Professor Daniela Reis Joaquim de Freitas

freitas.drj@gmail.com

MICROBIOLOGY

UNOESC - UNIVERSITY OF THE WEST OF SANTA CATARINA

DEPARTMENT OF BIOLOGICAL SCIENCES

Part I

Observing MicroorganismsThrough a Microscope

Unidades de medidas básicas :

Quando se trata de microscopia...

•Seres que possuem acima de 100 mm podem ser vistos ou com auxílio de lupa ou a olho nu.

Um pouco de história...

• Leeuwenhoek no século XVII criou

um microscópio similar a uma lupa, com

somente uma lente

• Porém, suas lentes eram polidas com tamanha precisão que podiam aumentar 300X um microorganismo.

• O microscópio de Robert Hooke tinham lentes múltiplas – mais próximo dos microscópios atuais

• Hoje define-se microscopia óptica o uso de qualquer tipo de microscópio que se use luz para observar espécimes.

Microscópio estereoscópico

• Os microscópios estereoscópicos são habitualmente designados por lupas binoculares. Contrariamente aos outros, estes não se encontram limitados a observar por transparência, não sendo todavia excluído que o possam fazer. Recebem a luz refletida pelo objeto e atingem geralmente ampliações da ordem de 30 x. 

Microscópio estereoscópico (lupa)

• Possui uma série de lentes e uma fonte de luz visível.

• Pode aumentar até 100X os microscópios comuns; alguns microscópios podem aumentar 200X com lentes em imersão em óleo mineral.

Cálculo de ampliação total da amostra:

• O microscópio comum é constituído basicamente por dois conjuntos de lentes: o conjunto objetiva e o conjunto ocular . A objetiva dá do objeto AB uma imagem real A'B', ampliada e invertida . A ampliação da objetiva, Aob , é dada pela fórmula :

Aob = A’B’/AB

• A ampliação, é uma das características ópticas essenciais da objetiva.

• A ocular fornece de A’B’ uma imagem virtual A’’B’’ muito afastada, mas que, através do cristalino, se projeta na retina do globo ocular.

• A ampliação da ocular é função da distância focal (foc ) em milímetros:

Aoc = 250/foc

Importante:

Destacam-se, nos microscópios, três características principais: a ampliação, a abertura numérica e o poder de resolução!!!!

• ampliação A do microscópio é determinada a partir das ampliações da objetiva e da ocular:

A = Aob x Aoc

• Habitualmente, os microscópios vêm equipados com diversas objetivas montadas sobre um tambor rotativo (ou revólver), o que permite mudar comodamente de ampliação no decurso do trabalho.

•  A abertura numérica AN da objetiva é dada pela fórmula:

AN = n. sen a

sendo n o índice de refração do meio que se interpõe entre o objeto AB e a lente e a , o ângulo que forma o raio mais externo captado pela lente frontal da objetiva.

• Habitualmente, o meio em contato com a lente é o ar (n = 1). Porém, se se substituir o ar por um líquido cujo índice de refração seja superior, pode obter-se um valor superior para a abertura numérica - óleo de imersão, cujo índice de refração é de 1,51; as melhores objetivas de imersão possuem uma abertura numérica que atinge 1,4 .

•   O poder de resolução é a capacidade que o microscópio possui de distinguir dois pontos adjacentes.

• Na prática, o poder de resolução é expresso pelo limite de resolução e, que é a menor distância que pode existir entre dois pontos para que apareçam individualizados. Em conseqüência, quanto menor for o limite de resolução da objetiva, maior será o respectivo poder de resolução.

Poder de resoluçãolimite de resolução

Microscópio óptico de fluorescência

• O microscópio de fluorescência permite estudar os constituintes celulares que manifestem autofluorescência, como por exemplo o caroteno, ou fluorescência secundária a eles transmitida por corantes especiais (fluorocromos).

• Denomina-se fluorescência a propriedade de certas substâncias que, ao serem excitadas por uma luz de comprimento de onda curto, emitirem luz de um comprimento de onda maior.

• Emprega-se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm, de formaa obterem-se radiações emitidas na gama de 400 a 700 nm, isto é, dentro do espectro da luz visível.

• É com recurso a esta técnica que se evidenciam, por exemplo, os antígenos quando associados a anticorpos acoplados a moléculas fluorescentes.

• Ainda que em princípio qualquer microscópio possa ser adaptado para trabalhar em fluorescência, os melhores resultados obtêm-se com microscópios especialmente concebidos para este fim, nos quais as ópticas de vidro são substituídas por lentes de quartzo, a fonte luminosa consiste numa lâmpada de vapor de mercúrio e, antes da ocular, se insere um filtro protetor, para remover as radiações ultravioletas, indesejáveis pelos danos que poderiam causar aos olhos do observador.

Microscópio de fluorescência comum

                                                                                                                       

Microscopia ultravioleta: A luz ultravioleta possui um comprimento de onda de 180 a 400 nm, muito menor que a luz visível, que é de 400 a 700 nm

• É uma variante do microscópio comum, dotado de um sistema óptico especial que transforma diferençasde fase dos raios luminosos em diferenças deintensidade.

• O microscópio de contraste de fase possibilita o estudo de materiais vivos e não corados, de acordo com a espessura e a refração.

• Baseia-se no princípio de que a densidade de um corpo determina a velocidade com que a luz o atravessa e, consequentemente, o seu índice de refração.

• Usado para observar células vivas – cultivo

de células

Microscopia de contraste de fase

Microscopia de contraste de fase

•Na microscopia de campo escuro ocorre oinverso da microscopia comum, ou seja, o objeto apresenta-se brilhantemente iluminado,em contraste com o fundo escuro.

•Para conseguir seu objetivo, a técnica de microscopia de campo escuro faz uso de um tipo especial de condensador, capaz de fazer com que somente os raios

luminosos que atingirem um objeto na lâmina entrem na objetiva.

•A microscopia de campo escuro é útil quando precisamos analisar células, componentes ou microrganismos não corados - bactérias que não podem ser coradas adequadamente por meios convencionais, como a Borrelia burgdorferi

Microscopia de fundo escuro

microscopia de campo escuro

Microscopia confocal

• Desenvolvida primariamente por Marvin Minsky,

em 1955.

• funcionamento semelhante ao do Microscópio de Fluorescência - mas é utilizado para aumentar o contraste da imagem microscópica e construir imagens tridimensionais através da utilização de um orifício de abertura, pinhole, que permite uma grande definição de imagem em amostras mais espessas que o plano focal.

• Esta técnica adquiriu grande popularidade e possui diversas aplicabilidades na ciência, na obtenção de imagens de amostras vivas e de informação computorizada tridimensional na pesquisa biológica, na análise química e de materiais, principalmente na área de neuroanatomia e neurofisiologia.

• Existem três tipos de Microscópios Confocais comercialmente disponíveis:

– Confocal Laser Scanning Microscope (LSCM), o modelo mais utilizado devido à elevada qualidade de imagem que permite a obtenção de imagens de alta resolução através de cortes ópticos, posteriormente agrupados para se fazer a reconstrução tridimensional da topografia de objectos complexos;

– Spinning-Disk Confocal Microscope, com um disco de Nipkow, cujo rácio de construção é mais rápido e eficaz que o LSCM, sendo, por isso, útil em observações dinâmicas;

– Programmable Array Microscope (PAM).

• O sistema óptico usado neste tipo de Microscópios é o mesmo que é aplicado nos Microscópios de Fluorescência. No entanto, nestes últimos, o campo é todo iluminado, enquanto que no Microscópio Confocal focaliza somente um ponto em determinada profundidade no espécimen

Efeito_de_Photobleaching_-_Photobleaching_Diferencial_em_Tecidos_com_Marcação_Múltipla.JPG (413 × 321 pixel, tamanho do ficheiro: 27 KB, tipo MIME: image/jpeg)

Microscopia confocal a laser

Muito mais definição de imagem; possível ver estruturas não vistas em outras microscopias

Microscopia de transmissão

• Utiliza um feixe de elétrons ao invés de luz

• Os elétrons passam através do espécime

• Devido ao curto comprimento de onda dos elétrons, estruturas menores que 0,2 µm podem obter resolução

• A imagem produzida é bidimensional

Microscópio eletrônico de transmissão

Legenda:1 - Fusobacterium nucleatum - microscopia eletrônica de transmissão;2 - Bacteroides fragilis - microscopia eletrônica de transmissão;3 - Fusobacterium nucleatum - coloração de Gram;4 - Bactérias produtoras de pigmento negro - Porphyromonas e Prevotella.

Microscopia de varredura

• Utiliza um feixe de elétrons ao invés de luz

• Os elétrons são refletidos a partir do espécime

• Devido ao curto comprimento de onda dos elétrons, estruturas menores que 0,2 µm podem obter resolução

• A imagem produzida é tridimensional

Mycobacterium bovis

Coloração diferencial

•Reage de modo distinto dependendo o tipo de bactéria; exemplo: coloração de Gram

Microscopia de força atômica

•Utiliza uma sonda de metal e diamante que é pressionada delicadamente na superfície da amostra

•Produz imagem tridimensional

•Não é necessário preparo especial

Os corantes em microscopia

•Importantes para qualquer tipo de microscopia

•Específicos para o tipo de organismo e microscopia

Coloração simples

•Solução aquosa ou alcoólica de corante único

•Cora esfregaço

•Substância química pode ser adicionada para intensificar a coloração - mordente

Balantidium coli

Questões para estudo:

• Em 0,00015 ml de uma solução de HCl 0,001 N foram encontradas partículas que mediam entre 0,012 mm e 0,000000034 m. E surpresa: eram bactérias! Sim, bactérias acidófilas!!!

– Uniformize as unidades de medida para micrômetros (µm) e angstrons (Å).

• Se uma amostra foi vista com uma ocular de 10X no microscópio óptico comum e com objetivas de 10X e 40X, quais os aumentos reais que estas amostras tiveram?

• Qual a diferença de microscopia confocal para microscopia de fluorescência?

• Qual a diferença de microscopia de varredura para microscopia de transmissão?

Questões para estudo:

Prokaryotic and Eukaryotic Cells: Structure and Function

Part II

Thank You!