dosaggi proteici e preparazione campioni

Dosaggi Proteicie

Preparazione Campioni

Dr. Alessandro Trentini

Analisi quantitativeDiversi metodi per la quantificazione delle proteine totali:

1. Dosaggio spettrofotometrico diretto.2. Determinazione dell’azoto.3. Metodi colorimetrici.


Analisi quantitativeDiversi metodi per la quantificazione delle proteine totali:

1. Dosaggio spettrofotometrico diretto.2. Determinazione dell’azoto.3. Metodi colorimetrici.

1. Dosaggio spettrofotometrico direttoMetodo più semplice e più vantaggioso: permette il riutilizzo del campioneesaminato.Si basa sulla determinazione dell’assorbanza a 280 nm (triptofano, tirosina efenilalanina).L’assorbimento varia in base alla composizione in aa della proteina.

mg proteine/ml = 1,55 * A280 -0,76 * A260

A260 = assorbanza a 260 nm, dovuta agli acidi nucleici

Svantaggio: limitazione di specificità e precisione.

Fonte: Internet


3. Metodi colorimetriciBasati sulla formazione di complessi colorati di proteine con alcuni reattivi.

Principali metodi:a) Metodo del Biuretob) Metodo di Lowryc) Metodo dell’Acido Bicinconinicod) Metodo di Bradford (o del Blue Coomassie)

a) Metodo del BiuretoAggiungendo alla soluzione proteica una soluzione rameica in ambiente basico, siottiene una colorazione viola-porpora con un max assorbimento a 540 nm.Dovuto alla formazione di un complesso tetra-coordinato del rame con legamipeptidici (es. biureto, peptidi e proteine): il rame viene poi ridotto.

Fonte: Internet

Cu+


Vantaggi

1. Rapido e semplice.2. Deviazione del colore meno frequenti rispetto al metodo di Lowry,

assorbimento UV.3. Poche sostanze di natura non proteica interferiscono con il dosaggio.4. Non dosa l’azoto da sorgenti non proteiche o non peptidiche.

Svantaggi

1. Poco sensibile (almeno 2-4 mg di proteine per saggio).2. Alte concentrazioni di sali d’ammonio interferiscono con il dosaggio.3. Il colore può variare a seconda delle proteine (la gelatina dà una reazione

rosa-porpora).4. La soluzione può essere opalescente a causa di alto contenuto di lipidi e

carboidrati.5. Non è un metodo assoluto: necessaria una curva di taratura (e.g. con BSA).


BSA (mg/ml) OD netti0 0,322

0,08 0,362 0,0400,12 0,370 0,0480,16 0,399 0,0770,2 0,417 0,094

0,24 0,424 0,1010,4 0,540 0,2170,8 0,74 0,417

Campione 1 0,476 0,154


BSA (mg/ml) OD netti0 0,322

0,08 0,362 0,0400,12 0,370 0,0480,16 0,399 0,0770,2 0,417 0,094

0,24 0,424 0,1010,4 0,540 0,2170,8 0,74 0,417

Campione 1 0,476 0,154

CONCENTRAZIONE CAMPIONE INCOGNITO


b) Metodo di LowryCombina la reazione del biureto con la riduzione del reattivo fosfomolibdico-fosfotungstico per i fenoli, il reattivo di Folin-Ciocalteau.Gli ioni rameosi prodotti dai legami peptidici, e le tirosine e triptofani delleproteine reagiscono con il reattivo di Folin formando un colore blu (750 nm), perla formazione di blu di tungsteno e blu di molibdeno.

Applicazioni:Viene usato spesso in campo biochimico, data la sua semplicità e sensibilità,anche se in genere sono preferiti dosaggi più rapidi (es. Bradford).


Vantaggi1. Molto sensibile: 50-100 volte più sensibile del biureto; 10-20 volte più

sensibile dell’assorbimento UV.2. Meno sensibile alla torbidità del campione.3. Più specifico di altri metodi.4. Semplice (1-1,5 ore per il dosaggio).

Svantaggi1. Il colore può variare a seconda della proteina maggiormente rispetto al

biureto.2. Il colore non è strettamente proporzionale alla concentrazione proteica.3. Diverse sostanze interferiscono (saccarosio, lipidi, fosfati, monosaccaridi).4. Alte concentrazioni di zuccheri riducenti, solfato d’ammonio, e composti

sulfidrilici interferiscono con la reazione.


Il metodo di Markwell: un Lowry modificato

La modifica consiste nell'aggiungere Sodio Dodecil Solfato (SDS) al reagente alcalino, solubilizzando quindi le membrane e le proteine di membrana.

Tale metodo viene utilizzato quindi anche per dosare virus come il Sendai, dotati di envelope.

Il dosaggio viene condotto in due tappe:

1. Il campione viene mescolato, in presenza di SDS e in ambiente basico, agli ioni rameici presenti nella soluzione; avviene quindi la reazione del biureto.

2. Il reattivo di Folin-Ciocalteau viene ridotto per la presenza degli aminoacidi aromatici presenti nelle proteine del campione, con la formazione di blu di tungsteno e blu di molibdeno grazie alla riduzione operata dal complesso rame-proteina.


Reagenti utilizzatiSoluzione A contiene NaOH, sodio tartrato ed SDS.

Soluzione B contiene CuSO4.

Soluzione C: 100 parti soluzione A, 1 parte soluzione B.

Soluzione D: reattivo di Folin-Ciocalteu opportunatamente diluito.

Standard: Albumina serica bovina (BSA) 1 mg/ml in tampone fosfato.

1) Il campione viene trattato con un volume opportuno di soluzione C.

2) La miscela viene incubata 10 min a temperatura ambiente, quindi si aggiunge la soluzione D, e l'incubazione viene continuata per altri 30 min a temperatura ambiente.

3) Il colore è stabile per circa mezz’ora e l’assorbanza viene determinata a 660 nm con uno spettrofotometro.

4) La curva di calibrazione è costruita utilizzando BSA con quantità comprese tra 2,5 e 20 µg.


c) Metodo dell’Acido BicinconinicoProteine e peptidi riducono gli ioni rameici a rameosi in ambiente basico(reazione del Biureto).Gli ioni rameosi reagiscono con il reagente di Acido Bicinconinico (BCA) verdemela, per formare un complesso viola-porpora (1 ione rameoso chelato da 2molecole di BCA).Il colore viene misurato alla lunghezza d’onda di 562 nm, ed è lineare con laconcentrazione proteica da microgrammi fino a 2 mg/ml.Contribuiscono al colore legami peptidici, cisteina, cistina, triptofano, tirosina.

NB. La reazione avvieneper 30 minuti a 37°C, 15minuti a 60°C o 2 ore aRT.

Fonte: InternetDr. Alessandro Trentini

Applicazioni:Viene usato per la quantificazione proteica durante i processi di purificazione edisolamento delle proteine.

Vantaggi1. Sensibilità compatibile o maggiore (micro-metodo, 0.5-10 µg di proteina) del

Lowry.2. Reazione in un unico passaggio, più semplice del Lowry.3. Il reagente è più stabile del reagente di Lowry.4. Detergenti non ionici e tamponi non interferiscono con il dosaggio.5. Concentrazioni medie di reagenti denaturanti (Urea e Cloruro di Guanidinio)

non interferiscono.

Svantaggi1. Il colore non è stabile nel tempo.2. Ogni composto capace di ridurre Cu2+ a Cu+ formerà colore.3. Gli zuccheri riducenti interferiscono maggiormente rispetto al Lowry.4. Variazioni nella colorazione tra le proteine simile al metodo di Lowry.


d) Metodo di Bradford (o del Blue Coomassie)Sfrutta l’uso di un colorante, il Coomassie Brilliant Blue G-250.

Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine determinauno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976).


595 nm595 nm

a) Colorante libero

b) Colorante legato alle proteine

Formazione di complessi non covalenti con proteine tramite interazioni elettrostatiche con amminoacidi basici (positivi a pH acido) ed interazioni idrofobiche con amminoacidi aromatici.

Fonte: Internet


Vantaggi1. Semplicità di preparazione del reattivo2. Sviluppo del colore immediato (reazione completa in 2 minuti).3. Stabilità del complesso.4. Elevata sensibilità (fino a 22 µg/ml).5. Il saggio è compatibile con la maggior parte dei tamponi comuni, degli agenti

denaturanti e dei preservanti.

Svantaggi1. La quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal contenuto in

amminoacidi basici ed idrofobici difficile usare uno standard «reale»2. Molte proteine non sono solubili nelle condizioni di pH estremo del dosaggio.3. I detergenti ionici e non ionici interferiscono con il dosaggio (es. SDS e Triton

X-100).


Come fare un dosaggio proteico?

1) Preparazione del campione da analizzare

2) Esecuzione del dosaggio (es. Metodo di Bradford)


1) Preparazione del campione da analizzareSi devono estrarre le proteine totali dal campione (es. cellule, tessuto), per poi dosarle.Applicazione «upstream»: è a monte dei dosaggi che interessano veramente (es. western blot, ELISA ecc…).a) Metodi fisicib) Metodi «chimici»: basati su reagenti (tamponi di lisi)

a) Metodi fisici

Fonte: ThermoFisher. Dr. Alessandro Trentini

«Distruzione» meccanica

Lame rotanti sminuzzano e disperdono grandi quantità di campione complesso.

Il Polytron attira il campione all’interno di una «camera» contenente delle piccole lame rotanti.

La dimensione dell’asta e della camera possono essere variabili per permettere di omogenarepoco campione (anche 1 ml).

Ottimale per tessuti resistenti e fibrosi.

Frullatore Polytron


Omogenizzazione liquida

Tecnica di lisi del campione più comunemente utilizzata per piccoli volumi e per campioni cellulari.

Le cellule vengono lisate tramite il loro passaggio forzato attraverso uno spazio ristretto, rompendo le membrane.

Fonte: ThermoFisher.


SonicazioneQuesto metodo usa onde sonore (ultrasuoni) ad alta frequenza e pulsanti.

Le onde vengono prodotte meccanicamente da una sonda vibrante immersa nel campione.

Si formano delle piccole bolle di vapore temporanee (cavitazione) che implodono causando onde d’urto che si distribuiscono nel campione rompendo le cellule.

Per prevenire l’eccessivo riscaldamento, si usano brevi trattamenti, con il campione in ghiaccio.

Adatta per campioni <100 mL.


Fonte: internetDr. Alessandro Trentini

Gelo-sgelo(freeze-thaw)

Usato comunemente per lisare le cellule batteriche e di mammifero.Si fanno dei cicli di congelamento/sgelo della sospensione cellulare: la cellula si rompe per la formazione dei cristalli di ghiaccio, che si espandono nel congelamento e contraggono durante lo scioglimento.

Svantaggio: procedura lunga e non sempre efficace

15-20 min90 min o ∞ 15-20 min90 min o ∞ 15-20 min90 min o ∞


Mortaio e pestello

E’ il metodo più comune per rompere le cellule delle piante o per tessuti molto fibrosi.

Il tessuto viene congelato rapidamente in azoto liquido e poi polverizzato con un mortaio e pestello.



Additivi e metodi per facilitare la lisi meccanica

4) La viscosità del campione aumenta durante la lisi, a causa del rilascio di acidi nucleici: si possono usare DNAasi e RNAasi per dimuirne la viscosità.

5) Devono essere sempre aggiunti inibitori delle proteasi per evitare la degradazione del campione, e conservarlo a 4°C.

1) Sospendere le cellule in soluzione ipotonica.

2) Utilizzare lisozima per digerire i polisaccaridi della parete batterica o dei lieviti.

3) Utilizzare biglie di vetro per favorire la rottura della membrana cellulare. Fonte: ThermoFisher.


b) Metodi «chimici»

La lisi delle cellule tramite detergenti è una alternativa più «gentile» rispetto ai metodi meccanici, anche se spesso è usata assieme ai metodi meccanici.

Detergente: molecola anfipatica, che contiene una parte idrofobica ed una idrofilica o polare.

La parte idrofila o polare può essere:

1) Carica (ionica) detergenti ionici, cationici o anionici (es. SDS).

2) Non ionica priva di carica.

3) Zwitterionica con carica sia positiva che negativa (es. CHAPS).

Il detergente può essere denaturante o non denaturante, a seconda del suo impatto sulla struttura della proteina (es. SDS).



In genere, concentrazioni moderate (es. 1%) di detergente (es. non ionico come il Triton X-100) alterano l’integrità di membrana facilitando la rottura della cellula e l’estrazione delle proteine.

I detergenti si inseriscono efficacemente nel bilayer lipidico per formare micelle miste con fosfolipidi e proteine di membrana.



Es. detergente denaturante SDS

Si lega sia alle proteine di membrana (idrofobiche) che solubili in acqua (idrofiliche) a concentrazioni minori della CMC (concentrazione critica di micella, in forma di monomeri).

Il legame dell’SDS alle proteine è cooperativo (il legame di una molecola alla proteina aumenta la probabilità di legame di altro detergente) ed ALTERA LA STRUTTURA PROTEICA a «bastoncini» rigidi di dimensione proporzionale al peso molecolare.

Fonte: Internet.

Fonte: Internet.


Es. detergente NON denaturante TRITON X-100

Ha una grossa testa non polare rigida che non penetra nelle proteine solubili.

Non distrugge la struttura nativa delle proteine e non ha legame cooperativo.

Si associa alle parti idrofobiche delle proteine di membrana portandole in soluzione.

A concentrazioni al di sotto della CMC, i monomeri si legano alle proteine solubili. Molto al di sopra della CMC, il detergente legato alle proteine compete per la formazione di micelle e quindi non lega molto bene le proteine.

Triton X-100


SolubilizzazioneI monomeri di detergenti solubilizzano le proteine di membrana inserendosi nel bilayer lipidico.

Aumentando la concentrazione del detergente, la membrana può andare incontro a diversi gradi di solubilizzazione:

1) Rottura della membrana: con rapporto molare 0,1:1 1:1 (detergente:lipidimembrana) il bilayer lipidico resta intatto ma si possono estrarre alcune proteine di membrana.

2) Aumentando il rapporto detergente:lipidi di membrana a 2:1 avviene la solubilizzazione della membrana formando micelle miste.

3) A rapporto 10:1, tutte le interazioni lipidi:proteine sono «scambiate» con interazioni detergente:proteina.

La concentrazione ottimale di detergente richiesta per l’estrazione delle proteine dipende dalla CMC, numero di aggregazione, temperatura, e natura della membrana e del detergente.


Esempi di alcuni buffer di lisi utilizzati

RIPA buffer: 25 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP40, 1% sodiumdeoxycholate and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), INIBITORI DELLE PROTEASI.Utile per SDS-PAGE.

Cell lysis buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, INIBITORI DELLE PROTEASI.Utile per altre applicazione (es. dosaggi enzimatici).


Ho le mie proteine….

e adesso?!?!?!?


Dosaggio delle proteine con metodo di Bradford

1) Creare una curva di calibrazione utilizzando come proteina la BSA a diverse concentrazioni: 0.08, 0.12, 0.16, 0.2, 0.24, 0.4, 0.8 mg/ml. Il dosaggio viene effettuato in doppio.

2) Per creare le diverse concentrazioni di BSA necessarie, mettere il volume di PBS nelle eppendorf contrassegnate e poi la quantità di BSA stock 2 mg/ml mescolando 3-4 volte, come da tabella sottostante:

Numero provetta

Concentrazione di BSA di riferimento

(mg/ml)

Volume di PBS(µl)

Volume di BSA stock

(2 mg/ml)1 0 100 02 0.08 96 43 0.12 94 64 0.16 92 85 0.2 90 106 0.24 88 127 0.4 80 208 0.8 60 40


3) Diluire i campioni almeno 3 volte (3X) con PBS (soluzione fisiologica tamponata con fosfato, pH 7.4).

Es. per 30 µl di campione diluito, 10 µl di campione madre + 20 µl di PBS (dil 3X).

4) Dispensare 5 µl di campione (standard e campione diluito) o 5 µl di PBS(bianco di reazione) in doppio nella micropiastra, toccando con il puntale il fondo del pozzetto.

puntale

pozzetto

campioneDr. Alessandro Trentini

1 = bianco di reazioneC = campione diluito

1 12 23 34 4

5 5

6 67 7

8 8

CC

Dopo ogni duplicato, cambiare puntale



1 12 23 34 4

5 5

6 67 7

8 8

CC

5) Aggiungere 200 µl di Blue di Coomassie, avendo cura di non toccare con il puntale la soluzione nel pozzetto. Qualora capitasse, cambiare il puntale.



1 12 23 34 4

5 5

6 67 7

8 8

CC


6) Incubare 15 minuti a temperatura ambiente in agitazione.

7) Leggere l’assorbanza alla lunghezza d’onda di 595 nm.


Elaborazione dei risultatiBSA (mg/ml) OD netti

0 0,3220,08 0,362 0,0400,12 0,370 0,0480,16 0,399 0,0770,2 0,417 0,094

0,24 0,424 0,1010,4 0,540 0,2170,8 0,74 0,417

Campione 1 0,476 0,154

Campione 1: diluito 3 volte

1) Faccio i netti

2) Costruisco la retta di taratura

3) Trovo la concentrazione nel campione incognito


Esempio pratico (dosaggio proteico)BSA (mg/ml) OD netti

0 0,3220,08 0,362 0,0400,12 0,370 0,0480,16 0,399 0,0770,2 0,417 0,094

0,24 0,424 0,1010,4 0,540 0,2170,8 0,74 0,417

Campione 1 0,476 0,154


1) Faccio i netti




Esempio pratico (dosaggio proteico)BSA (mg/ml) OD netti

0 0,3220,08 0,362 0,0400,12 0,370 0,0480,16 0,399 0,0770,2 0,417 0,094

0,24 0,424 0,1010,4 0,540 0,2170,8 0,74 0,417

Campione 1 0,476 0,154


1) Faccio i netti



Sapendo che A = 0,5151 * conc (mg/ml)

Conc = (0,154/0,5151)*3 = 0,90 mg/ml


Materiale didattico di supporto

Tutto il materiale fornito a supporto delle lezioni e

reperibile nel minisito dell’insegnamento o sulla

piattaforma online UniFE deve essere inteso come

traccia degli argomenti svolti e non sostituisce il libro di

testo.

Raccomandazione importante: questo materiale didattico è per uso personale

dello studente, ed è coperto da copyright. Ne è severamente vietata la

riproduzione, la diffusione o il riutilizzo, anche parziale, ai sensi e per gli effetti della

legge sul diritto d’autore.

Corso di laurea in Scienze BiologicheCorso di laurea magistrale in Scienze Biomolecolari e dell’Evoluzione


dosaggi proteici e preparazione campioni

Documents