proyecto de tesis: expresión génica inducida por el coito en el tracto genital de la rata hembra
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLOGICAS
MENCION EN CIENCIAS FISIOLOGICAS
Proyecto de Tesis Doctoral:
Expresión génica inducida por el coito en el tracto genital de la
rata hembra
(Más: Resultados Preliminares, Discusión y Trabajo Pendiente)
Estudiante: Andrés Müller González
Tutor: Dr. Horacio Croxatto Avoni
Noviembre de 1999
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Resumen
La función más universal del coito es proveer los espermatozoides fecundantes. Otras
funciones establecidas para algunas especies tienen que ver con la inducción de la
ovulación y con la mantención del cuerpo lúteo. Es probable que el coito también
provea estímulos al tracto genital y que éstos hagan más eficaz el proceso reproductivo
en la hembra. Esta supuesta función es el tema de esta tesis.
Dos componentes biológicamente significativos del coito son: la estimulación mecánica
cérvico-vaginal (ECV) y el semen que introduce el macho en la hembra. Está bien
establecido que, en la rata y otros roedores, la ECV determina cambios en la secreción
de prolactina y previene la luteólisis. Recientemente se estableció que la ECV en la rata
disminuye la aceleración del transporte oviductal (ATO) inducida por estradiol. El
semen, por su parte, desencadena la producción de factor estimulante de colonias de
macrófagos en el epitelio uterino del ratón, altera el ARNm de oviductina en el oviducto
del hámster y suprime la ATO inducida por estradiol exógeno en la rata. Por la
naturaleza, la cronología y las circunstancias en que se presentan estos fenómenos;
estas observaciones indican que el coito afecta de un modo significativo la fisiología del
tracto genital de la hembra por mecanismos independientes de su función fecundante
y de su función luteotrófica.
En esta tesis, se propone que la ECV, los espermatozoides y/o los componentes
solubles del semen actúan como señales que originan cambios en el funcionamiento
del sistema reproductor a través de variaciones tempranas en la expresión génica de
oviducto y/o útero. Se intentará poner en evidencia cambios en la expresión de uno o
más genes en el tracto genital de la rata hembra en las primeras 24 horas que siguen
al coito o a la aplicación aislada de sus componentes.
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Introducción
La rata madura presenta ciclos estrales regulares de 4 ó 5 días, ininterrumpidamente mientras
no se aparee. El apareamiento conduce, eventualmente, a la cópula o el coito cuando la hembra
se hace receptiva al macho, lo que ocurre entre la tarde del proestro y la mañana del estro. El
día del estro se designa como día 1 del ciclo, de preñez o seudopreñez. Después del coito la
hembra deja de ciclar y permanece en diestro. Si el coito ocurre con un macho fértil, la hembra
se preña, mientras que si el macho no es fértil (ejemplo: vasectomizado), se produce un estado
endocrinológico semejante al de la preñez, denominado seudopreñez. La seudopreñez también
se puede inducir estimulando mecánica o eléctricamente la vagina y el cérvix en la noche del
proestro o en la mañana del estro.
Es claro que, en la rata y otros roedores, el coito de por sí determina un cambio en el
funcionamiento del sistema reproductor de la hembra, independiente del hecho que ocurra o no
la fecundación. El coito tiene, a lo menos, dos componentes biológicamente significativos: la
estimulación mecánica cérvico-vaginal y el semen que introduce el macho en la hembra, cuyos
efectos se analizarán a continuación.
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I.- Efectos de la estimulación mecánica cérvico-vaginal
I.1.- Cambios endocrinológicos
Los movimientos del pene en la vagina (durante el coito) y la presencia del tapón vaginal
(después del coito) estimulan las terminaciones nerviosas y los receptores de la vagina y del
cuello uterino. Esto activa respuestas reflejas neuro-endocrinas y posiblemente neurales. La vía
aferente de estos reflejos neuro-endocrinos comprende vías ascendentes medulares y vagales.
Las ramas eferentes comprenden a lo menos la secreción de prolactina (Smith y col., 1975 y
1976) y -MSH (Volosin y Cellis, 1979a, 1979b y 1984. Estos reflejos determinan diferencias
endocrinológicas entre ratas en ciclo y preñadas o seudopreñadas. Las ratas en ciclo presentan
un solo pico de prolactina por ciclo, mientras que las preñadas y seudopreñadas presentan dos
picos diarios de prolactina durante los primeros 9-12 días que siguen a la estimulación cérvico-
vaginal. Esta segunda forma de secreción de prolactina tiene un efecto luteotrófico, por lo que a
partir de la mañana del día 3, las ratas preñadas y seudopreñadas producen mayor cantidad de
progesterona que las ratas en ciclo y no presentan el aumento de estradiol asociado al
crecimiento folicular preovulatorio (Smith y col., 1975 y 1976). En las primeras 48 horas que
siguen al coito, los niveles plasmáticos de las gonadotrofinas y de los esteroides ováricos son
idénticos a los que se observan en las primeras 48 horas del ciclo. Si el funcionamiento del
tracto genital dependiera exclusivamente de estos esteroides y gonadotrofinas, la expresión
génica dentro de este período debería ser idéntica en ciclo y preñez.
I.2.- Cambios en la respuesta del oviducto al estradiol exógeno, inducidos por el coito
La administración de estradiol en día 1 del ciclo o de la preñez adelanta el paso de los huevos al
útero, siendo la rata en ciclo más sensible a este efecto. Por lo tanto, la sensibilidad del
oviducto al estradiol exógeno es disminuida por el coito (Ortiz y col., 1994), cuando todavía no
se aprecian diferencias en los niveles plasmáticos de estradiol y progesterona en ciclo y preñez
(Smith y col., 1975 y 1976).
Recientemente, se demostró que la estimulación mecánica cérvico-vaginal en la noche del
proestro, atenúa el efecto acelerador del transporte ovular inducido por estradiol administrado
en el día 1 (Müller y Croxatto, no publicado).
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Lo anterior sugiere que la ECV asociada al coito determina una modificación funcional del
tracto genital a través de un mecanismo independiente de su efecto luteotrófico. Dicho
mecanismo podría involucrar cambios en la expresión génica en el oviducto y/o el útero.
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II.- Acción de los componentes del semen sobre el tracto genital de la hembra
II.1.- Espermatozoides
En la mayoría de los mamíferos, la hembra ovula entre 1 y 20 ovocitos en cada ciclo, por lo
tanto, para su fecundación se necesitan 20 espermatozoides o menos. La rata ovula alrededor
de 12 ovocitos. Sin embargo, en la eyaculación se depositan aproximadamente 60 millones de
espermatozoides en el útero y a cada ámpula entran 5 a 500 espermatozoides (Sultan y
Bedford, 1996, Blandau, 1973 y Harper, 1994). Por lo tanto, la inmensa mayoría de los
espermatozoides que ingresa al tracto genital de la hembra son espermatozoides no
fecundantes. Esta sobreabundancia de espermatozoides no fecundantes es común a todos los
mamíferos (Blandau, 1973 y Harper, 1994). Sin embargo, su distribución a lo largo del tracto
genital sigue patrones que difieren entre las especies. Por otra parte, inseminando con el 10 ó
20% del número normal de espermatozoides desde el eyaculado es posible fecundar el 100% de
ovocitos. Lo que pone en evidencia que el macho insemina un exceso de espermatozoides por
sobre lo requerido para fecundar. Como la razón de espermatozoides: ovocitos es cercana a 1 en
el sitio de fecundación, parece apropiado preguntarse, si este exceso de espermatozoides no
fecundantes, que ni siquiera llega al sitio de la fecundación, cumple algún papel en el proceso
reproductivo.
El número mínimo de espermatozoides que se debe inseminar artificialmente en cualquier
especie para garantizar el éxito del proceso reproductivo es muy superior al número de
espermatozoides fecundantes y lo habitual es que en la inseminación natural este número
mínimo esté sobrepasado ampliamente.
Bedford y col. (1984) revisaron los intentos de racionalizar la enorme desproporción que hay
entre el número de gametos femeninos y masculinos, pero las teorías propuestas no están
avaladas experimentalmente. Una de las ideas parcialmente explorada es que los
espermatozoides tendrían otras funciones en el tracto genital de la hembra aparte de la
fecundación.
Chaykin y Watson (1983) inseminaron ratonas con sólo 5% del número normal de
espermatozoides. El número de embriones de 2 células y el de embriones implantados
disminuyó en un 44% y 67%, respectivamente, en comparación con los animales inseminados
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con el número normal. Estas reducciones fueron revertidas cuando se hizo una segunda
inseminación con espermatozoides no fecundantes (inactivados por frío y calor) 12 horas
después de la primera. De esta observación concluyeron, que la presencia de un gran número
de espermatozoides no fecundantes en el tracto genital de la hembra mejora la eficiencia del
episodio reproductivo por mecanismos independientes de la disponibilidad de espermatozoides
fecundantes.
La inseminación instrumental posterior a la transferencia intrauterina de embriones en la rata
(Carp y col., 1984) y en la mujer (Bellinge y col., 1986) aumenta el número de implantaciones y
de nacidos vivos en los dos casos. Lo que sugiere que la presencia de espermatozoides no
fecundantes en el tracto genital puede afectar favorablemente etapas del proceso reproductivo
posteriores a la fecundación.
El coito practicado 36 horas antes de la ovulación e inseminación instrumental intrauterina, en
mujeres sometidas a hiper-estimulación ovárica, aumenta la probabilidad que se embaracen
(Weckstein y col., 1993). Estos autores sugieren que el coito previo aumenta la probabilidad de
embarazo porque los espermatozoides inseminados naturalmente se suman a los inseminados
instrumentalmente, y juntos superan el número crítico necesario para estimular
adecuadamente el ambiente uterino para la implantación embrionaria.
Respecto del mecanismo por el que los espermatozoides no fecundantes podrían afectar el
proceso reproductivo en la hembra se conoce muy poco.
Watson y col. (1983) inseminaron ratonas con espermatozoides que tenían su ADN marcado
con timidina tritiada. Después de 72 horas encontraron que cerca de un 10% de la
radiactividad estaba localizada en ovario, útero y ganglios linfáticos mesentéricos, entre otros
órganos. Cuando la inseminación con espermatozoides se sustituyó por timidina tritiada libre o
por Escherichia coli con ADN marcado, se obtuvo un patrón diferente de marcación en los
órganos. Estas observaciones sugieren que productos de la degradación de los espermatozoides
pueden pasar desde el útero a otros órganos con cierta selectividad y de este modo influir sobre
la fisiología de la hembra.
Muchos de los espermatozoides que no participan en la fecundación son fagocitados por
macrófagos en el lumen del útero en roedores (Reid, 1965a y b). Es poco probable que dichos
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macrófagos transmitan un mensaje que requiera su migración desde el lumen a la pared del
tracto genital. Pero, podrían ser mediadores del efecto de los espermatozoides secretando un
mensajero soluble que actúe sobre el epitelio luminal o que difunda transepitelialmente.
Orihuela y col. (1999) determinaron que aproximadamente un 16% de los espermatozoides que
entran al oviducto de la rata, se adhieren al epitelio oviductal en las primeras horas después de
la inseminación, fenómeno que ha sido descrito en varias otras especies (ver revisión en
Orihuela y col., 1999). Aunque no se ha identificado el mecanismo de adhesión en este caso, en
otros sistemas, se ha establecido que las moléculas de adhesión celular funcionan también
como transductores de señales hacia el interior de la célula (Buck y Horwitz, 1987). Es posible,
por lo tanto, que los espermatozoides que se adhieren al epitelio den señales a las células
oviductales, las que podrían modificar su funcionamiento, y por ende, el del tracto genital de la
hembra.
En una experiencia realizada recientemente en nuestra Unidad de Reproducción y Desarrollo,
se encontró asociación entre cambios en el funcionamiento del oviducto y la
presencia/ausencia de espermatozoides en el tracto genital. La inseminación intrauterina con
espermatozoides epididimarios en la mañana del estro suprimió parcialmente el efecto
acelerador del estradiol exógeno sobre el transporte oviductal en la rata (Müller y Croxatto, no
publicado). Es improbable que este efecto de los espermatozoides sea a través de la fecundación
de los ovocitos. Ya que en la rata no se ha encontrado diferencia en el día en que huevos
fecundados y no fecundados pasan desde el oviducto al útero (Villalón y col., 1982, Croxatto y
Ortiz, 1991 y Ortiz y col., 1991). Por exclusión es más probable que éste sea un efecto directo
de los espermatozoides no fecundantes sobre el oviducto.
En otra experiencia realizada recientemente en nuestra Unidad, se encontró asociación entre
cambios en la expresión de un gen en el oviducto y la presencia/ausencia de espermatozoides
en el tracto genital. La expresión del gen de la oviductina en el oviducto del hámster tiene
distintas características cuando se comparan hembras en tres condiciones: día 1 del ciclo, día 1
de preñez por coito con macho intacto y día 1 de seudopreñez por coito con macho
vasectomizado (Villanueva y Croxatto, 1999). En este experimento, la autopsia de todas las
hembras se realizó temprano cuando todavía no había ocurrido la fecundación. De modo que
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las hembras que tuvieron coito con macho intacto sólo difieren de las seudopreñadas por la
presencia de espermatozoides en el tracto genital. En estas condiciones, se encontró que en los
oviductos de día 1 de preñez disminuye la cantidad de ARNm de oviductina en comparación con
el día 1 de seudopreñez. Este resultado muestra que la presencia de espermatozoides en el
tracto genital tiene por efecto disminuir la expresión del ARNm de oviductina.
Por lo tanto, estas observaciones apoyan la idea que los espermatozoides pueden ejercer una
acción sobre el tracto genital, que es directa y no dependiente de la fecundación.
II.2.- Componentes solubles del semen
En la rata, así como en otras especies, una proporción importante del volumen del semen
penetra en la cavidad uterina, pero no al lumen del oviducto. Los componentes solubles del
semen provienen desde el testículo, el epidídimo y las glándulas anexas del tracto genital
masculino y constituyen una compleja mezcla de sustancias cuyas funciones son poco
conocidas. Carballada y Esponda (1997) demostraron que las proteínas secretadas por las
vesículas seminales son incorporadas al epitelio endometrial en la rata. Por lo tanto, es posible
que estas proteínas ejerzan efectos directamente sobre el útero. Además, podrían pasar a la
circulación sanguínea desde donde actuarían sobre otros órganos, incluyendo el oviducto.
También se ha demostrado que los estrógenos presentes en el semen aumentan la actividad
contráctil del miometrio de la cerda (Claus y col., 1987). Pocos minutos después de la
inseminación o de la administración intraluminal de estrógenos, aumenta la producción de
prostaglandina F2 (PGF2) en el endometrio, y también aumenta la concentración de PGF2 y
estrógeno en la vena uterina. Esta respuesta parece ser muy rápida para ser explicada por un
cambio en la expresión génica. Pero, ilustra como los componentes del semen que entran al
tracto genital de la hembra pueden afectar directamente su funcionamiento.
Recientemente, Tremellen y col. (1998) demostraron que la respuesta de tipo inflamatoria con
infiltración de leucocitos en el endometrio de ratonas, posterior a la inseminación natural, es
causada por el factor de crecimiento transformante 1 (TGF1) producido por las vesículas
seminales. El TGF1 actuando sobre el epitelio luminal del útero desencadena la producción del
factor estimulante de colonias de macrófagos (GM-CSF). Este último factor atrae a los
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leucocitos causando la infiltración endometrial post-coital.
Barrat y col. (1990) propusieron posibles funciones para la infiltración endometrial post-coital
por polimorfonucleares y macrófagos. Postularon que los leucocitos estimularían al tracto
genital de la hembra facilitando la fecundación y la implantación. Además, servirían para
prevenir infecciones y ejercerían más tarde un efecto inmuno-supresor sobre otras células del
sistema inmune (ejemplo: células citotóxicas y linfocitos), para que no se reconozca al
conceptus como extraño.
Primera síntesis
Los antecedentes expuestos sugieren que el coito, además de su papel fundamental en la
fecundación para todos los mamíferos, así como en la inducción de la ovulación y en la
mantención del cuerpo lúteo para algunas especies, afecta otros aspectos de la fisiología
reproductiva de la hembra que ameritan ser explorados.
La estimulación mecánica producida por el coito y la exposición del tracto genital de la hembra
a un gran número de espermatozoides no son esenciales para lograr un embarazo a término. Ya
que el embarazo a término se puede lograr por transferencia de embriones al tracto genital de
hembras vírgenes en varias especies (roedores, largomorfos, ungulados, primates). No obstante,
el éxito de estos procedimientos es limitado y una razón podría ser la falta de estimulación del
tracto genital producida por el coito, que estaría ausente en estos casos.
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III.- Modificaciones de la expresión génica asociadas a la preñez y al ciclo en el tracto
genital de la hembra
En esta tesis, se intentará poner en evidencia modificaciones de la expresión génica del tracto
genital de la hembra en las primeras 24 horas que siguen al coito, o dicho de otra manera,
expresión diferencial de uno o más genes debido al coito, sobre lo que la literatura no ofrece
información. Como ya se dijo, en las primeras 48 horas todavía no se aprecian diferencias en
los niveles plasmáticos de estradiol y progesterona (Smith y col. 1975 y 1976), que pudieran
inducir cambios en la expresión génica.
Sin embargo, existe abundante información respecto de etapas más tardías. En la Tabla 1, se
presenta información respecto de expresión génica en oviducto y útero durante el ciclo y la
preñez, indicándose la expresión de ARNm y proteínas específicos, la especie y las referencias.
La información presentada en la Tabla 1, que no es exhaustiva, demuestra que la expresión
diferencial de algunos genes durante la preñez, se manifiesta alrededor del período de la
implantación, al final de la preñez o en el parto. Por ser tardía es más probable que sea efecto
del estado de preñez y no un efecto de sólo el coito.
Una experiencia muy reciente realizada en nuestro laboratorio demostró la disminución de la
síntesis de un producto proteico al comparar el patrón fluorográfico de ratas en día 1 de ciclo y
preñez (Orihuela, no publicado). El experimento consistió en incubar por 8 horas oviductos de
ratas en día 1 de ciclo y preñez en un medio de cultivo que contenía metionina marcada
radiactiva. El tejido se homogenizó y las proteínas se separaron por electroforesis en gel
denaturante de poliacrilamida. El gel se tiñó con azul de Coomassie y se fotografió. Luego el
mismo gel se incubó con una solución intensificadora de marca radiactiva. El gel seco se
expuso por 7-15 días y la autoradiografía se reveló. El resultado fue que no hubo diferencia con
la tinción de azul de Coomassie, pero la banda de una proteína de un poco más de 200 Kda
aparece menos densa y más angosta para las ratas preñadas en la fluorografía. Esto significa
que todos los productos proteicos, inclusive el correspondiente a esa banda, son similares en
ratas en día 1 de ciclo y preñez. En tanto que, la incorporación de metionina a esta proteína de
un poco más de 200 Kda durante el cultivo está diferencialmente regulada por el coito dentro
de las primeras 24 horas de ocurrido éste. Esta investigación está en progreso para determinar
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algunas características de esta proteína.
Esta evidencia y las demás presentadas previamente apoyan fuertemente que el coito y/o sus
componentes significativos inducen la expresión diferencial de uno o más genes en el tracto
genital de la hembra.
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Tabla 1. Expresión génica de proteínas y/o ARNm en oviducto y/o útero en diferentes
especies.
ARNm y/o
proteína
Tejido Expresión génica Especie Referencia
Ciclo Preñez
TIMP-1 Oviducto Mayor
expresión en
día 2
Mayor expresión
en día 2
Cerdo Buhi y col.
1997
IGFBP-1 Útero No expresada Mayor expresión
en días 5 y 6
Rata Sadek y col.
1994
NOS II Útero 100%
expresión en diestro
Sobre-expresión
en día 18 (900%) y 75% en parto
Rata Dong y col.
1998
NOS I Útero Expresión
basal en ciclo
Altamente
expresada en
preñez tardía y
expresión basal
en parto
Rata Bansal y col.
1997
Oviductina Oviducto Expresión
constitutiva
Expresión
constitutiva
Hámster Revisión de
Boatman, 1997
Oviductina Oviducto Expresión activa en estro
Expresión inhibida en
preñez
Primates, ovino,
bovino y
cerdo
Revisión de Boatman,
1997
Receptor de PAF Oviducto 100%
expresión en
día 4
100% expresión
en día 3
Rata Velásquez y
col. 1997
Kalikreína Útero 100%
expresión en diestro y
metaestro
250% de
expresión en día 7
Rata Valdés y col.
1993
PTHRP Útero No expresado Expresado desde
día 6, aumento
entre días 19 y 21
Rata Thiede y col.
1990
Receptor de
PTH/PTHRP
Útero --- Expresado Rata Ureña y col.
1993
Fosfatasa alcalina Útero Expresión
entre días 23 y
27
--- Humano Wilson, 1969
Fosfatasa alcalina Útero --- Expresión entre los días 5 y 8 (y
en seudopreñadas
con deciduoma)
Ratón Wilson, 1969 (cita a Finn y
Hinchliffe,
1964)
Fosfatasa alcalina Útero --- Expresión entre
los días 5 y 8
Rata Wilson, 1969
(cita a
Pritchard,
1947)
Monoamina oxidasa y estradiol
deshidrogenasa
Útero --- (Aumenta en el día 3 de
seudopreñez)
Rata Psychoyos, 1986 (cita a
Rath y col.
1979)
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Continuación de Tabla 1. Expresión génica de proteínas y/o ARNm en oviducto y/o útero
en diferentes especies.
ARNm y/o
proteína
Tejido Expresión génica Especie Referencia
Ciclo Preñez
IGFBP-1
RBP
Péptidos neutros
de 27-30 Kda
Útero --- Expresados entre
los días 18 y 32
Mandril Fazleabas y
col. 1993
IGFBP-1
RBP Péptidos neutros
de 27-30 Kda
Útero Expresados en
fase lútea media
--- Mandril Fazleabas y
Verhage, 1987
CRBP
CRABP
CRABP II
Útero Mayor expresión
en: diestro
proestro
estro
--- Rata Wardlaw y col.
1997
CBG (análoga a
SHBG)
Útero Expresión --- Rata Kuhn y col.
1986
SHBG
Útero Mayor expresión en fase secretora
--- Humano Misao y col. 1994
Receptor de mesotocina (MTR)
Útero --- Mayor expresión en útero grávido
antes de parto
Marsupial Parry y col. 1997
pIgR Útero Mayor expresión
en estro
--- Rata Kaushic y col.
1997
Integrinas:
2, 3, 5, 6 y
4
Útero En todo el ciclo --- Humano Lessey y col.
1992
Integrina
4
Útero No detectada --- Humano Lessey y col.
1992
Integrina
1
Útero Entre los días 15
y 28
--- Humano Lessey y col.
1992
Integrina
Útero Expresión
aumentada
durante el ciclo
--- Humano Lessey y col.
1992
Integrina
3
Útero Entre los días 20
y 24
--- Humano Lessey y col.
1992
Glicógeno
sintetasa
Útero Se expresa --- Humano Harris y col.
1994
Factor de
diferenciación Neu
(NDF)
Útero --- Expresado en los
días 4 y 5
Ratón Reese y col.
1998
Laminina Útero --- Se expresa desde el día 5
Ratón Senior y col. 1988
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IV. – Síntesis
El conjunto de los antecedentes presentados sugiere que, dentro de las primeras horas que
siguen al coito, el tracto genital de la hembra recibe señales desde el semen, desde el sistema
neuro-endocrino, y desde el sistema inmune. Estas señales son las que determinan cambios en
su funcionamiento, tendientes a hacer más eficaz el proceso reproductivo. Se propone que
dichos cambios en el funcionamiento involucran cambios tempranos en la expresión génica en
el tracto genital. Si es así, hembras expuestas y no expuestas al coito se diferenciarán en las
próximas 24 horas, en parte por el patrón de expresión génica en el tracto genital, o dicho de
otra manera por activación y/o represión de uno o más genes. Luego, los componentes
significativos del coito por separado también activarán y/o reprimirán esos genes.
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Hipótesis
La estimulación cérvico-vaginal, los espermatozoides y/o el material soluble del semen
determinan activación y/o represión de uno o más genes en el oviducto y/o el útero de la rata
dentro de las primeras 24 horas que siguen al coito.
Objetivos
Determinar si el coito modifica la expresión génica en el oviducto y/o el útero de ratas en día 1.
Determinar si la estimulación cérvico-vaginal, los espermatozoides y/o el material soluble del
semen median el efecto del coito sobre la expresión génica en el oviducto y/o el útero de la rata.
Identificar la probable familia del o los genes activados y/o reprimidos por el coito en el
oviducto y/o el útero de la rata.
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Materiales y Métodos
Estrategia experimental
En esta sección, se explica a grandes rasgos lo que se propone realizar para responder la
hipótesis y lograr los objetivos planteados. Los detalles metodológicos se encuentran más
adelante en las secciones: “Protocolos experimentales” y “Métodos”. Algunas consideraciones
respecto a la técnica a emplear son presentadas en la sección siguiente.
En el primer protocolo, se intentará caracterizar el patrón del ácido desoxiribonucleico
complementario (ADNc) obtenido desde el ácido ribonucleico mensajero (ARNm) extraído desde
oviductos y úteros de ratas en día 1 de preñez y ciclo. Se espera que los patrones de ADNc
reflejen la expresión diferencial de transcritos de ARNm inducida por el coito.
La técnica más apropiada para este propósito es la expresión diferencial, descrita por Liang y
Pardee (1992) y Liang y col. (1993). Esta consiste en obtener fragmentos de ADNc por
transcripción reversa desde los ARNm obtenidos de los tejidos en estudio, los que son
separados en geles denaturantes de poliacrilamida para comparar las bandas del mismo peso
molecular y determinar cuales aparentan corresponder a ARNm expresados diferencialmente.
Estos fragmentos se reamplifican, se clonan y se someten a diversos análisis que comprenden
Dot-Blot, Northern Blot y Ensayo de Protección de Ribonucleasa, que en conjunto permiten
verificar que dichos fragmentos tienen alta complementariedad con ARNm existente en el tejido
y que efectivamente son expresados diferencialmente, permitiendo determinar si el coito activó
o reprimió la expresión de los genes respectivos.
Si se demuestra expresión diferencial de uno o más genes en el protocolo anterior, en el
segundo protocolo se investigará si alguno de los tres componentes del coito: estimulación
mecánica cérvico-vaginal, espermatozoides y material soluble del semen regulan la expresión de
dichos genes. Para esto se utilizará solamente la técnica del Northern Blot. Se espera que uno o
más de los tres componentes del coito examinados de cuenta de uno o más genes expresados
diferencialmente en el primer protocolo.
En el tercer protocolo, se intentará identificar algunos de los fragmentos clonados que reflejen
expresión diferencial. Para ello se determinará las secuencias de estos fragmentos, las que
serán comparadas con las secuencias registradas en el banco de genes para determinar la
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probable familia a la que pertenecen.
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Consideraciones respecto de la técnica de expresión diferencial y otras alternativas.
Existiendo varias maneras de enfrentar la problemática de la expresión génica diferencial
hemos decidido utilizar la expresión diferencial. Otra alternativa, es examinar la expresión de
genes preseleccionados cuya secuencia sea conocida y cuya función conocida los haga
candidatos a cambiar su expresión después del coito o se haya encontrado una mayor o menor
concentración de su producto proteico después del coito. Algunos ejemplos serían los genes de
la oviductina y el factor estimulante de colonias de macrófagos (GM-CSF). Bastaría con verificar
que la expresión de un gen es diferente en oviducto y/o útero de ratas en día 1 de preñez y ciclo
por Northern blot para dar sustento a la hipótesis.
En la tabla 1, se mostró que la expresión diferencial de algunos genes preseleccionados se
manifiesta alrededor del período de implantación, al final de la preñez o en el parto y no en los
primeros días de preñez y ciclo. Se debe hacer notar que pocos genes han sido estudiados con
relación a su expresión o represión respecto del coito o sus componentes significativos porque
recién ahora es un tema tratado en la literatura. No se conocen genes con secuencia y función
conocidas y/o aumento o disminución proteica que los hagan candidatos a cambiar su
expresión debido al coito o a uno de sus componentes, excepto los ya mencionados. Además,
todavía no se ha demostrado fehacientemente que un gen modifique su expresión durante las
primeras 24 horas que siguen al coito. Estas son las razones por las que preferimos la
expresión diferencial de genes. Porque nos da la posibilidad de encontrar genes de secuencia
conocida y también genes desconocidos que se expresen diferencialmente debido al coito.
Aunque la expresión diferencial es un método más laborioso, podría llegar a dar mucha más
información que el Northern blot. En todo caso, el Northern blot con genes preseleccionados se
puede sumar a la expresión diferencial porque no son técnicas excluyentes. Nos
concentraremos primero en la expresión diferencial y esta otra alternativa la evaluaremos en el
futuro.
Recientemente está tomando mucha fuerza otra técnica alternativa. Esta es llamada ”Gene
Chip”, “DNA Chip” o “tecnología del microarreglo” (para revisar respecto de esta técnica y
algunas de sus aplicaciones: Kurian y col. , 1999; Zweiger, 1999; Bucher, 1999; Schraml y col.
, 1999; Pollack y col. , 1999; Galitski y col. , 1999). Consiste en que una mezcla de ADNc
20
generada desde ARNm de una muestra se pone a hibridar con una multitud de ADNc y EST
(trozos de secuencia conocida, que son expresados y que a veces se sabe en que condición son
expresados) que están firmemente adheridos a una fase sólida con sus posiciones establecidas.
Los ADNc de la muestra son marcados con fluoresceína o biotina, así cuando se unen a los
ADNc y EST del microarreglo se puede establecer su patrón e intensidad de unión con un láser.
Usando este método, la expresión génica global puede ser comparada en dos poblaciones. Por
ejemplo en nuestro caso, oviductos de hembras en día 1 de ciclo y preñez. Esta técnica está
siendo considerada para determinar la expresión génica de útero y oviducto de rata inducida
por estradiol y progesterona. Así en nuestro laboratorio, estos resultados se podrán sumar a los
ya obtenidos y posibilitarán centrar la atención en la función de estos genes y sus mecanismos
de expresión. Lo mismo estamos evaluando con relación a la expresión génica en oviducto y
útero debido al coito. Porque tampoco es una técnica excluyente con la expresión diferencial.
En todo caso, debido a que la técnica de expresión diferencial está dando resultados positivos
parecieran no ser necesarias en este instante otras alternativas (ver “Resultados preliminares y
su discusión”).
21
Protocolos experimentales
Protocolo 1:
Se utilizarán 2 grupos de ratas preñadas y 2 grupos de ratas en ciclo para verificar la
reproducibilidad de los resultados experimentales. Las hembras se sacrificarán en la tarde del
día 1 de preñez o ciclo. Luego de separar oviductos y úteros, éstos se perfundirán para eliminar
los ovocitos, los embriones, el semen y los espermatozoides. El ARN total de oviductos y úteros
se purificará por separado utilizando el método de tiocianato de guanidina-fenol-cloroformo
descrito por Chomczynski y Sacchi (1987). El ARN total obtenido de cada órgano y en cada una
de las dos condiciones fisiológicas se someterá a la técnica de expresión diferencial utilizando el
kit “RNAimage” de GenHunter Corporation (1997), para construir los ADNc. Se utilizarán 3
oligo-deoxinucleótidos (oligos-dT), la transcriptasa reversa y los 4 nucleótidos. Los ADNc se
amplificarán y marcarán radiactivamente con 33P-ATP por PCR, utilizando los 3 oligos-dT, 10
partidores, la Taq polimerasa y los 4 nucleótidos no marcados. Los ADNc marcados se
separarán en geles denaturantes de poliacrilamida y la ubicación de los fragmentos se revelará
por autoradiografía. Se presumirá que ocurrió expresión diferencial de genes (activación o
represión) cuando al comparar bandas de ADNc del mismo peso molecular provenientes desde
ratas preñadas y en ciclo se observe diferencias en densidad o grosor, o en algún caso
ausencia.
La utilización de dos grupos de ratas en la misma condición es para verificar la
reproducibilidad de las diferencias observadas y eliminar algunos de los falsos positivos.
Los fragmentos que presuntamente se expresen en forma diferencial debido al coito, se
clonarán para tenerlos disponibles y así no tener que repetir la primera parte del protocolo 1
cuando se requiera de éstos. Para ello, cada fragmento de interés se eluirá del gel y se
reamplificará por PCR para luego clonarlo según el sistema PCR-TRAP de GenHunter
Corporation. Cuando sea requerido un fragmento clonado, se pondrán a multiplicar bacterias
que lo contengan en placas de agar. Las colonias bacterianas se lisarán con un tampón de lisis
de colonia según Engebrecht y col. (1991), obteniéndose por purificación el ADN plasmidial. El
ADN plasmidial purificado se digerirá con enzimas de restricción provistas por PCR-TRAP de
GenHunter Corporation, para aislar cada fragmento.
22
Los fragmentos así obtenidos se amplificarán por PCR con el oligo-dT y el partidor del plasmidio
adecuados (este último provisto en el kit de clonamiento PCR-TRAP). Con la ayuda de otras
enzimas de restricción se generará un fragmento de 450 pb que estará inserto en el plasmidio,
que sólo aparece cuando la clonación es exitosa. Este fragmento servirá como estándar de peso
molecular. Luego, los fragmentos se separarán en geles de agarosa y los que sean de interés se
eluirán del gel.
Para reconfirmar la expresión diferencial de algunos genes en el primer PCR, se realizará un
Dot-Blot según Brown y Mackey (1997). Gotas de los fragmentos, se dejarán secar en
membranas de nylon y estas últimas se hibridarán con ADNc marcado radiactivamente que
provendrá desde la transcripción reversa del ARN total de hembras en ciclo y preñadas. Luego
las membranas se lavarán y los fragmentos se revelarán por autoradiografía. Se comparará
visualmente, si las señales autoradiográficas son diferentes cuando un mismo fragmento es
incubado con ADNc proveniente desde hembras en ciclo o preñadas. Esta técnica no está dando
buenos resultados en el laboratorio así que se evaluará en su momento si se utiliza o no.
Para cuantificar y confirmar de manera irrefutable la expresión diferencial de los genes,
detectada en el primer PCR y Dot-Blot, se realizará un Northern Blot, según Brown y Mackey
(1997). Esta técnica también sirve para eliminar los falsos positivos. Para esto, los ARN totales
desde oviducto o útero obtenidos de animales en ciclo o preñez, se separarán en geles de
agarosa-formaldehído y se transferirán a una membrana de nylon mediante capilaridad. Los
fragmentos clonados, se extraerán desde las bacterias clonadas por lisis de colonia.
Posteriormente, los fragmentos clonados se marcarán radiactivamente al azar con 32P-NTP,
siguiendo las instrucciones propuestas en el Kit “Random Primers DNA Labelling” de Life
Technologies. Se pondrá a hibridar cada fragmento de interés con los ARN que estarán en las
membranas de nylon. Finalmente, se revelarán las autoradiografías de las membranas para
identificar los fragmentos que realmente se expresan diferencialmente a causa del coito en
oviducto y útero de ratas. Además, el grado de expresión de dichos genes se cuantificará por
densitometría de las autoradiografías.
23
Protocolo 2:
Una vez que se haya determinado, sin lugar a dudas en el protocolo anterior, que debido al
coito, uno o más genes se expresan diferencialmente en oviducto o útero o ambos, se
establecerán 3 grupos de ratas tratadas y 2 grupos de ratas controles, cada uno de 5 animales.
Los tratamientos consistirán en: a) estimulación mecánica del cérvix y vagina con una varilla
conectada a un vibrador; b) inseminación intrauterina con espermatozoides epididimarios, y c)
inseminación intrauterina con secreción obtenida desde las vesículas seminales. Los animales
de los grupos controles se someterán a estimulación cérvico-vaginal simulada o inseminación
simulada. Los tratamientos y las simulaciones se aplicarán temprano en la mañana del estro
(día 1) y las ratas se sacrificarán en la tarde del mismo día.
Para determinar que genes se expresan diferencialmente ante cada tratamiento se utilizará la
técnica del Northern Blot, según Brown y Mackey (1997). En este caso y en breve, se obtendrá
el ARN total desde oviductos y úteros separadamente en cada grupo tratado o control. Los ARN
en la membrana de nylon se hibridarán con las sondas marcadas generadas en el protocolo 1.
La radiactividad de los fragmentos se revelará por autoradiografía, la que se analizará por
densitometría. Por comparación con la marca autoradiográfica de la hibridación se determinará
si hubo expresión diferencial de los genes entre animales tratados y controles. Se espera que
cada uno de los tres componentes del coito examinados de cuenta de uno o más genes
expresados diferencialmente en el primer experimento.
24
Protocolo 3:
Cada fragmento o gen expresado diferencialmente debido al coito, y a un componente del coito
si es posible, se secuenciará en cuatro tubos de reacción. Cada tubo contendrá: los cuatro
dNTP, un partidor universal, uno de los cuatro 33P-ddNTP, la polimerasa de ADN termo
secuenasa y el fragmento a secuenciar. Se procederá según instrucciones del kit “Radiolabeled
terminator cycle sequencing” de Amersham Life Science. Los fragmentos contenidos en cada
tubo de reacción se separarán en un gel de secuenciación para determinar la secuencia del gen.
Estas secuencias se compararán con las registradas en el Banco de Genes mediante el
programa “Lasergene Navigator” para determinar la probable familia o la proteína para las que
codifican. Es posible que la secuenciación de los fragmentos se encargue a un laboratorio que
ofrece el servicio de secuenciación, porque resulta más barato y más rápido. El hecho que una
técnica como ésta la haga otro laboratorio no perjudica el trabajo realizado en el laboratorio de
origen de la muestra.
25
Métodos
Animales:
En este estudio, se utilizarán ratas adultas de la cepa Sprague-Dawley mantenidas en vivero
con agua y alimento ad libitum. La temperatura se mantendrá entre 21 - 24ºC y la iluminación
entre 07:00 - 21:00 horas. Los machos tendrán 4 a 5 meses de edad, 350 g de peso y fertilidad
probada. Se utilizarán hembras que tengan ciclos regulares de cuatro días y pesen entre 200 y
300 g.
Hembras en ciclo y preñez:
La regularidad del ciclo estral se controlará por frotis vaginal cada mañana. El día del estro se
considerará como día 1 del ciclo, ya que la ovulación ocurre en la madrugada de ese día. Para
obtener hembras preñadas en el experimento 1, éstas se dejarán con machos en la tarde del día
del proestro (día anterior al estro). Al día siguiente, el coito se verificará por la presencia de
espermatozoides o sangre en el frotis vaginal. Ese día se designará como día 1 de la preñez.
Estimulación cérvico-vaginal:
La estimulación mecánica cérvico-vaginal se aplicará entre las 7:30 y 10:00 del estro. Consiste
en introducir la punta de una pipeta volumétrica de 1 mL en la vagina de la hembra hasta
hacer contacto con el cérvix uterino, mientras el otro extremo hace contacto con un vibrador en
funcionamiento. La estimulación se aplicará 3 veces por 10 segundos, con intervalos de 1
minuto.
La simulación de la estimulación cérvico-vaginal consistirá en el mismo procedimiento anterior,
excepto que la punta de la pipeta que se introducía en la vagina se apoyará en el dorso del
animal.
Inseminación intrauterina:
La inseminación intrauterina se realizará mediante una laparotomía supra-púbica entre las
7:30 y 10:00 del estro, bajo anestesia con éter. Los cuernos uterinos se exteriorizarán y se
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inyectará la suspensión respectiva en cada uno de ellos. Se practicarán suturas al músculo y
piel de los animales.
La simulación de la inseminación consistirá en el mismo procedimiento anterior, salvo que se
inyectará suero fisiológico.
Para la inseminación intrauterina con espermatozoides epididimarios, machos adultos de 4 a 5
meses de edad se sacrificarán por decapitación. La cola de cada epidídimo se disecará y se
dividirá en pequeños trozos que se incubarán en suero fisiológico estéril a 37ºC. La suspensión
de espermatozoides resultante se someterá a recuento espermático. Luego 10-20 millones de
espermatozoides se inseminarán en cada cuerno uterino con una jeringa tuberculina.
Para la inseminación intrauterina con secreción de las vesículas seminales, esta secreción se
obtendrá desde los mismos machos sacrificados para la obtención de espermatozoides
epididimarios, por punción con una aguja #22 y aspiración con una jeringa tuberculina. La
totalidad de la secreción aspirada desde una vesícula se inseminará en cada cuerno uterino.
Purificación de ARN:
Las hembras se sacrificarán con una sobredosis de éter en la tarde del día 1 (día del estro). Los
oviductos y los úteros se extraerán y perfundirán por separado. El ARN total de los oviductos y
los úteros por separado, se purificará utilizando el método de tiocianato de guanidina-fenol-
cloroformo descrito por Chomczynski y Sacchi (1987) y Chomczynski (1996). Consiste en la
homogenización de los órganos en tiocianato de guanidina 4 molar (M). Este homogenizado se
mezclará secuencialmente con: acetato de sodio 2 M (pH 4), fenol y finalmente
cloroformo/alcohol isoamílico. La mezcla se centrifugará y así la fase acuosa superior que
contendrá el ARN total se separará de las proteínas y ADN. El ARN total se precipitará con
isopropanol, el precipitado se resuspenderá en tiocianato de guanidina 4 M, se reprecipitará
con isopropanol y se lavará con etanol 70%. Luego, el ARN total purificado se incubará con
ADNasa para eliminar el ADN cromosomal contaminante según técnica descrita por Gilman
27
(1997).
Reacción de la transcriptasa reversa:
A partir del ARN total se construirán los ADNc según procedimiento especificado en el kit
“RNAimage” para expresión diferencial de GenHunter Corporation (1997). Para esto se
utilizarán 3 oligo-deoxinucleótidos-dT (oligos-dT) que contienen 11 timinas más una base
adicional arbitraria y que se anclan a las colas de poly(A) de los ARNm que son parte del ARN
total. Cada tubo de reacción contendrá: 1 de los 3 oligos-dT, los 4 nucleótidos y el ARN total.
Sólo si se desea obtener ADNc marcado radiactivamente se añadirá 33P-dATP al tubo en el inicio
junto con los demás reactivos. El tubo se pondrá en el termociclador a 65°C por 5 minutos y
37°C por 10 minutos. Enseguida se añadirá la enzima transcriptasa reversa a cada tubo y se
mezclará rápidamente su contenido agitando los tubos. Los tubos se continuarán incubando a
37°C por 50 minutos para que la transcripción reversa tome lugar. Luego, se incubarán a 75°C
por 5 minutos y a 4°C hasta el momento de usar. Los tubos se pondrán en hielo si se va a
realizar de inmediato la PCR, o si no se guardarán a -20°C.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):
Los ADNc obtenidos antes o fragmentos clonados (ver después) se someterán a amplificación
por PCR siguiendo el protocolo establecido y utilizando los reactivos provistos en el kit
“RNAimage” para expresión diferencial de GenHunter Corporation (1997). Cada tubo de
reacción contendrá: 1 de los 3 oligos-dT (mencionados anteriormente), 1 de 10 partidores, la
enzima termosensible Taq ADN polimerasa, los 4 nucleótidos no marcados y la muestra a
amplificar. Cuando sea necesario marcar el producto-PCR se utilizará 33P-dATP como isótopo
radiactivo desde el inicio de la reacción, porque según Liang y Pardee (1995) y Trentmann y col.
(1995) es el más apropiado. Se realizarán 30 a 40 ciclos de PCR. Cada ciclo consiste en someter
al tubo y los reactivos contenidos a las siguientes condiciones: 94ºC por 30 segundos, 40ºC por
2 minutos y 72ºC por 30 segundos hasta completar el número de ciclos deseados en un
termociclador. Después del último ciclo, se debe llevar al tubo a 72ºC por 5 minutos y luego a
4ºC hasta el momento de usar. Los tubos se pondrán en hielo si se va a realizar de inmediato el
28
siguiente paso, o si no se guardarán a -20°C.
Cuando se haya realizado un PCR desde ARN total será imprescindible separar los fragmentos
resultantes. Para esto, se utilizarán 4 L de cada ADNc-PCR marcado radiactivamente para
separar los fragmentos en geles denaturantes de poliacrilamida al 6%. El exceso de líquido del
gel será extraído por la misma máquina en que se realiza la corrida del gel. El gel seco será
cubierto con una placa autoradiográfica por 24 a 100 horas para revelar los fragmentos como
bandas.
Para el caso particular del RT-PCR desde ARN total de oviducto o útero, se determinará por
examen visual de las autoradiografías cuales bandas son expresadas aparentemente en forma
diferencial en oviductos y úteros en cada condición experimental. Se determinará que ocurrió
presunta expresión diferencial de genes (activación o represión) cuando aparezcan bandas de
ADNc aumentadas o disminuidas en densidad o grosor, o diferencialmente ausentes o
presentes provenientes desde útero y oviducto de ratas preñadas y en ciclo. Todo este
procedimiento se realiza con dos muestras en paralelo para verificar la reproducibilidad de la
expresión diferencial y eliminar algunos falsos positivos.
Elución de una banda o un fragmento desde un gel:
Cada banda o fragmento de interés se cortará desde el gel ayudándose con la referencia de la
autoradiografía. El trozo de gel que contiene el fragmento, se remojará en tampón de PCR 1x
por 10 minutos y luego se hervirá por 15 minutos. Se realizará una centrifugación de corta
duración para colectar la condensación de dentro del tubo y precipitar el gel. Al sobrenadante
se añadirá acetato de sodio 3M, glucógeno (10 mg/mL) y etanol 100%, que se mantendrá a -
70°C por 30 minutos. El tubo se centrifugará por 10 minutos a 4ºC para precipitar el ADN. Al
precipitado se le añadirá etanol 85% a 4ºC para renaturar el ADN. Nuevamente, el tubo se
centrifugará y el precipitado se dejará secar a temperatura ambiente para remover el etanol.
Luego al precipitado se le añadirá 10 μL de agua destilada para hidratar y resuspender el ADN.
Este ADN se puede utilizar de inmediato o guardar a –20ºC. Si es necesario asegurarse de la
presencia del fragmento amplificado, se debe hacer una electroforesis en agarosa antes de usar.
29
Clonación de un fragmento-PCR:
Cada fragmento de interés se clonará según el sistema de clonamiento PCR-TRAP de
GenHunter Corporation (versión 3.0). Consiste en insertar el fragmento en el vector o el
plasmidio de expresión bacteriano “PCR-TRAP”, por una reacción de ligazón que involucra
enzimas de restricción y ligasa de ADN T4. Luego, estos vectores se incorporarán en bacterias
por medio de un procedimiento de transformación. Gracias a que el vector contiene un gen que
le confiere resistencia a la tetraciclina, al cultivar las bacterias en placas de agar con
tetraciclina, sólo sobreviven las bacterias transformadas y que contienen el vector, por ende, el
fragmento de interés. Cuando sea requerido un fragmento clonado, se utilizará el procedimiento
especificado por Engebrecht y col. (1991). Este consiste en sembrar bacterias conteniendo dicho
fragmento en placas de agar con tetraciclina. Se toma un pequeño volumen de la o las colonias
bacterianas, que pueda ser visto por el ojo humano, para incubarlo a 95ºC por 10 minutos en
tampón de lisis, que contiene una solución denaturante a base de NaOH y sodio dodecil sulfato
(SDS), además, contiene las mismas enzimas de restricción utilizadas en el procedimiento de
ligazón del fragmento al plasmidio. Luego, se centrifuga por 2 minutos para precipitar el ADN
cromosomal y las proteínas bacterianas. El ADN plasmidial en el sobrenadante, conteniendo el
fragmento clonado, puede ser utilizado inmediatamente para reamplificación u otros fines. Se
debe almacenar a –20ºC. Si fuese necesario asegurar la presencia del fragmento de interés o
separarlo de los demás se debe realizar una electroforesis en agarosa según el protocolo
especificado por PCR-TRAP de GenHunter Corporation (versión 3.0). Antes de la electroforesis,
el ADN plasmidial puede ser tratado con otras enzimas de restricción provistas en ese kit,
distintas a las mencionadas hasta ahora. Aparecerán el o los fragmentos de interés en el gel y,
además, un fragmento de 450 pb que está inserto en el plasmidio y que sólo aparece cuando la
clonación de un fragmento es exitosa. Este fragmento servirá como estándar de peso molecular.
El fragmento clonado reconocido positivamente se eluirá del gel.
Dot-Blot:
El Dot-Blot (Brown y Mackey, 1997) permite reconfirmar la expresión diferencial cualitativa de
algunos genes en un PCR anterior. Consiste básicamente en inmovilizar ADN denaturado en
30
una membrana de nylon y luego incubarla con ADN marcado y denaturado que pueda hibridar
con el inmovilizado. Para esto, los fragmentos clonados se incuban en una solución de ácido
propanosulfónico, acetato de sodio, ácido etilenodiamina tetracético (EDTA), formamida y
formaldehído por 15 minutos a 65ºC. Las gotas del fragmento denaturado se dejarán secar en
membranas de nylon a 80ºC por 30 minutos al mismo tiempo que se irradian con luz
ultravioleta (UV) para inmovilizar el ADN. Se podrá verificar la presencia del fragmento en las
membranas por tinción con azul de metileno al 0,03% (p/v). Las membranas secas así
preparadas se pueden guardar por meses a temperatura ambiente. Las membranas con el o los
fragmentos inmovilizados serán incubadas con solución de prehibridación-hibridación a base
de formamida por 3 horas a 42ºC con rotación. Al mismo tiempo, se debe realizar una
transcripción reversa de ARN total de hembras en ciclo o preñez en presencia de 33P-dATP para
obtener ADNc marcado radiactivamente. Este ADNc se denaturará a 100ºC por 10 minutos. Se
tomará el volumen necesario de ADNc con una concentración que oscilará entre 2 y 10 ng/mL,
que se agregará a la solución de prehibridación-hibridación, donde estarán las membranas, que
se incubarán toda la noche a 42ºC. Las membranas se lavarán en una solución a base de 0,1%
de SDS varias veces. Se adsorberá el exceso de líquido con papel y estas membranas serán
cubiertas con las placas autoradiográficas por 72 horas. Los sitios donde los ADNc marcados
radiactivamente hibridaron con los fragmentos clonados se revelarán en las autoradiografías.
Las marcas radiactivas se compararán visualmente y serán proporcionales a la cantidad de
fragmento presente. Si la cantidad de señal autoradiográfica es diferente para fragmentos de un
mismo peso molecular provenientes de ARN total de hembras en ciclo y preñadas, se
reconfirmará el resultado del primer PCR.
Marcaje radiactivo de un fragmento:
Los fragmentos clonados, se extraerán desde las bacterias clonadas por lisis de colonias (ver
antes). Posteriormente servirán como templados para marcar radiactivamente nuevos
fragmentos con 32P-NTP siguiendo las instrucciones propuestas en el kit “Random Primers DNA
Labelling” de Life Technologies (número de catálogo: 18187-013). Los fragmentos clonados se
hierven para denaturarlos y luego se mezclan con los cuatro dNTP en presencia de los cuatro
31
32P-dNTP y la ADN polimerasa I a 25ºC por 1 hora para generar nuevos fragmentos marcados
radiactivamente al azar.
Northern Blot:
El Northern Blot (Brown y Mackey, 1997) sirve para eliminar los falsos positivos en la expresión
diferencial y consiste en transferir el ARN total separado en geles de agarosa a una membrana
para ser hibridado con ADN o ARN marcado radiactivamente. En este caso, el ARN total de
oviducto o útero, en los protocolos 1 ó 2, se separará en geles de agarosa-formaldehído (1,1-
5,0%) y en los mismos geles se pondrán ARN de pesos moleculares conocidos, pero en carriles
distintos. Estos ARN servirán de referencia de peso molecular. De cada muestra se cargarán a
lo menos dos carriles, uno para teñirlo con bromuro de etidio (0,5 ug/mL) o naranja de acridina
(10 ug/mL) y otro para transferirlo a una membrana de nylon. Los segmentos de gel para teñir
se irradiarán con luz UV para visualizar los ARN y se les tomarán fotografías si fuese necesario.
Los ARN del segmento de gel no teñido se transferirán a una membrana de nylon (0,45 m)
mediante capilaridad. Este segmento de gel se secará a 80ºC por 30 minutos mientras se
irradia con luz UV para inmovilizar los ARN. Las membranas secas así preparadas se pueden
guardar por meses a temperatura ambiente. Para comprobar la eficiencia de la transferencia se
puede teñir el gel con azul de metileno a 0,03% (p/v). Si se apreciara mucha tinción en el gel
querrá decir que no todo el ARN fue transferido a la membrana. Las membranas con el ARN
inmovilizado se incubarán con solución de prehibridación-hibridación a base de formamida por
3 horas a 42ºC con rotación. Al mismo tiempo, se realizará el marcaje radiactivo del o los
fragmentos de interés con 32P-NTP. Cada fragmento marcado se denaturará por 10 minutos a
100ºC. Se tomará el volumen deseado de cada fragmento con una concentración que oscilará
entre 2 y 10 ng/mL, que se agregará a la solución de prehibridación-hibridación, donde estarán
las membranas, que se incubarán toda la noche a 42ºC. Las membranas se lavarán en una
solución a base de 0,1% de SDS varias veces. Se adsorberá el exceso de líquido con papel y
estas membranas serán cubiertas con las placas autoradiográficas por 72 horas. Los sitios
donde los fragmentos marcados radiactivamente hibridaron con los transcritos de ARN se
revelarán en las autoradiografías. Se cuantificará el grado de expresión de dichos genes o
32
fragmentos por densitometría de las autoradiografías. La marca radiactiva será proporcional a
la cantidad de fragmento hibridado. Si las señales autoradiográficas son diferentes para
fragmentos equivalentes que fueron incubados con ARN total proveniente de hembras en ciclo y
preñadas, en el primer protocolo, o provenientes de hembras sometidas a componentes del
coito por separado, en el segundo protocolo, se reconfirmará el resultado del primer PCR y del
Dot-Blot.
Técnica de secuenciación:
Cada fragmento de interés, se secuenciará en cuatro tubos de reacción. Cada tubo contendrá:
los cuatro dNTP, un partidor universal, uno de los cuatro 33P-ddNTP, la polimerasa de ADN
termo secuenasa y el fragmento a secuenciar según instrucciones del kit “Radiolabeled
terminator cycle sequencing” de Amersham Life Science (1997, modificado desde el método de
Sanger y col., 1977). Los tubos se introducirán en un termociclador para iniciar 30 ciclos de
secuenciación. Las condiciones de estos ciclos consisten en: 95ºC por 30 segundos, 55ºC por
30 segundos y 72ºC por 60 ó 120 segundos. Después del último ciclo se debe agregar una
solución a base de formamida que detiene la reacción. Las muestras pueden ser almacenadas
congeladas hasta antes de cargar en el gel de secuenciación. Cada tubo se calentará a 70ºC por
2 a 10 minutos. Los fragmentos contenidos en cada tubo de reacción se separarán en un gel de
secuenciación para determinar la secuencia del gen.
Estas secuencias se compararán con las registradas en el Banco de Genes mediante el
programa “Lasergene Navigator” para tratar de determinar la probable familia o proteína a las
que pertenecen las secuencias con mayor homología.
33
Resultados preliminares y su discusión
Se obtuvo ARN total desde oviductos y úteros de ratas en día 1 de ciclo y preñez. Para verificar
su estado de degradación se realizó una electroforesis en gel de agarosa 1,5 %.
Las muestras de oviductos casi no estaban degradadas, sin embargo, las de úteros estaban
degradadas (ver Figura 1). Esto se desprende del examen visual de la fotografía del gel. Por
cuanto las dos muestras de oviductos muestran claramente 3 bandas correspondiendo a los
ARN ribosomales de 28, 18 y 5S. Mientras las de útero muestran un esparcido de ARN
ribosomal y posiblemente ADN contaminante. Este examen es rutinario y recomendado por los
proveedores de material y equipo de biología molecular, por cuanto es barato y representa la
degradación del ARN total. La degradación en grado mínimo de las muestras de oviducto no es
problema porque después se deben tratar con ADNasa y volver a purificar. En la mayoría de las
muestras de útero se verificó degradación del ARN. La explicación de esto no es aparente ya que
estas muestras se trabajaron en forma paralela a las de oviducto, ninguna de las que se
degradó. Por lo tanto, el trabajo con útero se dejó temporalmente de lado. Es posible que el ARN
de las muestras de útero esté en parte degradado, pero también contaminado con ADN. Esto
puede haber ocurrido por la poca experiencia del tesista y el gran volumen de útero tratado.
Esta posibilidad va a ser investigada en el futuro, tratando estas muestras con ADNasa. Se
debe hacer notar que otras personas del laboratorio con experiencia en la extracción de ARN
total de útero también han tenido el mismo problema. Además, los reactivos fueron cambiados
por otros recién abiertos para descartarse la posibilidad que los reactivos de alguna forma
potenciaran la degradación del ARN de útero y el problema continuó.
Como era posible que el ARN total de oviducto estuviere mezclado con trazas de ADN
contaminante, se trató con 10 unidades de ADNasa por cada 10 μL de muestra. Luego se
precipitó la ADNasa, ADN digerido y proteínas que todavía hubiese con fenol/cloroformo. Este
procedimiento deja las muestras sin trazas de ADN que pudieran servir de templado en las
reacciones de PCR futuras. Finalmente, se precipitó y reprecipitó el ARN total. Después de este
procedimiento se verificó la degradación del ARN con una electroforesis en agarosa.
Las muestras de oviducto quedaron libres de ADN y las bandas de ARN ribosomal de 28 y 18S
son claramente distinguibles (ver Figura 2). Al comparar las figuras 1 y 2 se puede ver que en la
34
segunda verificación casi desaparece completamente la banda de 5S y no existe esparcido de
ningún tipo. Lo que demuestra que las muestras no están degradadas ni tampoco
contaminadas con ADN. Esta calidad de ARN total es requerida para el RT-PCR a que se
sometieron posteriormente las muestras.
El ARN total de oviductos de ratas en día 1 de ciclo y preñez se sometió a transcripción reversa
(RT) para obtener ADNc utilizando transcriptasa reversa y los partidores HT11A, HT11C y HT11G.
Los ADNc se sometieron a amplificación por PCR utilizando ADN polimerasa, P 33 -ATP, el
mismo partidor utilizado para RT y otro partidor específico provisto por GenHunter para cada
tubo de reacción. Los partidores específicos fueron AP 41, AP42,... y AP 56. Luego se realizó
una electroforesis en gel denaturante de poliacrilamida al 6% para separar los fragmentos de
ADNc.
La autoradiografía de uno de estos geles mostró 34 ADNc que presentan expresión diferencial
presunta al comparar ratas en ciclo (C1 y C2) y preñadas (P1 y P2) (ver Figura 3). Las flechas y
los rectángulos muestran estos ADNc, entendiendo como presunta expresión diferencial de
genes (activación o represión) la aparición de bandas de ADNc aumentadas o disminuidas en
densidad o grosor, o diferencialmente ausentes o presentes provenientes desde oviducto de
ratas preñadas y en ciclo. Las flechas indican bandas del mismo peso molecular aumentadas o
disminuidas en densidad o grosor, por lo tanto, según la definición de expresión diferencial
serían buenos candidatos. Lamentablemente confirmar esta expresión diferencial por Dot-blot y
Northern blot es difícil en nuestro laboratorio. Cuando se ha intentado en el pasado para otras
condiciones experimentales, los resultados demuestran que es pérdida de tiempo, trabajo y
dinero. Esto nos ha llevado a ser más estrictos. Sólo aceptamos que existe presunta expresión
diferencial de genes (activación o represión) cuando concurren 3 condiciones. 1) Hay bandas de
ADNc diferencialmente presentes o ausentes (o casi totalmente ausentes) para las condiciones
estudiadas, en este caso, provenientes desde oviductos de ratas preñadas y en ciclo, 2) que esta
diferencia se repite en al menos 3 autoradiografías y 3) que la banda “presente” sea de alta
densidad. Este caso corresponde a los rectángulos que encierran a las bandas denominadas:
125, 120, 115, 118, 151, 153 y 145 (ver Figura 3). Como el resultado positivo de la observación
visual es presencia/ausencia no se requiere hacer densitometría ni análisis estadístico en este
35
punto de la investigación. Al examinar detenidamente las marcas radiactivas en la
autoradiografía uno se puede dar cuenta que no son completamente iguales al comparar las
muestras de ciclo o las de preñez. Esto se debe a que C1 y P1 corresponden a 10 oviductos y C2
y P2 a 6 oviductos. Entonces, son esperables diferencias visuales entre muestras de la misma
naturaleza. Porque es posible que haya un número mayor de copias de uno o varios transcritos
en las muestras de 10 oviductos que en las muestras de 6. Este es un error que asume como
propio el tesista, que tenía la noción que cada muestra se iba a comparar con su contraparte de
igual número oviductos. A pesar de esto, se encontraron genes representados por las marcas
autoradiográficas de sus ADNc que presentan expresión diferencial presunta.
Al reunir toda la información recopilada en las autoradiografías podemos decir que se
encontraron 112 bandas expresadas diferencialmente considerando la definición más amplia.
Pero, al restringir la definición a presencia/ausencia (o casi total ausencia) este número se
redujo a 11 bandas (59, 105, 106, 107, 115, 118, 120, 125, 145, 151 y 153) (Figura 3 y datos
no mostrados).
Estas 11 bandas se eluyeron de al menos 1 gel cada una con la ayuda de las referencias de las
autoradiografías. Se eluyó por separado tanto la banda presente como el trozo de gel ubicado al
lado y a la misma altura (“banda ausente”). Luego se reamplificaron por PCR y alicuotas de
estas muestras se separaron por electroforesis en gel de agarosa. Los geles se tiñeron con
bromuro de etidio y se irradiaron con luz ultravioleta. Este procedimiento se llevó a cabo para
comprobar que las diferencias autoradiográficas se corresponden con diferencias en cantidad
de ADN. Así se pueden descartar algunos falsos positivos.
En la Figura 4, se muestra un trozo de una fotografía de un gel de ADNc reamplificados. Se
puede apreciar claramente presente la banda 120 P y casi totalmente ausente la banda 120 C.
Dicho de otra manera, la cantidad de ADN en las bandas 120 (Figura 4) se correspondió con su
marca autoradiográfica (Figura 3). Lo que no ocurre con las bandas 118 y 125. Esto se debe
probablemente a que la incorporación de fósforo radiactivo no es uniforme intra-tubo de PCR e
inter-tubo de PCR antes de correr los geles de poliacrilamida, debido al poco volumen en que se
realiza la reacción, y con esto se originan falsos positivos.
De las 11 bandas seleccionadas, sólo en 7 casos se correspondió la cantidad de ADN con su
36
marca autoradiográfica, estas bandas son: 105 C, 106 P, 107 C, 115 P, 120 P, 145 C y 151 C
(Figuras 3 y 4 y datos no mostrados).
Una vez confirmada la correspondencia entre marca autoradiográfica y cantidad de ADN, el
resto de la muestra reamplificada se separó por electroforesis de alta resolución en
poliacrilamida no denaturante (ver Figura 5). En cada carril se cargaron 28 μL de muestra que
constituyen un volumen muy grande para un mini gel. A esto se debió que el ADN aparezca
esparcido. Se pueden ver dos fragmentos de ADN de un poco más de 500 pb (115 P y 120 P).
Estos fragmentos son excelentes candidatos a ser clonados y secuenciados, su alto peso
molecular facilita estos procedimientos. Los otros fragmentos están en el rango de 100-200 pb,
lo que va a dificultar su clonación y secuenciación. En todo caso, estos procedimientos son
posibles de realizar con fragmentos de este tamaño. La presencia de bandas más tenues en los
carriles 145 C (no mostrado) y 115 P (se muestra una de las dos bandas tenues) sólo significa
que la reamplificación no fue tan específica para estos casos. A pesar que el ADN estuviera
esparcido y que aparecieran bandas más tenues se cortaron las bandas más intensas de cada
carril porque ese es el ADNc que nos interesa.
Se cortaron en total 7 bandas que corresponden a 105 C, 106 P, 107 C, 115 P, 120 P, 145 C y
151 C (Figura 5 y datos no mostrados). Luego los ADNc serán eluídos desde sus respectivos
trozos de gel, clonados y secuenciados. Además, se espera confirmar por Northern blot la
expresión diferencial de uno o más genes debido al coito. Para luego continuar con los
protocolos 2 y 3.
Se realizaron varias electroforesis de los primeros productos de PCR, algunos de estos ADNc se
encuentran todavía en los respectivos geles que fueron autoradiografiados. Entonces, estas
bandas serán cortadas, eluidas y reamplificadas. De esta manera nos aseguramos la existencia
de más ADNc antes de tenerlo clonado por si acaso las otras muestras sufren algún daño.
Hasta estos momentos no hemos probado nuestra hipótesis. Pero, estamos en condiciones de
formular una nueva hipótesis que probablemente será confirmada por Dot-blot y Northern blot.
Esta nueva hipótesis sería que “el coito determina cambios tempranos en la expresión de uno o
más genes en el oviducto de la rata”.
37
Figuras para Resultados Preliminares
28 S
18 S
5 S
OP UC OC UP
Figura 1. Verificación de estado de degradación de ARN total de oviducto (O) y útero (U) desde
ratas en día 1 de ciclo (C) o preñez (P). Fotografía de gel de agarosa 1,5 % irradiado con luz
ultravioleta después de electroforesis de ARN total. A las muestras antes de la electroforesis se
les agregó bromuro de etidio. Las flechas indican los niveles a los que migran algunos ARN
ribosomales.
38
28 S
18 S
5 S
C P
Figura 2. Verificación de estado de degradación de ARN total, previamente tratado con ADNasa,
desde oviductos de ratas en día 1 de ciclo (C) y preñez (P). Fotografía de gel de agarosa 1,5 %
irradiado con luz ultravioleta después de electroforesis de ARN total tratado con ADNasa (1
unidad por cada μL de ARN total). A las muestras antes de la electroforesis se les agregó
bromuro de etidio. Las flechas indican los niveles a los que migran algunos ARN ribosomales.
39
Figura 3. Patrones de expresión de ARNm
de 10 o 6 oviductos de ratas en día 1 de
ciclo (C1 o C2, respectivamente) y preñez
(P1 o P2, respectivamente). Explicaciones
en el texto.
Partidor HT11A
AP 44 AP 43 AP 42 AP 41 AP 48 AP 47 AP 46 AP 45
C1 C2 P1 P2 C1 C2 P1 P2 C1 C2 P1 P2 C1 C2 P1 P2 C1 C2 P1 P2 C1 C2 P1 P2 C1 C2 P1 P2 C1 C2 P1 P2
125
153
120115
118
151
145
La leyenda de la Figura 3 se presenta en la siguiente página.
40
Figura 3. Patrones de expresión de ARNm desde 10 ó 6 oviductos de ratas en día 1 de ciclo (C1
ó C2, respectivamente) y preñez (P1 ó P2, respectivamente). Autoradiografía de un gel
denaturante de poliacrilamida al 6 % después de electroforesis de fragmentos de ADNc
obtenidos por RT-PCR desde ARN total de oviducto de rata. El ARN total fue tratado
previamente con ADNasa (ver Figura 2). Para cada tubo de reacción de PCR se utilizó un par de
partidores específicos (ver parte alta de figura: AP 41, AP 42, ... ó AP 48 y HT11A, todos
provistos por GenHunter) y P 33 -ATP. Los rectángulos muestran los ADNc seleccionados que
se expresan diferencialmente y que fueron eluidos y reamplificados posteriormente (ver Figuras
4 y 5). Las flechas muestran otros ADNc que se expresan diferencialmente, pero no fueron
seleccionados.
41
200 pb
118 PM 120 125
500 pb
600 pb
C P C P C P
Figura 4. Verificación de cantidad de ADN eluído desde gel de electroforesis de fragmentos de
ADNc oviductal. Fotografía de gel de agarosa 1,5 % después de electroforesis de ADNc obtenidos
desde gel de electroforesis (ver rectángulos en Figura 3). Antes se eluyeron separadamente las
bandas provenientes desde oviductos de ratas en ciclo (C) y preñez (P). Luego se reamplificaron
por PCR utilizando los mismos partidores específicos que les dieron origen. El gel se tiñó con
bromuro de etidio (5 μg/mL). En la parte alta de la figura se muestra el número de cada banda
seleccionada y el carril central corresponde a estándar de peso molecular (PM). Las flechas
muestran el nivel de 600, 500 y 200 pb.
42
145 107 120 PM 151 115
200 pb
500 pb
600 pb
C C P C P
100 pb
Figura 5. Separación con alta resolución de bandas eluídas y reamplificadas. Fotografía de gel
de poliacrilamida al 12 % después de electroforesis de ADNc obtenidos desde Figura 3. Antes se
eluyeron y se reamplificaron por PCR, las bandas seleccionadas (número de bandas y letras C o
P según si corresponden a oviductos desde ratas en 1 día de ciclo o preñez, respectivamente). El
cuarto carril corresponde a estándar de peso molecular (PM). Las flechas muestran el nivel de
600 y 100 pb. El gel se tiñó con bromuro de etidio.
43
Resultados posibles, discusión e interpretación del trabajo pendiente
Protocolo 1:
Se espera que al comparar bandas de ADNc de igual peso molecular, provenientes desde útero,
éstas presenten diferencias según provengan desde ratas en ciclo o preñadas. Las diferencias
que se espera encontrar en útero y las diferencias ya encontradas en oviducto (ver antes) se
confirmarán por Dot-Blot, Northern Blot y Ensayo de Protección de Ribonucleasa. Si ocurre de
un modo reproducible, se considerará que el coito activó o reprimió la transcripción de uno o
más genes cuando dichos ensayos revelen que el transcrito está diferencialmente presente o
ausente, respectivamente, con respecto al de la rata en día 1 de ciclo. Hasta este punto de la
investigación, en cualquiera de los casos se aceptará la nueva hipótesis: “el coito determina
cambios tempranos en la expresión de uno o más genes en el oviducto y/o el útero de rata”.
Entonces, se podrá continuar con los protocolos 2 y 3 para aprobar o rechazar nuestra
hipótesis: “la estimulación cérvico-vaginal, los espermatozoides y/o el material soluble del
semen determinan activación y/o represión de uno o más genes en el oviducto y/o el útero de
la rata dentro de las primeras 24 horas que siguen al coito.
Alternativamente, todas las bandas de ADNc podrían ser iguales después del primer PCR
cuando se compara útero desde ratas en ciclo y preñadas, en cuyo caso, se concluirá que no
hubo expresión diferencial de genes en el útero. En otras palabras, se considerará que el coito
no indujo activación ni represión de genes en el útero. Si éste es el resultado obtenido, se
rechazará la hipótesis en cuanto al útero y se suspenderá el trabajo para este órgano. Es
posible que se abandone definitivamente el trabajo con útero. Aunque existe la posibilidad de
explorar que los cambios en la expresión génica del útero ocurran después de las 24 horas del
coito, pero antes de la implantación. También se podría trabajar con Northern Blot de genes
preseleccionados. Otra posibilidad es estudiar los efectos del coito en la síntesis in vitro de
productos proteicos en el útero mediante fluorografía.
Protocolo 2:
Al analizar las autoradiografías del Northern Blot provenientes desde oviducto o útero de ratas
a las que se les aplicó uno de los 3 componentes del coito, es posible encontrar dos resultados.
44
Estos y sus interpretaciones son:
a) Si los resultados son como los esquematizados en la Figura 6, su interpretación será que,
ocurrió activación y/o represión de uno o más genes atribuible a componentes del coito y se
aceptará la hipótesis que “la estimulación cérvico-vaginal, los espermatozoides y/o el material
soluble del semen determinan activación y/o represión de uno o más genes en el oviducto y/o
el útero de la rata dentro de las primeras 24 horas que siguen al coito”.
b) Si los resultados son como los esquematizados en la Figura 7, su interpretación será que, si
bien es cierto no apoyan la hipótesis, pero tampoco la niegan. Se aceptará la hipótesis que “el
coito determina cambios tempranos en la expresión de uno o más genes en el oviducto y/o el
útero de rata, pero independientemente de la estimulación cérvico-vaginal, los espermatozoides
y/o el material soluble del semen”.
Protocolo 3:
En el intento de identificar la o las proteínas (o las familias) codificadas por uno o más genes
activados o reprimidos por el coito o uno de sus componentes, pueden darse dos posibles
resultados que no tienen interpretación: a) que se encuentre alta homología (más de 70 %) con
genes registrados en el banco de genes o, b) que no se encuentre alta homología.
45
Ciclo Coito T1 T2 T3 C1 C2
Figura 6: Representación esquemática de la expresión génica posible si las bandas
marcadas se diferencian entre animales tratados con un componente del coito (T1, T2 y T3)
y su respectivo control (C1 y C2). Para simplificar el ejemplo, sólo se ilustran tres bandas.
Ciclo Coito T1 T2 T3 C1 C2
Figura 7: Representación esquemática de la expresión génica posible si las bandas
marcadas no se diferencian entre animales tratados con un componente del coito (T1, T2 y
T3) y su respectivo control (C1 y C2). Para simplificar el ejemplo, sólo se ilustran tres
bandas.
46
Experiencia en el trabajo pendiente
He ejecutado varias técnicas entre ellas: disección y obtención de oviductos y úteros, obtención
de ARN total, transcripción reversa, PCR, electroforesis en gel de poliacrilamida para productos
de PCR, autoradiografía, tinción con bromuro de etidio, elución de bandas desde geles,
inseminación con espermatozoides epididimarios y semen, inseminación simulada,
estimulación cérvico-vaginal y su simulación. Manejo de los machos, disección de cola de
epidídimo, recuento y dilución de espermatozoides.
En el curso Desarrollo Embrionario y Técnicas Moleculares, realizado en el primer semestre de
1997, se explicaron teóricamente algunas técnicas de Biología Molecular y se llevaron a cabo
algunas de ellas, tales como: extracción de ADN plasmidial desde bacterias y Southern Blot de
ADN plasmidial revelado con bromuro de etidio.
No tengo experiencia y necesito aprender: densitometría, Dot-Blot, Northern Blot, clonamiento y
secuenciación de genes y búsqueda de homología en el banco de genes.
Referencias
Bansal R., Goldsmith P., He Y., Zaloudek C., Ecker J. & Riemer R. 1997. A decline in myometrial
nitric oxide synthase expression is associated with labor and delivery. J Clin Invest.
99: 2502-2508.
Barrat C., Bolton A. & Cooke I. 1990. Mini review. Functional significance of white blood cells in
the male and female reproductive tract. Hum Reprod. 5 (6): 639-648.
Bedford J., Rodger J. & Breed W. 1984. Why so many mammalian spermatozoa- a clue from
marsupials? Proc Roy Soc London. B. 221: 221-233.
Bellinge B., Copeland C., Thomas T., Mazzuchelli R., O’Neil G. & Cohen M. 1986. The influence
of patient insemination on the implantation rate in an in vitro fertilization and
embryo transfer program. Fert Steril. 46: 2523-2526.
Blandau R. 1973. Gamete transport in the female mammal. Chapter 38. In: Handbook of
Physiology. Volume II. Section 7: Endocrinology. Greep R. & Astwood E. (eds).
Baltimore. Waverly Press, Inc.
Boatman D. 1997. Responses of gametes to the oviductal environment. (JBFS. 2). Hum Reprod.
12 (suppl): 133-149.
Brown T. & Mackey K. 1997. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot hybridization. Chapter
4. Preparation and analysis of RNA. Section 9. Supplement 37. In: Current Protocols
in Molecular Biology. Vol. 1. Ausubel F., Brent R., Kingston R., Moore D., Seidman
J., Smith J. & Streihl K. (eds) Greene Publ. Assoc. & John Wiley & Sons.
Bucher P. 1999. Regulatory elements and expression profiles. Curr Op in Struct Biol. 9: 400-
417.
Buck C. & Horwitz A. 1987. Integrin, a transmembrane glycoprotein complex mediating cell-
substratum adhesion. J Cell Sci. Suppl. 8: 231-250.
Buhi W., Alvarez I., Pickard A., McIntush E., Kouba A., Ashworth C. & Smith M. 1997.
Expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 protein and messenger
ribonucleic acid by the oviduct of cyclic, early-pregnant, and ovariectomized steroid-
treated gilts. Biol Reprod. 57: 7-15.
48
Carballada R. & Esponda P. 1997. Fate and distribution of seminal proteins in the genital tract
of the female rat after natural mating. J Reprod Fert. 109: 325-335.
Carp H., Serr D., Mashiach S. & Nebel L. 1984. Influence of insemination on the implantation of
transferred rat blastocysts. Gynecol Obstet Invest. 18: 194-198.
Chaykin S. & Watson G. 1983. Reproduction in mice: spermatozoa as factors in the development
and implantation of embryos. Gamete Res. 7: 63-73.
Chomczynski P. & Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162: 156-159.
Chomczynski P. 1996. Guanidine methods for total RNA preparation. Chapter 4. Preparation
and analysis of RNA. Section 2. Supplement 36. In: Current Protocols in Molecular
Biology. Vol. 1. Ausubel F., Brent R., Kingston R., Moore D., Seidman J., Smith J. &
Streihl K. (eds) Greene Publ. Assoc. & John Wiley & Sons.
Claus R., Hoang-Vu C., Ellendorff F., Meyer H., Schopper D. & Weiler U. 1987. Seminal
oestrogens in the boar: origin and functions in the sow. J Steroid Biochem. 27: 331-
335.
Croxatto H. & Ortiz M. 1991. Oviductal recognition of embryonic signals. In: Uterine and
embryonic factors in early pregnancy. Strauss III & Lyttle (eds). Plenum Press. New
York.
Dong Y., Fang L., Gangula P. & Yallampalli C. 1998. Regulation of inducible nitric oxide
synthase messenger ribonucleic acid expression in pregnant rat uterus. Biol Reprod.
59: 933-940.
Engebrecht J., Brent R. & Kaderbhai M. 1991. Minipreps of plasmid DNA. Chapter 1.
Escherichia coli, plasmids, and bacteriophages. Section 6. Supplement 15. In:
Current Protocols in Molecular Biology. Vol. 1. Ausubel F., Brent R., Kingston R.,
Moore D., Seidman J., Smith J. & Streihl K. (eds) Greene Publ. Assoc. & John Wiley
& Sons.
Fazleabas A., Donnelly K., Mavrogianis P. & Verhage H. 1993. Secretory and morphological
changes in the baboon (Papio anubis) uterus and placenta during early pregnancy.
49
Biol Reprod. 49: 695-704.
Fazleabas A. y Verhage H. 1987. Synthesis and release of polypeptides by the baboon (Papio
anubis) uterine endometrium in culture. Biol Reprod. 37: 979-988.
Finn C. & Hinchliffe J. 1964. Reaction of the mouse uterus during implantation and deciduoma
formation as demostrated by changes in the distribution of alkaline phosphatase. J
Reprod Fertil. 8: 331.
Galitski T., Saldanha A., Styles C., Lander E. & Fink G. 1999. Ploidy regulation of gene
expression. Science. 285: 251-254.
Gilman M. 1997. Preparation of RNA from eukaryotic and prokariotic cells. Chapter 4.
Preparation and analysis of RNA. Section 1. Supplement 37. In: Current Protocols in
Molecular Biology. Vol. 1. Ausubel F., Brent R., Kingston R., Moore D., Seidman J.,
Smith J. & Streihl K. (eds) Greene Publ. Assoc. & John Wiley & Sons.
Harper M. 1994. Gamete and zygote Transport. Chapter 4. In: The Physiology of Reproduction.
Knobil E. & Neill J. (eds) Raven Press. New York. Pp: 123-187.
Harris G., Schuler L. & Shapiro S. 1994. Characterization of human endometrial glycogen
synthase. Fertil Steril. 62: 514-520.
Kaushic C., Frauendorf E. & Wira C. 1997. Polymeric immunoglobulin A receptor in the rodent
female reproductive tract: influence of estradiol in the vagina and differential
expression of messenger ribonucleic acid during estrous cycle. Biol Reprod. 57: 958-
966.
Kuhn R., Green A., Raymoure W. & Siiteri P. 1986. Immunocytochemical localization of
corticosteroid-binding globulin in rat tissues. J Endocrinol. 108: 31-36 with 2 plates.
Kurian K., Watson C. & Wyllie A. 1999. DNA chip technology (editorial). J Pathol. 187: 267-271.
Lessey B., Damjanovich L., Coutifaris C., Castelbaum A., Albelda S. & Buck C. 1992. Integrin
adhesion molecules in the human endometrium. J Clin Invest. 90: 188-195.
Liang P. & Pardee A. 1992. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the
polymerase chain reaction. Science. 257: 967-971.
Liang P., Averboukh L. & Pardee A. 1993. Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by
50
means of differential displays: refinements and optimization. Nucleic Acids Res. 21:
3269-3275.
Liang P. & Pardee A. 1995. Alternatives to 35S as a label for the differential display of eukaryotic
messenger RNA. Response to technical comments of Trentmann. Science. 267: 1186-
1187.
Misao R., Itoh N., Mori H., Fujimoto J. & Tamaya T. 1994. Sex hormone-binding globulin mRNA
levels in human uterine endometrium. Eur J Endocrinol. 131: 623-629.
Orihuela P., Ortiz M. & Croxatto H. 1999. Sperm migration into and through the oviduct
following artificial insemination at different stages of the estrous cycle in the rat. Biol
Reprod. 60: 908-913.
Ortiz M., Noé G., Bastías G., Darrigrande O. & Croxatto H. 1994. Increased sensitivity and
accumulation of estradiol in the rat oviduct during early pregnancy. Biol Res. 27: 57-
61.
Ortiz M., Gajardo G., Mosso L., Rojas P., Carvajal J., Ortiz P. & Croxatto H. 1991. Differential
transport of fertilized and unfertilized eggs. Arch Biol Med Exp. 24: 393-401.
Parry L., Bathgate R., Shaw G., Renfree M. & Ivell R. 1997. Evidence for a local fetal influence on
myometrial oxytocin receptors during pregnancy in the tammar wallaby (Macropus
eugenii). Biol Reprod. 56: 200-207.
Pollack J., Perou C., Alizadeh A., Eisen M., Pergamenschikov A., Williams C., Jeffrey S., Botstein
D. & Brown P. 1999. Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using
cDNA microarrays. Nat Genet. 23: 41-46.
Pritchard J. 1947. The distribution of alkaline phosphatase in the pregnant uterus of the rat. J
Anat, London. 81: 352.
Psychoyos A. 1986. Uterine receptivity for nidation. Ann N Y Acad Sci USA. 476: 36-42.
Rath N., Olmedo C., Casimiri V., Parvez S., Roche D., Parvaez. & Psychoyos A. 1979. Monoamine
metabolism during early pregnancy in the rat. In Research on Steroids. 8: 11-15.
Academic Press. New York.
Reese J., Brown N., Das S. & Dey S. 1998. Expression of neu differentiation factor during the
51
periimplantation period in the mouse uterus. Biol Reprod. 58: 719-727.
Reid B. 1965a. The fate of isotope labeled uterine spermatozoa in the mouse post coitum.
Austral J Zool. 13: 525-531.
Reid B. 1965b. Interaction between homologous sperm and somatic cells of the uterus and
peritoneum in the mouse. Exp Cell Res. 40: 679-683.
Sadek S., Unterman T. & Bell S. 1994. Epithelial localization of insulin-like growth factor
binding protein 1 in the uterus of the rat during pregnancy, deciduoma-bearing
pseudopregnancy and hormone treatment. J Reprod Fertil. 101: 67-75.
Sanger F., Nicklen S. & Coulson R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.
Proc Natl Acad Sci USA. 74: 5463-5467.
Schraml P., Kononen J., Bubendorf L., Moch H., Bissig H., Nocito A., Mihatsch M., Kallioniemi
O-P. & Sauter G. 1999. Tissue microarrays for gene amplification surveys in many
different tumor types. Clin Cancer Res. 5: 1966-1975.
Senior P., Critchley D., Beck F. & Walker R. 1988. The localization of laminin mRNA and protein
in the postimplantation embryo and of mouse: an in situ hybridation and
immunocytochemical study. Development. 104: 431-446.
Smith M., Freeman M. & Neill J. 1975. The control of progesterone secretion during the estrous
cycle and early pseudopregnancy in the rat: prolactin, gonadotropin and steroid
levels associated with rescue of the corpus luteum of pseudopregnancy.
Endocrinology, 96: 219-226.
Smith M., McLean B. & Neill J. 1976. Prolactin: the initial luteotropic stimulus of
pseudopregnancy in the rat. Endocrinology, 98: 1370-1377.
Sultan K. & Bedford J. 1996. Two modifiers of sperm transport within the fallopian tube of the
rat. J Reprod Fertil. 108: 179-184.
Thiede M., Daifitis A., Weir E., Brines M., Burtis W., Ikeda K., Dreyer B., Garfield R. & Broadus
A. 1990. Intrauterine occupancy controls expression of parathyroid hormone-related
peptide gene in preterm rat myometrium. Proc Natl Acad Sci USA. 87: 6969-6973.
Tremellen K., Seamark R. & Robertson S. 1998. Seminal transforming growth factor 1
52
stimulates granulocyte-macrophage colony-stimulating factor production and
inflammatory cell recruitment in the murine uterus. Biol Reprod. 58: 1217-1225.
Trentmann S., van der Knaap E. & Kende H. 1995. Alternatives to 35S as a label for the
differential display of eukaryotic messenger RNA. Technical comments. Science. 267:
1186.
Ureña P., Kong X-F., Abou-Samra A-B., Jüppner H., Kronenberg H., Potts J. & Segre G. 1993.
Parathyroid Hormone (PTH)/PTH-related peptide receptor messenger ribonucleic
acids are widely distributed in rat tissues. Endocrinology. 133: 617-623.
Valdés G., Corthorn J., Scicli A., Gaete V., Soto J., Ortiz M., Foradori A. & Saed G. 1993. Uterine
kallikrein in the early pregnant rat. Biol Reprod. 49: 802-808.
Velásquez L., Ojeda S. & Croxatto H. 1997. Expression of platelet activating factor receptor in
the hamster oviduct: localization to the endosalpinx. J Reprod Fertil. 109: 349-354.
Villalón M., Ortiz M., Aguayo C., Muñoz J. & Croxatto H. 1982. Differential transport of fertilized
and unfertilized ova in the rat. Biol Reprod. 26: 337-341.
Villanueva S. & Croxatto H. Regulación de la expresión de oviductina en el oviducto de hámster.
X Reunión Anual Soc Chil Rep Des. Temuco. 12-14 de agosto de 1999.
Volosin M. & Cellis M. 1979a. Serum MSH levels and pituitary MSH content: their fluctuation
during pregnancy in the rat. Can J Physiol Pharmacol. 57: 424-427.
Volosin M. & Cellis M. 1979b. Serum melanocyte-stimulating hormone levels and pituitary
melanocyte-stimulating hormone content during pseudopregnancy in the rat.
Endocrinology. 105: 541-543.
Volosin M. & Cellis M. 1984. Evidence for the role of -MSH in the induction of
pseudopregnancy in the rat. Neuroendocrinology. 39: 13-18.
Wardlaw S., Bucco R., Zheng W. & Ong D. 1997. Variable expression of cellular retinol- and
cellular retinoic acid-binding proteins in the rat uterus and ovary during the estrous
cycle. Biol Reprod. 56: 125-132.
Watson J., Carroll J. & Chaykin S. 1983. Reproduction in mice: the fate of spermatozoa not
involved in fertilization. Gamete Res. 7: 75-84.
53
Weckstein L., Jacobson A., Galen D., Hammel J. & Hampton K. 1993 (abstract). Sexual
intercourse prior to ovulation improves pregnancy rates in cycles of controlled
ovarian hyperstimulation and intrauterine insemination. 41st Meeting P. C. F. S.
April. P: A6.
Wilson E. 1969. Alkaline phosphatase in pre-decidual cells of human endometrium. J Reprod
Fertil. 19: 567-568.
Zweiger G. Knowledge discovery in gene-expression- microarray data: mining the information
output of the genome. Trends in Biotechnology. 17: 429-436.