I. PENDAHULUAN

A. Judul

Enumerasi mikrobia

B. Latar belakang

Mikrobia dapat dinggal dimana-mana atau yang kita kenal dengan

istilah kosmopolitan (tanah, air dan sebagai simbiosis dari organisme lain),

serta mikrobia bersifat mikroskopis, yang hanya bisa dilihat dengan

menggunakan mikroskop, salah satunya adalah bakteri. Mikrobia dapat

tumbuh dan berkembang dengan sangat pesat di alam. Bakteri merupakan

makhluk hidup yang sering ditumbuhkan dalam medium untuk tujuan

suatu penelitian. Pertumbuhan dan perkembangan mikrobia berbentuk

koloni-koloni yang sulit dihitung jumlah bakterinya. Setelah mempelajari

bagaimana menumbuhkan suatu koloni bakteri, tentunya kita harus

mengetahui kuantitas dan kualitas dari bakteri tersebut. Kualitas suatu

bakteri dapat diketahui dengan melihat sifat-sifat bakteri baik yang

menguntungkan maupun merugikan. Sedangkan, untuk menentukan

kuantitas bakteri dapat dengan berbagai cara perhitungan jumlah bakteri,

antara lain dengan cara perhitungan mikroskopis langsung (direct

microscopis count) dan metode hitungan tak langsung (indirect count)

yang menggunakan metode hitung pada cawan (spread plate maupun pour

plate).

Dalam percobaan kali ini akan dipraktikan cara penghitungan

langsung bakteri menggunakan mikroskop dengan metode counting

chamber (haemocytometer) dan cara penghitungan tak langsung bakteri

menggunakan teknik plate count dengan metode hitung pada spread plate

pada medium NA. Penghitungan jumlah bakteri biasanya bertujuan untuk

mengetahui banyaknya jumlah bakteri yang mungkin ada pada suatu

bahan (khususnya bahan makanan) yang disimpan dengan waktu tertentu

sehingga kualitas bahan tersebut dapat diketahui atau diketahui masa

dimana bahan makanan tidak boleh di konsumsi lagi.

C. Tujuan

1. Melakukan perhitungan jumlah bakteri pada Tempe, jamu, saos, dan susu

dengan perhitungan langsung

2. Melakukan perhitungan jumlah bakteri pada Tempe, jamu, saos, dan susu

dengan perhitungan perhitungan tidak langsung

3. Mengetahui kelebihan dan kekurangan perhitungan secara langsung

4. Mengetahui kelebihan dan kekurangan perhitungan secara tidak langsung

II. TINJAUAN PUSTAKA

Enumerasi bakteri adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam suatu

media tanpa mengidentifikasi jenis mikroba (bakteri, jamur, yeast) yang bertujuan

untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif (Jutono,

1980). Penetapan jumlah bakteri dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri

yang mampu membentuk koloni di dalam media biakan atau membentuk suspense

dalam larutan biak (Dwidjoseputro, 1990). Analisis kuantitatif mikrobiologi pada

bahan pangan ini penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan dan

menghitung proses pengawetan yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut

(Fardiaz, 1993).

Menurut Jannasch dan Jones (1959), indek aktivitas dan nilai biomassa

mikroorganisme dapat ditunjukkan dengan mengetahui jumlah mikroorganisme

dalam perairan tersebut. Untuk mengetahui jumlah mikroorganisme dalam suatu

perairan ada dua cara dasar yaitu:

a. Perhitungan mikroorganisme secara langsung (direct count)

b. Perhitungan bakteri secara tidak langsung (indirect count).

Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan

langsung maupun tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui

beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada saat tertentu tanpa

memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah orgnisme yang

diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan

tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan secara langsung, dapat

dilakukan dengan beberapa cara antara lain, adalah dengan membuat preparat dari

suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan

ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung

hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih

hidup saja (viable count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu:

perhitungan pada cawan petri (total plate count/ TPC), perhitungan melalui

pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan

calorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Carrol, 1964).

Menurut Lay (1994) cara untuk menentukan jumlah bakteri dalam

suatu medium dapat dilakukan dengan :

1. Jumlah bakteri secara keseluruhan (tottal cell counts), bila menggunakan cara

ini maka semua bakteri dalam medium tersebut akan terhitung baik yang

hidup maupun mati

2. Jumlah bakteri hidup (viable counts), bila menggunakan cara ini maka sel

hidup daja yang di hitung sehingga lebih akurat

Perhitungan secara langsung dilakukan secara mikroskopis, yaitu

dengan menghitung sel dibawah mikroskop. Setiap sel dalam suspensi contoh

dengan volume yang sangat sedikit dan telah diukur secara teliti, diukur

dengan menggunakan slide khusus yaitu kotak penghitung (counting

chamber). Volume cairan yang terdapat pada tiap kotak kecil pada kotak

hitung dapat diketahui secara pasti sehingga jumlah sel dalam tiap kotak

dapat terlihat dan dihitung, jadi jumlah sel/ml larutan sel dapat diketahui

(Buckle dkk, 1987).

Menurut Juntono dkk (1980), perhitungan mikrobia secara langsung

dilakukan dengan cara menghitung jumlah sel yang hidup dan yang mati.

Terdapat beberapa cara yang dapat dilakukan, antara lain :

1. Counting chamber

Pada perhitungan ini menggunakan haemocytometer dimana 1 tetes

suspensi biakan mikrobia pada alat ini ditutupi dengan gelas penutup dan

diamati dibawah mikroskop. Jumlah sel mikrobia tiap cc dapat ditentukan

dengan cara menentukan jumlah dari sel rata-rata pada tiap petak yang

volumenya telah diketahu

2. Pengecatan dan pengamatan mikroskopik

Pada cara ini, preparat mikroskopik dibuat pada gelas benda kemudian

suspensi bahan atau biakan mikrobia yang volumenya telah diketahui

diratakan diatas gelas benda pada luas tertentu. Preparat di cat dan dihitung

dengan cara mengukur garis tengahnya sehingga jumlah mikrobia yang

terdapat pada gelas benda dapat dihitung seluruhnya.

3. Filter membran

Pada cara ini, suspensi bahan atau biakan mikrobia disaring, lalu

disaring lagi dnegan menggunakan filter membran yang telah disterilkan.

Jumlah sel dari volume yang disaring dapat dihitung dari jumlah sel rata-rata

tiap kesatuan luas pada filter membran.

Perhitungan langsung merupakan perhitungan yang dilakukan secara

mikroskopis dengan cara menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang

sangat kecil. Perhitungan ini menggunakan alat yang di sebut

haemocytometer (Ferdiaz, 1992). Hemocytometer adalah ruang kaca atau

gelas yang meliliki sisi-sisi ditinggikan dengan penutup kecil tembus cahaya

yang tepat 0,1mm diatas lantai ruang (Hansen, 2013).Cairan yang digunakan

dalam perhitungan tersebut memiliki volume tertentu, hingga gelas penutup

dapat terpenuhi. Pada alat ini terdapat 9 kotak besar dengan luas 1 mm3,

dalam 1 kotak besar ditengah terbagi menjadi 26 kotak sedang dengan

panjang 0,2 mm. Sehingga dalam 1 kotak besar terdapat 400 kotak kecil. Tiap

ruang hitung memiliki lebar 0,1 mm, tinggi sampel yag terletak antara gelas

objek dan gelas penutup adalah 0,2 mm (Ferdiaz, 1992).

Menurut Carol dan Freund (1964), pada haemocytometer terdapat

celah yang dipergunakan sebagai wadah untuk larutan dengan tinggi 0,1 mm,

oleh karena itu volume larutan yang dapat masuk ke celah kotak hitung besar

(counting grid) adalah 0,1 mm3. Perhitungan ini menggunakan teknik

sampling, dimana 5 kotak diambil dari 25 kotak yang ada kemudian hasil di

hitung rata-rata dan dianggap sebagai jumlah bakteri perkotak. Jumlah dari

bakteri per kotak dikalikan dengan 25, hal ini dilakukan untuk mendapatkan

jumlah bakteri per volume haemocytometer (0,1 mm-3). Volume pada

haemocytometer memiliki satuan yang dikonversi ke cm3 dengan mengalikan

1000 lalu dikalikan dengan kebalikan dari faktor pengenceran hal ini

disebabkan pengenceran berbanding terbalik dengan jumlah bakteri. Rumus

perhitungan langsung dapat dituliskan :

∑ bakteri total = jumlah bakteri rata-rata × 25 × 10 × 103 ×1faktor pengenceran

Gambar 1. Haemocytometer (Sumber: dokumentasi pribadi)

Menurut Hadioetomo (1990), kelebihan dari metode ini :

1. Pelaksanaan perhitungan cepat

2. Peralatan yang diperlukan dalam perhitungan tidak banyak

Kelemahan metode perhitungan tidak langsung menurt Hadioetomo

(1990), yaitu :

1. Sulit menghitung sel yang berukuran sangat kecil, misalnya bakteri. Hal ini

disebabkan oleh ketebalan hemocytometer yang tidak mungkin untuk

digunakannya lensa obyektif celup minyak

2. Kecenderungan sel untuk bergerombol sehingga sukar untuk membedakan

sel-sel individu

Metode yang digunakan dalam perhitungan tidak langsung yaitu

metode perhitungan cawan. Prinsip perhitungan cawan ini adalah jika

mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel

mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat

dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode

hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitive untuk menghitung

jumlah mikroba karena adanya alas an yaitu hanya sel yang hidup dihitung,

beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus, dapat digunakan untuk

isolasi atau identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk mungkin

berasal dari satu sel. Metode hitungan cawan dibagi menjadi dua yaitu

metode tuang (Pour plate) dan metode permukaan (Surface plate) (Fardiaz,

1993).

Jumlah masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang

dipilih untuk penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai

300 koloni, karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui

sebelumnya, maka untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang

mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat tersebut maka harus

dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang

terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni

yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan

(Penn, 1991).

Pada praktikum digunakan teknik penghitungan tidak langsung yaitu

dengan metode plate count, pada perhitungan bakteri secara tidak langsung,

suspensi susu dan tanah diambil 100 μl disetiap pengenceran 10-2, 10-4, dan

10-6, kemudian suspensi bahan yang mengandung bakteri diinokulasi pada

medium NA dan diratakan dengan trigalski secara spread plate agar diperoleh

koloni bakteri terpisah dan tersebar di seluruh permukaan medium tersebut

sehingga dapat memudahkan perhitungan jumlah koloni bakteri. Plate count /

viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup

dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam

media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai.

Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan

merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam

suspensi tersebut. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel

mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung

membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut digunakan

istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. Perhitungan ini menggunakan

teknik spread plate, jadi nilai CFU yang terhitung adalah per 0,1 ml atau 0,1

gram sampel. Jadi konversi dari CFU/0,1 ml sampel menjadi CFU/ml sampel

yaitu dengan nilai jumlah bakteri dikali 10 lagi untuk hasil per ml atau per

gram.

TPC merupakan pemeriksaan kuantitatif terhadap bakteri dalam

sampel. TPC adalah Total Plate Count, yaitu suatu hitungan jumlah bakteri

yang terkandung didalam 1 ml sampel. Untuk menghitung Total Plate Count

(TPC) dilakukan pemeriksaan terhadap sampel air dengan spread plate

method. Setiap satu sampel dilakukan pengulangan tiga kali. Pertumbuhan

koloni yang terjadi setelah 24 jam inkubasi, dihitung dengan bantuan qubec

colony counter karena setiap sampel dilakukan pemeriksaan 3 kali

(pengulangan 3 kali), maka hasil perhitungan TPC pada 3 petridisk

dijumlahkan dan dibuat angka rata-ratanya (Rahayu, 2000).

Metode viable count atau disebut dengan metode TPC (Total Plate

Count) merupakan kultur yang diencerkan sampai batas yang diinginkan.

Kultur encer ditumbuhkan kembali pada media, sehingga diharapkan setiap

sel tumbuh menjadi satu koloni, biasanya 4-12 jam. Namun, cara ini memiliki

keterbatasan yaitu jumlah sel terhitung biasanya lebih kecil dari sebenarnya

dan tidak dapat diaplikasikan pada bakteri yang tumbuh lambat. Faktor yang

mempengaruhi perhitungan bakteri dengan metode ini adalah jumlah sel

bakteri hatus mendekati kelipatan 10 pada setiap pengencerannya. Jika tidak,

maka perhitungan dianggap gagal (Purwoko, 2007).

Menurut Waluyo (2007), pengamatan bakteri dapat dilakukan secara

individual, satu per satu, maupun secara kelompok dalam bentuk koloni. Bila

bakteri yang ditumbuhkan di dalam medium yang tidak cair, maka akan

terjadi suatu kelompok yang dinamakan koloni. Bentuk koloni berbeda-beda

untuk setiap spesies, dan bentuk tersebut merupakan ciri khas bagi suatu

spesies tertentu. Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan yang

dipilih untuk dihitung mengandung 30-300 koloni. Untuk memenuhi

persyaratan tersebut dilakukan sederatan pengenceran dan pencawan. Jumlah

mikroba dalam sampel ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni dengan

faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Satuan yang  digunakan

untuk menyatakan jumlah koloni atau bakteri adalah cfu/mL (cfu = colony

forming units).

Tempe adalah makanan yang dibuat dari fermentasi terhadap

biji kedelai atau beberapa bahan lain yang menggunakan beberapa

jenis kapang  Rhizopus, seperti  Rhizopus oligosporus, Rh. oryzae, Rh.

stolonifer (kapang roti), atau  Rh. arrhizus. Sediaan fermentasi ini secara

umum dikenal sebagai "ragi tempe". Kapang yang tumbuh pada kedelai

menghidrolisis senyawa-senyawa kompleks menjadi senyawa sederhana yang

mudah dicerna oleh manusia. Tempe kaya akan serat

pangan, kalsium, vitamin B dan zat besi. Berbagai macam kandungan dalam

tempe mempunyai nilai obat, seperti antibiotika untuk

menyembuhkan infeksi dan antioksidan pencegah penyakit degeneratif.

Jamu adalah sebutan untuk obat tradisional dari Indonesia. Jamu

dibuat dari bahan-bahan alami, berupa bagian dari tumbuhan

seperti rimpang (akar-akaran), daun-daunan, kulit batang, dan buah. Ada juga

menggunakan bahan dari tubuh hewan, seperti empedu kambing, empedu

ular, atau tangkur buaya. Seringkali kuning telur ayam kampung juga

dipergunakan untuk tambahan campuran pada jamu gendong.

Saos Tomat mengandung energi sebesar 98 kilokalori, protein 2 gram,

karbohidrat 24,5 gram, lemak 0,4 gram, kalsium 12 miligram, fosfor 18

miligram, dan zat besi 1 miligram.  Selain itu di dalam Saos Tomat juga

terkandung vitamin A sebanyak 1880 IU, vitamin B1 0,09 miligram dan

vitamin C 11 miligram.  Hasil tersebut didapat dari melakukan penelitian

terhadap 100 gram Saos Tomat, dengan jumlah yang dapat dimakan sebanyak

100 %. Susu disebut sebagai makanan yang hampir sempurna karena

kandungan zat gizinya yang lengkap. Selain air, susu mengandung protein,

karbohidrat, lemak, mineral, enzim-enzim, gas serta vitamin A, C dan D

dalam jumlah memadai. Manfaat susu merupakan hasil dari interaksi

molekul-molukel yang terkandung di dalamnya.

III. METODE

A. Alat

Alat yang dihunakan pada percobaan ini adalah bunsen, petri dish, gelas

beker, gelas penutup, haemocytometer, handcounter, inkubator, kapas, karet

gelang, kertas payung, korek api, label, laminair flow (LAF), mikropipet,

mikroskop, mikrotip, pipet ukur, pro pipet, rak tabung reaksi, tabung reaksi,

timbangan elektrik, trigalski, dan vortex.

B. Bahan

Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah aquadest steril, alkohol

70%, medium NA dalam petri dish, tip, tissue, sampel tempe, sampel jamu,

sampel susu dan sampel saos.

C. Cara Kerja

1. Perhitungan langsung

a. Pengenceran sampel

Susu, jamu dan saos diambil sebanyak 0,1 ml dengan

menggunakan timbangan elektrik dan dimasukkan ke tabung reaksi yang

berisi 9,9 ml aquades steril, untuk pengenceran 10-2. Tabung reaksi

kemudian divortex. Susu, jamu dan saos pada pengenceran 10-2 diambil

sebanyak 0,1 ml dengan menggunakan pipet ukur dan propipet kemudian

dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades steril, untuk

pengenceran 10-3. Tabung reaksi kemudian di vortex. Susu, jamu dan

saos pada pengenceran 10-3 diambil sebanyak 0,1 ml dengan

menggunakan pipet ukur dan propipet kemudian dimasukkan ke tabung

reaksi yang berisi 9 ml aquades steril, untuk pengenceran 10-4. Tabung

reaksi kemudian di vortex. Susu, jamu dan saos pada pengenceran 10-4

diambil sebanyak 0,1 ml dengan menggunakan pipet ukur dan propipet

kemudian dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades steril,

untuk pengenceran 10-5. Tempe ditumbang dengan menggunakan

timbangan elektrik sebanyak 0,1 ml kemudian pengenceran sampel

dilakukan seperti pada Susu, jamu dan saos.

b. Perhitungan langsung

Haemocytometer dan gelas penutup disterilkan dengan

menggunakan alkohol 70% kemudian di panaskan diatas api bunsen.

Haemocytometer kemudian ditutup dengan mengunakan gelas penutup

dan suspensi sampel Saos, susu, tempe dan jamu dengan pengenceran 10-

3, 10-4, dan 10-5 diteteskan pada haemocytometer sebanyak 0,1 ml pada

kedua sisi yang berbeda. Haemocytometer diletakkan pada meja benda

kemudian diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 45 x 10.

Jumlah bakteri yang terdapat pada 5 kotak dalam bilik hitung diamati

kemudian dihitung dengan menggunakan hand counter. Cara

penghitungannya dari kiri ke kanan kemudian kebawah lalu kekiri, begitu

seterusnya. Perghitungan secara langsung dengan cara ini dilakukan juga

pada hati ayam. Rumus yang digunakan yaitu :

∑bakteri = ∑ bakteri rata-rata × 25×10× 103 ×1faktor pengenceran

2. Perhitungan tidak langsung

a. Pengenceran sampel

Susu, jamu dan saos diambil sebanyak 0,1 ml dengan

menggunakan pipet ukur dan propipet kemudian dimasukkan ke dalam

tabung reaksi yang berisi 9,9 ml aquades steril, untuk pengenceran 10-2.

Tabung reaksi kemudian divortex. Susu, jamu dan saos pengenceran 10-2

diambil sebanyak 0,1 ml dengan menggunakan pipet ukur dan propipet

propipet kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9,9

ml aquades steril, untuk pengenceran 10-4. Tabung reaksi kemudian

divortex. Susu, jamu dan saos pengenceran 10-4 diambil sebanyak 0,1 ml

dengan menggunakan pipet ukur dan propipet propipet kemudian

dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9,9 ml aquades steril,

untuk pengenceran 10-6. Tempe ditumbang dengan menggunakan

timbangan elektrik sebanyak 0,1 ml kemudian pengenceran sampel

dilakukan seperti pada jus alpukat.

b. Perhitungan tidak langsung

Inokulasi bakteri dari Susu, jamu, tempe dan saos dilakukan pada

ruang LAF. Suspensi sampel hus alpukat dengan pengenceran 10-2, 10-4,

dan 10-6 diambil sebanyak 100 µl dengan menggunakan mikropipet dan

tip kemudian di tuangkan ke atas medium pada petri dish. Teknik spread

plate method dilakukan pada medium NA, sampel tersebut diratakan

pada medium dengan trigalski. Petri dish dibungkus dengan

menggunakan kertas payung dan diinkubasi dengan suhu 37°C pada

inkubator selama 48 jam. Jumlah koloni dihitung kemudian bila

memenuhi syarat CFU maka dihitung dengan menggunakan rumus :

∑ Bakteri= rata−rata jumlah bakterivolumesuspensi bakteri

x 10 CFUml

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Enumirasi adalah suatu teknik perhitungan jumlah mikrobia dalam

medium tanpa mengidentifikasi jenis mikrobia(bakteri, yeast, jamur).

Teknik ini bertujuan untuk untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur

bakteri secara kuantitatif (Cappucino dan Sherman, 1983). Analisis

kulaitatif mikrobiologi pada bahan makanan berguna untuk mengetahui

mutu bahan pangan dan menghitung proses pengawetan yang akan

diterapkan pada bahan pangan terebut (Ferdiaz, 1992).

ALT atau Angka lempeng total adalah angka yang menunjukkan

jumlah bakteri mesofil dalam tiap-tiap 1 ml atau 1 gram sampel makanan

yang diperiksa. Prinsip dari ALT adalah menghitung pertumbuhan koloni

bakteri aerob mesofil setelah sampel makanan ditanam pada lempeng

media yang sesuai dengan cara tuang kemudian dieramkan selama 24-48

jam pada suhu 35-37°C (Joko Wibowo Ristanto, 1989). Uji angka

lempeng total merupakan metode yang umum digunakan untuk

menghitung adanya bakteri yang terhadap dalam sediaan yang diperiksa.

Metode penentuan angka lempeng total ini digunakan untuk menentukan

jumlah total mikroorganisma aerob dan anaerob (psikrofilik, mesofilik

dan termofilik).

a. Psikofilik adalah kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu

kurang dari 20°C,

b. Mesofilik adalah kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu

20 °C-40°C

c.  Termofilik adalah kelompok mikroorganisme yang hidup pada

suhu lebih besar dari 40°C.

Angka lempeng total aerob adalah jumlah mikroorganisma hidup

yang membutuhkan oksigen yang terdapat dalam suatu produk yang diuji.

Pertumbuhan mikroorganisme aerob dan anaerob (psikrofilik, mesofilik

dan termofilik) setelah contoh diinkubasikan dalam media agar pada suhu

35°C ± 1°C selama 24 jam 48 jam ± 1 jam mikroorganisme ditumbuhkan

pada suatu media agar, maka mikroorganisma tersebut akan tumbuh dan

berkembang biak dengan membentuk koloni yang dapat langsung

dihitung.

Fungsi perlakuan larutan vortex dengan tujuan agar sampel

tercampur secara merata dengan aqades (homogen). Pengenceran

dilakukan dengan fungsi untuk mengurangi jumlah koloni bakteri sehingga

semakin mudah ketika dilakukan perhitungan. Seharusanya pada

perhitungan, bila jumlah pangkat pengenceran makin kecil maka jumlah

bakteri makin sedikit. tip/pipet setiap seri pengenceran harus berbeda

memiliki fungsi agar tidak terjadi kontaminasi. Pengenceran dilakukan

untuk mengurangi jumlah koloni bakteri sehingga semakin mudah ketika

dilakukan perhitungan. Seharusanya pada perhitungan, bila jumlah

pangkat pengenceran makin kecil maka jumlah bakteri makin sedikit.

Perbedaan jumlah bakteri secara langsung dan secara tidak

langsung disebabkan karena pada perhitungan langsung menghitung

jumlah bakteri total baik yang hidup maupun yang mati, sedangkan

perhitungan tak langsung menghitung jumlah sel bakteri yang mampu

hidup dengan menunjukkan pertumbuhan koloni. Sehingga sangat jelas

apabila penghitungan langsung menunjukkan hasil yang lebih besar

dibandingkan penghitungan secara tak langsung. Selain itu dapat

disebabkan karena pada penghitungan tak langsung terdapat beberapa sel

mikrobia yang terhitung sekaligus, terdapat beberapa sel berdekatan yang

membentuk spreader sehingga tidak terhitung, dan proses inkubasi yang

kurang sempurna sehingga koloni mikrobia yang terbentuk kurang

maksimal.

Perbedaan dari perhitungan secara langsung dan tidak langsung

adalah dalam perhitungan secara langsung, tidak dapat dibedakan antara

bakteri yang mati dan yang hidup dan dilakukan perhitungan secara

mikroskopis dengan menggunakan mikroskop.Sedangkan pada

perhitungan secara tidak langsung, bakteri diinokulasi terlebih dahulu pada

medium nutrient agar, sehingga yang dihitung hanya koloni bakteri yang

hidup saja secara makroskopis.

Beberapa faktor yang mempengaruhi penghitungan bakteri baik

secara langsung maupun secara tidak langsung, antara lain:

1. Faktor pengenceran, semakin tinggi pengenceran suatu suspensi maka

jumlah bakteri yang dikandungnya akan semakin sedikit.

2. Temperatur dan pH, berkaitan dengan temperatur dan pH optimum dari

suatu jenis bakteri.

3. Komposisi medium, medium yang digunakan untuk inokulasi harus sesuai

dengan bakteri yang akan dihitung.

4. Keterampilan dan ketelitian dalam menggunakan alat.

A. Perhitungan Langsung

Berikut ini merupakan hasil dalam praktikum penghitungan jumlah

bakteri secara langsung (menggunakan counting chamber dengan

haemocytometer) dan secara tidak langsung menggunakan teknik plate

count dengan metode spread plate.

Tabel 1. Hasil Perhitungan Langsung Jumlah bakteri pada tempe, jamu,

saos dan susu.

Kelom

Pok Sampel

Rata-rata bakteri Sel bakteri sel/ml

10-3 10-4 10-5 10-3 10-4 10-5

1Tempe

27 21,3 39 0,68.1010 5,325.1010 9,75.1010

2 45 40 30,67 1,13.1010 10.1010 76,7.1010

3Jamu

152,8 140,2 115 38,2.1010 35,1.1010 287,5.1010

4 152,8 140,2 115 38,2.1010 35,1.1010 287,5.1010

5Saos

44 23,5 42,6 1,1.1010 5,87.1010 107.1010

6 57,67 23,5 42,6 1,44.1010 5,83.1010 107.1010

7Susu

137 129 37,3 3,425.1010 3225.1010 93,25.1010

8 83,8 35 20,2 2,095.1010 8,75.1010 50,5.1010

Pada metode ini, sampel diencerkan dengan pengenceran 10-2, 10-3,

10-4, 10-5. Sebelumnya sampel yang berbentuk padatan di tumbuk terlebih

dahulu, lalu ditimbang sebanyak 1 gram, tambahkan aquades hingga

larutan menjadi 9 ml. Sampel (Tempe, jamu, susu, dan saos) di ambil

menggunakan pipet ukur sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam aquades

steril 9 mL. Semua sampel di ambil hanya 1 mL dan aquades sebanyak 9

mL dikarenakan pengenceran dilakukan lompat dari 10 menjadi 10-2.

Larutan kemudian di vortex, Pengenceran selanjutnya dilakukan secara

berurutan sehingga larutan pengenceran sebelumnya yang diambil yaitu

1mL dan aquades steril pada tabung reaksi yaitu 9 mL, setelah itu selalu di

vortex.

Untuk mengamati jumlah sel bakteri, haemocytometer disterilkan

kemudian diletakkan gelas penutup diatasnya. Pengenceran 10-3, 10-4, 10-5

diamati secara berurutan dengan meneteskan larutan pada haemocytometer

dan diamati dibawah mikroskop. Hand counter digunakan untuk

menghitung bakteri yang dapat diamati. Pengenceran ini dilakukan untuk

memenuhi syarat penghitungan statistik, yaitu jumlah mikroba yang

dihitung tidak boleh lebih dari 100 dengan demikian, kesalahan

penghitungan dapat diminimalkan. Suspensi bakteri ini diteteskan

sebanyak 1 tetes pada alat yang disebut Hemocytometer yang telah

dibersihkan dengan alkohol, hal ini dimaksudkan agar hemositometer

bersih dari debu dan kuman yang dapat mengganggu perhitungan, prinsip

dari cara pemakaian alat ini adalah dengan menempatkan 1 tetes suspensi

mikrobia pada ruang hitung yang terdiri dari 9 kotak besar yang luasnya 1

mm2. Hemositometer dengan ukuran besar, 1 x 1 mm (1 mm2) ini dibagi

dalam 3 cara: 0,25 x 0,25 mm (0,0625 mm2), 0,25 x 0,20 mm (0,05 mm2)

dan 0,20 x 0,20 mm (0,04 mm2). Pusat, 0,20 x 0,20 mm ditandai, 1 x 1

mm2 yang kemudian dibagi lagi menjadi 0,05 x 0,05 mm (0,0025 mm2).

Struktur sel-ukuran yang akan dihitung adalah yang terletak antara tengah

tiga baris di atas dan kanan alun-alun dan dari tiga baris di bagian bawah

dan kiri alun-alun. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume

ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat

diketahui dan dapat digunakan sebagai data dalam rumus untuk

mengetahui jumlah sel mikrobia tiap ml.

Rumus yang digunakan pada perhitungan Langsung :

∑ bakteri total = jumlah bakteri rata-rata × 25 × 10 × 103 ×1faktor pengenceran

Logika perhitungan :

a. Jumlah bakteri rata-rata : merupakan jumlah bakteri rata-rata yang dihitung

dalam lima kotak perwakilan yang diasumsikan sebagai jumlah bakteri setiap

kotak.

b. Angka 25 : setelah diketahui asumsi jumlah bakteri tiap kotak, maka asumsi

jumlah bakteri tiap kotak dikalikan 25, karena ada 25 kotak yang kita hitung

melalui perwakilan dari 5 kotak.

c. Angka 10 : berasal dari volume yang kita hitung, dengan rumus volume = p x l

x t. Panjang kotak adalah 1 mm, lebar kotak adalah 1 mm, dan ketinggian

haemocytometer dari dasar (bukan dari kanal) hingga permukaan gelas penutup

adalah 0,01 mm. Jumlah sel yang sudah kita kali di bagu dengan volume 1/10,

sehingga didapat angka perkalian dengan 10.

d. Angka 103 : berasal dari konversi mm3 dari satuan volume sebelumnya

menjadi cm3 karena cm3 = ml.

e. 1/faktor pengenceran : berdasarkan faktor pengenceran dari suspensi yang kita

gunakan.

Setelah mengetahui kekurangan perhitungan langsung adalah

terlalu kecilnyua bakteri menyebabkan sulit untuk melihat yang kecil

bahkan bakteri individu, maka dari itu hasil perhitungan langsung

terkadang lebih banyak dibandingkan perhitungan tidak langsung. Karena

pada perhitungan langsung juga sulit untuk membedakan antara bakteri

atau kotoran.

Seharusanya pada perhitungan jumlah bakteri, bila jumlah pangkat

pengenceran makin kecil maka jumlah bakteri makin sedikit. Sedangkan

pada rata-rata jumlah bakteri semakin kecil pangkat pengenceran makan

semakin banyak jumlahnya. Kolom rata-rata bakteri tidak sebanding

dengan kolom total bakteri di karenakan ada faktor pengenceran pada

rumus total bakteri. Jumlah rata-rata bakteri berbanding terbalik dengan

faktor pengenceran pada rumus, semakin tinggi rata-rata bakteri maka

semakin rendah faktor pengenceran yang berpengaruh. Jika tidak sesuai

maka perhitungan langsung bisa saja di sebabkan dengan beberapa faktor

yang tidak di sengaja. Faktor-faktor yang mempengaruhi perhitungan

secara langsung jumlah bakteri pada praktikum yang sudah dilakukan

adalah skill praktikan dalam membuat suspense ataupun dalam memakai

mikroskop, kedalaman pipet untuk mengambil suspense, adanya debu

mikroskop, subjektivitas pengamatan dan penumpukan koloni.

Sampel yang jumlah mikrobanya tertinggi adalah sampel pada

Susu. Pada percobaan yang pertama dan kedua pada angka pengenceran

10-3 secara berturut-turut jumlah mikrobanya adalah 3,425.1010 dan

2,095.1010. Pada pengenceran 10-4 pada pengulangan yang pertama dan

kedua secara berturut-turut adalah 3225.1010 dan 8,75.1010. Pada

pengenceran 10-5 pengulangan pertama dan kedua secara berturut-turut

adalah 93,25.1010 dan 50,5.1010. sampel yang jumlah mikrobanya ter-

rendah adalah sampel pada Tempe. Pada pengenceran 10-3 di pengulangan

pertama dan kedua didapatkan hasil secara berturut-turut 0,68.1010 dan

1,13.1010. Pada pengenceran 10-4 pada npengulangan pertama dan kedua di

dapatkan hasil secara berturut-turut 5,325.1010 dan10.1010. Pada

pengenceran 10-5 pengulangan pertama dan kedua di dapatkan hasil secara

berturut-turut 9,75.1010 dan 76,7.1010.

B. Perhitungan Tidak Langsung

Sampel yang digunakan dalam percobaan perhitungan tidak

langsung sama seperti sampel perhitungan langsung yaitu tempe, saos,

susu dan jamu. Dilakukan pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-6 dengan cara

sama seperti di atas. Suspensi sampel kemudian di ambil sebanyak 100µl

dengan menggunakan mikropipet dan tip. Dilakukan teknik spread plate

pada medium lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam. Penggunaan

suhu ini, karena bakteri tersebut bekerja optimum pada suhu tersebut.

Perhitungan ini dilakukan dengan menghitung jumlah koloni.

Tabel 2. Tabel hasil perhitungan tidak langsung pada Tempe, Jamu, Saos,

dan Susu

Kelompok Sampel

Rata-rata bakteri Jumlah Mikroba (CFU/ml

)10-3 10-4 10-5

1

Tempe

TNTC 152 85

2,85.1052TNT

C - 105

3

Jamu

TFTC

TNTC

TNTC

1,73.1064TFT

C 173TNT

C

5

Saos

157 54TFT

C2,0818.1

056 190 57TFT

C

7

Susu

TNTC

TNTC

TNTC

TNTC8TNT

CTNT

CTNT

CKeterangan :

1. TNTC = bakteri lebih dari 300

2. TFTC = bakteri kurang dari 30

Pada penentuan jumlah bakteri secara tidak langsung, jumlah

masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang dipilih untuk

penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni,

karena jumlah mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya,

maka untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan yang

mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat tersebut maka

harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Pengenceran

bertujuan untuk memperoleh bakteri dengan medium dan motilitas bakteri

yang menyebar sehingga dapat dihitung dengan mudah. Pengenceran

dibuat dengan kelipatan 10 dan diambil 100 μl di setiap pengenceran 10-2,

10-4, 10-6 untuk membandingkan jumlah koloni dari tiap konsentrasi

pengenceran, dimana pada pengenceran yang kecil jumlah bakterinya

dalam medium tersebut akan menjadi terlalu padat dan nutrisi yang

diterima bakteri semakin sedikit, sementara pada pengenceran yang lebih

besar, jumlah bakteri dalam medium tersebut tidak sepadat seperti pada

medium pengenceran yang kecil, sehingga nutrisi yang diperoleh bakteri

dapat tercukupi, kemudian diinokulasi pada medium Nutrient Agar,

medium NA ini dipilih karena medium ini merupakan medium serbaguna

yang baik untuk pertumbuhan bakteri dan selanjutnya diinkubasi

menggunakan inkubator. Perhitungan secara tidak langsung ini hanya

untuk menghitung sel yang hidup saja.

Menurut Fardiaz (1993), beberapa syarat perhitungan tidak

langsung dengan menggunakan metode ini adalah :

1. Tidak ada spreader.

2. Jumlah koloni mulai dari 30-300.

3. Perbandingan jumlah bakteri antara pengenceran yang lebih besar

dengan pengenceran yang lebih kecil :

a. Jika ≤ 2, hasil perhitungan dirata-rata.

b. Jika ˃ 2, dipakai hasil pengenceran yang sebelumnya.

Rumus yang digunakan padaperhtitungan tidak langsung adalah

sebagai berikut :

∑ Bakteri= rata−rata jumlah bakterivolumesuspensi bakteri

x 10 CFUml

Sampel yang jumlah mikrobanya terbanyak terbanyak adalah pada

Susu karena pada susu sudah lebih dari 300 sehingga hasilnya TNTC.

Sampel yang terendah mikrobanya adalah pada sampel jamu yaitu

1,73.106. Perhitungan yang lebih akurat atau lebih valid adalah pada teknik

perhitungan secara tidak langsung, karena yang dihitung hanya bakteri

yang hidup saja sedangkan sel-sel kontaminan tidak ikut dihitung.

Beberapa bakteri dapat dihitng sekaligus. Perhitungan secara tidak

langsung juga dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikrobia.

V. SIMPULAN

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, maka dapat diperoleh

kesimpulan :

Pada perhitungan langsung, jumlah bakteri Tempe pada pengenceran

10-3 yaitu 0,68 x 1010, pengenceran 10-4 jumlah bakteri terhitung yaitu 5,325 x

1010, pengenceran 10-5 jumlah bakteri terhitung yaitu 97,5 x 1010. Pada

perhitungan langsung, jumlah bakteri Jamu pada pengenceran 10-3 yaitu 38,2 x

1010, pengenceran 10-4 jumlah bakteri terhitung yaitu 35,1 x 1010,

pengenceran 10-5 jumlah bakteri terhitung yaitu 287,5 x 1010. Pada perhitungan

langsung, jumlah bakteri saos pada pengenceran 10-3 yaitu 1,1 x 1010,

pengenceran 10-4 jumlah bakteri terhitung yaitu 5,87 x 1010, pengenceran 10-5

jumlah bakteri terhitung yaitu 107 x 1010. Pada perhitungan langsung, jumlah

bakteri susu pada pengenceran 10-3 yaitu 2,095 x 1010, pengenceran 10-4

jumlah bakteri terhitung yaitu 8,75 x 1010, pengenceran 10-5 jumlah bakteri

terhitung yaitu 50,5 x 1010.

Pada perhitungan tidak langsung, jumlah bakteri pada Tempe yaitu

2,85 x 10-5. Pada perhitungan tidak langsung, jumlah bakteri pada Jamu yaitu

1,73 x 10-6. Pada perhitungan tidak langsung, jumlah bakteri pada Saos yaitu

2,0818 x 10-5. Pada perhitungan tidak langsung, jumlah bakteri pada Susu

yaitu TNTC atau lebih dari 300 koloni.

Kelebihan perhitungan langsung yaitu pelaksanaan perhitungan cepat

dan peralatan yang diperlukan dalam perhitungan tidak banyak. Sedangkan

kekurangan metode perhitungan langsung yaitu sulit menghitung sel yang

berukuran sangat kecil dan kecenderungan sel untuk bergerombol sehingga

sukar untuk membedakan sel-sel individu

Kelebihan perhitungan tidak langsung yaitu sel mikrobia yang dapat

dihitung hanyalah sel mikrobia hidup, beberapa mikrobia atau jasad renik

dapat dihitung sekaligus, dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi

mikrobia Sedangkan kekurangan metode perhitungan tidak langsung yaitu

hasil perhitungan dengan menggunakan metode ini tidak menunjukkan jumlah

sel yang sebenarnya, bila medium dan kondisi inkubasi berbeda, maka akan

menghasilkan jumlah perhitungan yang berbeda pula, mikrobia yang akan

dihitung jumlahnya harus dapat hidup pada medium padat dan dapat

membentuk koloni yang kompak, jelas dan tidak menyebar, memerlukan

persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga koloni dapat dihitung.

DAFTAR PUSTAKA

Buckle. 1987. Ilmu Pangan. Universitas Indonesia Press, Jakarta.Carol, B., Freund, M. 1964. Factors Affecting Haemocytometer Counts of Sperm

Concentration in Human Semen. The Journal of the Society forDwidjoseputro. 1990. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.Fardiaz, S. 1992. Mikirobiologi Pangan. Gramedia Pustaka Utama, Hadioetomo, R. S. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia Pustaka

Utama, Jakarta. Hansen, P. J. Counting of Bacterial Colony Forming Units for Direct Enumeration

of Viable and Total Bacteria in Drinking Water. Departement of Civil Engineering Journal of Microbiological Methods Canada, 37 : 77-79.

Jakarta.Jannasch, H.W., dan G.E., Jones. (1959). Bacterial Population in Sea Water as

Determined by Different Methods of Enumeration. Limnal. Oceanogr. 4:128-139.

Jutono, J., Soedarsono, S., Hartadi, S., Kabirun, S., Suhadi, D., Soesanto. 1980. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM, Yogyakarta.

Lay, W. B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Persada, Jakarta.

Penn, C. 1991. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek: Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikrobia. Bumi Aksara, Jakarta.Rahayu, Asih. 2000. Deteksi Adanya Bakteri Pada Air Minum dalam Kemasan

Galon. Jurnal Dosen Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma. Surabaya.

Reproduction and Fertility, 8 : 149-155.Soetarto, E. S., Suharni, T. T., Nastiti, S. Y., Sembiring, L. 2008. Mikrobiologi.

Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Tomasiewicz, D. M. 1980. The Most Suitable Number Colonies On Plates for Counting. Journal of Food Protection. 43(4) : 282-286.

Waluyo, L. 2007. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. UMM Press, Malang.