle
Verapamil RVerapamil SMK571
BHK21
Contrôle
Verapamil R
MK571
Verapamil SBHK21-MRP1
Aucun effet sur
les cellules contrôles
Les 2 énantiomères inhibent
l’efflux de calcéine
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 35
Vincristine (nM)
0,1 1 10 100
Via
bili
té c
ellu
lair
e (
%)
0
20
40
60
80
100
Vincristine (nM)
0,1 1 10 100
Via
bili
té c
ellu
laire
(%
)
0
20
40
60
80
100
Vincristine (nM)
0,1 1 10 100V
iabi
lité
cellu
laire
(%
)0
20
40
60
80
100
IC50 (nM) de la vincristine
R-vérapamil (µM)
0 5 15
BHK-21 1,51 ± 0,4 1,48 ± 0,27 1,06 ± 0,38
BHK-MRP1 9,42 ± 0,23 2,87 ± 0,42 1,02 ± 0,18
BHK21
BHK21-MRP1
Réversion du phénotype MDR par le R-vérapamil
0 µM 15 µM 5 µM
Le vérapamil R réverse le phénotype MDR induit par MRP1
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 36
Purification de MRP1 à l’aide des cellules BHK-MRP1
MRP1
SDS-PAGE 6%, Coomassie
MW(KDa)
220 -
170 -
116 -
76 -
MR P1
MW(KDa)
205 -
115 -
97 -
Western Blot, Lumilight®
Purification de MRP1
20 boites de 15 cm Ø ~ 200 µg
Concentration ~ 0.07 µg/µl
Dépôt de 1.5 µg de protéines purifiées
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 37
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
F0/
F
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
F0/
F
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
F0/
F
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
NaI (M)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
F0/
F
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
● MRP1 seul
▲ 0.5 µM R-vérapamil
■ 0.5 µM S-vérapamil
Pas d’asolectine 0.2 % asolectine
Changements conformationnels induits parles énantiomères du vérapamil
L’asolectine modifie l’accessibilité des Trp
Les deux énantiomères induisent des changements conformationnels différents
MRP1 seul KSV = 1.23 ± 0.15 M-1 0.5 µM R-vérapamil KSV = 2.51 ± 0.17 M-1
0.5 µM S-vérapamil fa = 0.45
MRP1 seul KSV = 1.46 ± 0.23 M-1 0.5 µM R-vérapamil fa = 0.420.5 µM S-vérapamil fa = 0.48
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 38
Verapamil enantiomers (µM)
0 1 2 3 4 5
Flu
ores
cenc
e qu
ench
ing
(%)
86
88
90
92
94
96
98
100
Verapamil enantiomers (µM)
0 1 2 3 4 5
Flu
ores
cenc
e qu
ench
ing
(%)
86
88
90
92
94
96
98
100
R-vérapamil
S-vérapamil
Fixation du S- et R-vérapamil sur MRP1 purifiée
Fixation du S et R-verapamil sur MRP1
R-vérapamil Kd = 47.7 ± 4 nM
S-vérapamil Kd = 92.5 ± 5 nM
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 39
1/S-Verapamil (µM)-1
0 20 40 60 80 100
1/flu
ores
cenc
e (%
)-1
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1/S-Verapamil (µM)-1
0 20 40 60 80 100
1/flu
ores
cenc
e (%
)-1
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2 0.5 µM R-vérapamil
MRP1 seul
0.05 µM R-vérapamil
Effet du R-vérapamil sur la fixation su S-vérapamil,topologie des sites de fixation
Modification de la fixation du S-vérapamil par le R-vérapamil
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 40
1/R -Verapamil (µM)-1
0 20 40 60 80 100 120
1/A
tténu
atio
n de
fluo
resc
ence
(%
)-1
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
1/R -Verapamil (µM)-1
0 20 40 60 80 100 120
1/A
tténu
atio
n de
fluo
resc
ence
(%
)-1
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
S-vérapamil
1/S-Verapamil (µM)-1
-20 0 20 40 60 80 100 120
1/A
ttén
uatio
n de
flu
ores
cenc
e (%
)-1
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1/S-Verapamil (µM)-1
-20 0 20 40 60 80 100 120
1/A
ttén
uatio
n de
flu
ores
cenc
e (%
)-1
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
MRP1 seul
■ 0.5 mM GSH
R-vérapamil
Effet du GSH sur la fixation du S-vérapamil et du R-vérapamil
Modification de l’interaction des deux énantiomères avec MRP1 par le GSH
Interdépendance entre les sites de fixation des énantiomères et du GSH
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 41
Effet des énantiomères du vérapamil sur l’activité ATPaseDe MRP1 purifiée
Act
ivité
AT
Pa
se (
nm
ol/m
in/m
g)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
S-V
erap
amil
N
one
R-V
erap
amil
GS
H R
-Ver
apam
il
+
GS
H S
-Ver
apam
il
+
GS
H
Act
ivité
AT
Pa
se (
nm
ol/m
in/m
g)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
S-V
erap
amil
N
one
R-V
erap
amil
GS
H R
-Ver
apam
il
+
GS
H S
-Ver
apam
il
+
GS
H
Con
trol
Act
ivité
AT
Pas
e (%
)
0
20
40
60
80
100
120
140
Vi
R-V
erap
amil
S-V
erap
amil
GS
HR
-Ver
apam
il+
GS
HS
-Ver
apam
il +
GS
H
Con
trol
Act
ivité
AT
Pas
e (%
)
0
20
40
60
80
100
120
140
Vi
R-V
erap
amil
S-V
erap
amil
GS
HR
-Ver
apam
il+
GS
HS
-Ver
apam
il +
GS
H
0.2 % asolectinePas d’asolectine
5 mM GSH
1 µM S- ou R-vérapamil
0.8 mM vanadate
Modification de l’activité ATPase par l’asolectine
Abolition des effets du GSH sur l’activité ATPase par le S-vérapamil, par d’effet du R-vérapamil
Activité basale : 2.11 ± 0.1 nmol/min/mg Activité basale : 16.2 ± 0.4nmol/min/mg
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 42
Conclusions résultats 2
- Effets biologiques différents: → seul le S-vérapamil induit l’efflux du glutathion, entraînant la mort cellulaire
→ le R-vérapamil agit comme un inhibiteur de MRP1
- Les deux énantiomères ont des sites de fixation interdépendants
INTÉRÊT DE CES
RÉSULTATS
=
NOUVELLES
STRATEGIES
INTÉRÊT DE CES
RÉSULTATS
=
NOUVELLES
STRATEGIES
Il faut choisir entre les deux énantiomères pour cibler
MRP1 de manière plus efficace, et selon deux aspects:
- Le R-vérapamil a deux avantages:
→ il est peu cardiotoxique
→ il réverse le phénotype MDR
- Le S-vérapamil a l’avantage de tuer spécifiquement
les cellules susceptibles de devenir résistantes,
par induction de l’apoptose
Il faut choisir entre les deux énantiomères pour cibler
MRP1 de manière plus efficace, et selon deux aspects:
- Le R-vérapamil a deux avantages:
→ il est peu cardiotoxique
→ il réverse le phénotype MDR
- Le S-vérapamil a l’avantage de tuer spécifiquement
les cellules susceptibles de devenir résistantes,
par induction de l’apoptose
Perrotton T, et al. (2007) J Biol Chem 26;282(43):31542-8
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 43
NBD1NBD1 NBD2NBD2
R S
GSHS
GSH
GSHGSH
GSH
GSHGSH
Vincristine
Vincristine
Activité du S-vérapamil sur MRP1
1. Transport du GSH, et de la vincristine en co-transport avec le GSH
2. Fixation du S-vérapamil
3. Modification de la conformation de MRP1
4. Transport massif du GSH
5. Inhibition du transport de la vincristine
Extracellulaire
Intracellulaire
ATP
ADP+Pi
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 44
NBD1NBD1 NBD2NBD2
R S
R
GSH
GSH
GSH
GSH
GSH
GSH
GSHVincristine
Vincristine
1. Transport du GSH et de la vincristine en co-transport avec le GSH
2. Fixation du R-vérapamil
3. Modification de la conformation de MRP1
4. Inhibition du transport de la vincristine et du GSH
Activité du R-vérapamil sur MRP1
Extracellulaire
Intracellulaire
ATP
ADP+Pi
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 45
NBD1NBD1 NBD2NBD2
R S
Extracellulaire
Intracellulaire ADP+Pi
RS
Sites de fixationdes énantiomères du vérapamil
La fixation du R-vérapamil sur MRP1 modifie la fixation du S-vérapamil
Interdépendance des sites de fixation des énantiomères du vérapamil
ATP
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 46
Conclusions résultats 2
Synthèse des énantiomères diiodés du vérapamil, pour une meilleure efficacité à plus faible concentration
Etudier l’influence des énantiomères du vérapamil sur la fixation du glutathion sur MRP1, intérêt mécanistique
Etudier l’influence du phénotype cellulaire sur l’activité du S- vérapamil
Passer à un modèle animal
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 47
II. RESULTATS
2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1
1. Caractérisation fonctionnelle des NBD
3. Relation structure/activité des dérivés iodés du vérapamil
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 48
3. Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil
ComposésType de modification chimique
1 2 3 4 n
Verapamil CH3 OCH3 OCH3 - 2
NMeOMe CH3 - OCH3 - 2
NMeOMeI CH3 I OCH3 - 2
NMeOMeI2 CH3 I OCH3 I 2
NMeOH CH3 - OH - 2
NMeOHI CH3 I OH - 2
NMeOHI2 CH3 I OH I 2
Verapamil C CH3 - OH - 3
Verapamil CI CH3 - OH I 3
Verapamil CI2 CH3 I OH I 3
Verapamil D CH3 - OH - 1
Verapamil DI CH3 - OH I 1
Verapamil DI2 CH3 I OH I 1
NHOH H - OH - 2
NHOHI H I OH - 2
NHOHI2 H I OH I 2
N
N
CH3
CH3
O
O
CH3
CH3
1
2
3
( )n
Partie « ouest »
Partie « est »
3
2
4
4
Structure chimique des dérivés iodés du vérapamil
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 49
ComposésIC50 (µM)
BHK-21-MRP1 BHK-21
Verapamil 10.6 ± 0.5 ≥ 100
NMeOMe 17.2 ± 1.0 33.6 ± 7.7
NMeOMeI 4.7 ± 0.6 13.0 ± 0.5
NMeOMeI2 1.7 ± 0.9 8.9 ± 0.3
NMeOH 11.7 ± 0.3 55.9 ± 0.8
NMeOHI 8.6 ± 1.2 32.8 ± 0.9
NMeOHI2 1.1 ± 0.9 54.7 ± 7.1
Verapamil C 20.9 ± 1.4 ≥ 100
Verapamil CI 9.3 ± 1.4 9.4 ± 0.2
Verapamil CI2 6.0 ± 0.8 33.1 ± 5.1
Verapamil D 6.6 ± 0.9 28.5 ± 1.6
Verapamil DI 13.0 ± 1.2 14.1 ± 0.3
Verapamil DI2 6.6 ± 1.2 27.4 ± 2.6
NHOH 38.1 ± 0.3 ≥ 100
NHOHI 0.78 ± 0.7 14.2 ± 0.3
NHOHI2 1.96 ± 0.4 13.8 ± 0.5
Cytotoxicité des dérivés iodés du vérapamil
L’iodation augmente l’efficacité des molécules en général
3. Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 50
C
Verapamil (µM)
0 5 10 15 20 25 30
Su
rvie
ce
llula
ire
(%
)
-20
0
20
40
60
80
100
120
Verapamil (µM)
0 5 10 15 20 25 30
Su
rvie
cellu
laire (
%)
-20
0
20
40
60
80
100
120
NHOHI (µM)
0 5 10 15 20 25 30
Surv
ie c
ellu
laire (
%)
0
20
40
60
80
100
120
NHOHI (µM)
0 5 10 15 20 25 30
Surv
ie c
ellu
laire (
%)
0
20
40
60
80
100
120
NMeOHI2 (µM)
0 5 10 15 20 25 30
Su
rvie
ce
llula
ire
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
NMeOHI2 (µM)
0 5 10 15 20 25 30
Su
rvie
ce
llula
ire
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
Vérapamil NHOHI NMeOHI2
Toxicité cellulaire du vérapamil et de deux dérivés actifs
Trois composés intéressants
F > 10 F ~ 18 F ~ 49
3. Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 51
Effet des dérivés iodés du vérapamil sur le contenu cellulaire en GSH
Tem
ps p
our
50 %
d'e
fflu
x du
GS
H c
ellu
laire
(m
in)
0
10
20
30
40
50
60
NH
OH
IN
HO
HI 2
Ver
apam
il C
Ver
apam
il C
IV
erap
amil
CI 2
Ver
apam
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Ver
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il D
IV
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DI 2
NM
eOM
eN
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NM
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NM
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NH
OH
Ver
apam
il
NM
eOH
IN
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Tem
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50 %
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fflu
x du
GS
H c
ellu
laire
(m
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0
10
20
30
40
50
60
NH
OH
IN
HO
HI 2
Ver
apam
il C
Ver
apam
il C
IV
erap
amil
CI 2
Ver
apam
il D
Ver
apam
il D
IV
erap
amil
DI 2
NM
eOM
eN
MeO
MeI
NM
eOM
eI2
NM
eOH
NH
OH
Ver
apam
il
NM
eOH
IN
MeO
HI 2
Effet de la taille du linker
Effet de l’iodation
3. Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 52
Conclusions résultats 3
Intérêts des modifications chimiques:
→ Pas de bénéfice lors de modification linker
→ Puissant effet de l’iodation
→ CH3 → OH: pas d’intérêt sauf dans cas d’iodation
Intérêt: synthétiser et étudier les énantiomères du NMeOHI2
Etudier attentivement les résultats du dosage de GSH, ne pas se contenter de la toxicité cellulaire!
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 53
II. RESULTATS
1. Caractérisation fonctionnelle des NBD2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil
sur MRP13. Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil
I. RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
1. Le cancer : un enjeux sociétal et économique2. Le phénotype de résistance des cancers3. Les transporteurs ABC4. Le transporteur de multiples drogues MRP15. Les modulateurs de MRP1
III. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 54
III. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Mieux comprendre le fonctionnement moléculaire de MRP1
Explication de l’asymétrie des NBD dans leur séquences
La différence de fixation des nucléotides peur expliquer les différentes étapes du cycle catalytique
Les NBD ont la capacité de fixer le LTC4 et le MK571
Le GSH, le NMeOHI2, la vincristine et la vinblastine modifient l’accessibilité des NBD
Participation des NBD à la fixation des substrats?
Intérêt mécanistique à confirmer par d’autres techniques
Intérêt mécanistique à confirmer par d’autres techniques
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 55
III. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Analyser une nouvelle stratégie de lutte contre la chimiorésistance
induite par MRP1
Améliorer les modulateurs actifs
S-vérapamil : responsable de
l’efflux de GSH
R-vérapamil : inhibiteur du
transporteur
Une nouvelle stratégie thérapeutique : aller plus loin,
d’autres modèles
Une nouvelle stratégie thérapeutique : aller plus loin,
d’autres modèles
Un intérêt majeur de l’halogénation
des composés
Un dérivé prometteur : le NMeOHI2
Synthétiser les énantiomères du NMeOHI2 :
un espoir prometteur!
Synthétiser les énantiomères du NMeOHI2 :
un espoir prometteur!
14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 56
REMERCIEMENTS
Le laboratoire du Dr. DI PIETRO, IBCP, Lyon
• Dr. Atillio DI PIETRO• Dr. Hélène CORTAY• Dr. Pierre FALSON• Tous les membres du laboratoire et de l’Institut
Plateau technique cytométrie en flux, IFR128, Lyon
• Chantal BELLA• Odette DE BOUTEILLER
Mayo Clinic, Scottsdale, USA
• Dr. Xiu-Bao CHANG• Yue-Xian HU et Irène BEAUVAIS
Département de Chimie Moléculaire, UJF, Grenoble
• Dr. Amaury DU MOULINET DHARDEMARE
University of Cape Town Medical School, Cape Town, SOUTH AFRICA
• Dr. David MCINTOSH