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Discente: Abadio Oliveira da Costa Júnior
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Small RNAs
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Regulação genômica por Small RNAs
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Diferentes tipos de small RNAs
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Diferentes tipos de small RNAs
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Dificuldades para avaliar as diversas funções de sRNAs
• Necessidade de extração de RNA total de amostra tecidual;
• Adição de miRNA inibidor pode afetar a detecção de miRNAs complementares;
• RNAs genômicos virais podem mascarar a detecção de vsRNA complementar.
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METODOLOGIA Formamida (F) – convencional
FDEFormamida + EDTA 0.5 mM
+Corantes
Incubação65ºC 5-10 min
RNA
Refrigeraçãoimediata
Formaldeido-Formamida (FDF)
FDFFormaldeido (40%) +
Formamida + MOPS (MOPS-acetato
de sódio-EDTA)
RNA
Eletroforese(TBE)
Incubação55ºC 15 min
Adição corante a T.A.
Eletroforese(MOPS)
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Eletroforese
Blotting21nt sense (21_S)
21nt antisense (21_AS)21nt não-complementar
(21_NC)
RNA complementar pode influenciar na detecção por sRNA?
sRNA (21nt)+
Oligonucleotídeos 21 ou 40 nt
Form
amid
a
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Eletroforese
Blotting21nt sense (21_S)
21nt antisense (21_AS)21nt não-complementar
(21_NC)
RNA complementar pode influenciar na detecção por sRNA?
sRNA (21nt)+
Oligonucleotídeos 21 ou 40 nt
Form
amid
a
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Eletroforese
Blotting21nt sense (21_S)
21nt antisense (21_AS)21nt não-complementar
(21_NC)
RNA complementar pode influenciar na detecção por sRNA?
sRNA (21nt)+
Oligonucleotídeos 21 ou 40 nt
Form
amid
a
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A presença de RNA complementar interfere na clonagem de sRNA?
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A presença de RNA complementar interfere na clonagem de sRNA?
A presença de oligonucleotídeos em maior concentração que o sRNA de interesse reduz o sinal de hibridização.
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RNA 21_S 32P ‘hot’+
RNA total (A. thaliana)
+Oligonucleotídeos 40nt_AS ou aleatórioFo
rmam
ida
Eletroforese
Radioexposição
RNA complementar pode influenciar na detecção por sRNA?
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RNA 21_S 32P ‘hot’+
RNA total (A. thaliana)
+Oligonucleotídeos 40nt_AS ou aleatórioFo
rmam
ida
Eletroforese
RadioexposiçãosRNA hibridizado permanece estável em gel contendo uréia a 7M e que o ensaio de northen pode não fornecer estimativa
acurada da abundancia de sRNA.
RNA complementar pode influenciar na detecção por sRNA?
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Como resolver o problema de sequestro do sRNA?
RNA Formamida + uréia +
Glioxal/DMSO
Formamida
Eletroforese
Fervura(98ºC)
Blotting21nt sense (21_S)
21nt antisense (21_AS)
RNA Tampão FDF
Eletroforese(MOPS)
Aquecimento(50ºC)
FDF
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Como resolver o problema de sequestro do sRNA?
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Como resolver o problema de sequestro do sRNA?
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Como resolver o problema de sequestro do sRNA?
O tratamento com FDF aboliu completamente o sequestro de sRNA.
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Como resolver o problema de sequestro do sRNA?
• Impede o sequestro de sRNAs por seu complemento;
• O sRNA apenas é exposto ao formaldeído durante o tratamento antes de electroforese.
Dois fatores reforçam o uso de FDF:
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Sequestro de sRNA representa um problema em amostras biológicas?
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Sequestro de sRNA representa um problema em amostras biológicas?
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Sequestro de sRNA representa um problema em amostras biológicas?
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Sequestro de sRNA representa um problema em amostras biológicas?
Os pontos quentes observados sob FDFSS provavelmente se assemelham ao estado in vivo.
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Sequestro de sRNA representa um problema em amostras biológicas?
![Page 26: Discente: Abadio Oliveira da Costa Júnior. Small RNAs](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022081604/570638611a28abb8239001b4/html5/thumbnails/26.jpg)
Sequestro de sRNA representa um problema em amostras biológicas?
miRNAs podem ser sequestrados por RNAs endógenos complementares nas amostras NSS.
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O tratamento com FDFSS afeta sRNA endógenos?
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O tratamento com FDFSS afeta sRNA endógenos?
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O tratamento com FDFSS afeta sRNA endógenos?
Estes achados validam a comparação de FDFSS x NSS para identificar a relevância biológica de sRNA sequestados.
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O tratamento com FDFSS altera a composição da sequência de sRNA?
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O tratamento com FDFSS altera a composição da sequência de sRNA?
Nenhuma diferença significativa na composição de bases foi observada.
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• o excesso de RNAs complementares presentes (durante a infecção viral ou quando miARNs são submetidos a controle por ceRNAs) a detecção de pequenos RNAs cognatos pode ficar distorcido;
• Desenvolvido novo método (FDF-PAGE) de desnaturação à base de formaldeído para contornar o potencial de sequestro de sRNA por RNA complementar
• Comparação de FDF-PAGE a métodos não desnaturante é um primeiro passo na identificação de sRNAs sob o controle de ceRNAS.
Conclusões