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Medio Ambiente
Diagnóstico microbiológico de Legionella: situación actual
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Medio Ambiente
Ningún método puede ser mejor que la muestra sobre laque se realiza el análisis
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Medio AmbienteEstudio medioambiental de Legionella
AGUA LODO AIRE
Toma de muestras eficaz
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Medio Ambiente
REDES DE DISTRIBUCIÓN:
- Cabos extremos- Zonas de bajo consumo- Fuentes públicas- Bocas de riego
Toma de muestra de agua
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Medio Ambiente
REDES INTERNAS:- Aljibes y depósitos- Intercambiadores de calor- Acumuladores de agua caliente- Grifos y duchas- Circuitos de aa- Redes contraincendios
Toma de muestra de agua
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Medio Ambiente
EQUIPOS QUE UTILIZAN AGUA EN SU FUNCIONAMIENTO:
- Torres de refrigeración- Acondicionadores evaporativos- Humidificadores- Terapia respiratoria- Equipos de hidroterapia
Toma de muestra de agua
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Medio Ambiente
VENTAJAS
• Q ↑ (100 L/min ⇒ ↓ t
• ↑ V de muestra
• No procesamietnode muestra
• Bateriaincluida
INCONVENIENTES
• Saturación de placas
• ↓ viabilidad (stress, desecación)
• Cultivo
• Equipos caros
VENTAJAS
• No desecación
• Diluciones y ≠medios de cultivo
• Cultivo y otras técnicas (PCR)
INCONVENIENTES
• Q max 12,5 L/min ⇒ ↑ t
• A V ↑ ⇒evaporacion, reaerosoliz. y ↓viabilidad
• ↑ recuentos (“clusters”)
• Partículas hidrofóbicas
• Bomba
Toma de muestra de bioaerosoles
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Medio Ambiente
EDIFICIOS DE OFICINAS
• Torres refrigeración (25-30ºC)
• Sistemas de aire acondicionado
Toma de muestra de bioaerosoles
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Medio Ambiente
INDUSTRIA
Torres refrigeración (30-35ºC)
Humidificadores
Toma de muestra de bioaerosoles
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Medio Ambiente
EDAR• Pretratamiento• Decantadores primarios•Tratamiento biológico•Deshidratación fangos
Toma de muestra de bioaerosoles
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Medio Ambiente
CENTROS HOSPITALARIOS
Quirofanos
Toma de muestra de bioaerosoles
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Medio Ambiente
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Medio Ambiente
PCR Secuenciaciónde
rDNA 16S
Hibridación FISH
Fenotípicos Genotípicos
Aislamiento en cultivo
Pruebas de confirmación metabólicas
MétodosInmunológicos
Microscopía
Métodos diagnósticos
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Medio AmbienteMétodos fenotípicos de detección
1. Detección de antígeno
- Rápidos y sencillos
2. Inmunofluorescencia directa (IFD)
- Límite de detección elevado - Solo detecta L. pneumophila sg. 1- Presencia de reacciones cruzadas
3. Estudios serológicos (IFI)- Estudios retrospectivos
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Medio AmbienteMétodos fenotípicos de detección
4. Aislamiento en cultivo (ISO 11731)
Ventajas:
• Metodología normalizada
• Aislamiento de Legionella
• Metodología sencilla
Inconvenientes:
• Períodos de incubación largos (Días, semanas)• Baja especificidad. Problema con muestras
conteniendo abundante microbiota• No se detectan viables no cultivables
• Perdida de viabilidad después del muestreo
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Medio Ambiente
RESULTADOS OBTENIDOS
TRATAMIENTO ACIDO DIRECTO
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Medio Ambiente
TRATAMIENTO CONVENCIONAL
RESULTADOS OBTENIDOS
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Medio Ambiente
Amplificación de DNA por la Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
Solución
PCR: Técnica enzimática sencilla que permite copiar un fragmentoespecífico de DNA millones de veces en pocas horas
DNA Pol
Mg2+
Primer
dCTPdGTP
dTTPdATP
Componentes:
- Molde- Tampón PCR - Taq DNA polymerase- Cebadores- Mg+2
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
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Medio Ambiente
Desnaturalización (95 oC)
Extensión (72 oC)
Hibridación (55 oC) PCR
1 copia
2 Copias
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
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Medio Ambiente
• Secuenciación de DNA• Mutagénesis dirigida• Clonaje de DNA • Mapeado de genes y secuencias reguladoras• Expresión génica• Análisis forense y determinación de sexo• Pruebas de paternidad• Sistemática molecular y evolución• Genética de poblaciones• Detección de OGMs• Análisis de mutaciones• Carga viral• Cuantificación de genomas bacterianos
• Estudios de epidemiología molecular (RAPID-PCR; AFLP; MLST)
• Detección de patógenos
PCR: Aplicaciones prácticas
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Medio Ambiente
L . pneumophila
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Standard Curve
010
2030
4050
0 2 4 6 8 10
Log Nº copies
Ct
CIP
404 pb
900 pb
• Rapidez• Elevada sensibilidad y especificidad• Reproducibilidad• Permite cuantificación• Procesado de elevado nº muestras• Posibilidad de amplificación ydetección simultánea
PCR Convencional
“real-time” PCR (Cuantitativa)
PCR: Ventajas
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Medio Ambiente
Diagnóstico molecular de Legionella
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Medio Ambiente
Legionella spp.
Legionella pneumophila
Gen dotA (defective organelle trafficking)Gen mip (macrophage infectivity potentiator)
Gen 16 S rDNA
Espaciador 23S-5S rDNA
Gen dnaJ (“heat shock protein”)
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Dianas
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Medio Ambiente
PCR
CUALITATIVA CUANTITATIVA
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
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Medio Ambiente
Amplificación
(4 h 20 min)Electroforesis (45 min)
Extracción/Purificación de DNA (85 min.)
PCR convencional: Proceso
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Medio Ambiente
Dot F
Dot M Dot M
Dot F
Dot M
Dot K
Dot M
CIint F
444 bp 890 bp
1stamplification
Amplification Conditions
94ºC 4:00
94ºC 0:3058ºC 0:30 35 Cycles72ºC 1:00
72ºC 10:00
dotA IPC (dot-gyrB-dot)
825 bp387 bp
2nd amplification
Amplification Conditions
94ºC 4:00
94ºC 0:3058ºC 0:30 35 Cycles72ºC 1:00
72ºC 10:00
Legionella pneumophila
PCR convencional: Sistema
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Medio Ambiente
L . pneumophila
L. pneumophila Control Interno (CIP)
INTERPRETACIÓN
Positivo Positivo Positivo
Negativo Positivo Negativo
Positivo Negativo Positivo
Negativo Negativo Inhibición
Carrera
1, 2
3, 4, 5
6, 7
8, 9
2 3 4 5 6
CIP
404 pb
900 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9
PCR convencional: Interpretación de resultados
Detección de células totales (vivas y muertas)
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Medio Ambiente
Solución:
“Real-Time” PCR (PCR cuantitativa)
Amplificación y Detección simultáneas en una única reacción
SYBR-Green Sondas internas marcadasfluorescentemente
PCR convencional Cualitativa
PCR a “tiempo-real”
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Medio Ambiente
SYBR-Green se intercalaentre la doble hélice del DNA y emite fluorescencia
Inconvenientes:
• Detección no específica
•Aparición de productos PCR inespecíficos (Falsos positivos)
PCR a “tiempo-real”
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Medio Ambiente
Sondas específicas marcadas hibridan con la diana amplificada
Ventajas Alta especificidad
Sondas HybProbe Molecular Beacon
Sondas TaqMan
PCR a “tiempo-real”
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Medio Ambiente
Detección y análisis (10 min.)
Amplificación
(90 min.)
Extracción/Purificación de DNA (85 min.)
PCR a “tiempo-real”: Proceso
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Medio Ambiente
5 35 3 5 35 3
80 bp53
dotA (FAM) Internal Control (VIC)
53202 bp
33 535 3
R QR Q5 3
53
Step 1: Hold 50ºC for 2 min
Step 2: Hold 95ºC for 10 min
Step 3: 42 cycles
- Hold 95ºC for 15 sec
- Hold 60ºC for 1min
Legionella pneumophila
PCR a “tiempo-real”: Sistema
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Medio Ambiente
Standard Curve
010
2030
4050
0 2 4 6 8 10
Log Nº copies
Ct
Ct=-3,028 log[DNA] +39,6148
R²= 0,94743 r= -0,9733
PCR a “tiempo-real”: Interpretación de resultados
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Medio AmbientePCR y viabilidad
1. Realización de un precultivo
3. Uso de agentes intercalantes (Monoazida de etidio)Bloquean DNA libre y de células muertas
2. Cambio de molécula diana. DNA mRNA(RT-PCR)(NASBA)
Métodos cualitativos (Presencia/Ausencia)
Método cuantitativo
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Medio Ambiente
Controles de calidad en PCR
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Medio AmbientePCR: Controles de calidad
Evaluación interna de la calidad:
1. Controles del método:Control de proceso (positivo/negativo)Control de extracción (positivo/negativo)Control de PCR (positivo/negativo)Control interno positivo (CIP)Control de cuantificación
Materiales de referencia: Células - Suspensiones a partir de cepas colección
- Material de referencia comercial
DNA - Cuantificado (espectrofotométricamente)- Material de referencia comercial
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Medio Ambiente
Evaluación interna de la calidad:
2. Plan de evaluación de ensayos:Muestras ciegasMuestras dobles ciegasEnsayos entre analistasEnsayos entre métodos
PCR: Controles de calidad
Materiales de referencia: Células - Suspensiones a partir de cepas colección
- Materiales de referencia comercial
DNA - Cuantificado (espectrofotométricamente)- Material de referencia comercial
3. Auditorías
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Medio Ambiente
Evaluación externa de la calidad:
1. Ejercicios de Intercomparación
PCR: Controles de calidad
2. Auditorías
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Medio Ambiente
Inconvenientes de la PCR
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Medio Ambiente
1. Presencia de inhibidores puede provocar errores de interpretación (falsos negativos) Importancia del patrón interno (CIP)
PCR: Inconvenientes y soluciones
2. Métodos científicos mas que procedimientos normalizados. Necesidad de conocimientos en el diseño, desarrollo y validación desistemas de amplificación
Evolución de los sistemas de preparación de muestras
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Medio Ambiente
Validación. Proceso de evaluación de las características de un procedimiento de medida y comprobación de que dichas características cumplen una serie de requisitos preestablecidos.
PCR: Validación
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Medio Ambiente
1. Diseño de cebadores:Múltiples alineamientos del gen diana (secuencias del GenBank)mediante CLUSTAL X.
2. Secuencias potenciales:. Analizadas por BLAST con las secuencias del GenBank
. Analizadas con programas de diseño de primers (Primer express,etc.)
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Medio Ambiente
3. Sensibilidad, Especificidad, Falsos positivos, Falsos negativos,Eficiencia, Selectividad
4. Optimización de la reacción PCR
5. Límite de detección
6. Límite de cuantificación
7. Exactitud7. Exactitud
8. Repetibilidad y reproducibilidad
9. Incertidumbre
10. Linealidad
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Medio Ambiente
1. Presencia de inhibidores puede provocar errores de interpretación (falsos negativos) Importancia del patrón interno (CIP)
PCR: Inconvenientes y soluciones
2. Métodos científicos mas que procedimientos normalizados. Necesidad de conocimientos en el diseño, desarrollo y validación desistemas de amplificación
Evolución de los sistemas de preparación de muestras
Sistemas comerciales en formato kitDocumentos de validación de métodos PCREstudios intercolaborativos (AFNOR)
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Medio Ambiente
Diseño
Desarrollo
Validación
Fabricación ycomercialización
Aplicación
Asesoramiento técnico
•Tan sencillo como unos pocos pipeteos• Fiable• Fácil de interpretar• Coste asequible
•Evaluación interna de la calidad•Evaluación externa de la calidad
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Medio AmbientePCR: Inconveniente y Soluciones
3. Técnica laboriosa
4. Elevado coste
Plataformas automatizadas de procesamiento de muestrasy realización de la PCR
A medida que aumente el consumo se reducirán los costes
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Medio Ambiente
El futuro de los métodos diagnósticos moleculares
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Medio Ambiente
Ventajas:
- Detección simultánea de miles de genes
- Posibilidad de automatización - Gran potencial analítico
DNA arrays (DNA chips)
Inconvenientes:
- Baja sensibilidad (necesita PCR)- Tecnología con un coste elevado
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Medio Ambiente
1. Procedimientos biológicos en miniatura, incluyendo PCR
2. Integración de múltiples protocolos en un único chip para realizar el análisisíntegro de una muestra
3. La tecnología de microfluidics acoplada a PCR será una herramienta muypotente para la detección simultánea de patógenos
Biosensores de microcanales: Microfluidics
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Medio Ambiente
Actualmente la mayoría de las legislaciones no contemplan los métodos basados en PCR
Sin embargo, sabemos que los métodos PCR mejorandrásticamente la detección de patógenos
En consecuencia:
- Más que protocolos científicos, importancia de emplear métodos validados y normalizados - Participación en Ejercicios de Intercomparación- Incorporación progresiva a las legislaciones nacionales
PCR: Implicaciones Legales
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Medio Ambiente