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“Estrategias termorregulatorias

y fisiología digestiva del lagarto

Liolaemus darwinii

en el desierto del Monte”

Licenciatura en Ecología

Universidad Champagnat

Andrea Anabella Barauna,

Director: Dr. Eduardo Alfredo Sanabria

Co-directora: Dra. María Eugenia Cabrillana

Mendoza, 2013

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Índice

Pág.

Agradecimientos……………………………………………………………4

Resumen…………………………………………………………………….6

Introducción………………………………………………………………...8

Fundamentación……………………………………………………...9

Objetivo……………………………………………………………………13

Área de estudio…………………………………………………………….14

Clima………………………………………………………………..14

Fauna………………………………………………………………..15

Flora………………………………………………………………...16

Descripción de la especie………………………………………………….17

Materiales y Métodos……………………………………………………..19

Captura……………………………………………………………...19

Trabajo de Laboratorio……………………………………………...19

Medición de la Temperatura corporal selecta……………………20

Obtención de tejidos y plasma………………………………………21

Actividad enzimática en intestino delgado y páncreas…………….23

Concentración de proteínas totales y albúmina………………….24

Determinación de proteínas totales…………………………24

Determinación de albúmina………………………………….25

Curva de calibración………………………………………………..25

3

Análisis de Datos……………………………………………………………27

Resultados…………………………………………………………………28

Temperatura corporal selecta……………………………………….28

Actividad enzimática en intestino delgado y páncreas…………..30

Concentración de proteínas totales y albúmina…………………..30

Discusión……………………………………………………………………32

Temperatura corporal selecta………………………………………32

Actividad enzimática en intestino delgado y páncreas……………35

Concentración de proteínas totales y albúmina………………….36

Conclusiones generales……………………………………………………37

Bibliografía…….……………………………………………………………39

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Agradecimientos

Este trabajo no hubiera sido posible sin la ayuda y el apoyo de muchas personas que

me acompañaron en cada etapa y a lo largo de toda la carrera.

Quiero agradecer a mis padres, Norma y Alejandro, por darme la posibilidad de

estudiar, por alentar siempre mis sueños y acompañarme en cada decisión.

A mi novio, Gustavo, por ser mi apoyo emocional, por acompañarme en todo desde

que empecé la carrera, bancar mis ausencias por viajes al campo, cursos, congresos, sin

jamás limitarme a crecer y siempre incentivar mi formación.

A mis hermanos Gabriel y Antonella, y mis cuñados, Mariela y Agustín, por estar

siempre conmigo, sacarme de apuros las veces que lo necesité y ser siempre

incondicionales.

A mi director, Eduardo, y su esposa Lorena, por enseñarme tanto, por ser tan

pacientes, tan comprensivos y divertidos.

A mi codirectora, María Eugenia, siempre predispuesta a enseñarme, a explicarme

con mucha paciencia todo, del modo más alegre y llevadero.

Tuve la suerte de tener un director y una codirectora que siempre me hicieron sentir

muy cómoda trabajando con ellos, que sabían muchísimo y me enseñaban transmitiendo su

pasión por lo que hacen.

A mi querida amiga Rocío Aguilar, por darme una mano enorme cuando más lo

necesitaba, poniéndome en contacto con mi director. Por todo lo que me enseñó tanto en

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campo como en oficina y por corregir este trabajo. Me alegra que podamos tener proyectos

en común para seguir trabajando juntas.

A mi otra querida amiga, Daniela Rodríguez, por siempre darme fuerza, por confiar

en mí y hacer que yo también confíe en que soy capaz de hacer lo que me proponga con

esfuerzo. Por enseñarme tantas cosas que no se aprenden en ninguna universidad y por

permitir que siempre aprenda a su lado.

A Paola Sassi, por su calidez y predisposición para ayudarme, por corregir este

trabajo y por sus excelentes aportes profesionales.

A Yamil Rodríguez, Emanuel Ontivero, Exequiel Gonzalez y Ariel Cataldo, por ir

al campo y capturar prácticamente todos los lagartos utilizados en este estudio.

A mis compañeros de la facultad, con quienes compartí innumerables viajes,

salidas, momentos, fue grandioso conocerlos a todos y hoy son mis amigos además de

colegas.

A mis amigos de siempre, Flor, Barby, Maty y Matias, por estar siempre a mi lado,

por acompañarme a lo largo de toda esta experiencia y contar siempre con su amistad.

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Resumen

El comportamiento de selección de temperaturas corporales elevadas frente a la

ingesta, es frecuentemente observado en organismos del orden Squamata. No se ha

estudiado este patrón en el género Liolaemus, por ello se puso a prueba en la especie

Liolaemus darwinii (Squamata: Liolaemidae), un lagarto insectívoro, habitante de los

Médanos Grandes, Caucete, Provincia de San Juan. Se determinó la temperatura corporal

selecta (Tsel) bajo dos condiciones experimentales: “ayuno”/“no ayuno” en un gradiente

linear térmico en los meses de octubre y marzo. Además, se midió la actividad de la enzima

digestiva tripsina en intestino delgado y páncreas de lagartos aclimatados a diferentes

temperaturas. En el primer estudio, los lagartos capturados en octubre presentaron una Tsel

significativamente menor (t(gl=722)=18,518; p<0.00002) en el tratamiento “no ayuno”

(30.9±0.2ºC) que en el “ayuno” (32.3±0.2ºC). En cambio, para marzo, la Tsel fue

significativamente mayor (t(gl=498)=5.73; p<0.0001) en el tratamiento “no ayuno”

(32.5±0.2ºC), que en el “ayuno” (30.5±0.2ºC). En el segundo estudio, las mediciones

realizadas en intestino delgado no mostraron diferencias significativas a las diferentes

temperaturas de aclimatación (Kruskal-Wallis test: H (2, N=11)=2,09; p=0,35). En contraste,

las mediciones realizadas en tejido pancreático mostraron una mayor actividad enzimática a

40°C, siendo esta estadísticamente diferente (Kruskal-Wallis test: H (2, N=9)=6,44; p=0,039)

con la actividad obtenida a los 15°C. Los resultados obtenidos en el primer estudio,

muestran que las diferencias estacionales encontradas entre octubre y marzo, podrían

deberse a los ciclos circanuales de los reptiles, como almacenamiento de grasas y

aletargamiento. Respecto al segundo estudio, los resultados reflejan que un aumento de la

temperatura corporal no tiene efecto en el intestino delgado, pero si favorece la secreción

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de enzima tripsina en el páncreas de los lagartos y estimula las contracciones peristálticas

del esófago.

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Introducción

El presente trabajo de investigación tiene como propósito acercarnos al

conocimiento de las estrategias termorregulatorias y su relación con los procesos

fisiológicos digestivos en el lagarto Liolaemus darwinii (Reptilia: Squamata: Liolaemidae).

Desde que el control comportamental de la temperatura corporal fue descripto

primariamente por Cowles y Bogert (1944), la termorregulación comportamental ha sido

considerada un factor de importancia en la fisiología digestiva de los reptiles.

Existen evidencias de que las especies pertenecientes al orden Squamata seleccionan

temperaturas corporales más altas luego de alimentarse (Brown y Roberts, 2008). La

hipótesis de la presencia de este patrón, está ampliamente basada en el supuesto de que

temperaturas corporales más elevadas, luego de alimentarse, representan una respuesta

adaptativa comportamental que mejora la digestión y/o conserva energía en periodos de

baja disponibilidad alimentaria (van Marken Lichtenbelt, 1992).

No existen estudios precedentes sobre el comportamiento termofílico digestivo y su

correlación con la actividad de enzimas pancreáticas e intestinales para el género

Liolaemus, por lo que se puso a prueba en el lagarto Liolaemus darwinii (Bell, 1843), un

lacértido ovíparo, insectívoro y psamófilo, habitante de los Médanos Grandes,

departamento de Caucete, provincia de San Juan.

En este proyecto se plantea identificar una relación entre el comportamiento

termofílico y la digestión en dependencia de la temperatura ambiental. Se comparó la

temperatura corporal selecta bajo condiciones de presencia y ausencia de alimento en un

gradiente linear térmico. Además, se contrastó la actividad de la enzima tripsina, una

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proteasa secretada en el páncreas de forma inactiva y activada en la porción anterior del

intestino delgado, entre organismos aclimatados a diferentes temperaturas.

Fundamentación La temperatura ambiental varía a lo largo del espacio y el tiempo, por lo que la

mayoría de los organismos combinan mecanismos comportamentales, fisiológicos y

morfológicos para regular su temperatura dentro de límites tolerables y de este modo

amortiguar la heterogeneidad ambiental (Angilletta, 2009).

En base a la fuente de origen del calor corporal, podemos distinguir entre

organismos endotermos y ectotermos (IUPS Thermal Commission, 2001). Los primeros

alcanzan su temperatura corporal fundamentalmente mediante una gran producción de calor

metabólico (Bennet et al., 2000), mientras que en los segundos, la fuente de energía

calórica necesaria para los procesos fisiológicos, es externa (Rome et al., 1992).

Con respecto a la capacidad metabólica de mantener una temperatura corporal

constante o no, se puede diferenciar entre organismos homeotermos y poiquilotermos,

respectivamente (IUPS Thermal Commission, 2001). Los límites entre homeotermos y

poiquilotermos son considerablemente borrosos, teniendo en cuenta que muchos

homeotermos exhiben una variación estacional de su temperatura corporal (Prinzinger et

al., 1991).

A su vez, podemos hacer una distinción entre organismos termorreguladores y

termoconformes. Siendo un perfecto termorregulador el organismo que mantiene una

temperatura corporal invariable a lo largo del tiempo aunque las temperaturas del ambiente

puedan variar. Por otro lado, un termoconforme poseerá un amplio rango de tolerancia

térmica, permitiéndole mantener su temperatura corporal cercana a la del medio ambiente

10

(Angilletta, 2009). Entre estas dos estrategias extremas existen intermedios, donde los

organismos tienen un compromiso entre el tiempo destinado a la termorregulación y el

empleado en el resto de las funciones biológicas (Huey y Slatkin, 1976).

Los termorreguladores, para mantener su temperatura corporal dentro un

determinado rango, requieren cambios conductuales, como movimientos entre sitios que

ofrecen microclimas adecuados para su calentamiento y enfriamiento (Withers y Campbell,

1985; Huey et al., 1989; Schultz, 1998; Díaz y Cabezas-Díaz, 2004). Este valor estable de

una variable, en un organismo saludable, por medio de su propia regulación, se denomina

“Set point” (Hertz et al., 1993).

Más aún, un termorregulador mantiene una media o varianza particular de su

temperatura corporal utilizando un mecanismo neural para percibir y responder a su

ambiente (Bicego et al., 2007).

Esta regulación comportamental de la temperatura posee un rol preponderante en los

organismos pertenecientes al orden Squamata, ya que las funciones fisiológicas y

conductuales dependen de la temperatura corporal adquirida, afectando a los organismos en

su distribución espacial a diferentes escalas (Hutchinson, 1957; Haramura, 2007), actividad

estacional y diaria (Huey y Stevenson, 1979), desempeño locomotor (salto, natación,

locomoción) (Marvin, 2003; Aguilar y Cruz, 2010), tasa de crecimiento (Lillywhite et al.,

1973), tasa de digestión y comportamiento termofílico (Witters y Sievert, 2001); entre

otros.

Los animales pertenecientes al orden Squamata pueden además, disminuir su tasa

metabólica mediante un descenso de su temperatura corporal o aumentar la energía

destinada al crecimiento y la reproducción, consumiendo y digiriendo más alimento cuando

las presas son abundantes (Keith et al., 1984; Du et al., 2000; Wang et al., 2003; Kooijman,

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2010). Este incremento en la tasa digestiva permite comidas frecuentes, lo cual es

acompañado por un incremento de la temperatura corporal (Du et al., 2000; Wang et al.,

2003).

Consecuentemente, la selección de temperaturas más elevadas dentro de su rango de

temperaturas selectas, les confiere un beneficio ya que la búsqueda, captura, digestión y

asimilación de los alimentos dependen fuertemente de la temperatura corporal (Greenwald

y Kanter, 1979; Waldschmidt et al., 1986; Angilletta, 2001). Si el alimento no estuviera

disponible ya sea porque se encuentra en regiones subóptimas o con una alta tasa de

depredación; el costo-beneficio de alimentarse haría que estos organismos seleccionen

temperaturas óptimas más bajas (Brett 1971; Elliott, 1982; Jonassen et al., 1999).

Este comportamiento efectivamente se observa en algunas especies de lagartos

como: Anolis carolinensis (Brown y Griffin, 2005), Crotaphytus collaris (Sievert, 1989);

en un gecko del género Eublepharis (Autumn y De Nardo, 1995) como así también en un

integrante de la familia Pygopodidae, Lialis burtonis (Bradshaw et al., 1980).

No obstante, Brown y Griffin (2005), han argumentado que la magnitud de este

efecto probablemente es muy pequeña para representar un ahorro energético significativo

en ectotermos como los reptiles. De hecho, no se ha comprobado este patrón en el lagarto

Sceloporus jarrovi (Schuler et al., 2001).

Todas estas respuestas derivan de las sensibilidades térmicas de los procesos

anabólicos y catabólicos, las cuales varían de acuerdo a la cantidad de comida que puede

ser procesada, digerida y absorbida por el estómago (Schuler et al., 2011). En tales

procesos, la actividad enzimática está estrechamente vinculada con la temperatura corporal

y se ve aumentada con el ascenso de la misma (Müller-Esterl, 2008). Los organismos

provenientes de regiones cálidas evolucionaron con niveles enzimáticos estables y ciertas

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estructuras bioquímicas alcanzan su estabilidad funcional a altas temperaturas (Hochochka

y Somero, 2002).

La digestión es el proceso mediante el cual se realiza la conversión de sustancias

complejas en otras más simples para favorecer su absorción. Los alimentos sufren

transformaciones físicas y químicas a lo largo del tracto digestivo. Particularmente, una vez

arribado al intestino delgado, el alimento es degradado por secreciones biliares y enzimas

pancreáticas (Blanco, 2006). Las enzimas digestivas exócrinas del páncreas en reptiles,

incluyen compuestos amilolíticos (amilasa), proteolíticos (quimotripsina, tripsina,

carboxipeptidasa y elastasa), lipolíticos y quitinasa, en reptiles insectívoros. Las enzimas

producidas por el páncreas son altamente dependientes de la temperatura corporal y del pH,

el cual debe ser mayor a 6.0. (Yarto Jaramillo, 2011).

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Objetivo

Objetivo General Determinar la existencia de un patrón de comportamiento termofílico en relación a

la digestión, en el lagarto L. darwinii.

Objetivos particulares Comparar la temperatura corporal selecta por L. darwinii en un gradiente térmico

linear, a lo largo de su horario de actividad, bajo diferentes condiciones

experimentales (ayuno vs. no ayuno).

Medir la concentración de la enzima tripsina, a tres temperaturas ecológicamente

relevantes, establecidas a partir de las mediciones de las temperaturas corporales

selectas.

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Área de estudio

El área denominada Médanos Grandes se

encuentra ubicada a 42 km al sureste de la

ciudad de San Juan, en el departamento de

Caucete. Comprende una amplia región de

aproximadamente 2000 Km2.

El sitio de colecta seleccionado fue la

Estación Guayamas, ubicada al norte del

Sistema de Médanos Grandes (31.7445 Lat. S,

68.1045 Long. O; 670 m.s.n.m.).

Fig. 1: Caucete, provincia de San Juan

(tomado de www.wikimedia.org,

Autor: Enrique Guardia, 2011).

Clima Conforme a la Ecorregión del Monte, las precipitaciones se encuentran concentradas

en verano, con una variación anual entre 80 y 250 mm en promedio (Cabrera, 1976). En el

área de estudio en particular, la precipitación tiene un promedio anual de 89 mm. La

temperatura máxima media anual es de 25.7 °C y la mínima media anual es de 10.4°C

(Cabrera, 1976).

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Fauna La fauna de insectos es bien conocida en la zona norte del Monte, donde existe una

alta proporción de géneros y especies endémicas pertenecientes a diferentes familias (Roig-

Juñent et al., 2001).

Entre los reptiles más representativos se encuentran la iguana colorada (Tupinambis

rufescens); la falsa yarará (Pseudotomodon trigonatus), la yarará ñata (Bothrops

ammodytoides), la falsa coral (Lystrophis semicinctus); lagartos como Liolaemus darwinii,

L. gracilis, los matuastos Liosaurus paronae y L. belli; los teidos Cnemidophorus

longicauda y Teius oculatus. También está presente la tortuga terrestre Chelonoidis

chilensis. Respecto a los anfibios, podemos mencionar a la ranita del monte (Pleurodema

nebulosa) y el sapo común, Rhinella arenarum, (Chebez, 1988; Bertonatti y González,

1992; Chebez, 1994; García Fernández et al., 1997).

Las aves incluyen gauchos (Agriornis sp.), dormilonas (Muscisaxicola sp.), la

martineta común (Eudromia elegans), la monterita canela (Poospiza ornata), el inambú

pálido (Nothura darwinii) y el loro barranquero, Cyanoliseus patagonus, (García Fernández

et al., 1997).

Los mamíferos están representados por especies de tamaño grande como el guanaco

(Lama guanicoe) y el puma (Felix concolor); por especies de tamaño mediano como la

vizcacha (Lagostomus maximus), el zorro colorado (Lycalopex culpaeus) y el zorro gris (L.

griseus); y por especies de tamaño pequeño como los cuises (Microcavia australis, Galea

musteloides), los tuco-tucos (Ctenomys mendocinus), el zorrino chico (Conepatus

castaneus) y el huroncito, Lyncodon patagonicus, (García Fernández et al., 1997; Díaz y

Ojeda, 2001).

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Flora El tipo de vegetación predominante es el matorral o la estepa arbustiva xerófila,

sammófila o halófila. Desde el punto de vista florístico la provincia se caracteriza por la

presencia, casi constante, de especies del género Larrea (L. divaricata y L. cuneifolia) y

Prosopis (P. flexuosa, P. alpataco) arbustivos. Otros géneros de Zigofiláceas como

Bulnesia y Plectrocarpa sólo se hallan en la parte norte de la Provincia.

Además, se encuentran cactáceas como Tephrocactus articulatus y Opuntia

sulphurea (Cabrera, 1976).

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Descripción de la especie

Dentro del género Liolaemus hay un grupo de especies que se caracteriza por la

presencia de un parche de escamas agrandadas en la cara posterior del fémur, este conjunto

de especies es llamado “grupo de L. boulengeri”. Integrando este grupo de especies, se

reconoce entre otros, un clado monofilético denominado grupo L. darwinii, al cual

pertenece el lagarto bajo estudio con el mismo nombre, Liolaemus darwinii (Fig. 2 y 3).

Este grupo, se caracteriza entre otras particularidades, por presentar las coronas de los

dientes posteriores con bordes rectos y un marcado dicromatismo sexual (Etheridge, 1993).

La especie L. darwinii, de pequeño a mediano tamaño corporal (LHC: 65 mm), es

común y típica de ambientes de Monte. Su distribución es muy amplia, desde La Rioja

hasta Chubut. (Cruz et al., 2012). En cuanto a su estado de conservación, se encuentra

categorizada como No Amenazada (NA) (Abdala et al., 2012).

Los machos pueden tener una coloración vivaz que incluye manchas pectorales,

ventrales y en muslos intensamente negras. Las hembras, (como en muchas especies del

género Liolaemus) son más pálidas (Cruz et al., 2012).

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Fig. 2: Macho adulto de Liolaemus darwinii, de los Médanos Grandes de Caucete,

provincia de San Juan (Foto: Eduardo A. Sanabria, 2013).

Fig. 3: Hembra y macho adultos de Liolaemus darwinii, de los Médanos Grandes de

Caucete, provincia de San Juan (Foto: Andrea A. Barauna, 2013).

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Materiales y Métodos

Captura Los ejemplares (machos y hembras adultos) fueron capturados durante las primeras

horas de su horario de actividad en los meses de octubre 2012 (n=29) y marzo 2013 (n=20),

realizando caminatas al azar por el área de estudio. Se utilizó un lazo hecho de hilo dental

sujeto a una vara de 2 metros de largo aproximadamente.

Inmediatamente después de la captura se les midió la temperatura corporal en

campo con un termómetro digital TES 1312 (TES Electrical Electronic Corp., Taipei,

Taiwan, ± 0.1ºC). También se registró temperatura del aire a 1 cm de la superficie, del

sustrato al sol y a la sombra, y la velocidad del viento con un anemómetro digital (Kaise

AR 816, ±0.2 ºC – 0.1 m/s). Estos datos se tomaron con la finalidad de conocer las

condiciones ambientales a las que se expone el animal, en los momentos de captura del año,

y así poder hacer una mejor recreación en laboratorio.

La época del año selecta para la captura, está relacionada con el comienzo y el fin

del periodo anual de actividad de los lagartos, teniendo en cuanta su ciclo circanual (Hill et

al., 2004).

Trabajo de Laboratorio Los lagartos capturados en ambos meses, se separaron en dos grupos y fueron

sometidos simultáneamente a tratamientos opuestos, ayuno vs. no ayuno (Tabla 1), a lo

largo de cuatro días.

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OCTUBRE 2012 MARZO 2013

AYUNO 15 10

NO AYUNO 14 10

Tabla 1: Cantidad de individuos (n) por mes

y por tratamiento

Durante la fase de tratamiento se los colocó en recintos de plástico individuales para

asegurar que cada animal comiera el alimento que se le suministró. Cada recinto contaba

con una provisión de arena, para imitar su sustrato natural. Se los mantuvo a temperatura

ambiente (24°C ± 2°C), respetando su fotoperíodo natural 12:12 (horas luz/oscuridad).

Diariamente, se rociaba a los individuos con agua, para evitar una posible deshidratación.

A cada individuo del grupo “no ayuno”, alrededor del mediodía, se le proporcionó

por día una larva o una pupa de Tenebrio sp. (1,40% de su masa corporal). Previamente, se

registró el peso de cada larva o pupa, para llevar un control de la ingesta de los animales.

Medición de la temperatura corporal selecta Concluida la etapa de aclimatación a los tratamientos, se dispuso a los individuos en

un terrario con carriles de 1,5 metros de largo. El terrario posee paredes de vidrio. Por

debajo, corren placas térmicas, provistas de sensores que permiten mantener un gradiente

linear térmico entre 25-55°C. Este rango es ampliamente conservado en el género

Liolaemus (Medina et al., 2009). Las placas están aisladas del vidrio por una plancha de

telgopor, la cual a su vez está cubierta por arena, sirviendo ésta como sustrato para los

animales testeados.

El terrario se ubicó en un lugar cerrado, separado del ruido y de cualquier otra

perturbación que pudiera alterar el comportamiento de los lagartos. La temperatura

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ambiente se mantuvo constante (20°C ± 2°C) con la ayuda de un aire acondicionado. La

iluminación también fue constante durante el experimento, provista por luz blanca.

Los lagartos fueron previamente aclimatados al carril, de 07:00 a 08:00 hs., y luego

se comenzaron a registrar sus temperaturas corporales selectas cada media hora durante

todo su periodo diario de actividad (08:00 a 20:00 hs). Las temperaturas corporales selectas

se registraron con un termómetro digital TES 1312 (TES Electrical Electronic Corp.,

Taipei, Taiwan, ± 0.1°C), que cuenta con una termocupla tipo sonda (TPK-01) de

aproximadamente 0,8 mm de espesor. Esta se introducía en el orificio cloacal de los

animales (~5 mm).

Se eligió este método porque la mejor evidencia de las preferencias térmicas de un

organismo, provienen de la medición de su temperatura corporal selecta en un gradiente

termal, donde lo único que varía espacialmente es la temperatura (Angilletta, 2009).

Controlando las variables ambientales, fácilmente se puede cuantificar la frecuencia

de las temperaturas selectas. La temperatura corporal selecta provee una valiosa

información sobre las estrategias termorregulatorias en ambientes donde no existen

restricciones ecológicas (Angilletta, 2009).

Obtención de tejidos y plasma Se mantuvo a quince individuos en incubadora a 25°C, con fotoperíodo de 12:12

(horas luz/oscuridad), durante 5 días, con el fin de producir su vaciamiento gástrico.

Posteriormente, se los dividió en 3 grupos de 5 ejemplares cada uno, fueron colocados en

recipientes individuales y alimentados ad libitum con larvas de Tenebrio sp., mientras se

incubaba a cada grupo durante 3 días a 15°, 33° y 40°C.

22

Se eligieron estas tres temperaturas de incubación en base a la frecuencia de

temperaturas seleccionadas en el gradiente linear térmico.

Cumplido el tiempo de incubación, los ejemplares se sacrificaron mediante una

sobredosis de anestesia (2.5 ml de 2% Xylocaine y 2% Lidocaine HCl, Astra Zeneca Labs,

Buenos Aires, Argentina) la cual fue inyectada vía intramuscular a la altura del abdomen.

Posteriormente se disecaron y se les extrajo sangre y órganos (páncreas e intestino

delgado).

La sangre se extrajo directamente del corazón y se colectó con capilares

heparinizados (para evitar su coagulación). Luego, se centrifugó a 2000 rpm durante 15

minutos. Finalizado el centrifugado, se separó el plasma y se lo congeló a -20°C, para

posteriormente medir la concentración de proteínas totales y albúmina.

Esta medición tiene la finalidad de conocer los niveles séricos de proteínas en el

momento de la extracción de los órganos. Es preciso saber si la relación entre la albúmina y

las globulinas es normal, pues la sumatoria de estas concentraciones equivale a la

concentración de las proteínas totales (Blanco, 2006).

Los órganos extraídos para el análisis fueron: la porción anterior del intestino

delgado (duodeno) y el páncreas. El primero de ellos se cortó longitudinalmente, para su

ulterior lavado de la cavidad del lúmen con cloruro de sodio (NaCl) al 1% (solución

fisiológica), durante 1-2 minutos. Luego se lo secó en papel secante y se lo almacenó a

-20ºC. El páncreas se extrajo y almacenó a -20°C.

Actividad enzimática en intestino delgado y páncreas Ambos órganos se homogenizaron para la determinación de la actividad enzimática.

Para la homogeneización del intestino delgado y páncreas, se utilizó un homogenizador

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(Whirlotone N° Cat.: 59880-10, Matheson Scientific, USA), equipado con una sonda

(S25N-18G).

El intestino delgado se descongeló, se pesó y se suspendió en una solución de tritón

X100 (Sigma Aldrich, N° Cat.: T9284, Industria Argentina) al 10%, en una proporción de 6

ml por cada gramo de tejido. Luego de homogeneizar, se lo centrifugó a 14.000 rpm

durante 60 minutos a 4°C. Se colectó el sobrenadante para el análisis y se almacenó a

-80°C.

El páncreas se descongeló, pesó y se suspendió en una solución 154 mM de NaCl

(Dalton, N° Cat.: 7647, Industria Argentina), en una proporción 1 a 4 (volumen de tejido:

volumen de solución). Luego de homogeneizar se centrifugó a 11.400 rpm durante 20

minutos a 4°C. Posterior al centrifugado, se separó el sobrenadante y también fue

almacenado a -80°C.

La medición de la actividad enzimática se realizó en los sobrenadantes obtenidos en

el paso previo. El protocolo utilizado fue el del Kit Thermo Scientific Pierce Protein

Biology products, USA. Este Kit de Ensayo Colorimétrico de Proteasa (Parte Nº23263)

utiliza la caseína completamente succinilada como un sustrato para el ensayo. La hidrólisis

de este sustrato en presencia de la proteasa, resulta en la liberación de fragmentos de

péptidos con grupos amino terminales libres.

Los péptidos reaccionan con ácido sulfónico trinitrobenceno (TNBSA), dando como

resultado productos de color amarillo (TNB-péptido), los cuales se detectaron a una

longitud de onda de 500 nm en un lector de placa Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo

Fisher Scientific, Shangai, China).

El procedimiento se realizó según indicaciones del fabricante (Rao S.K. et al., 1997;

Tian M. et al., 2004).

24

El valor obtenido de actividad enzimática en cada órgano fue relativizado al peso

del mismo previo a la homogenización, expresado en: UI/ml/gr (Unidades

Internacionales/mililitro/gramo).

Concentración de proteínas totales y albúmina

Determinación de proteínas totales Se utilizó un método colorimétrico, en el que los enlaces peptídicos de las proteínas

reaccionan con el ión cúprico, en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con

máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de

proteínas totales en la muestra.

Procedimiento En un primer tubo marcado como Blanco (B), se colocaron 50 ul de agua destilada y

3,5 ml de Reactivo A (complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en hidróxido de sodio 875 mmol/l y

alquil aril poliéter, AAP). En un segundo tubo marcado como suero patrón (P) se colocaron

50 ul de de la misma (Suero Patrón: solución de albúmina y globulinas de origen bovino,

con título conocido de proteínas) y 3,5 ml de Reactivo A. Luego, se procesó la cantidad de

tubos necesarios para la cantidad de condiciones experimentales previstas. Se colocaron 50

ul de la muestra (plasma de los lagartos) y 3,5 ml de Reactivo A en cada tubo. El volumen

final de la reacción fue de 3,55 ml.

Se mezcló cada preparado con una varilla y se incubó a 37°C durante 10 minutos. Se leyó

en un espectrofotómetro (Sunostik SBA 733, China) a 540 nm y se llevó a cero con el Blanco de

Reactivo.

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Determinación de albúmina La albúmina reacciona específicamente (sin separación previa) con la forma

aniónica de la 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfon ftaleína (BCF), en presencia de un exceso

de colorante, en medio tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto

del Blanco de reactivo, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra.

Procedimiento Para este caso, se destinó un tubo para el procesamiento de el blanco de reactivo, en

donde se colocaron 3,5 ml de Reactivo B (solución de 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfon

ftaleína, en polioxietilén lauril éter); otro tubo para el procesamiento del suero patrón de

concentración conocida, en donde se colocaron 10 ul de la misma y 3,5 ml de Reactivo B; y

finalmente, un tubo para cada condición experimental a medir (desconocido), en donde se

colocaron 10 ul de la muestra y 3,5 ml de Reactivo B.

Nuevamente, se mezcló cada preparado con una varilla y se mantuvieron a 25°C

durante 10 minutos. Se leyó en el espectrofotómetro a 625 nm y se llevó a cero con el

Blanco de Reactivo.

En este caso, también se preparó una curva de calibración con cantidades crecientes

de suero patrón (10 y 20 ul), con un volumen de reactivo de 3,5 ml en todos los casos.

Curva de calibración Para constatar que el colorímetro tenga una respuesta lineal en las longitudes de

onda fijadas para las reacciones, se prepararon curvas de calibración para las proteínas

totales (Fig. 4a) y la albúmina (Fig. 4b) con cantidades crecientes de suero patrón (50 y

100 ul) y un volumen de reactivo de 3,5 ml en todos los casos.

26

Fig. 4: Curvas de calibración para la concentración plasmática de

proteínas totales (a) y albúmina (b)

27

Análisis de datos

Para el análisis de los datos obtenidos del comportamiento termofílico de los

lagartos, se realizaron comparaciones de la temperatura corporal selecta entre los grupos

propuestos en las dos experiencias (ayuno vs. no ayuno). En el caso de los análisis

enzimáticos, se comparó la actividad enzimática a las diferentes temperaturas presentadas

para el estudio (15, 33, 40ºC).

En ambos casos se aseguró la independencia estadística de los datos. La normalidad

se comprobó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov y se realizó un análisis de la

varianza con el peso corporal como covariable (ANCOVA). La homocedasticidad se

demostró mediante la prueba de Levenne. Para todos los análisis el nivel de significancia

fue de α=0,05. De todos los datos muestrales se extrajeron los estadísticos descriptivos de

media y desviación estándar. Todos los análisis se efectuaron con el paquete estadístico

STATISTICA 7.0.

28

Resultados

Temperatura corporal selecta Los lagartos capturados en el mes de octubre mostraron variaciones significativas en

la temperatura corporal selecta (Tsel) en relación a su estado de ingesta (t(gl=722)=18,51;

p<0.00002). Siendo mayor la temperatura seleccionada en los lagartos ayunados

(32.3±0.2ºC) que en los alimentados (30.9±0.2ºC ) (Fig. 5).

No se encontraron diferencias significativas entre los lagartos alimentados, durante

su periodo de actividad (ANCOVA: F(12, 169)= 0,59; p= 0,84; Cov.: peso corporal). Tampoco

se reportaron diferencias significativas en la Tsel durante el periodo de actividad de los

lagartos ayunados (ANCOVA: F(12, 182)=1,53; p=0,11; Cov.: peso corporal).

Fig. 5: Variación en la Temperatura corporal selecta (Tsel) en lagartos

capturados en el mes de octubre

29

Por el contrario, los lagartos capturados en marzo presentaron una Tsel

significativamente mayor (t(gl=498)=5.73; p<0.0001) en los lagartos alimentados

(32.5±0.2ºC), que en los ayunados (30.5±0.2ºC) (Fig.: 6).

No existió variación significativa en la temperatura selecta (Tsel) de los individuos

que se encontraban alimentados entre las horas de actividad (ANCOVA: F(12, 116)=0,81,

p=0,63; Cov.: peso corporal). Se detectaron diferencias significativas en la Tsel de los

lagartos que se encontraban en condiciones de ayuno durante las horas de actividad

(ANCOVA: F(12, 116)=3,31, p<0,0003; Cov.: peso corporal). El test a posteriori Tukey HSD

arrojo que las Tsel son significativamente diferentes a partir de las 13hs.

Fig. 6: Variación en la Temperatura corporal selecta (Tsel) en lagartos capturados

en el mes de marzo

30

Actividad enzimática en intestino delgado y páncreas En mediciones realizadas en intestino delgado no se observaron diferencias

significativas a las diferentes temperaturas de aclimatación (Kruskal-Wallis test: H (2,

N=11)=2,09; p=0,35; Fig. 7a). En contraste, las mediciones realizadas en tejido pancreático

mostraron una mayor actividad enzimática a 40°C, siendo esta estadísticamente diferente

con la actividad obtenida a los 15°C, (Kruskal-Wallis test: H (2, N=9)=6,44; p=0,039; Fig.

7b).

Fig. 7: Variación de la actividad enzimática de tripsina en intestino delgado (a) y

páncreas (b) en función a la temperatura de incubación

Concentración de proteínas totales y albúmina No se lograron detectar diferencias significativas para los niveles de proteínas

totales en relación a las temperaturas de incubación seleccionadas (Kruskal-Wallis test: H

(2, N=15)=1,52; p=0,46. Fig. 8a). De la misma manera, no se encontró diferencia significativa

en los niveles de albúmina en relación a las temperaturas de incubación seleccionadas

(Kruskal-Wallis test: H (2, N=15)=1,35; p=0,5. Fig. 8b).

15 33 40

0

10

20

30

40

50

Temperatura (°C)

Acti

vid

ad

de T

rip

sin

a (

UI/m

l/g

r)

15 33 40

0

1000

2000

*

Temperatura (°C)

Acti

vid

ad

de T

rip

sin

a (

UI/m

l/g

r)

INTESTINO DELGADO PÁNCREAS

a) b)

31

Fig. 8: Variación de la concentración plasmática de proteínas totales (a) y

albúmina (b) en función a la temperatura de incubación

15 33 40

0

1

2

3

4

Temperatura (°C)

Co

ncen

tració

n (

g/d

l)

PROTEÍNAS TOTALES

15 33 40

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Temperatura (°C)

Co

ncen

tració

n (

g/d

l)

ALBÚMINA

a) b)

32

Discusión

Temperatura corporal selecta Muchos estudios sugieren que existe un comportamiento termofílico en ectotérmos

luego de alimentarse (Witters y Sievert, 2001), mientras que otros sostienen que no existe

dicho efecto (Schuler et al., 2011).

Los lagartos capturados en el mes de octubre, exhibieron una temperatura corporal

selecta significativamente más elevada en condiciones de ayuno que de alimentación, en

promedio. Estos resultados contradicen los modelos de termorregulación óptima, basados

en costos y beneficios energéticos, los cuales predicen que los animales disminuirán su

temperatura corporal selecta cuando la disponibilidad de alimento sea restringida (Huey,

1982).

En contraste, los resultados obtenidos para este caso, implican que los lagartos

expuestos a un déficit alimentario estarían afinando su comportamiento termorregulatorio

hacia beneficios no energéticos como el desarrollo, la inmunidad y la locomoción.

Probablemente el crecimiento se vea comprometido, como consecuencia del costo que

insume mantener temperaturas corporales elevadas durante condiciones de ayuno (Schuler

et al., 2011).

Los beneficios no energéticos están bien documentados en ectotérmos (Angilletta,

2009). La necesitad de capturar presas y evitar depredadores es un fuerte incentivo para

mantener elevadas temperaturas que permitan la locomoción (Schuler et al., 2011).

Esta situación no puede ser mantenida en el tiempo, y cuando estos lagartos se

enfríen por debajo de su óptimo térmico, su habilidad para localizar y dominar presas

disminuirá, tal como describen Greenwald (1974), Díaz (1994), y Van Damme y colegas

33

(1991). Además, estos animales fríos no podrían escapar efectivamente de un depredador

(Christian y Tracy, 1981; Cooper, 2000), y deberían detectarlos tempranamente o adoptar

defensas alternativas (Rand, 1964; Hertz et al., 1982; Goode y Duvall, 1989; Passek y

Gilligham, 1997 y Shine et al., 2000).

Por el contrario, los lagartos capturados en el mes de marzo, seleccionaron en

promedio, temperaturas significativamente más elevadas en condiciones de alimentación

que de ayuno. Los animales ayunados tienen mayor necesidad de forrajear que los nutridos

(Schuler et al., 2011). Esto representaría una dificultad para los primeros, ya que una

depresión térmica podría perjudicar su habilidad para defender recursos alimenticios de sus

conspecíficos (Garland et al., 1990; Robson y Miles, 2000).

Las diferencias estacionales encontradas, podrían deberse al ritmo biológico de los

reptiles. Estos ritmos son variaciones fisiológicas y conductuales rítmicas a lo largo de un

día (ciclo circadiano) o de un año (ciclo circanual). Los ritmos son endógenos y persisten

incluso cuando se coloca a los animales en un ambiente de laboratorio, privados de

información ambiental sobre la época del año (Hill et al., 2004). Entre los ciclos

circanuales de interés para este estudio, se encuentran la acumulación de grasa y el

aletargamiento (Hill et al., 2004).

Los lagartos colectados en octubre están saliendo del periodo de letargo, y los

reptiles ayunados seleccionarían temperaturas corporales selectas elevadas para poder

llevar a cabo una captura de presas potenciales más eficiente. Los alimentados

seleccionarían temperaturas más bajas para retener más tiempo la comida en el tracto

digestivo y asegurar una buena digestión.

Los lagartos de marzo seleccionaron temperaturas corporales selectas más bajas

durante horas de la mañana. Probablemente esta variación diaria de la temperatura corporal

34

selecta podría deberse a que los lagartos en esta época del año forrajean durante horas de la

tarde (de 13 a 20 hs.) donde las temperaturas son mayores y quizás la disponibilidad de

alimento también. Por otro lado, la selección de temperaturas más bajas durante la mañana

les permitiría resguardar el alimento ya al disminuir su tasa metabólica desciende también

el gasto energético.

Los lagartos capturados en marzo, están por entrar en un periodo de aletargamiento.

La selección de temperaturas elevadas en lagartos alimentados, podría ser explicada por la

necesidad por fijar una mayor cantidad de reservas en forma de grasa, antes de que llegue el

periodo de baja disponibilidad de recursos alimenticios. Los lagartos ayunados se

ahorrarían de perder las bajas reservas de grasa presentes en su cuerpo, seleccionando

temperaturas corporales más bajas.

En este estudio, se les presentó a los lagartos un conflicto entre termorregulación y

alimentación, donde se vieron expuestos a riesgos de supervivencia y/o fecundidad. Hacer

un correcto análisis de los costos y beneficios de la termorregulación requiere un gran

esfuerzo por el hecho de que los organismos utilizan diversos mecanismos para

termorregular y cada uno tiene su costo particular (Lustick, 1983; Chappell y Whitman,

1990).

Actividad enzimática en intestino delgado y páncreas No se hallaron diferencias significativas entre las concentraciones de enzima

tripsina presentes en las porciones de intestino delgado analizadas. En apariencia, la

aclimatación a diferentes temperaturas no tuvo ningún efecto sobre la actividad enzimática

intestinal de los lagartos. Estudios similares realizados en especies pertenecientes a los

35

géneros Dipsosaurus, Uma, Anolis y Gerrhonotus, encontraron que si existía un máximo de

actividad en una enzima fosfatasa alcalina a altas temperaturas (Licht, 1964).

Volviendo a este trabajo, en el tejido pancreático se observó una mayor actividad

enzimática a los 40°C, mostrando una diferencia significativa con la actividad obtenida a

los 15°C.

Esta variación solo observada en páncreas, tiene lógica funcional, ya que este

órgano es el encargado de sintetizar y almacenar esta (y muchas otras) enzimas digestivas

(Hill et al., 2004). Estos resultados, podrían indicar que a bajas temperaturas, la actividad

de tripsina es escasa o nula, debido a que estaría por debajo del óptimo térmico requerido

por la enzima (Müller-Esterl, 2008).

Aparentemente, el aumento de la temperatura conlleva un aumento en la secreción

de tripsina en el páncreas de los lagartos. Se ha observado este incremento de la actividad

enzimática relacionado con la temperatura en reptiles, ya en estudios muy tempranos, como

los realizados por Riddle (1909) en una tortuga del género Emydoidea.

Probablemente la selección de temperaturas mayores durante el ayuno, observada en

los lagartos durante el mes de octubre, los prepararía para la digestión de presas

potencialmente capturadas. El ascenso térmico corporal, registrado en los lagartos

alimentados en marzo, favorecería la digestión de las presas ingeridas durante el forrajeo

(Stevens y Hume, 2004).

También se podría inferir que, a bajas temperaturas se ve desfavorecido el

movimiento peristáltico muscular. Este consiste en movimientos rítmicos, ondulatorios y

automáticos, realizados por el sistema digestivo para hacer avanzar la comida (Hill et al.,

2004). El peristaltismo empieza en el esófago y empuja el bolo alimenticio hacia el

estómago, donde las contracciones musculares y los jugos gástricos ayudan a desmenuzar

36

la comida (Hill et al., 2004). En estudios llevados a cabo en lagartos del género Varanus y

Ctenosaura (Mackay, 1968), se corroboró que las temperaturas corporales elevadas

incrementaban la amplitud y frecuencia de las contracciones peristálticas.

El ascenso de actividad enzimática observado en páncreas, conforme a la

temperatura tiene un límite, pues las altas temperaturas extremas implican un estrés físico

que superan todo efecto positivo en las tasas catalíticas (Angilletta, 2009).

Son necesarios más estudios para entender la variación en el efecto termodinámico.

Hasta ahora, la mayor parte de la evidencia encontrada, sugiere que los organismos se

benefician de la adaptación a altas temperaturas, combinado con una precisa

termorregulación (Angilletta, 2009).

Concentración de proteínas totales y albúmina La albúmina aporta la fuente de aminoácidos esenciales requeridos por el páncreas

para sintetizar enzimas. Como son esenciales, solo llegan al cuerpo de manera externa. Una

deficiencia en la concentración de albúmina plasmática se vería reflejada en una

interrupción de la síntesis enzimática (Blanco, 2006).

No se encontraron diferencias significativas entre los niveles séricos de proteínas

totales y albúmina en los lagartos aclimatados a distintas temperaturas. Esto indicaría que

los individuos de los tres grupos estarían en las mismas condiciones nutricionales (Blanco,

2006). De este modo, se suprimió una posible variable de error en los resultados de

actividad enzimática obtenidos.

37

Conclusiones Generales

Este trabajo contribuye a la comprensión de aspectos termorregulatorios

(comportamentales y fisiológicos) de una especie típica de la Ecorregión del Monte, como

lo es Liolaemus darwinii. Conocer el rol que juega la temperatura en una función

fisiológica como la digestión, permite predecir cómo se verían alteradas otras funciones

como el crecimiento, la reproducción, la fecundidad, entre otros.

La especie L. darwinii es un buen modelo representativo del género Liolaemus, por

su similitud con un gran número de lagartos emparentados, pertenecientes a este género tan

diverso y por su alta plasticidad fenotípica. Los resultados obtenidos con este modelo,

permitirían hacer inferencias sobre los resultados esperados en trabajos futuros.

La Ecorregión del Monte posee escasas precipitaciones anuales y una marcada

estacionalidad. Si nos paramos frente a un escenario de inminente cambio climático, las

especies de flora y fauna presente en regiones desérticas, son más vulnerables ya que están

sujetas a una gran amplitud térmica. Un pequeño cambio en la temperatura media anual en

la región, podría provocar el desplazamiento de las especies más íntimamente relacionadas

y dependientes de la temperatura ambiente.

Para el caso de la medición de la temperatura corporal selecta, en el mes de octubre

obtuvimos resultados inversos a los esperados, pero en el mes de marzo, los lagartos

mostraron un comportamiento coincidente con la mayor parte de la bibliografía analizada

en este trabajo.

Sería interesante evaluar qué ocurre en los meses intermedios, e incluso, en las

épocas del año que se encuentran inactivos.

38

Respecto a los análisis de actividad enzimática, los resultados obtenidos fueron

lógicos y compatibles con lo esperado. Aclimatar a los animales a temperaturas más altas

(cercanas a la crítica), nos llevaría a visualizar el punto de inflexión por sobre el cual la

actividad enzimática ya no es favorecida por el ascenso térmico, y podría tener

consecuencias letales.

39

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