Étude du transporteur mrp1 : caractérisation des nbd, et étude de modulateurs conduisant à la...

Étude du transporteur MRP1 : caractérisation des NBD,

et étude de modulateurs conduisant à la mort des cellules surexprimant le transporteur

Soutenance de thèse de

M. Thomas PERROTTON

Directeur de thèse : Dr. Hélène CORTAY

14 Décembre 2007 – 14h30

Laboratoire des Protéines de Résistance aux Agents Chimiothérapeutiques

Dr. Attilio DI PIETRO

Institut de Biologie et Chimie des Protéines

14 Décembre 2007 Thomas PERROTTON - IBCP 2

SOMMAIRE

II. RESULTATS

1. Caractérisation fonctionnelle des NBD2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil

sur MRP13. Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil

III. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

I. RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

1. Le cancer : un enjeux sociétal et économique2. Le phénotype de résistance des cancers3. Les transporteurs ABC4. Le transporteur de multiples drogues MRP15. Les modulateurs de MRP1


1. Le cancer : un enjeu sociétal et économique


TYPE DE COUTSEVALUATION

(k€)

Impacts immédiats et indirects de la maladie

Impact de la maladie sur la vie des personnesAnnées potentielles de vie perdues (en années)

~ 2 300 000

Perte de productionPerte de productivité du fait d’arrêts maladiePerte de productivité du fait de mortalité

527 81116 921 070

Coûts de la lutte contre le cancer pour l’État et l’Assurance Maladie

Le coût des soins 10 886 190

Politique de prévention primaire à la lutte contre les cancersTabacAlcoolNutrition/exercice physique

120 000

Dépistages organisésCancer du seinCancer colorectal

247 900

Recherche publique 670 000

« Analyse économique des

coûts du cancer en France », Institut

national du cancer, 10 avril 2007

(dossier de presse)

1. Le cancer : un enjeu sociétal et économique


2. Le phénotype de résistance des cancers

1. Inactivation moléculaire

2. Anomalies de réponses (apoptose, augmentation de la réparation de l’ADN)

3. Altération de la cible moléculaire (ADN topoisomérases)

4. Efflux actif en dehors de la cellule (transporteurs ABC)

Un échec majeur des chimiothérapies, dû au traitement par des médicaments

Résistance croisée à de nombreux agents chimiothérapeutiques

1

22

3

4

2

4

1


3. Les transporteurs ABC

Généralités

Une très large famille de protéines

Présents des microorganismes à l’Homme

Une séquence hautement conservée : ATP Binding Cassette

Une classification unique (HUGO) : → homologie structurale

Trois transporteurs ABC impliqués dans le phénotype MDR:

P-gp/ABCB1 (Glycoprotéine-P)

MRP1/ABCC1 (Multidrug Resistance Protein 1)

BCRP/ABCG2 (Breast Cancer Resistance Protein)


Transporteur Nomenclature MaladieMDR1, MRP1, BCRP ABCB1, ABCC1, ABCG2 Cancer

CFTR ABCC7 Mucoviscidose

ABC1 ABCA1Maladie de Tangier et déficience familiale en

HDL

MRP2 ABCC2Syndrome de Dubin-

Johnson

SUR1, SUR2 ABCC8, ABCC9Hyperinsulinisme

familial

Les pathologies associées aux transporteurs ABC

Des transporteurs impliqués dans de nombreuses fonctions physiologiques

Des mutations associant souvent ces transporteurs à des maladies



Topologie générale des transporteurs ABC

Une topologie générale

• 2 domaines transmembranaires (TMD) : reconnaissent les substrats

• 2 domaines de fixation des nucléotides (NBD) : fournissent l’énergie



Des motifs inclus dans les NBD très conservés

• Motif A de Walker

• Motif B de Walker

• Motif C, signature des ABC

Les domaines de fixation des nucléotides ou NBD


1

1

23

2

3


Higgins CF, et al. (2004)Nat Struct Mol Biol 11(10):918-26

Les différentes étapes du transport d’un substrat par un transporteur ABC



4. Le transporteur de multiples drogues MRP1

TMD1 TMD2 TMD3

NBD1 NBD2

Une topologie originale de MRP1

Un domaine transmembranaire supplémentaire en position N-terminale


Des NBD originaux au fonctionnement asymétrique

Des différences structurales

Une asymétrie fonctionnelle des NBD de MRP1

La structure de NBD1 a été résolue

Ramaen O, et al. (2006) J Mol Biol 359:940-949

Conformation non productive

du site catalytique

Peut expliquer la régulation entre

NBD1 et NBD2



Composés ExemplesAntinéoplasiques methotrexate, doxorubicine, étoposide, vincristine, vinblastine,

paclitaxel

Antiviraux Saquinavir, ritonavir

Antibiotiques Difloxacine, grepafloxacine

Metalloïdes Arsénite, arséniate, antimoine

Sondes fluorescentes Calcéine, Fluo-3, BCECF, SNARF

Toxines Aflatoxine B1

Conjugués à des glucuronides

Etoposide-Gluc

Conjugués au GSH Leucotriène C4, prostaglandine A2-SG

Conjugués à des glucuronides

17β-Estradiol-17-β-D-Gluc, glucuronosylbilirubine

Conjugués à des sulfates Estrone-3-sulfate

Peptides GSH, GSSG

Médicamentsxénobiotiques

Médicaments xénobiotiques

conjugués

Composés naturels

Une grande diversité de substrats transportés


Transports d’anions organiques

transports de substrats conjugués: GSH, glucuronates, sulfonates

Co-transport de substrats avec du GSH


NBD1 NBD2

Extracellulaire

Intracellulaire

ATP

ADP+Pi

1. Transport du GSH et du GSSG

2. Transport du LTC4

3. Transport de l’estrone sulfate

4. Transport de la vincristine

5. Effet du vérapamil

NBD1NBD1 NBD2NBD2

Différents mécanisme de

transport

Vérapamil

GSHGSH

GSSG

VincristineLTC4

Estrone sulfate

GSH

GSH



5. Les modulateurs de MRP1

Classe des composés Composés

Analogues des leucotriènes MK571

Stéroïdes ZK112993, LY329146

Bloqueurs de canaux calciques Vérapamil, PAK-104P, nicardipine, NIK 250

Nucléotides antisens ISIS-7597

Cyclosporines Cyclosporine A, PSC833

Flavonoïdes Génistéine, quercitine

Divers Probénécide, VX-710, MS-209, difloxacine, GF109203X, indométhacine, dipyridamole, LY415975

Un objectif : contrecarrer la chimiorésistance

Une stratégie : inhiber le transporteur

Des solutions : flavonoïdes et vérapamil

Pourquoi rechercher des modulateurs pour MRP1?


Caractériser la fonctionnalité et l’implication des NBD vis-à-vis des nucléotides, substrats et modulateurs

Étudier les énantiomères du vérapamil, comprendre leur activité

Déterminer de nouvelles structures efficaces, et comprendre pourquoi

LES OBJECTIFS DE CES TRAVAUX

Mieux comprendre le fonctionnement moléculaire de MRP1

Analyser une nouvelle stratégie de lutte contre la chimiorésistance

induite par MRP1

Améliorer les modulateurs actifs




II. RESULTATS




II. RESULTATS

1. Caractérisation fonctionnelle des NBD



Asymétrie fonctionnelle des NBD de MRP1

Rôle de cette asymétrie encore inconnue

Changements conformationnels induits par l’ATP sur les NBD : transfert d’information vers les TMD

Interaction de flavonoïdes avec les NBD de MRP1

Généralités

Trompier D, et al. (2003) Cell Mol Life Sci. 60(10):2164-77

Conseil G, et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 18;95(17):9831-6

Interaction des substrats et modulateurs sur les

NBD?

Propriété de fixation des nucléotides sur les NBD

?


8N 3AXP (µM)

0 100 200 3000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

mol

pro

be /

mol

pro

téin

e

NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

F0

/F

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

F0

/F

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

F0

/F

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

F0

/F

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

Nucléotides et NBD : interaction et modifications conformationnelles

○ NBD2 8-azido-[α-32P]ATP

NBD2 8-azido-[α-32P]ADP

● NBD1 8-azido-[α-32P]ATP

▲ NBD1 8-azido-[α-32P]ADP

● NBD seul

■ + ATP-Mg

▲+ ADP-Mg

NBD1 NBD2

Fort marquage par l’ATP sur NBD1,

faible pour l’ADP

Faible marquage sur NBD2

L’ATP et l‘ADP modifie

l’accessibilité des Trp

de NBD1

Seul l’ADP modifie

l’accessibilité de NBD2



MK571 (µM)

0 5 10 15 20 25

Att

énua

tion

de f

luo

resc

ence

(%

)

0

20

40

60

80

100

120

MK571 (µM)

0 5 10 15 20 25

Att

énua

tion

de f

luo

resc

ence

(%

)

0

20

40

60

80

100

120

LTC4 (µM)

0 2 4 6

Att

énua

tion

de f

luo

resc

ence

(%

)

60

70

80

90

100

110

LTC4 (µM)

0 2 4 6

Att

énua

tion

de f

luo

resc

ence

(%

)

60

70

80

90

100

110

Fixation du LTC4 et du MK571

● NBD1

■ NBD2

● NBD1

■ NBD2

Fixation du LTC4 sur les deux NBD

Fixation du MK571 sur les deux NBD

NBD1 Kd = 5.8 ± 0.4 µM NBD2 Kd = 8.2 ± 0.7 µM

NBD1 Kd = 6.0 ± 1.3 µM

NBD2 Kd = 3.9 ± 1.6 µM



NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

F0/

F

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

F0/

F

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1/MK571 (µM)-1

-0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

1/At

ténu

atio

n de

fluo

resc

ence

(%)

-1

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

1/MK571 (µM)-1

-0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

1/At

ténu

atio

n de

fluo

resc

ence

(%)

-1

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

1/MK571 (µM)-1

-0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4

1/A

tténu

atio

n de

fluo

resc

ence

(%)

-1

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

1/MK571 (µM)-1

-0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4

1/A

tténu

atio

n de

fluo

resc

ence

(%)

-1

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12A B

Les NBD et le NMeOHI2

● NBD1 seul

■ 30 µM NMeOHI2

▲30 µM NMeOHI2

+ 2 mM ATP-Mg

NBD1 NBD2

● NBD seul

■ 10 µM NMeOHI2

▲30 µM NMeOHI2

Modification de l’accessibilité des Trp de NBD1 par le NMeOHI2

Modification différente de l’ATP

Interaction au même site que le MK571



NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

F0/

F

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

F0/

F

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5F

0/F

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,7

NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5F

0/F

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,7

Changements conformationnels induits par les substrats et modulateurs

○ NBD seul

■ 30 μM docetaxel

▲ 30 μM vincristine

▼ 30 μM vinblastine

◊ 5 mM GSH

□ 5 μM LTC4

NBD1 NBD2

Tous les composés modifient l’accessibilité des Trp de NBD1

Seuls le GSH et le LTC4 modifient l’accessibilité des Trp de NBD2



Conclusions résultats 1

NBD1 NBD2NBD2ATPATP

ATPATP

LTC4MK571

NMeOHI2

LTC4MK571

NMeOHI2

VincristineVinblastine

GSHLTC4

VincristineVinblastine

GSHLTC4

LTC4MK571

NMeOHI2

LTC4MK571

NMeOHI2

GSHLTC4

GSHLTC4

InteractionInteraction InteractionInteraction

ModificationsConformationnelles






Les nucléotides et les NBD:

→ Comportement intrinsèque asymétrique vis-à-vis des nucléotides

→ Changements conformationnels pouvant expliquer le rôle de chaque NBD dans le mécanisme catalytique

→ Les domaines recombinants sont fonctionnels

Les substrats/modulateurs et les NBD:

→ Participation des NBD à la fixation des substrats et modulateurs?

→ Validation par d’autres techniques (photomarquage, mutagenèse, …)


II. RESULTATS


2. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1


*

Un dérivé diphénylalkylamine

Inhibiteur des canaux calciques de type L (cœur)

Utilisation en thérapeutique: hypertension, arythmie

L’énantiomère S est pharmacologiquement efficace

L’énantiomère S est beaucoup plus vite métabolisé

Le vérapamil



Trompier D, et al. (2004) Cancer Res 64:4950-4956

Vérapamil

Fuite massive du GSH intracellulaire Mort des cellules surexprimant MRP1 par apoptose

Effet du vérapamil sur MRP1

Low DW, et al. (2000) J Pharmacol Exp Ther 293(2):530-8


Vérapamil

Cellules

BHK-21

Cellules

BHK-MRP1


Vérapamil: inhibiteur de référence de la glycoprotéine -P

Même activité des énantiomères sur la glycoprotéine-P

Les énantiomères : 60 milliards de dollars dépensés chaque année aux USA

Effet physiologique différentiel des énantiomères de molécules

ThalidomideThalidomide IbuprofèneIbuprofène

Le vérapamil et ses énantiomères

et sur MRP1

…?



Seul le S-verapamil induit une cytotoxicité des cellules BHK-MRP1

Cytotoxicité des énantiomères du vérapamil

Verapamil (µM)

0 10 20 30 40

Via

bilit

é ce

llula

ire (

%)

0

20

40

60

80

100

Verapamil (µM)

0 10 20 30 40

Via

bilit

é ce

llula

ire (

%)

0

20

40

60

80

100

○ vérapamil +/-

□ vérapamil S

vérapamil R

● vérapamil +/-

■ vérapamil S

▲ vérapamil R

BHK-21

BHK-21-MRP1



Temps d'incubation (min)

0 20 40 60 80 100 120 140

Glu

tath

ion

intr

acel

lula

ire t

otal

(%

)

0

20

40

60

80

100

120

Temps d'incubation (min)

0 20 40 60 80 100 120 140

Glu

tath

ion

intr

acel

lula

ire t

otal

(%

)

0

20

40

60

80

100

120

○ 10 µM vérapamil +/-

□ 5 µM vérapamil S

5 µM vérapamil R

● 10 µM vérapamil +/-

■ 5 µM vérapamil S

5 µM vérapamil R

BHK-21

BHK-21-MRP1

Effet des énantiomères du vérapamil sur le transport de GSH par MRP1

L’effet du S-vérapamil est plus fort en absence de l’énantiomère R



1/S-verapamil (µM)-1

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,51/ G

luta

thio

n in

trac

ellu

laire

tota

l (nm

ol/m

g)-1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

1/S-verapamil (µM)-1

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,51/ G

luta

thio

n in

trac

ellu

laire

tota

l (nm

ol/m

g)-1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

● 0 µM vérapamil R

■ 2 µM vérapamil R

▲ 4 µM vérapamil R

BHK-21-MRP1

Effet du R-vérapamil sur l’activité du S-vérapamil

Inhibition de type mixte de l’isomère R sur l’activité de l’isomère S



Effet des énantiomères du vérapamil sur le transport de calcéine

Contrôle

Verapamil RVerapamil SMK571

BHK21

Contrôle

Verapamil R

MK571

Verapamil SBHK21-MRP1

Aucun effet sur

les cellules contrôles

Les 2 énantiomères inhibent

l’efflux de calcéine



Vincristine (nM)

0,1 1 10 100

Via

bili

té c

ellu

lair

e (

%)

0

20

40

60

80

100

Vincristine (nM)

0,1 1 10 100

Via

bili

té c

ellu

laire

(%

)

0

20

40

60

80

100

Vincristine (nM)

0,1 1 10 100V

iabi

lité

cellu

laire

(%

)0

20

40

60

80

100

IC50 (nM) de la vincristine

R-vérapamil (µM)

0 5 15

BHK-21 1,51 ± 0,4 1,48 ± 0,27 1,06 ± 0,38

BHK-MRP1 9,42 ± 0,23 2,87 ± 0,42 1,02 ± 0,18

BHK21

BHK21-MRP1

Réversion du phénotype MDR par le R-vérapamil

0 µM 15 µM 5 µM

Le vérapamil R réverse le phénotype MDR induit par MRP1



Purification de MRP1 à l’aide des cellules BHK-MRP1

MRP1

SDS-PAGE 6%, Coomassie

MW(KDa)

220 -

170 -

116 -

76 -

MR P1

MW(KDa)

205 -

115 -

97 -

Western Blot, Lumilight®

Purification de MRP1

20 boites de 15 cm Ø ~ 200 µg

Concentration ~ 0.07 µg/µl

Dépôt de 1.5 µg de protéines purifiées



NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

F0/

F

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

F0/

F

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4

F0/

F

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

NaI (M)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4

F0/

F

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

● MRP1 seul

▲ 0.5 µM R-vérapamil

■ 0.5 µM S-vérapamil

Pas d’asolectine 0.2 % asolectine

Changements conformationnels induits parles énantiomères du vérapamil

L’asolectine modifie l’accessibilité des Trp

Les deux énantiomères induisent des changements conformationnels différents

MRP1 seul KSV = 1.23 ± 0.15 M-1 0.5 µM R-vérapamil KSV = 2.51 ± 0.17 M-1

0.5 µM S-vérapamil fa = 0.45

MRP1 seul KSV = 1.46 ± 0.23 M-1 0.5 µM R-vérapamil fa = 0.420.5 µM S-vérapamil fa = 0.48



Verapamil enantiomers (µM)

0 1 2 3 4 5

Flu

ores

cenc

e qu

ench

ing

(%)

86

88

90

92

94

96

98

100

Verapamil enantiomers (µM)

0 1 2 3 4 5

Flu

ores

cenc

e qu

ench

ing

(%)

86

88

90

92

94

96

98

100

R-vérapamil

S-vérapamil

Fixation du S- et R-vérapamil sur MRP1 purifiée

Fixation du S et R-verapamil sur MRP1

R-vérapamil Kd = 47.7 ± 4 nM

S-vérapamil Kd = 92.5 ± 5 nM



1/S-Verapamil (µM)-1

0 20 40 60 80 100

1/flu

ores

cenc

e (%

)-1

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2


0 20 40 60 80 100

1/flu

ores

cenc

e (%

)-1

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2 0.5 µM R-vérapamil

MRP1 seul

0.05 µM R-vérapamil

Effet du R-vérapamil sur la fixation su S-vérapamil,topologie des sites de fixation

Modification de la fixation du S-vérapamil par le R-vérapamil



1/R -Verapamil (µM)-1

0 20 40 60 80 100 120

1/A

tténu

atio

n de

fluo

resc

ence

(%

)-1

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

1/R -Verapamil (µM)-1

0 20 40 60 80 100 120

1/A

tténu

atio

n de

fluo

resc

ence

(%

)-1

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

S-vérapamil


-20 0 20 40 60 80 100 120

1/A

ttén

uatio

n de

flu

ores

cenc

e (%

)-1

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2


-20 0 20 40 60 80 100 120

1/A

ttén

uatio

n de

flu

ores

cenc

e (%

)-1

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

MRP1 seul

■ 0.5 mM GSH

R-vérapamil

Effet du GSH sur la fixation du S-vérapamil et du R-vérapamil

Modification de l’interaction des deux énantiomères avec MRP1 par le GSH

Interdépendance entre les sites de fixation des énantiomères et du GSH



Effet des énantiomères du vérapamil sur l’activité ATPaseDe MRP1 purifiée

Act

ivité

AT

Pa

se (

nm

ol/m

in/m

g)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

S-V

erap

amil

N

one

R-V

erap

amil

GS

H R

-Ver

apam

il

+

GS

H S

-Ver

apam

il

+

GS

H

Act

ivité

AT

Pa

se (

nm

ol/m

in/m

g)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

S-V

erap

amil

N

one

R-V

erap

amil

GS

H R

-Ver

apam

il

+

GS

H S

-Ver

apam

il

+

GS

H

Con

trol

Act

ivité

AT

Pas

e (%

)

0

20

40

60

80

100

120

140

Vi

R-V

erap

amil

S-V

erap

amil

GS

HR

-Ver

apam

il+

GS

HS

-Ver

apam

il +

GS

H

Con

trol

Act

ivité

AT

Pas

e (%

)

0

20

40

60

80

100

120

140

Vi

R-V

erap

amil

S-V

erap

amil

GS

HR

-Ver

apam

il+

GS

HS

-Ver

apam

il +

GS

H

0.2 % asolectinePas d’asolectine

5 mM GSH

1 µM S- ou R-vérapamil

0.8 mM vanadate

Modification de l’activité ATPase par l’asolectine

Abolition des effets du GSH sur l’activité ATPase par le S-vérapamil, par d’effet du R-vérapamil

Activité basale : 2.11 ± 0.1 nmol/min/mg Activité basale : 16.2 ± 0.4nmol/min/mg




- Effets biologiques différents: → seul le S-vérapamil induit l’efflux du glutathion, entraînant la mort cellulaire

→ le R-vérapamil agit comme un inhibiteur de MRP1

- Les deux énantiomères ont des sites de fixation interdépendants

INTÉRÊT DE CES

RÉSULTATS

=

NOUVELLES

STRATEGIES

INTÉRÊT DE CES

RÉSULTATS

=

NOUVELLES

STRATEGIES

Il faut choisir entre les deux énantiomères pour cibler

MRP1 de manière plus efficace, et selon deux aspects:

- Le R-vérapamil a deux avantages:

→ il est peu cardiotoxique

→ il réverse le phénotype MDR

- Le S-vérapamil a l’avantage de tuer spécifiquement

les cellules susceptibles de devenir résistantes,

par induction de l’apoptose

Il faut choisir entre les deux énantiomères pour cibler

MRP1 de manière plus efficace, et selon deux aspects:

- Le R-vérapamil a deux avantages:

→ il est peu cardiotoxique

→ il réverse le phénotype MDR

- Le S-vérapamil a l’avantage de tuer spécifiquement

les cellules susceptibles de devenir résistantes,

par induction de l’apoptose

Perrotton T, et al. (2007) J Biol Chem 26;282(43):31542-8


NBD1NBD1 NBD2NBD2

R S

GSHS

GSH

GSHGSH

GSH

GSHGSH

Vincristine

Vincristine

Activité du S-vérapamil sur MRP1

1. Transport du GSH, et de la vincristine en co-transport avec le GSH

2. Fixation du S-vérapamil

3. Modification de la conformation de MRP1

4. Transport massif du GSH

5. Inhibition du transport de la vincristine

Extracellulaire

Intracellulaire

ATP

ADP+Pi


NBD1NBD1 NBD2NBD2

R S

R

GSH

GSH

GSH

GSH

GSH

GSH

GSHVincristine

Vincristine

1. Transport du GSH et de la vincristine en co-transport avec le GSH

2. Fixation du R-vérapamil

3. Modification de la conformation de MRP1

4. Inhibition du transport de la vincristine et du GSH

Activité du R-vérapamil sur MRP1

Extracellulaire

Intracellulaire

ATP

ADP+Pi


NBD1NBD1 NBD2NBD2

R S

Extracellulaire

Intracellulaire ADP+Pi

RS

Sites de fixationdes énantiomères du vérapamil

La fixation du R-vérapamil sur MRP1 modifie la fixation du S-vérapamil

Interdépendance des sites de fixation des énantiomères du vérapamil

ATP



Synthèse des énantiomères diiodés du vérapamil, pour une meilleure efficacité à plus faible concentration

Etudier l’influence des énantiomères du vérapamil sur la fixation du glutathion sur MRP1, intérêt mécanistique

Etudier l’influence du phénotype cellulaire sur l’activité du S- vérapamil

Passer à un modèle animal


II. RESULTATS



3. Relation structure/activité des dérivés iodés du vérapamil


3. Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil

ComposésType de modification chimique

1 2 3 4 n

Verapamil CH3 OCH3 OCH3 - 2

NMeOMe CH3 - OCH3 - 2

NMeOMeI CH3 I OCH3 - 2

NMeOMeI2 CH3 I OCH3 I 2

NMeOH CH3 - OH - 2

NMeOHI CH3 I OH - 2

NMeOHI2 CH3 I OH I 2

Verapamil C CH3 - OH - 3

Verapamil CI CH3 - OH I 3

Verapamil CI2 CH3 I OH I 3

Verapamil D CH3 - OH - 1

Verapamil DI CH3 - OH I 1

Verapamil DI2 CH3 I OH I 1

NHOH H - OH - 2

NHOHI H I OH - 2

NHOHI2 H I OH I 2

N

N

CH3

CH3

O

O

CH3

CH3

1

2

3

( )n

Partie « ouest »

Partie « est »

3

2

4

4

Structure chimique des dérivés iodés du vérapamil


ComposésIC50 (µM)

BHK-21-MRP1 BHK-21

Verapamil 10.6 ± 0.5 ≥ 100

NMeOMe 17.2 ± 1.0 33.6 ± 7.7

NMeOMeI 4.7 ± 0.6 13.0 ± 0.5

NMeOMeI2 1.7 ± 0.9 8.9 ± 0.3

NMeOH 11.7 ± 0.3 55.9 ± 0.8

NMeOHI 8.6 ± 1.2 32.8 ± 0.9

NMeOHI2 1.1 ± 0.9 54.7 ± 7.1

Verapamil C 20.9 ± 1.4 ≥ 100

Verapamil CI 9.3 ± 1.4 9.4 ± 0.2

Verapamil CI2 6.0 ± 0.8 33.1 ± 5.1

Verapamil D 6.6 ± 0.9 28.5 ± 1.6

Verapamil DI 13.0 ± 1.2 14.1 ± 0.3

Verapamil DI2 6.6 ± 1.2 27.4 ± 2.6

NHOH 38.1 ± 0.3 ≥ 100

NHOHI 0.78 ± 0.7 14.2 ± 0.3

NHOHI2 1.96 ± 0.4 13.8 ± 0.5

Cytotoxicité des dérivés iodés du vérapamil

L’iodation augmente l’efficacité des molécules en général



C

Verapamil (µM)

0 5 10 15 20 25 30

Su

rvie

ce

llula

ire

(%

)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Verapamil (µM)

0 5 10 15 20 25 30

Su

rvie

cellu

laire (

%)

-20

0

20

40

60

80

100

120

NHOHI (µM)

0 5 10 15 20 25 30

Surv

ie c

ellu

laire (

%)

0

20

40

60

80

100

120

NHOHI (µM)

0 5 10 15 20 25 30

Surv

ie c

ellu

laire (

%)

0

20

40

60

80

100

120

NMeOHI2 (µM)

0 5 10 15 20 25 30

Su

rvie

ce

llula

ire

(%

)

0

20

40

60

80

100

120

NMeOHI2 (µM)

0 5 10 15 20 25 30

Su

rvie

ce

llula

ire

(%

)

0

20

40

60

80

100

120

Vérapamil NHOHI NMeOHI2

Toxicité cellulaire du vérapamil et de deux dérivés actifs

Trois composés intéressants

F > 10 F ~ 18 F ~ 49



Effet des dérivés iodés du vérapamil sur le contenu cellulaire en GSH

Tem

ps p

our

50 %

d'e

fflu

x du

GS

H c

ellu

laire

(m

in)

0

10

20

30

40

50

60

NH

OH

IN

HO

HI 2

Ver

apam

il C

Ver

apam

il C

IV

erap

amil

CI 2

Ver

apam

il D

Ver

apam

il D

IV

erap

amil

DI 2

NM

eOM

eN

MeO

MeI

NM

eOM

eI2

NM

eOH

NH

OH

Ver

apam

il

NM

eOH

IN

MeO

HI 2

Tem

ps p

our

50 %

d'e

fflu

x du

GS

H c

ellu

laire

(m

in)

0

10

20

30

40

50

60

NH

OH

IN

HO

HI 2

Ver

apam

il C

Ver

apam

il C

IV

erap

amil

CI 2

Ver

apam

il D

Ver

apam

il D

IV

erap

amil

DI 2

NM

eOM

eN

MeO

MeI

NM

eOM

eI2

NM

eOH

NH

OH

Ver

apam

il

NM

eOH

IN

MeO

HI 2

Effet de la taille du linker

Effet de l’iodation




Intérêts des modifications chimiques:

→ Pas de bénéfice lors de modification linker

→ Puissant effet de l’iodation

→ CH3 → OH: pas d’intérêt sauf dans cas d’iodation

Intérêt: synthétiser et étudier les énantiomères du NMeOHI2

Etudier attentivement les résultats du dosage de GSH, ne pas se contenter de la toxicité cellulaire!


II. RESULTATS








Mieux comprendre le fonctionnement moléculaire de MRP1

Explication de l’asymétrie des NBD dans leur séquences

La différence de fixation des nucléotides peur expliquer les différentes étapes du cycle catalytique

Les NBD ont la capacité de fixer le LTC4 et le MK571

Le GSH, le NMeOHI2, la vincristine et la vinblastine modifient l’accessibilité des NBD

Participation des NBD à la fixation des substrats?

Intérêt mécanistique à confirmer par d’autres techniques

Intérêt mécanistique à confirmer par d’autres techniques



Analyser une nouvelle stratégie de lutte contre la chimiorésistance

induite par MRP1

Améliorer les modulateurs actifs

S-vérapamil : responsable de

l’efflux de GSH

R-vérapamil : inhibiteur du

transporteur

Une nouvelle stratégie thérapeutique : aller plus loin,

d’autres modèles

Une nouvelle stratégie thérapeutique : aller plus loin,

d’autres modèles

Un intérêt majeur de l’halogénation

des composés

Un dérivé prometteur : le NMeOHI2

Synthétiser les énantiomères du NMeOHI2 :

un espoir prometteur!

Synthétiser les énantiomères du NMeOHI2 :

un espoir prometteur!


REMERCIEMENTS

Le laboratoire du Dr. DI PIETRO, IBCP, Lyon

• Dr. Atillio DI PIETRO• Dr. Hélène CORTAY• Dr. Pierre FALSON• Tous les membres du laboratoire et de l’Institut

Plateau technique cytométrie en flux, IFR128, Lyon

• Chantal BELLA• Odette DE BOUTEILLER

Mayo Clinic, Scottsdale, USA

• Dr. Xiu-Bao CHANG• Yue-Xian HU et Irène BEAUVAIS

Département de Chimie Moléculaire, UJF, Grenoble

• Dr. Amaury DU MOULINET DHARDEMARE

University of Cape Town Medical School, Cape Town, SOUTH AFRICA

• Dr. David MCINTOSH

Étude du transporteur mrp1 : caractérisation des nbd, et étude de modulateurs conduisant à la...

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