dna marker

Kỹ thuật DNA Marker 1

DNA MARKER °¨¨°º°¨¨°

Nhóm thực hiện:

1. Trần Như Khoa 2. Nguyễn Duy Lan 3. Nguyễn Thị Bích Liễu 4. Lê Hoàng Lâm 5. Nguyễn Thị Kim Ngân 6. ðặng Thị Ái Trinh

Nội dung

� Khái niệm DNA marker. � Các kỹ thuật: 1. Kỹ thuật RFLP (Restriction fragment length polymorphism). 2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism). 3. Kỹ thuật RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA). 4. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat).

DNA MARKER � Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào ñược dùng ñể phân biệt hai cá thể, hai dòng hoặc hai

giống khác nhau ñều có thể ñược xem như một DNA marker. Các DNA marker có thể chia thành hai nhóm: -Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP, minisatellite. -Marker dựa trên sự khuếch ñại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR, SSCP, RAPD.

� Dựa trên kiểu hình có thể phân loại DNA marker thành 2 loại: -Marker ñồng trội: là những marker có thể phân biệt ñược cá thể ñồng hợp tử và cá thể dị hợp tử, ñó là các marker allozyme, microsatellite, PCR nhân RFLP. Trong trường hợp này tần số alen có thể ñược tính trực tiếp từ dữ liệu kiểu gen. -Marker trội: RAPD marker không thể phân biệt những cá thể ñồng hợp tử và cá thể dị hợp tử.

Marker Tên ñầy ñủ

RFLP Restriction fragment length polymorphism ALP Amplicon length polymorphism

AFLP Amplified freagment lenth polymorphism

RAPD Random Amplification Polymorphic DNA

DAF DNA amplification fingerprinting

SSR Single sequence repeat (microsatellite)

AP-PCR Arbitrary primer-PCR

SSCP Single strand conformation polymorphism

MRDHV-DNA Moderately repeated, dispersed and highly variable DNA (minisatellite)


Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

ðịnh nghĩa: � Kỹ thuật phân tích RFLP (ñọc là / ri-flip/- viết tắt của Restriction Fragment Length

Polymorphism) � RFLP ñược ñịnh nghĩa là tính ña hình chiều dài các phân ñoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự

khác nhau về kích thước các phân ñoạn ñược tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay ñổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác.

Nguyên tắc

� Dựa trên ñộ ñặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (RE) ñối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen.

� DNA bộ gen sẽ ñược cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy ñiện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (ñược ñánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus ñặc biệt.

� Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân ñoạn cắt khác nhau.


T-RFLP method


Ưu và nhược ñiểm

� Ưu ñiểm : � Là marker ñồng trội cho phép phân biệt ñược cá thể ñồng hợp và dị hợp. � Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều ñủ

ñáp ứng nhu cầu nghiên cứu. � Hạn chế:

� Do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm ñối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ ñánh dấu).

� DNA yêu cầu có chất lượng cao.

Ứng dụng 1.Xác ñịnh thông tin di truy ền: Schematic for RFLP by cleavage site loss.

2.Phân tích cấu trúc di truy ền DNA ứng dụng trong Y pháp nhận dạng :

Từ những năm 30s dấu vân tay ñược ñưa vào ứng dụng trong Y Pháp (Forensics) và trở thành một công cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm của cảnh sát hình sự và thám tử ñể nhận dạng. Tuy nhiên dấu vân tay bộc lộ nhiều khiếm khuyết một khi áp dụng trong thực tế. Chẳng hạn, dấu vân tay thông thường chỉ có thể lấy mẫu ñược từ các ñầu ngón tay mà thôi. ðã thế ngày nay nó không còn ñặc hiệu cho từng cá thể nữa từ khi phẫu thuật chỉnh hình phát triển mạnh, người ta có thể chủ ñịnh thay ñổi dấu vân tay qua phẫu thuật. Chỉ trong vòng trên dưới 50 năm từ khi cấu trúc chuỗi di truyền DNA ñược Watson và Crick công bố [1], ngành sinh học phân tử ñã phát triển mạnh mẽ và ñược ứng dụng rộng rãi. Một trong những ứng dụng quan trọng của sinh học phân tử là sử dụng ñặc tính của cấu trúc chuỗi di truyền DNA của từng cá thể vào trong Y pháp ñể nhận dạng ñối tượng coi như là một cuộc cách mạng trong Y học hình sự của nhân loại.

Tương tự như dấu vân tay, mỗi một con người ñều có một ñặc trưng riêng về cấu trúc di truyền của mình, ñược xác ñịnh bằng chuỗi di truyền DNA.

Cấu trúc của DNA [1], và"ñiểm chỉ" DNA: ðặc tính của tất cả các sinh vật, kể cả con người, ñều ñược cấu tạo từ ñơn vị căn bản nhất là tế bào, từ nguyên thuỷ là hợp tử ñược thụ tinh bởi trứng và tinh trùng. Về phương diện sinh học phân tử, mỗi tế bào của cơ thể (trừ hồng cầu) ñều có nhân, trong nhân chứa các chất liệu di truyền, nhiễm sắc thể (chromosome) quyết ñịnh cấu trúc ñặc tính cho mỗi cá thể. Con người có 23 bộ nhiễm sắc thể (22 ñôi thường và một ñôi xác ñịnh giới tính). Các nhiễm sắc thể này ñược tạo bởi các chuỗi chất liệu chứa ñựng thông tin di truyền DNA (viết tắt của từ DeoxyriboNucleic Acid) thừa kế từ cha và mẹ. Mỗi cá thể sống nhận chất liệu DNA 50% từ cha và 50% từ mẹ.

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:RFLPDemo1.gif

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:RFLP_genotyping.gif


Có thể hình tượng cấu trúc phân tử của một DNA như là một cái phéc-mơ-tuya (zip), mỗi răng kéo là một trong bốn khối chất liệu căn bản, viết tắt bằng các ký tự A (adenine), C (cytosine), G (guanine), và T (thymine), mà mỗi một ký tự ñó gọi là một nucleotide, chúng cũng ñứng song ñôi như các răng kéo của phéc-mơ-tuya theo cặp cố ñịnh A-T hoặc G-C. Thông tin chứa ñựng trong DNA ñược xác ñịnh cơ bản bằng chuỗi tiếp nối các ký tự này dọc theo cái "phéc-mơ-tuya" di truyền ñó. Các 'ký tự' này ñứng theo một thứ tự và một số lượng nhất ñịnh ñể tạo thành ñơn vị lớn hơn gọi là gien. Nhiều gien nối lại với nhau tạo thành nhiễm sắc thể. Theo ước tính mới nhất, con người có khoảng 35000 bộ gien. Trong ñó chỉ có 1% số lượng gien ñóng vai trò chức năng (thí dụ như gien quy ñịnh màu da, tóc v.v..), 99% còn lại là những gien không có chức năng, các gien này rất ña dạng, khác nhau ở từng cá thể. Cho nên chẳng thể có người nào giống người nào về cấu trúc di truyền DNA cả, trừ ñó là người sinh ñôi cùng trứng. 'Hồ sơ' DNA (tạm dịch từ DNA profiling) là một phần nhỏ trích từ cấu trúc toàn bộ của chuỗi DNA (của một cá thể), tức là các bộ gien và thuộc phần gien không có chức năng, ñủ ñể phản ánh ñặc thù riêng nhất của mỗi cá thể không lẫn lộn với người khác. Và cũng từ ñó mà thuật ngữ "ðiểm chỉ" DNA (tạm dịch từ DNA fingerprint)- cũng chính là 'hồ sơ DNA', do một nhà Di truyền học người Anh, Alec Jeffreys ñề xuất, ñể nói lên một ñặc trưng duy nhất cho mỗi cá thể giống như là dấu vân tay (hay ñiểm chỉ). 'ðiểm chỉ' DNA là hoàn toàn giống nhau ở tất cả các tế bào, tổ chức mô, tạng phủ trong một cơ thể; và ñiểm chỉ DNA không có thể thay ñổi ñược bằng bất cứ hình thức nào với tri thức của nhân loại hiện nay.

Về nguyên lý nhận dạng cá thể sống bằng DNA rất ñơn giản, ñó là nguyên lý so sánh và ghép cặp. ðối với nhận dạng vết tích thì người ta ñem mẫu DNA của vết tích so sánh với mẫu DNA dự trữ hoặc với các mẫu nghi ngờ. ðối với việc nhận dạng quan hệ huyết thống (cha mẹ chẳng hạn), người ta ñem so sánh DNA của cha, mẹ với cá thể ñó ñể xem có quan hệ di truyền hay không. Nói nôm na là như biển số ñăng ký xe. Mỗi một chiếc xe có một biển số riêng, người ta có thể dựa vào hồ sơ ñăng ký có thể xác ñịnh chính xác chủ nhân hiện thời của chiếc xe ñó, tương tự mỗi chủ nhân có một thẻ ñăng ký xe, khi mất xe họ có thể dùng số ñăng ký ñó ñi truy tìm chiếc xe ở ñâu. Kỹ thuật nhận dạng bằng DNA cũng y như vậy nhưng ñiều ñặc biệt là DNA không thể thay ñổi ñược, và nó 'ẩn' bên trong cơ thể, phải dùng các phương pháp kỹ thuật nhất ñịnh ñể có thể ñọc ñược nó mà thôi.

Tuy nhiên như ñã trình bày vì cấu trúc di truyền DNA ñầy ñủ của mỗi một cá thể rất phức tạp, người ta không thể và không cần thiết phải sử dụng toàn bộ 35 nghìn bộ gien ñể ñi phân tích, so sánh. Do ñó chỉ sử dụng những bộ gien (khoảng chừng 12 gien hoặc ít hơn) hoặc các marker (ñoạn ñặc trưng) của các gien (không có chức năng) sao cho ñủ ñể ñặc trưng cho mỗi cá thể ñể phân tích mà thôi. Ứng dụng thực tế của công nghệ ñiểm chỉ DNA:

ðiểm chỉ DNA ñược ứng dụng trong cuộc sống hàng ngày với mục ñích: (a) Trong Y pháp, hình sự : ñể xác ñịnh quan hệ phụ hoặc mẫu hệ; ñể nhận dạng tội phạm cũng như loại trừ nghi can thông qua dấu vết của cơ thể ñể lại hiện trường; nhận dạng cá nhân, nạn nhân vô thừa nhận. (b) Trong Y học ñiều trị: ñể chẩn ñoán các bệnh về di truyền; phát triển các phương pháp ñể chữa các rối loạn về di truyền. (c) Trong các ngành khoa học khác: Như trong khảo cổ học; hoặc trong nông-lâm-ngư nghiệp dùng ñể vẽ bản ñồ gien (mapping), tạp giao, lai giống, chuyển gien, ñể nhận dạng dấu vết các loài thú quý hiếm. Một trong ứng dụng mới nhất của công nghệ phân tích ñiểm chỉ DNA trong nông nghiệp là ñể bảo vệ tác quyền thương mại các sản phẩm, hay giống lai tạo mới.

Tuỳ theo các mục ñích khác nhau mà người ta tiến hành cách thức thu thập mẫu ñể có ñược chuỗi DNA cơ bản ñầu tiên ñể phân tích khác nhau. Trong ứng dụng nhận dạng con người các mẫu thu thập cũng tuỳ theo yêu cầu mà có thể lấy mẫu máu, tóc, lông, da v..v ñặc biệt trong nhận dạng tội phạm hình sự, mẫu thu thập rất ña dạng tuỳ theo tính chất sự kiện các dấu vết ñược ñể lại hiện trường.


Các kỹ thuật phân tích ñiểm chỉ DNA hiện hành [2]:Có nhiều kỹ thuật phân tích nhưng hai kỹ thuật thông dụng nhất hiện nay là:

Kỹ thuật phân tích RFLP (ñọc là / ri-flip/- viết tắt của Restriction Fragment Length Polymorphism) (tạm dịch là các ñoạn gien có ñộ dài giới hạn ña hình thái). Xuất phát từ thực tế là các ñoạn DNA chức năng và các ñoạn DNA không chức năng có thể tồn tại dưới nhiều hình thái khác nhau. Bằng cách sử dụng các enzyme ñặc hiệu, chẳng hạn Restriction enzyme, có thể cắt ra các ñoạn gien RFLP. Người ta ñã có thể nhận dạng ñược ñến vài nghìn loại RFLP, rất ñặc hiệu cho cơ thể.

Kỹ thuật phân tích PCR/STR (Polymerase chain reaction/Short Tandem Repeat) Tức là kỹ thuật dùng phản ứng chuỗi enzyme ña phân ñể 'khuếch ñại' các ñoạn gien ngắn có ñộ lặp ngắn theo thứ tự (Short Tandem Repeat, STR). Ở ñây polymesase tức là một loại enzyme có thể cho phản ứng tạo ra nhiều bản copy của một ñoạn DNA nào ñó; phản ứng chuỗi tức là một phản ứng diễn ra liên tục. Như vậy bằng kỹ thuật PCR có thể trong một thời gian ngắn tạo ra hàng triệu triệu ñến hàng tỷ bản copy của một STR. Kỹ thuật này còn ñược gọi là kỹ thuật "khuếch ñại DNA" hay "Photocopy phân tử" trong một lối nói rộng rãi hơn.

ðây là một kỹ thuật hiện ñại nhất hiện nay ñược dùng trong Y pháp DNA. Về mặt cơ bản kỹ thuật này cũng tiến hành tương tự như kỹ thuật RFLPs. Lợi ñiểm của kỹ thuật này so với RFLP là: - Mẫu thu thập không nhất thiết phải ñạt tiêu chuẩn cao, những mẫu lấy từ các mô bị huỷ hoại hoặc cháy bỏng nặng, xác thối rữa do chôn lâu ñều có thể dùng ñược, hoặc chỉ lấy các 'vi vết' như tàn thuốc lá, vết dính nước bọt, những mẫu bệnh phẩm bị trộn lẫn như máu của nạn nhân lẫn với máu hay dịch của phạm nhân.

Các ñặc ñiểm khác nhau về kỹ thuật cơ bản giữa PCR/STR vơi RFLP là: (a) Trong nhận dạng quan hệ huyết thống, nếu phân tích một gien bằng kỹ thuật RFLP chỉ có thể cho ra tối ña hai dị hợp tử (allele) và ba kiểu gien (genotype), trong khi ñó dùng kỹ thuật PCR ñể khuếch ñại số lượng gien này lên, thì có thể cho ra ñến 20 dị hợp tử và ñến (20x21)/2 kiểu gien, và vì thế kỹ thuật này cho phép ñánh giá chính xác hơn, (b) kỹ thuật PCR/STR gắn huỳnh quang rất tốt, nên rất dễ phát hiện tự ñộng, thuận lợi cho phân tích pháp y, bảo quản và dễ phục hồi số liệu.

Sau khi có các ñoạn gien cần thiết ñược cắt ñoạn, xếp theo kích thước, phân loại, thông qua hai kỹ thuật trên, các ñoạn DNA này ñược chuyển dạng, nhuộm màu hoặc gắn huỳnh quang và tạo thành các thanh (như các thanh mã (bar codes) trong các gói hàng bán trong siêu thị), và dùng ñể so sánh ñối chiếu. Tuy nhiên công nghệ DNA cũng như moị công nghệ khoa học khác, ưu ñiểm và nhược ñiểm vẫn luôn song ñôi với nhau.

Một số vấn ñề ñối với ñiểm chỉ DNA Kết quả sai lầm của ñiểm chỉ DNA không phải do sự trùng hợp giữa cấu trúc di truyền của

nhiều người mà do sai sót trong khâu kỹ thuật cũng như ñiều kiện tối ưu ñể cho ra kết quả chính xác. Ngoài ra kỹ thuật phân tích ñiểm chỉ DNA còn liên hệ ñến mặt ñạo ñức.

Thứ nhất phải kể ñến tình trạng nhiễm DNA ngoại lai, có khi bị nhiễm ngay trên kính hiển vi khi soi tiêu bản. Do ñó cần phải ñặt vấn ñề tiêu chuẩn chất lượng của phòng thí nghiệm phải ñạt yêu cầu. Ngay ở Mỹ cũng chỉ có 20 trên tổng số 60 phòng thí nghiệm làm DNA tiêu bản ñược Ban giám ñốc kiểm nhận phòng thí nghiệm của Hiệp Hội Tội phạm của Mỹ công nhận ñạt tiêu chuẩn mà thôi. Ở Úc, cho ñến 1991 vẫn chưa có một cơ quan kiểm nhận chất lượng các phòng thí nghiệm DNA nào [3], cũng như không có các chương trình kiểm tra chất lượng của nội bộ phòng thí nghiệm ñó.

Thứ hai, liên quan ñến kỹ thuật chọn mẫu, nhiều khi mẫu không ñại diện, không ñiển hình, hoặc mẫu bị thoái hoá. Tuy nhiên với kỹ thuật mới PCR/STR nêu trên có thể khắc phục ñược nhược ñiểm này, nhưng kỹ thuật này lại không cho ñộ chính xác cao.

Cũng trong vấn ñề phân tích kết quả, cần phải ñề cập ñến ñộ tin cậy của dữ kiện trong quần thể (population data). Ví dụ như FBI ñã xây dựng ñược một hệ dữ liệu thống kê quần thể tham khảo


cho các sắc dân da trắng, ñen, da màu và dân Á châu. Vấn ñề là ngay trong mỗi nhóm sắc dân ñó cũng có sự biến ñổi (chẳng hạn Á châu thì gồm ðông Á, Tây Á, ðông Nam Á v.v..). Xác suất ñể có thể khớp ñược một mẫu DNA với một mẫu trong quần thể tham khảo là rất thấp (1 phần 6 triệu!), do ñó xác suất này có thể cao hơn nếu dùng phụ nhóm của quần thể tham khảo (có thể tăng lên 1/800000). Một trở ngại khác liên quan ñến bằng chứng. Kết quả báo cáo của chuyên viên DNA ñược toà ghi nhận, thế nhưng lại không có bằng chứng cụ thể nào ñể xác nhận mẫu DNA ñó là sản phẩm lấy từ mẫu bệnh phẩm nguyên thuỷ cả.

ðiểm sau cùng trong tính phức tạp của kỹ thuật ñiểm chỉ DNA là liên quan ñến vấn ñề ñạo ñức và pháp lý. ðây là vấn ñề tranh cãi rất nhiều và chưa hoàn toàn thống nhất trong hệ thống pháp luật của nhiều quốc gia. Thứ nhất là về ngân hàng dữ liệu DNA tội phạm. Luật lệ nhiều nước gần như thống nhất là tội phạm hoặc như nghi phạm bắt buộc phải làm DNA. Còn những người bình thường thì không có cơ sở luật pháp bắt họ phải làm, như vậy về mặt dữ liệu sẽ bị thiếu hụt. Trong một số trường hợp những bệnh nhân bình thường, vì lý do gì ñó phải xét nghiệm DNA thì ñây là một trong những trường hợp nguy cơ kết quả DNA bị lạm dụng. Hoặc giả sử một trường hợp khác vừa liên quan ñến ñạo ñức, vừa luật pháp. Ví dụ một ñôi vợ chồng có một ñứa con bị bệnh Cystis Fibrosis (hay CF, dịch là bệnh xơ nang tổn thương chủ yếu là tuỵ tạng và phối) là một bệnh di truyền lặn, do ñó về di truyền thì bố mẹ phải có gien ẩn của bịnh này mới 'truyền' ñược cho ñưá con. Nhưng khốn thay, khi xét nghiệm ra thì chỉ có người mẹ mang gien lặn mà thôi. Vấn ñề ñặt ra là, liệu có nên thông báo cho người chồng của bà mẹ biết rằng ông không phải là bố của ñứa trẻ hay không? Và có nên thông báo cho cha chính thức của ñứa trẻ rằng chính ông có mang gien lặn của bệnh CF, về mặt di truyền ông không nên cưới vợ có cùng mang gien lặn bệnh như ông nữa, hay không?

ðiểm chỉ DNA và vụ thảm hoạ hoả hoạn ở ITC thành phố HCM tháng 10/2002: Áp dụng của ñiểm chỉ DNA trong nhận dạng tử thi của thảm hoạ hoả hoạn vừa mới xảy ra trong hạ tuần tháng 10 vừa qua tại ITC, thành phố HCM [4], theo báo cáo của nhà chức trách thì có 60 người tử vong, do sự huỷ hoại của lửa, 7 tử thi không có khả năng nhận dạng. Giới chuyên môn có thẩm quyền có hứa hẹn sẽ thu mẫu làm ñiểm chỉ DNA cho các trường hợp ñó. Vậy ta có quyền hy vọng không? Câu trả lời là hoàn toàn có thể nếu dưạ trên bài tổng quan trên ñây. Thực sự nhận dạng cá thể trong trường hợp này không hoàn toàn phức tạp như truy tìm dấu vết tội phạm. Các bước cần phải làm là chỉ cần thu mẫu mô bệnh phẩm, rồi lấy mẫu của thân nhân có người mất tích nghi ngờ trong vụ hoả hoạn. Chế khắc nhược ñiểm của mô bị cháy, nhiễm bẩn thì kỹ thuật phân tích PCR/STR hoàn toàn có khả năng. Vấn ñề chỉ còn là kinh phí và khả năng thực hiện kỹ thuật.

Về mặt thực tế, giới chuyên môn Phillipines ñã thành công trong việc ứng dụng công nghệ ñiểm chỉ DNA ñể nhận dạng các nạn nhân trong một vụ thảm hoạ hoả hoạn [5] tại một trại mồ côi ở Paco, Manila năm 1998. Vụ hoả hoạn này ñã cướp ñi ít nhất là 28 sinh mạng, trong ñó hầu hết là trẻ em. ðiều phức tạp là tất cả những thi thể ñã gần như cháy thành than ngoài khả năng nhận dạng cơ học, và các thi thể này vì lý do vệ sinh lúc ñó ñã ñược chôn cất ñến 3 tháng mới ñược khai quật ñể lấy mẫu. Vấn ñề ñạo ñức ñặt ra trong trường hợp này là sau vụ thảm nạn, nhiều bố mẹ trước ñó ñã từng gửi con vào trại mồ côi ở ñây, bây giờ không biết nạn nhân có phải là con của mình không, nếu nhận dạng ñược thì họ có thể làm ñược ñiều duy nhất họ có thể là nhang khói cho ñứa con xấu số của mình trong quá khứ họ không có khả năng nuôi dưỡng.

Mặc dù có một số nhược ñiểm, nhưng cho ñến nay ñiểm chỉ DNA vẫn ñược coi là công nghệ tối tân nhất trong khoa học nhận dạng cá thể ñặc hiệu và chính xác, do tính ñặc trưng duy nhất cho mỗi cá thể. ðiểm chỉ DNA ñã không những ñưa hình sự Y pháp lên một bước tiến mới mà nó còn ñược ứng dụng rộng rãi trong các ngành khoa học khác, kể cả ứng dụng trong nghiên cứu tế bào mầm và tạo sinh vô tính. 3.Xét nghiệm phát hiện quan hệ huyết thống, truy tầm tông tích, phát hiện thủ phạm.


Một người da ñen (gọi là "X") sinh tại Anh ñã bỏ qua sống với cha của mình tại Ghana. Sau ñó anh ta xin qua trở lại Anh ñể sống với mẹ (gọi là "M") và ba người anh chị em ruột của mình thì bị từ chối cho nhập cảnh vì người ta nghi ngờ ñã bị thay thế bởi một người cháu hay một người không thân thuộc gì với bà mẹ. Câu chuyện từ chối visa nhập cảnh này xảy ra vào năm 1985, lúc này xét nghiệm dấu ấn protein (protein markers) ñã ñược thực hiện và xác ñịnh ñược bà mẹ có liên hệ với "X?", tuy nhiên không thể loại trừ ñược M là cô hay dì của "X?". Thắc mắc trên tưởng chừng bế tắc, không có cách giải quyết, nhưng may mắn Jeffereys và các cộng sự ñã ñược nhờ ñến và lần ñầu tiên xét nghiệm dấu ấn DNA ñược áp dụng trong trường hợp này. Kết quả xét nghiệm ñã xác ñịnh ñược ñúng "X?" chính là "X" vì "X?" có mang các dấu ấn DNA từ M, ñồng thời có chung các dấu ấn DNA với những ñứa con của "M" thừa hưởng từ người cha. Vậy dấu ấn DNA là gì? Nguyên tắc hoạt ñộng của các xét nghiệm dấu ấn DNA như thế nào? Những tiến bộ và các phạm vi ứng dụng hiện nay của xét nghiệm dấu ấn DNA ra sao? DNA bộ gen người của chúng ta có ñến 30% chứa các trình tự base lặp lại và hầu như không mang những mã có ý nghĩa chức năng. Cũng như các trình tự base có ý nghĩa chức năng (gọi là gen), các trình tự base lặp lại này ñược di truyền từ cha mẹ sang con cái theo ñịnh luật phân ly ñộc lập của Mendel. Tuy nhiên khác với gen, rất khó tìm thấy sự khác biệt về trình tự base của gen giữa các cá nhân, có nhiều trình tự base lặp lại có thể giúp phân biệt ñược cá nhân này với các nhân khác, không những thế, có thể giúp tìm xem họ có quan hệ huyết thống với nhau hay không? Các trình tự base lặp lại này ñược gọi là các dấu ấn DNA. Có hai loại dấu ấn DNA hiện ñang ñược dùng trong xét nghiệm dấu ấn DNA là: Các tiểu vệ tinh (minisatellite) Ðó là các trình tự base lõi lặp lại, gọi là các tiểu vệ tinh VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats = Số lượng thay ñổi các trình tự base lặp lại), có các kích thước thay ñổi từ 1.000 base (1 KB) ñến 30.000 base (30 KB). Các VNTRs này hiện diện rải rác tại nhiều vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh ña vị trí (multilocus minisatellite); Hay chỉ có tại một vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh ñơn vị trí (single-locus minisatelite). Xét nghiệm dấu ấn DNA mà Jeffereys thực hiện năm 1985 là xét nghiệm phát hiện các tiểu vệ tinh ña vị trí bằng kỹ thuật phát hiện sự ña hình về chiều dài các ñoạn DNA của bộ gen bị cắt bởi men cắt hạn chế (Restriction Fragments Lenght Polymorphism = RFLP). Kỹ thuật này ñược tóm tắt như sau (hình 1): (1) Trước hết mẫu máu ñược lấy từ những người cần thử nghiệm ñể tách ñược bạch cầu, sau ñó ly trích toàn bộ bộ gen nguyên vẹn của bạch cầu trong các mẫu thử nghiệm; (2) Cắt ñoạn các bộ gen ñã ly trích này bằng men cắt hạn chế, là một loại men cắt nhận diện ñược 4 trình tự base ñặc hiệu, nhờ ñó cắt ñoạn ñược bộ gen thành những mảnh DNA dài ngắn khác nhau, trong ñó có những mảnh chứa các trình tự base lặp lại; (3) Ðiện di mẫu thử nghiệm ñể phân tách các ñoạn DNA này trên thạch agarose, sau ñó chuyển các ñoạn DNA trên thạch này qua một màng nylon bằng kỹ thuật thấm Southern (Southern blotting); (4) phát hiện vị trí các trình tự base lặp lại trên màng nylon bằng cách lai với một trong những dò DNA ñánh dấu ñồng vị phóng xạ và ñặc hiệu cho các trình tự base lặp lại này. Trong thử nghiệm, Jeffereys ñã thiết kế 2 dò DNA có mã số là 33.6 và 33.15. Kết quả xét nghiệm ở trường hợp trên ñã cho thấy "X?" có 61 vị trí của trình tự lặp lại ñặc hiệu với hai loại dò 33.6 và 33.15, và tất cả 61 vị trí này ñều thấy hiện diện ñược trên M (do "X?" ñã di truyền ñược từ "M") hoặc trên 3 người con của "M" (do "X?" và họ ñã di truyền ñược từ cha mình, tức là chồng của "M" dù không có mẫu thử nghiệm lấy từ ông này). Xét nghiệm phát hiện các tiểu vệ tinh ña vị trí, vì dùng kỹ thuật RFLP, nên ñược gọi ngắn gọn là xét nghiệm RFLP. Xét nghiệm này ñược dùng khá nhiều trong xác ñịnh quan hệ huyết thống. Xin dẫn thêm một trường hợp bị chứng minh loạn luân tại Anh (ảnh 1). Kết quả xét nghiệm RFLP cho thấy mẹ ñứa bé là "D" và cha của nó là "F" có ñến 62% các vạch vị trí của tiểu vệ tinh ña vị trí trùng nhau; ñồng thời "F" và "B" lại có ñến 78% các vạch trùng nhau. Chính nhờ vậy mà ñã xác ñịnh ñược chẳng những "F" là cha của "D" ñồng thời cũng là cha của "B", có nghĩa là "F" vừa là ông ngoại, vừa là cha của "D". Tuy nhiên xét nghiệm RFLP có một hạn chế là phải có mẫu thử nhiều tế bào ñể


có thể trích ñược bộ gen nguyên vẹn (phải lấy không dưới 10ml máu ñể tách ñủ bạch cầu dùng trong ly trích bộ gen). 4.Phân tích ña dạng di truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola Wei gây bệnh trrên cây cao su (Hevea brasiliensis) bằng phương pháp RFLP – PCR. (VŨ THỊ QUỲNH CHI . ðại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng 09/2005. Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN, ThS. PHAN THÀNH DŨNG.) Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su là một bệnh mới do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra nhưng có tác hại rất lớn ñến nền kinh tế của nhiều nước, ñặc biệt là những nước sản xuất cao su thiên nhiên. Triệu chứng biểu hiện của bệnh hiện nay rất biến thiên và dễ nhầm lẫn với các bệnh về lá khác. Do ñó tìm hiểu phương pháp chẩn ñoán, phát hiện nhanh bệnh Corynespora cũng là cách giúp khống chế bệnh nhanh hơn, trước khi bệnh lây lan. Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy, nấm C. cassiicola có sự phân hóa trong cùng loài, C. cassiicola trên các dòng vô tính cao su khác nhau có sự khác biệt về di truyền, nhờ ñó có thể nhận biết C. cassiicola qua khả năng gây bệnh cho các dòng vô tính cao su khác nhau. Việc nghiên cứu ña dạng di truyền của nấm C. cassiicola trên cây cao su ở nước ta là một việc làm cần thiết nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa sự ña dạng di truyền của C. cassiicola với tính kháng của một số dòng vô tính cao su ñang ñược trồng ở Việt Nam. Kết quả ñạt ñược :

• Nhận diện ñược triệu chứng ñặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su. • Thu thập mẫu bệnh trên 32 dòng vô tính cao su khác nhau, tiến hành quy trình chẩn ñoán và

phân tích ña hình vùng ITS của nấm C. cassiicola bằng phương pháp RFLP – PCR trên 7 dòng vô tính.

Qua phân tích ñi ñến kết luận: • Quy trình phản ứng PCR ñối với nấm C. cassiicola của Silva và cộng sự (1998) có thể sử

dụng ñể nghiên cứu vùng ITS nấm C. cassiicola ở Việt Nam. • Chẩn ñoán bệnh Corynespora bằng cách nhận diện sản phẩm khuếch ñại vùng ITS sử dụng

cặp primer ITS A và ITS B là không hiệu quả, sản phẩm thu nhận ñược không ñặc trưng cho nấm C. cassiicola

• Không tìm thấy bất cứ sự ña hình nào trong vùng ITS của các mẫu nấm nghiên cứu khi sử dụng phương pháp RFLP – PCR với các enzyme cắt giới hạn EcoRI, CfoI, MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI.

• Các mẫu nấm ñược dùng trong phân tích có thể thuộc cùng một chủng nấm C. cassiicola và ñây có thể là chủng duy nhất gây bệnh trên cây cao su ở Việt Nam hiện nay

Amplified Fragment Length Polimorphism (AFLP)

Khái niệm � AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism) là sự ña hình chiều dài các ñoạn DNA ñược khuếch ñại chọn lọc, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. � 1975 Vos và cộng sự ñã phát minh ra kỹ thuật này. � 1993 Vos và Zabeau cho ra protocol ñầu tiên cho kỹ thuật AFLP nhấn mạnh sự quan trọng của việc làm thuần khiết hai enzyme sử dụng (EcoRI và MseI), sau ñó là chuẩn bị adapter và thiết kế primer một cách thận trọng. Ngày nay nó ñược cải tiến khán nhiều với những công dụng như sau:

- Công cụ có hiệu quả phát hiện tính chất ña hình. - Xây dựng bản ñồ di truyền có mật ñộ cao của genome.


- Xây dựng bản ñồ DNA marker có hiệu quả nhất so với những marker khác (Vos và cộng tác viên. 1995). - Khám phá ra những clone genome, vd YAC. - Fingerprinting các ñoạn DNA ñã ñược cloned như cosmid, P1, BAC, YAC (Vos và cộng tác viên. 1995)

� AFLP marker dựa trên sự khuếch ñại DNA bằng kỹ thuật PCR. � AFLP là một marker trội. -Marker tr ội: marker không thể phân biệt những cá thể ñồng hợp tử và cá thể dị hợp tử.

Kỹ thuật AFLP Nguyên tắc của kỹ thuật AFLP giống như RFLP, ñiểm khác biệt cơ bản là AFLP không cần tiến hành lai phân tử (lai Southern blot), do vậy thực hành nhanh.

1. NÔI DUNG CƠ BẢN CỦA PHƯƠNG PHÁP 1.1. Cắt DNA bằng RE có bổ sung các adaptor ñặc hiệu tạo nên các ñoạn có ñầu mút giống nhau, ñặc trưng cho các mồi ñã chọn trước. 1.2. Nhân ñoạn DNA bằng kỹ thuật PCR ngắt quãng với hai loại mồi khác nhau.

2. QUI TRÌNH THỰC HIỆN AFLP: 4 bước

1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA. 1.2. Cắt các mẫu DNA nghiên cứu bằng cặp RE chọn lọc có bổ sung các adaptor (trình tự nối mạch ñôi- ðoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự ñặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. ) phù hợp. 1.3. Tiến hành PCR ngắt quãng với hai loại mồi ñặc hiệu primer 1+1 nucleotid và primer 2+ 2 nucleotid. 1.4. Phân tích kết quả bằng các phần mềm thông dụng, lập dendrogram ñể xác ñịnh sự khác biệt di truyền và ña dạng sinh học các mẫu nghiên cứu.


Ứng dụng So sánh ña hình AFLP giữa hai nhóm cá thể cá tra (pangasius hypophthalmus) có trọng lượng phân biệt. NGUYÊN LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu: Mẫu cá tra ñược thu từ trung tâm Cái Bè – Tiền Giang, ñược bảo quản trong cồn 700, ở 40C cho ñến khi sử dụng (Mẫu do Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I cung cấp). Từ 282 mẫu cá, chọn 10 mẫu


có trọng lượng lớn nhất (trung bình là 3,9 gam) và 10 mẫu có trọng lượng nhỏ nhất (trung bình là 2,2 gam). Tách chiết DNA: DNA cá tra ñược tách chiết chủ yếu theo Fetzner [3]. Cụ thể: khoảng 50 mg mẫu ñược rửa sạch cồn bằng 0,9 ml ñệm TLE (10 mM Tris; 0,1 mM EDTA; pH 8.0). Thêm vào 0,9 ml ñệm phá tế bào (10 mM Tris; 100 mM EDTA; 2% SDS, pH 8.0). Bổ sung 5µl enzyme protease K (20 mg/ml), ủ 550C trong 14-16 giờ. ðể mẫu ở nhiệt ñộ phòng và bổ sung 4µl RNAase A (10mg/ml), ủ 370C trong 30 phút. Thêm vào 0,3 ml dung dịch kết tủa protein (7,5 mM Ammonium Acetate), trộn ñều và ủ trong ñá 30 phút. Ly tâm 2 lần ñể loại tủa protein và thu dịch DNA. Kết tủa DNA bằng 0,9 ml isopropanol, ñể -200C trong 3 giờ, ly tâm thu tủa DNA. Rửa DNA bằng 0,75 ml cồn 700 . Hòa tan DNA trong 100µl ñệm TLE. Bảo quản ở 40C ñể sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Kỹ thuật AFLP: AFLP cơ bản ñược tiến hành theo Liu và cs [6]. Các bước chính của phương pháp ñược tóm tắt như sau: DNA ñược cắt bằng 2 enzyme EcoRI và MseI: 300 ng DNA, 3U enzyme EcoRI và MseI ở 370C trong 2 giờ. Sau ñó, các ñoạn DNA cắt ra ñược gắn vào các adapter của EcoRI và MseI nhờ enzyme T4 DNA ligase trong 3 giờ ở 200C. Các ñoạn DNA tạo ra trước hết ñược khuếch ñại bằng PCR sử dụng mồi tiền chọn lọc (preselective primer) sau ñó là mồi chọn lọc (selective primer)

Bảng 1: Trình tự các adapter và mồi ñược sử dụng trong phân tích AFLP Phân tích sản phẩm AFLP: sau PCR, một thể tích formamide dye ñược thêm vào phản ứng. Mẫu ñược biến tính bằng nhiệt ở 950C trong 3 phút, và ñặt ngay vào ñá. Sản phẩm AFLP ñược ñiện di trên gel polyacrylamide biến tính (19:1 acrylamide:bisacylamide; 7,5 M urea; 0,5 X TBE buffer ). Bản gel ñược cố ñịnh trong axit axêtic 10%, nhuộm trong bạc nitơrat 1%, hiện trong natricacbônat 2,5% và cố ñịnh lại trong axit axêtic 10% [1]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN DNA hệ gen từ hai nhóm cá tra có trọng lượng lớn và nhỏ ñược tách chiết. Kết quả ñánh giá trên ñiện di agarose cho thấy chất lượng DNA ñạt tiêu chuẩn cho các phân tích tiếp theo. ðể chuẩn bị khuôn DNA cho AFLP, DNA hệ gen ñược cắt ñồng thời bởi 2 enzyme giới hạn EcoRI có trình tự nhận biết 6 base pair (G(AATTC) và MseI có trình tự nhận biết 4 base pair (T(TAA). Thành công của kỹ thuật AFLP phụ thuộc vào sự cắt hoàn toàn của phản ứng cắt và chất lượng DNA. Các ñoạn DNA tạo ra ñược gắn với các adapter EcoRI và MseI ñể tạo thành khuôn cho phản ứng khuyếch ñại sau này, ñồng thời ngăn cản sự tái kết hợp giữa các ñoạn DNA vừa ñược tạo ra. Trước hết, một số ñoạn DNA tạo ra ñược nhân lên nhờ phản ứng PCR sử dụng mồi tiền chọn lọc


(PSP - preselective primers). PSP chứa các trình tự: i) bổ trợ với adapter; ii) bổ trợ với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn; iii) một nucleotid. Các ñoạn DNA mà nucleotid liền kề với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn bổ trợ với nucleotid của PSP sẽ ñược nhân lên (theo xác suất một phần tư số ñoạn DNA sẽ ñược nhân lên). Tương tự, các ñoạn DNA mà 3 nucleotid tiếp theo liền kề với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn bổ trợ với 3 nucleotid của mồi chọn lọc (SP - selective primers) sẽ ñược nhân lên. Theo xác suất qua 2 lần PCR, 1/256 số ñoạn DNA sẽ ñược nhân lên. ðối với các cá thể mang ñột biến tại các nucleotid bổ trợ với PSP và SP (so với mẫu chuẩn), các ñoạn AND sẽ không ñược nhân lên. Do ñó, trên bản ñiện di tại các vị trí trên không xuất hiện băng. 54 tổ hợp mồi ñược sử dụng ñể phân tích ña hình AFLP của hai nhóm cá tra có trọng lượng lớn và nhỏ. Mỗi tổ hợp mồi tạo ra từ 27 ñến 94 băng, trung bình là 55 băng trên một tổ hợp mồi. Trong ñó, cao nhất là tổ hợp mồi E-ACC/M-CAG: 94 băng/mẫu, và thấp nhất là tổ hợp mồi E-ACG/M-CTG: 27 băng/mẫu. Trong 54 tổ hợp mồi nghiên cứu, 11 tổ hợp mồi không tạo băng AFLP và 43 tổ hợp mồi tạo 204 băng AFLP. Tỷ lệ băng ña hình giữa các mẫu cá tra là 1,35% cho thấy sự ña hình AFLP giữa các mẫu trong cùng loài thấp. Kết quả này cũng phù hợp với phân tích của Liu và cs [6] tiến hành trên cá tra Mỹ (Ictalurus punctatus và Ictalurus. furcatus). Tỷ lệ băng ña hình trong cùng loài I. punctatus là 3,4 %, ở I. furcatus dao ñộng từ 1,7% -3,3% [6]. ða hình AFLP của tổ hợp mồi E-ACA/M-CAG giữa 2 nhóm cá lớn và nhỏ ñược thể hiện ở hình 1.

Hình 1. ða hình AFLP giữa nhóm cá lớn và nhóm cá nhỏ của tổ hợp mồi E-ACA/M-CAG 1,2: Băng AFLP xuất hiện ở cả 2 nhóm cá với tần số khác nhau

Tổng cộng có 204 băng AFLP ñược tạo ra từ 43 tổ hợp mồi, trung bình là 4,74 băng AFLP/mồi. Tần suất xuất hiện các băng AFLP ở hai nhóm cá tra là khác nhau nên chúng tôi ñã tính tần số khác biệt giữa hai nhóm. Kết quả ñược thể hiện ở bảng 2.

Bảng 2: Tần số khác biệt của các băng AFLP giữa hai nhóm cá tra


Những băng AFLP có tần số khác biệt trên 50% ñược thể hiện ở bảng 3.

Bảng 3: Các băng AFLP có tần số khác biệt trên 50 %.

Kết quả trên cho thấy, chỉ có 8 băng AFLP có tần số khác biệt trên 50%, chiếm 3,92% tổng số băng AFLP. ðể kiểm tra mức ñộ ổn ñịnh và tin cậy của các băng AFLP, chúng tôi ñã tiến hành phân tích các băng AFLP này với số lượng mẫu lớn hơn (18 mẫu). Kết quả cho thấy, băng AF 6-1 của tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT và băng AF 7-4 của tổ hợp mồi E- ACC/M-CAA ñạt ñộ chênh lệch giữa 2 nhóm cá thí nghiệm là 56% và 50%. Do có tính ổn ñịnh tương ñối, rõ nét và ưu thế cho nhóm cá có trọng lượng nhỏ, hai băng AFLP này ñược tách dòng và ñọc trình tự nhằm mục ñích xây dựng 2 chỉ thị AFLP liên quan tới tính trạng tăng trưởng của cá tra. KẾT LUẬN Phân tích ña hình AFLP cá tra bằng 54 tổ hợp mồi chọn lọc cho thấy tỷ lệ ña hình trong loài tương ñối thấp, trung bình 1,35%. Tuy nhiên, tỷ lệ này ñủ tin cậy trong việc xác ñịnh các chỉ thị liên quan tính trạng có ý nghĩa kinh tế. So sánh ña hình AFLP giữa 2 nhóm cá tra có trọng lượng 2 cực cho thấy 8 băng AFLP có tần số khác biệt trên 50%. Tuy nhiên chỉ có 2 băng: AF 7-4 của tổ hợp mồi E-ACC/M- CAA và AF 6-1 của tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT có tính ổn ñịnh, và vẫn giữ ñược tỷ lệ này khi kiểm tra trên số lượng mẫu lớn hơn. Hai băng này sẽ ñược sử dụng ñể tuyển chọn lại trong quần ñàn.

Ưu và nhược ñiểm - Ưu ñiểm.

AFLP nhanh, ñơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát ñược toàn bộ gen (kỹ thuật này kỹ thuật này ñòi hỏi ít lượng DNA ban ñầu, không cần biết trước trình tự ñích và ñộ lặp lại phản ứng cao, các mồi sử dụng không cần ñặc hiệu loài (các mồi thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài).


- Nhược ñiểm • AFLP là một marker trội, ñiều này làm hạn chế phân biệt cá thể ñồng hợp và dị hợp. • C và G trong primer càng nhiều, thì các DNA fragment ñược khuếch ñại càng ít. • Khích thước genome càng nhỏ, số fragment ñược khuếch ñại càng ít

Random Amplification Polymorphic DNA (RAPD) Khái niệm:

� RAPD (ñọc là "rapid") là chữ viết tắt của Random Amplification of Polymorphic DNA nghĩa là ña hình các ñoạn DNA ñược khuếch ñại ngẫu nhiên do William (1990), Welsh và cộng sự (1991) phát minh.

� Là phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm ñánh giá tính ña hình của các ñoạn DNA ñược nhân bản ngẫu nhiên.

Nguyên tắc � Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng như nguyên tắc phản ứng PCR thông thường. Tuy nhiên,

vì sử dụng mồi ngẫu nhiên nên nhiệt ñộ bắt cặp của mồi thấp ñể tạo ñiều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt.

� Nhiệt ñộ bắt cặp của phản ứng là 30oC-36oC. RAPD chỉ sử dụng các mồi oligonucleotide ñược tổng hợp ngẫu nhiên từ 9-12 base nên dễ dàng tìm ñược các ñoạn tương ñồng trên mạch ñơn DNA bộ gen . Các ñoạn mồi nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch ñối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách có thể khuếch ñại ñược (dưới 3000bp) sẽ cho ra những ñoạn DNA có kích thước khác nhau sau khi khuếch ñại. Tính ña dạng thu ñược nhờ RAPD là ñáng tin cậy, vì khi có sự thay ñổi một base nitơ nào ñó thì nó sẽ ngăn cản việc tiếp hợp giữa mồi và DNA mạch khuôn. Sự mất ñoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt ñiểm gắn mồi cũng như sự xen vào của một gen nào ñó sẽ làm thay ñổi kích thước ñoạn DNA ñược khuếch ñại. Tuỳ vào từng nhóm loài thực vật hay vi sinh vật mà các ñoạn mồi ngẫu nhiên ñược thiết kế ñặc dụng. Sản phẩm của PCR gồm nhiều ñoạn DNA có kích thước từ 2-100 bp. Kết quả sau khi ñiện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện ñược sự khác nhau trong phổ các ñoạn DNA ñược nhân bản. Sự khác nhau này ñược gọi là tính ña hình. Tính ña hình của các ñoạn DNA ñược phát hiện khi ñiện di sản phẩm PCR trên gel agarose hay polyacrilamid, sau ñó nhuộm ethidium và soi dưới ñèn tử ngoại. Tính ña hình của các mẫu RAPD-PCR là do sự thay ñổi một hoặc cả hai vùng gắn primer (ví dụ ñột biến ñiểm) hay là do những thay ñổi (thêm ñoạn, mất ñoạn, ñảo ñoạn) trong ñoạn DNA ñược nhân lên, gây ra sự thay ñổi về kích thước hay cản trở quá trình nhân lên của DNA này. Tính ña hình sẽ thể hiện thông qua sự có hay vắng mặt của vạch ñiện di tương ứng. Tính ña hình ñược nhận ra do: khi phân tích ña hình di truyền bằng kỹ thuật RAPD, nếu 2 cá thể có genome hoàn toàn giống nhau thì khi làm phản ứng PCR-RAPD với bất kỳ mồi nào cũng cho các băng giống nhau. ðoạn mồi ngẫu nhiên có thể bám vào bất cứ vị trí nào có trình tự nucleotide bổ sung trên phân tử DNA genome. Với ñặc ñiểm là ngắn nên xác suất ñoạn mồi có ñược ñiểm gắn trên phân tử DNA khuôn là khá lớn. Theo tính toán, một mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotide thì xác suất bắt cặp của nó là 1x410 = 1.048.576. Ở lúa, bộ DNA nhân ñơn bội có khoảng 550.000kb =550.000.000 bp.


Như vậy, với một mồi ngẫu nhiên có thể có 524 vị trí bắt cặp với mồi nghĩa là có thể có 262 ñoạn DNA ñược nhân bội. Do kỹ thuật RAPD chỉ sử dụng một loại mồi ñồng nhất cho cả 2 ñầu ñoạn DNA cần nhân bản, ngoài ra hai ñoạn mồi này phải kết cặp trên 2 sợi ñơn khác nhau của chuỗi DNA và phải “ñi” theo chiều hướng vào nhau nên xác suất trên sẽ phải nhỏ ñi nhiều. Xác suất này sẽ còn nhỏ hơn nữa do trong ñiều kiện thông thường kỹ thuật PCR chỉ tổng hợp ñược một ñoạn DNA không dài quá 5000 nucleotide dẫn ñến việc phản ứng PCR chỉ hiệu quả khi hai ñoạn mồi kết cặp với DNA genome ở vị trí không xa quá 5000 bp. Trong thực tế, số lượng này nhỏ hơn nhiều vì còn phụ thuộc vào ñộ dài của ñoạn ñược nhân bội và sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi trên DNA genome của lúa.

Quy trình thực hiện � Kỹ thuật RAPD ñược thực hiện theo các bước cơ bản sau: - Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR. - ðiện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid. - Xác ñịnh tính ña dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-PC,

GELCOMPAR, …). Các số liệu cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.

Ưu và nhược ñiểm

• RAPD là phương pháp phân tích nhanh, rẻ tiền hơn RFLP và chỉ sử dụng một lượng mẫu DNA rất nhỏ (25ng). Phương pháp này không ñòi hỏi việc phân lập và ñọc trình tự, cho phép phát hiện nhiều locus cùng một lúc.


• RAPD marker tỏ ra rất hiệu quả trong việc thiết lập bản ñồ gen của các cây họ tùng bách trong khi các RFLP marker không thể dùng cho mục ñích này bởi vì hàm lượng DNA trong các mô của các giao tử lớn rất thấp và sự ñòi hỏi thời gian dài ñể thu ñược quần thể F2.

• Mỗi primer cung cấp số liệu từ nhiều vị trí trong genom vì vậy những sai khác có tần xuất xuất hiện rất thấp giữa các mẫu có quan hệ gần gũi có thể ñược phát hiện nhanh hơn so với việc phân tích locus ñơn.

• Phương pháp này rất nhạy cảm với ñiều kiện phản ứng như chất lượng DNA, nồng ñộ muối ví dụ Mg2+ và tỷ lệ giữa mồi và ñoạn mẫu (template) và vì thế các kết quả không phải luôn trước sau như một.

• Các RAPD marker rất ít khi ñược sử dụng trong việc lập các bản ñồ gen so sánh và nhân dòng bởi tính ñặc thù thấp và không ổn ñịnh của chúng.

• Việc so sánh genom của những loài có quan hệ gần gũi ñòi hỏi các mẫu dò (probe) có thể nhận dạng các vùng ñồng dạng trong mỗi nhóm ñã phân loại.

• Tuy nhiên sự thiếu tính ñồng dạng giữa các genom lại cho phép các RAPD marker có thể dùng cho việc lập bản ñồ gen của các loài ña bội, trong khi các các mẫu copy ñơn của RFLP lại ñược lai với rất nhiều các trình tự và tạo ra các band khá phức tạp và do vậy rất khó xác ñịnh các allele thay thế.

• Việc sử dụng các marker rõ ràng ñể xác ñịnh các loci có một copy là rất cần thiết trong việc nhân dòng. Rất nhiều các trình tự ñược nhân lên nhờ PCR có chứa các ñoạn lặp lại rải rác và không thể dùng làm các mẫu lai.

• Các ñoạn mồi ngắn dùng ñể xác ñịnh các RAPD marker cũng nhân lên một vài trình tự từ các vùng không liên kết. Vì vậy các marker như vậy không thể sử dụng ñể ñánh giá các dòng từ các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men hay một thư viện mẫu thậm chí khi có sự liên kết gần gũi của chúng với gen ñã biết.

• Hiện tượng phát sinh tính ña hình giả ñôi khi cũng thấy khi phân tích RAPD do không chắc chắn các ñạon cùng kích thước từ hai mẫu DNA khác nhau có thực sự ñược tạo ra từ cùng một vị trí trên DNA của genome hay không.

• Sự di truyền tính trội và số lượng allele thấp cũng là những hạn chế của RAPD marker. Các marker trội chỉ mang ½ thông tin di truyền trong quần thể F2 cũng như các tính trạng ñồng trội. Một marker chỉ có ích cho chương chọn tạo giống khi chúng phân ly trong một số các tổ hợp lai. RFLP loci có thể có một vài allele dễ nhận biết. Số allele cao nhất (5-8) ñã ñược quan sát ở rau diếp và cá loài có quan hệ gần. Ngược lại một locus của RAPD thường có 2 allele thể hiện qua sự có hay vắng mặt của các vạch tương ứng. Sự ñồng trội của các RAPD marker thường ít khi gặp.

• Tính ña hình như vậy của ñộ dài các ñoạn cắt ñược nhân lên bằng PCR có thể là kết quả của việc mất ñoạn hay chèn ñoạn xảy ra giữa các vùng gắn mồi.

• Gần ñây, phương pháp trộn các ñoạn mẫu (template mixing) cho phép các RAPD marker ñồng trội có thể ñược xác ñịnh ñã ñược giới thiệu. Phương pháp này dựa trên sự xuất hiện các band nhân ñôi khác nhau không phải của bố mẹ trong các thể dị hợp tử, phân ly chậm hơn cả bố và mẹ vốn là ñặc trưng của các RAPD marker ñồng trội. Các band không phải của bố mẹ có thể thu ñược bằng việc trộn các ñoạn mẫu của DNA của bố mẹ trước khi chạy PCR. Việc này sẽ cho phép chọn lọc ñược các RAPD marker ñồng trội trứoc khi phân tích sự phân ly. Khi có sự nghi ngờ trong việc phân biệt các band phân ly chậm và nhanh, các ñoạn mẫu của bố mẹ và con cái ñược trộn lẫn ñể xác ñịnh các band kép dị hình trong số các band của các thể dị hợp tử của F2 và ñể khẳng ñịnh kiểu hình của một marker.

• Mặc dầu có các hạn chế, nhiều nghiên cứu ñã khẳng ñịnh RAPD là phương pháp hữu hiệu ñể xác ñịnh kiểu gen, phân tích quần thể và phả hệ, nghiên cứư sự phát sinh loài và lập bản ñồ di


truyền ở nhiều loài khác nhau như lúa, ñậu tương, lúa mạch ñen, ñại mạch, ñậu hà lan, hoa hồng, v.v.

Ứng dụng

� Sử dụng phương pháp này ñể nhận dạng ở mức ñộ phân tử, khảo sát ña dạng sinh học, phân lập gen ñột biến, xác ñịnh các tính trạng liên kết hay di truyền, chẩn ñoán bệnh.

� Ứng dụng cụ thể: nghiên cứu ña hình một số giống dâu tằm.

NGHIÊN CỨU ðA HÌNH M ỘT SỐ GIỐNG TẰM DÂU BẰNG KỸ THUẬT RAPD Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng, Nông Văn Hải Viện Công nghệ Sinh học I. MỞ ðẦU Ngày nay, việc sử dụng các chỉ thị phân tử DNA về ña hình các ñoạn DNA nhân ngẫu nhiên-RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), ña hình ñộ dài các ñoạn cắt giới hạn-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), sự lặp lại các chuỗi ñơn giản-SSR (Simple Sequence Repeats) hay còn gọi là tiểu vệ tinh (Microsatellite) ñể phân loại, nghiên cứu ña dạng sinh học của ñộng vật, thực vật và vi sinh vật ngày càng phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam [4, 5, 7, 8]. So sánh với phương pháp truyền thống, phân loại và nghiên cứu ña hình bằng chỉ thị phân tử cho kết quả có ñộ tin cậy cao [2]. Kỹ thuật RAPD do William và cs, 1990 [8] phát triển trên cơ sở PCR sử dụng một số ñoạn mồi ngẫu nhiên. Kỹ thuật này ñã ñược ứng dụng kết hợp cùng với một số kỹ thuật khác ñể phân loại, nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các cá thể tằm dâu [1, 2, 5, 10,11]. Ở Việt Nam chưa có công trình nào ñề cập tới vấn ñề này, mặc dù nghề nuôi tằm là một trong những nghề truyền thống của ñất nước, hiện ñang ñược ñẩy mạnh phát triển, việc phân loại ñánh giá ña hình vẫn dựa vào các ñặc ñiểm sinh học và hình thái, cho nên còn có những hạn chế nhất ñịnh. Trong bài báo này chúng tôi xin trình bày một số kết quả về sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu ña hình một số giống tằm dâu nuôi tại Vi ệt Nam. II. NGUYÊN LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Nguyên liệu Mẫu nghiên cứu gồm tám giống tằm ñang ñược dùng tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam: TTB, TML, VC, ðS 1, ðS 2, BM, THT, VYD, trong ñó có bốn giống ñược sử dụng nhiều trong vài năm gần ñây, ñó là hai giống ñịa phương thuộc tập ñoàn gốc ña hệ: vàng chấm [VC] và ðồ Sơn [ðS] hai giống tằm lưỡng hệ trắng Thái Bình [TTB] và trắng Mai Lĩnh [TML]. Tất cả các giống tằm trên do Trung Tâm Nghiên cứu Dâu Tằm Tơ Trung Ương, Xí nghiệp Giống Tằm Cấp I Mai Lĩnh và Xí nghiệp Giống tằm Thái Bình cung cấp. Hoá chất : EDTA, Tris-HCl, SDS, Proteaza K, RNaza, chloroform, phenol, NaCl, agaroza của các hãng Sigma, Merck, Amersham Phamacia Biotech, Fermentas...Các loại máy móc chuyên dụng thuộc phòng thí nghiệm trọng ñiểm Công nghệ Gen ñặt tại Vi ện Công nghệ Sinh học. 2. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA theo Wiliam và cộng sự, tham khảo thêm tài liệu của một số tác giả khác [ 8, 9, 10] và cải tiến cho phù hợp với ñiều kiện phòng thí nghiệm. Xác ñịnh nồng ñộ DNA bằng phương pháp ño quang phổ, kiểm tra DNA trên gel agaroza 0,8% và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại, chụp ảnh ở máy Geldoc hoặc Polaroid. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR với các ñoạn mồi do hãng Genset Singapore Biotech tổng hợp. Tổng thể tích dùng cho một mẫu là 25 µl. Chu trình nhiệt theo tài liệu của Zhou Zheyang và cộng sự [6]. Sản phẩm PCR


kiểm tra trên gel agaroza 0,8% và 1,3%. ------------------------------------------------------------------------ Công trình ñược hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của nhiệm vụ thường xuyên: ñề tài cấp Viện Công nghệ Sinh học Phân tích kết quả bằng chương trình phần mềm NTSYS phiên bản 2.0. Hệ số ñồng dạng di truyền ñược tính theo công thức của Nei và Li năm 1979 [3]. III. K ẾT QUẢ 1. Tách chiết và làm sạch DNA từ mẫu tằm Mẫu nghiền mịn và hoà tan trong dung dịch ñệm, thành tế bào và màng nhân ñược phá vỡ, giải phóng DNA. Tiếp theo bổ sung proteinaza K ñể phân huỷ hoàn toàn các protein liên kết . Sau ñó, dùng hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol loại bỏ các tạp chất và ly tâm thu DNA. Loại ARN bằng RNaza ở 37oC. Sản phẩm DNA ñược chạy ñiện di kiểm tra, ñánh giá trên gel agaroza 0,8% và ño OD trên máy ño quang phổ, bảng 1 và hình 1 là kết quả thu ñược. Kết quả cho thấy, sản phẩm nhận ñược cho vạch gọn và có trọng lượng phân tử lớn hơn 21,6 kb, tỉ lệ OD260 nm/OD280 nm dao ñộng từ 1,781 ñến 2,025 cho biết DNA thu ñược có ñủ ñộ sạch ñể làm nguyên liệu cho PCR hoặc các nghiên cứu tiếp theo. DNA ñược bảo quản lạnh trong dung dịch TE.

Ảnh 1. ðiện di DNA 1-5 : DNA của mẫu.

M : DNA λ/EcoRI+HindIII Bảng 1. Tỷ số OD260 nm/OD280 nm và nồng ñộ của DNA

2. PCR với DNA cuả tằm dâu Chúng tôi ñã tìm ñiều kiện tối ưu cho phản ứng nhân gen ñối với các mồi nghiên cứu [6 ], sàng lọc từ 20 ñoạn mồi ngẫu nhiên ñể chọn ra 5 ñoạn phù hợp cho tằm. Tiếp theo thực hiện PCR với các giống tằm, kết quả nhận ñược trình bày ở bảng 2.


Bảng 2: Kết quả RAPD của các giống tằm nghiên cứu [ Cột chỉ thị RAPD: chữ cái và số là ký hiệu của ñoạn mồi, tiếp theo là kích thước của băng. Số 1:phân ñoạn DNA ñược nhân. Số 0: phân ñoạn DNA không ñược nhân. Giống tằm 1: TTB, 2: TML, 3: VC, 4: ðS1, 5:ðS2, 6: BM, 7: THT, 8: VYD] Các băng nhân bản ñược sử dụng như là các chỉ thị RAPD bao gồm hai loại ñơn hình và ña hình. Băng ñơn hình có mặt trong tất cả các giống nghiên cứu, còn băng ña hình xuất hiện ở giống này nhưng lại vắng mặt ở giống khác. Trong tổng số 67 băng nhận ñược có 26 băng ñơn hình, chiếm 38,81% và 41 băng ña hình, chiếm 66,19%, kích cỡ của các băng từ 100bp ñến 3500bp. Trong 8 giống tằm nghiên cứu có 2 giống lưỡng hệ tương ñối xa nhau về quan hệ di truyền, còn 6 giống ña hệ ñịa phương có họ hàng khá gần gũi với nhau, do ñó tỷ lệ băng ñơn hình ở mức trung bình thấp, tỷ lệ băng ña hình ñạt mức trung bình cao hơn. Các băng ña hình là cơ sở phân biệt giữa các giống với nhau, có băng ña hình chỉ xuất hiện ở một giống mà không xuất hiện ở


các giống khác như băng 0P019-1200bp và 0P019-1000bp chỉ thấy ở giống TML, băng 0P019-800bp ở giống TTB và trong nhóm ña hệ chỉ xuất hiện ở giống BM. Với mồi 0P016, băng 300bp quan sát thấy ở giống TTB, còn băng 400bp có ở giống TML và duy nhất ở VC trong

Hình 2: Sản phẩm PCR mồi OP 13 của các

giống tằm nghiên cứu Giếng M: DNA λ/EcoRI+HindIII

Các giếng khác: mẫu của các giống tương ứng.

1-TTB 5-TML 6-VC 8-ðS 1 9-ðS 2 10-BM 11- THT 13- VYD

Từ các số liệu thu ñược, chúng tôi phân tích mối tuơng quan di truyền giữa các giống tằm nghiên cứu bằng chương trình phần mềm NTSYS phiên bản 2.0 và trình bày ở bảng 3. Bảng 3 cho thấy, giống TTB có hệ số ñồng dạng di truyền dao ñộng trong khoảng 0,547 ñến 0,703, thấp nhất trong các giống nghiên cứu, còn ở giống TML chỉ số này cao hơn, biến ñổi từ 0,766 ñến 0,906. Các giống trong nhóm ña hệ có hệ số ñồng dạng di truyền thay ñổi từ 0,766 ñến 0,984. Giống ðS1 và ðS2 có chỉ số cao nhất 0,984, có khả năng ñây chỉ là một giống nhưng nuôi ở hai ñịa phương khác nhau. Bảng 3. Hệ số ñồng dạng di truyền giữa các giống tằm nghiên cứu

Từ bảng hệ số ñồng dạng di truyền, chúng tôi xây dựng cây phân loại của các giống tằm và biểu diễn bằng hình 3. Dựa trên sơ ñồ hình cây biểu thị ña hình DNA giữa 8 giống tằm nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy các giống tằm khảo sát ñược chia thành hai nhóm lớn, cụm lại ở mức ñộ 0,54, nhóm thứ nhất chỉ có 1 giống TTB, còn nhóm thứ hai là các giống còn lại, cụm ở mức ñộ 0,79 và chia thành hai phân nhóm bậc I. Phân nhóm bậc I thứ nhất gồm hai giống TML và VC, cụm lại ở mức 0,90. Phân nhóm bậc I thứ hai là 5 giống thuộc ña hệ và lại chia thành phân nhóm bậc hai.... Riêng ðS1 và ðS2 ở phân nhóm bậc cao nhất.

Hình 1. Cây phát sinh chủng loại của các giống tằm


IV. K ẾT LUẬN 1. ðã phân tích tính ña dạng di truyền của 8 giống tằm dâu nuôi ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD với 5 ñoạn mồi, kết quả nhận ñược 67 băng DNA nhân bản trong ñó có 26 (38,8%) băng ñơn hình và 41 (61,2%) băng ña hình. ðoạn mồi 0P016 cho số băng ña hình phong phú nhất, mồi 101 có tỷ lệ băng ña hình thấp nhất. 2. Kết quả phân tích NTSYS-SIMUAL cho thấy các giống tằm nghiên cứu có mối tương ñồng di truyền trong khoảng 0,547 ñến 0,984.

(Simple Sequence Repeat - SSR) Kyõ thuaät SSR • Các trình tự lặp lại ñơn giản (Simple Sequence Repeat) hay còn ñược biết ñến như các

microsaterlite (vi vệ tinh) là những ñoạn ngắn của DNA có chứa từ 2 ñến 6 cặp base có trình tự lặp lại liên tiếp và số các trình tự lặp lại dao ñộng từ 2 ñến 40.

• Các trình tự lặp lại ñơn giản rất phổ biến ở hệ gen ñộng vật cũng như thực vật. Chúng ñược phân bố trong hệ gen và có tính ñực trưng cho từng loài.

• SSR rất phổ biến trong genom của lúa. • SSR là kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu ñầu tiên là nhận dạng các trình tự lặp

lại ñơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại ñơn giản này ñược nhận dạng, bước tiếp theo là xác ñịnh trình tự của DNA và thiết kế primer. Các trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR. SSR primer sau ñó ñược sử dụng tương tự như các RAPD primer.


Ưu ñiểm: • Kỹ thuật SSR có tiềm năng rất lớn do có khả năng phát hiện tính ña hình rất cao, có thể phân biệt

ñược sự sai khác mà không xác ñịnh ñược bằng các marker khác như RAPD và RFLP. • SSR primer có từ 1 ñến 12 locus (tuỳ vào loài) ñược tổ hợp trong một ống phản ứng PCR do vậy

cho phép ñồng thời ghi nhân các kiểu gen có nhiều locus. Phản ứng không quá tốn kém, tiêt kiệm ñược thời gian và hoá chất.

• Primer sử dụng trong SSR dài hơn mồi RAPD và dựa trên trình tự ñặc trưng và vì thế tỏ ra ñáng tin cậy khi phát hiện cùng một locus và thích hợp cho việc nghiên cứu bản ñồ gen.

• Marker SSR là các locus ñặc trưng, ña allele nên cung cấp nhiều thông tin rất có ích so viẹc phát hiện sự thay ñổi các trình tự hiếm. SSR là loại marker ñồng trội nên ñã nhanh chóng thay thế RFLP và RAPD và trở thành công cụ hữu hiệu trong các ứng dụng chọn giống thực vật và nghiên cứu di truyền.


Nhược ñiểm: • Nhược ñiểm của phương pháp này là quá trình thiết kế mồi ñắt, mỗi loại mồi chỉ ñặc trưng cho

mỗi locus ña hình. ðể xây dựng các cặp mồi ñặc hiệu cần tách dòng và ñọc trình tự một số lượng lớn các ñoạn ADN của genom có chứa SSR.

• Hiện nay, số lượng primer thiết kế cho các loại cây trồng còn hạn chế, làm giảm hiệu quả của SSR trong việc lập bản ñồ gen.

• Một vấn ñề khác cũng thường gặp phải trong sử dụng SSR là việc xác ñịnh quan hệ giữa các allele với các marker phân tử là rât khó. SSR có thể ñược phân bố ngẫu nhiên trong genom nhưng cũng có khi tập trung lại ở tâm ñộng hay eo thứ cấp của nhiễm sắc thể. ðiều này hạn chế việc sử dụng các mẫu dò nhiều locus trong phân tích liên kết di truyền và nghiên cứu quần thể.

Tài liệu tham khảo

• PGS.TS.Khuất Hữu Thanh-ðại học Bách Khoa Hà Nội – Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen – Trang 151 – NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội.

• Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang – Di truyền phân tử.Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng – Trang 93 – NXB Nông nghiệp.

dna marker

Documents