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ENZIMAS USADAS EN CLONAJE MOLECULAR
1- Enzimas de Restricción
2.- Otras enzimas
B. Paz
2011-I ( Ing. Biotecnológica)
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MAPA DE RESTRICCION DEL pBR 322
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OTRAS ENZIMAS USADAS EN CLONAJE MOLECULAR Recomendaciones para su uso:
Nunca usar una de estas enzimas en una reacción que contiene < 0.1 mg/ml de proteína. En estos casos usar BSA
Trabajan eficientemente sólo cuando la concentración de sustrato es la adecuada. Tratar siempre de trabajar a concentraciones cercanas a la Km.
Usar el pH, Temperatura y los requerimientos iónicos que les corresponde
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RELACION DE ENZIMAS(I)
DNA POLIMERASAS: DNA POLIMERASA I (Holoenzima) FRAGMENTO KLENOW DE LA DNA POL I DNA POLIMERASA DE T4 DNA POLIMERASA DE T7 Taq DNA POLIMERASA TRANSCRIPTASA REVERSA DNA POLIMERASA TRANSFERASA TERMINAL
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RELACION DE ENZIMAS (II)
RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTES:
LIGASAS
QUINASAS
FOSFATASAS
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RELACION DE ENZIMAS (III) NUCLEASAS:
Nucleasa Bal 31 Nucleasa S1 Ribonucleasa A Ribonucleasa T1 Desoxirribonucleasa I Exonucleasa III
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CARACTERISTICAS DE LAS DNA POLIMERASAS
Son usadas en varias etapas del clonaje molecular en donde se sintetiza DNALa mayoría requiere de un molde y sintetizan un producto complementarioPueden también copiar RNA pero lo hacen con muy poca eficienciaLas más usadas son : DNA pol I, fragmento Klenow, DNA pol T4, DNA pol T7, Taq polimerasa, Transcriptasa reversa y DNA pol transferasa terminal
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COMPARACION DE LA ACCION DE LAS DNA POLIMERASAS
DNA pol pol I F. K. Taq pol -
R.T.
Polimeriza
5’→3’ +
+ +
+
Exonucleasa
5’→ 3’ + -
+ +
Exonucleasa
3’→ 5’ + + - -
Actividad RNAasa H
+ - - +
P.M.(Kd) 109 76 94 84 y 170
No Unid. 1
1 1 1 y 2
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1.1 DNA POLIMERASA I (Holoenzima)
Características:
1. Tiene una sóla cadena polipeptídica
2. P.M de 109,000
3. Actividad polimerizante 5’→ 3’
4. Actividad exonucleásica 5’→3’ y 3’→5’
5. Tiene actividad RNAasa H
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DNA POLIMERASA I (Holoenzima)
USOS: Marcación de DNA mediante “nick
translation” Fue usada originalmente para copiar la
cadena complementaria del cDNA en el clonaje del cDNA
Marcar el extremo 3’ del DNA
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1.2 FRAGMENTO KLENOW (Fragmento largo de la DNA de la DNA polimerasa I) Características:1. En 1970 Klenow y Henningsen mediante
tratamiento proteolítico limitado de la DNA pol I obtuvieron un fragmento largo (PM 76000) que mantenía la actividad polimerizante y exonucleásica 3’→5’
2. Hoy día se le obtiene al tratarla con subtilisina o mediante clonaje
3. Permite hacer algunos experimentos superando los problemas de la acción exonucleásica 5’→3’ de la DNA pol I
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FRAGMENTO KLENOW (USOS I)
USOS:
1. Llenar los terminales 3’ creados por la digestión del DNA con las enzimas de restricción. Generalmente FK trabaja con el mismo tampón que el usado para la RE.
2. Marcar el terminal de un fragmento de DNA usando dNTPs marcados con P-32.
3. Marca terminal en la cola 3’ del DNA
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FRAGMENTO KLENOW (Usos II)
Usos:
4.- Sintetizar la hebra complementaria del cDNA en experimentos de clonaje del cDNA
5.- Secuenciación del DNA por el método de Sanger (Método del dideoxi)
6.- En PCR
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1.3 DNA POLIMERASA DEL T4CARACTERÍSTICAS:
1. A semejanza del FK la DNA polimerasa del bacteriófago T4 tiene acción polimerizante 5’→3’ y acción exonucleásica 3’→5’, que es más activa en el DNA de una hebra que el de doble hebra.
2. La actividad exonucleásica de la DNA pol del T4 es 200 veces más activa que la del FK
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DNA POLIMERASA DEL T4 USOS ADEMAS DE LOS SEÑALADOS
PARA EL FK:1. Marcación de fragmentos de DNA para
pruebas de hibridización, pudiendo los fragmentos ser convertidos en pruebas específicas mediante el uso de enzimas de restricción.
2. Extensión de primers oligonucleotídicos mutagénicos que se han unido a moldes de DNA de una sola hebra.
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1.4 DNA POLIMERASA DEL BACTERIOFAGO T7 CARACTERÍSTICAS Es la DNA polimerasa que se induce después de la
infección de E. coli por el bacteriófago T7 Esta polimerasa se presenta como la unión de 2
proteínas, la proteína del gen 5 del T7 y la proteína del hospedero tiorredoxina
Tiene actividad polimerizante 5’→3’, carece de actividad exonucleásica 5’→3’; pero tiene una actividad exonucleásica 3’→5’ mil veces más activa que la del fragmento Klenow.
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1.5 Taq DNA POLIMERASA
CARACTERISTICAS(I): Es una DNA polimerasa (PM 94000)
termoestable purificada inicialmente del Thermus aquaticus (Chien et al. 1976) y posteriormente obtenida mediante ingeniería genética (AmpliTaqTM Perkin Elmer Cetus)
Estas enzimas tienen actividad exonucleásica dependiente de la polimerización 5’→3’.
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Taq DNA POLIMERASA
CARACTERISTICAS (II): En la incorporación de nucleótidos la enzima
trabaja mejor entre 75 a 80o C.
La actividad polimerizante se reduce a la mitad a 60o
C. y en 1/10 a 37o C. Requiere de iones Mg Los tampones fosfato inhiben a la Taq
polimerasa, debe usarse tampón Tris-HCl pH 8.3
![Page 21: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/21.jpg)
AMIGOS
![Page 22: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/22.jpg)
HERMANOS
![Page 23: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/23.jpg)
Taq POLIMERASA
USOS
1. Para la secuenciación del DNA
2. Amplificación mediante PCR
A causa de la significativa amplificación que determina, puede utilizar cantidades muy pequeñas de DNA. Con sólo 100 ul de sangre podemos retirar suficiente DNA para PCR y para la detección de cualquier mutación.
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1.6 TRANSCRIPTASA REVERSA
CARACTERISTICAS (I): Se conocen dos formas comercialmente
disponibles de transcriptasa reversa (TR):1. Una preparación obtenida del virus de la
mieloblastosis aviaria (AMV)
2. Una enzima aislada de una cepa de E. coli que expresa una copia clonada del gen de la TR del virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV)
![Page 25: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/25.jpg)
TRANSCRIPTASA REVERSA
CARACTERÍSTICAS (II): Ambas enzimas carecen de actividad
exonucleásica 3’→5’ La aviaria (AMV) tiene 2 polipéptidos que
tienen tanto la actividad polimerizante y una poderosa actividad RNAasa H.
La murina (Mo-MLV) es una simple cadena polipeptídica (PM 84000), tiene actividad polimerizante y su actividad RNAasa H es más débil
![Page 26: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/26.jpg)
TRANSCRIPTASA REVERSA
CARACTERISTICAS (III): La aviaria trabaja eficientemente a 42o C., que es
una temperatura normal para las aves; en tanto que la murina se inactiva rápidamente a esta temperatura.
Por lo anterior, los RNAs con una importante estructura secundaria se copian mejor con la enzima aviaria; sin embargo las preparaciones de AMV pueden estar contaminadas con una endonucleasa que corta el DNA
![Page 27: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/27.jpg)
TRANSCRIPTASA REVERSA
CARACTERISTICAS (IV): La enzima aviaria trabaja más eficientemente a pH
8.3 que a pH 7.3 que es el más adecuado para la murina
Es tan crítico lo del pH que la longitud del cDNA sintetizado por ambas enzimas se reduce cuando el pH es diferente en tan sólo 0.2 unidades de pH del recomendado. Como el pH del tampón Tris, varía con la temperatura, se debe chequear el pH a la temperatura usada para la incubación
![Page 28: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/28.jpg)
TRANSCRIPTASA REVERSA
USOS:
1. Su principal empleo es en la transcripción del mRNA en cDNA de doble cadena que puede ser insertada en los vectores procarióticos; aunque también puede ser usada tanto con DNA de una hebra o RNA para pruebas usadas en hibridización.
2. Para secuenciar DNA por el método del dideoxi cuando las otras polimerasas están fallando.
- :
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TRANSCRIPTASA REVERSA
PARA LA FABRICACION DE “PRIMERS” PARA LA T.R., SE PUEDE USAR: Oligo dT ( 12 a 18 nucleótidos) Oligonucleótidos de secuencia al azar Oligonucleótidos de secuencia definida
LA Km DE LA T.R. PARA LOS dNTP ES MUY ALTA (rango milimolar); PARA PREVENIR LA TERMINACION PREMATURA DEL DNA QUE SE FORMA, SE DEBE USAR ALTAS CONCENTRACIONES DE dNTP
![Page 30: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/30.jpg)
2. RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTES RNA POLIMERASAS DE LOS FAGOS SP6, T7 y
T3.CARACTERÍSTICAS Los fagos señalados sintetizan una RNA polimerasa
DNA dependiente que reconocen e inician la síntesis de RNA sobre moldes de DNA de doble hebra, que llevan el promotor apropiado específico del fago
Los genes de estas enzimas han sido clonados y se expresan en E.coli y levadura
![Page 31: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/31.jpg)
RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTES USOS1. Síntesis de RNA de una hebra para ser usado
como prueba para hibridización2. Síntesis de RNA para ser usado como mRNA
funcional para traducción “in vitro”3. Síntesis de RNA para ser usado para estudiar
el “splicing” “ in vitro”4. Para transcripción de genes clonados en
bacterias y levaduras
![Page 32: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/32.jpg)
RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTESACCION DE LAS RNA POL. DE SP6,T3 y T7Actividad : Polimeriza el RNA en sentido 5’→ 3’
Sustrato : DNA de doble hebra conteniendo el promotor
específico.
Ejemplo:
5’ SP6 G A T C A T C A T C A T C G A T C
PROMOTOR
3’ C T A G T A G T A G T A G C T A G
Mg2* RNA pol de SP6
rATP,rGTP,rUTP y rCTP ↓
5’ppp G A U C A U C A U C A U C G A U C
![Page 33: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/33.jpg)
3. DNA LIGASAS Las DNA Ligasas son enzimas usadas para
unir dos piezas de DNA Las más usadas son:
DNA ligasa del bacteriófago T4 DNA ligasa de E. coli
![Page 34: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/34.jpg)
DNA LIGASA 3.1 DNA LIGASA DEL BACTERIOFAGO T4
Polipéptido de 68 000 daltons de P.M. que cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre el 3’ hidroxilo y el 5’ fosfato terminal en el DNA
USOS: Unir moléculas de DNA con terminales cohesivos
-Esta acción es estimulada por PEG a bajas concentraciones y requiere de ATP y iones Mg
Unir moléculas de DNA con terminales romos- Es más lenta que la acción anterior pero aumenta su
velocidad en presencia de NaCl 200 mM
![Page 35: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/35.jpg)
DNA LIGASA
3.2.- DNA LIGASA de E. coli Cataliza la formación de enlaces diéster fosfóricos en
los terminales cohesivos del DNA Los estudios iniciales indicaron que no unía terminales
romos, pero se ha mostrado que en presencia de PEG puede hacerlo
No une segmentos de RNA Es de menos uso que la DNA ligasa de T4
![Page 36: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/36.jpg)
RNA LIGASA DE BACTERIÓFAGO T4 Características:
La RNA ligasa del bacteriófago T4 cataliza la unión covalente de fragmentso de RNA o de DNA de una hebra.
Usos:- Como puede usar como sustratos mononucleótidos
(ejemplo pNp) se le puede usar para marcar el 3’ terminal del RNA
- Síntesis de oligodesoxirribonucleótidos
![Page 37: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/37.jpg)
4. POLINUCLEOTIDO QUINASA DEL BACTERIOFAGO T4 CARACTERISTICAS:
Cataliza la transferencia del fosfato γ del ATP al extremo 5’ terminal del DNA y RNA
USOS:
-Marcación del extremo 5’ terminal del DNA para la secuenciación de DNA por el método de Maxam-Gilbert
-Forforilación de linkers sintéticos
![Page 38: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/38.jpg)
5. FOSFATASAS ALCALINAS
CARACTERISTICAS Se usa con mayor frecuencia la fosfatasa
alcalina bacteriana (BAP) y la fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIP).
Catalizan el retiro del residuo 5’ fosfato del DNA tanto del RNA, DNA y de rNTPs y dNTPs
![Page 39: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/39.jpg)
FOSFATASAS ALCALINAS
USOS: Retiro de los fosfato 5’ del DNA y
RNA antes de sustituirlo por fosfato marcado con P-32
Retiro de los 5’ fosfato del DNA para prevenir su unión.
![Page 40: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/40.jpg)
6. NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31
CARACTERISTICAS: BAL 31 es predominantemente una exonucleasa
3’ que retira mononucleótidos de ambos extremos 3’ de las dos hebras del DNA.El DNA de una hebra que va dejando es degradado por su acción endonucleásica
La reacción es estrictamente dependiente de calcio y por lo tanto puede ser detenida en cualquier momento por la adición de agentes quelantes del Ca como el EGTA
![Page 41: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/41.jpg)
NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31
USOS: Remoción de nucleótidos del extremo terminal
del DNA en una manera controlada. Mapear sitios de restricción en el DNA Mapear estructura secundaria del DNA( lugares
de unión entre B-DNA y Z-DNAy sitios de modificaciones covalentes y no covalentes en el DNA e doble hebra)
Remoción de nucleótidos de RNA de doble hebra
![Page 42: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/42.jpg)
NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31
DETERMINACION DE LA VELOCIDAD DE REMOCION DE LOS NUCLEÓTIDOS:
2Vmáx . Mn V = ---------------------------
( Km + (S))
Donde : Vmax de la reacción
Mn el P.M, promedio de un
mononucleótido
(S) Moles/L de DNA en el tiempo O
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NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31
OBSERVACION IMPORTANTE:Cuando los productos de la digestión de Bal 31 serán ligados, se debe tener muy en cuenta que la actividad exonucleásica 3’ de la enzima es 20 veces más eficiente que la actividad endonucleásica.
Lo anterior determina que el tratamiento con DNA polimerasa de T4 o el fragmento Klenow deben ser usados para digerir las colas de una hebra que van quedando.
Almacenar la enzima a cero grados, no congelada.
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ACCION DE LA NUCLEASA BAL 31
5’ ----------------------------- 3’ 3’ ----------------------------- 5’ ↓ ------------------ ------------------ ↓ ------- ------- (10 A 20% )
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NUCLEASA S1 CARACTERISTICAS:
La nucleasa S1 degrada DNA y RNA de hebra simple para dar nucleótidos 5 fosfato ( dN ó rN)
Los DNA y RNA de doble hebra y los híbridos DNA-RNA son relativamente resistentes a la enzima; pero esto se supera cuando se usan concentraciones grandes de la enzima
![Page 46: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/46.jpg)
PROTECCION DEL ADN CON NUCLEASA S1
![Page 47: Enzimas Usadas en Clonaje Molecular2011-Biotech](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062307/5571faca49795991699320de/html5/thumbnails/47.jpg)
RIBONUCLEASA A DE PANCREAS DE BOVINO CARACTERISTICAS:
RNAasa A es una endorribonucleasa que ataca especificamente RNA de una hebra en el extremo 3’ de sus nucleótidos pirimidínicos, rompiendo la unión del fosfato al nucleótido adyacente
Sus productos son nucleótidos pirimidínicos 3’ fosfato y oligonucleótidos con terminal nucleotídico pirimidínico 3’ fosfato
5’pApGpGpCpCpApGpUpAp3’ > 5’pApGpGp + Cp + Cp + ApGpUp + Ap 3’
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RIBONUCLEASA A DE PANCREAS DE BOVINO La RNAasa A es activa en ausencia de cofactores y
cationes divalentes; pero es inhibida por el inhibidor placentario de la RNAasa o por los complejos vanadil ribonucleósidos.
USOS Retiro de regiones no hibridizadas de RNA en los
híbridos DNA-RNA
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RIBONUCLEASA T1 ( Aspergillus oryzae) CARACTERISTICAS
RNAasa T1 es una endorribonucleasa que ataca especificamente ataca los grupos 3’ fosfato de los nucleótidos de guanina y rompe el enlace 5’ fosfato al nucleótido adyacente.
Los productos finales son guanosina 3’ fosfato y oligonucleótidos con terminal en guanosina3’ fosfato.
5’pApGpGpCpUpGpApC 3’ > 5’pApGp + Gp + CpUpGp + ApC 3’
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RIBONUCLEASA T1 ( Aspergillus oryzae) USOS:
Retiro de regiones de RNA de los híbridos DNA-RNA
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DESOXIRRIBONUCLEASA I(DE PÁNCREAS DE BOVINO)
CARACTERISTICAS: DNAasa I es una endonucleasa que hidroliza DNA de
doble hebra o de hebra simple preferencialmente en los lugares adyacentes a nucleótidos pirimidínicos
En presencia de iones Mg la DNAasa I ataca cada cadena de DNA independientemente
En presencia de iones manganeso la DNAasa I ataca ambas cadenas de DNA a aproximadamente el mismo lugar dando fragmentos de DNA que son romos o que sobresalen solamente en uno o dos nucleótidos (Melgar E.y Goldthwait D.A. J. Biol. Chem 243:4409, 1968 )
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DESOXIRRIBONUCLEASA I(DE PÁNCREAS DE BOVINO)
USOS: Introduciendo huecos al azar en el DNA de doble
hebra en preparaciones para “ nick translation”. Introduciendo un solo hueco en DNAs circulares en
preparaciones para mutaciones mediadas por bisulfito
Generando clones al azar para secuenciación en vectores del bacteriófago M13
Análisis de complejos proteína-DNA (DNAasa footprinting)
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EXONUCLEASA III ( E. coli ) CARACTERISTICAS
La exonucleasa III cataliza el retiro de mononucleótidos 5’ del extremo 3’ terminal del DNA de doble hebra, no tiene actividad sobre DNAs de una hebra
Tiene como otras actividades añadidas una actividad endonucleasa específica para DNAs apurínicos y RNAasa H
5’ p----------------------------------OH 3’
3’OH------------------------------P 5’ ↓
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EXONUCLEASA III(E. coli )
ACTIVIDAD:
5’ p----------------------------------OH 3’
3’OH------------------------------P 5’
↓
5’P---------------------OH 3’
3’OH--------------------P 5’
+ 5’pN OH
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