Decontamination de sols pollues par leshydrocarbures aromatiques polycycliques parbiodegradation en presence de substratsorganiques supplementaires

Nathalie Simeon, Guy Mercier, Jean-Francois Blais, Stephanie Ouvrard,Aurelie Cebron, Corinne Leyval, Jean-Louis Goergen et Emmanuel Guedon

Resume : Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont connus pour etre cancerigenes et mutagenes. Cette etudea porte sur la biodegradation de HAP (les 16 HAP de la liste prioritaire etablie par l’Agence americaine de protection de l’en-vironnement) presents dans un sol industriel en ajoutant des substrats organiques comme du lisier de porc, du compost de cre-vettes ou des boues d’epuration. Les boues municipales et le lisier de porc ont ete utilises comme inoculum pour ameliorer labiodegradation des HAP. Les resultats ont montre une biodegradation de 60 % de la somme des 16 HAP en 16 semaines a30 8C. Cette degradation a ete obtenue dans le cas d’une biopile composee de 75 % de sol pollue, 10 % d’inoculum (bouesacclimatees), 10 % de boues brutes et 3 % de paille (pour ameliorer le niveau d’aeration). Pour cette condition, le ratio sol–amendements etait de 1,0:0,3 et le rapport C/N de 30. Lors de cet essai, le GC-MS montre un taux de 68 % ± 16 % de degra-dation des HAP de cinq a six cycles. La quantification de la HAP-dioxygenase par « polymerase chain reaction » en tempsreel montre que la majorite des bacteries degradantes provenant du sol contamine et de l’inoculum sont des Gram+, alors quel’inoculum fait a partir des boues favorise le developpement des bacteries degradantes Gram–.

Mots-cles : hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), biodegradation, sol contamine, boue, lisier, compost, rapportC/N.

Abstract: Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are well-known carcinogens and mutagens. In this study, the biodegra-dation of PAHs (16 major pollutants mentioned by the US Environmental Protection Agency) present in industrial pollutedsoil was carried out under addition of different organic substrates such as pig manure, shrimp compost, or sewage sludge.Wastewater sludge and pig manure were used as inoculum to enhance biodegradation of PAHs. The results showed a maxi-mum biodegradation of 60% of total PAHs in 16 weeks at 30 8C. This degradation rate was obtained for a biopile that con-sisted of 75% of PAH contaminated soil, 10% of inoculum (acclimatized sludge), 10% of crude sludge, and 3% of straw(to increase aeration rate). The ratio of soil–amendment was 1.0:0.3 and the C/N ratio was 30. In this assay, GC-MS resultsshowed a degradation of 68% ± 16%.of PAH with five to six cycles. Quantification of PAH-dioxygenase genes in DNA ex-tracted from soil and inoculum, using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) showed that the major bacterial de-graders from the soil were Gram+ bacteria, while in acclimated sludge (inoculum) major degraders were Gram– bacteria.

Key words: polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), biodegradation, contaminated soil, sludge, manure, compost, C/N ra-tio.

Introduction

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sontdes composes organiques de noyaux benzeniques fusionnes

dont certains presentent un caractere mutagene, teratogenevoire cancerigene (Cerniglia 1992; Kanaly et Harayama2000). L’Agence americaine de protection de l’environ-nement (USEPA) a etabli une liste prioritaire comprenant

Recu le 7 septembre 2007. Revision acceptee le 10 juin 2008. Publie sur le site Web des Presses scientifiques du CNRC, a rgse.cnrc.ca le11 juillet 2008.

N. Simeon, G. Mercier et J.-F. Blais.1 Institut national de la recherche scientifique (Centre eau, terre et environnement), Universite duQuebec, 490 rue de la couronne, Quebec, QC G1K 9A9, Canada.S. Ouvrard. Laboratoire sols et environnement, Nancy-Universite, Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), 2 avenue dela Foret de Haye B.P. 172 F-54505 Vandœuvre les Nancy, France.A. Cebron et C. Leyval. Laboratoire des interactions micro-organismes mineraux matiere organique dans les sols, Universite de Nancy,Centre national de la recherche scientifique (CNRS), B.P. 239, 54506 Vandoeuvre-les-Nancy CEDEX, France.J.-L. Goergen et E. Guedon. Laboratoire des sciences du genie chimique-UPR CNRS 6811, Institut National Polytechnique de Lorraine,2 avenue de la Foret de Haye, 54501 Vandoeuvre-les-Nancy, France.

Les commentaires sur le contenu de cet article doivent etre envoyes au redacteur en chef avant le 31 janvier 2009.

1. Auteur correspondant (courriel : blaisjf@ete.inrs.ca).

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16 HAP en raison de leur dangerosite (Haeseler et al. 1999).Les HAP d’origine naturelle ou anthropogenique, resultentde la combustion incomplete de la matiere organique (Garonet al. 2000). Les activites industrielles, comme les procedesde transformation du charbon, sont les premieres causes an-thropiques.

L’etude du devenir des HAP dans le compartiment eda-phique est complexe du fait de la multitude de facteurs in-tervenants : proprietes du sol, duree de persistance, methodede determination de la biodisponibilite (Liste et Alexander2002). Ces composes sont le plus souvent liposolubles etsemi-volatils (ASTDR 1995). Ces proprietes font que lesHAP tendent a s’adsorber a la matiere organique ainsiqu’aux particules du sol ou aux sediments, ralentissant ainsila degradation (Dean-Ross 2005).

L’adaptation des microorganismes a la degradation desHAP a ete demontree (Wilson et Jones 1993; Breedveld etSparrevik 2000; Canet et al. 2001; Antizar-Ladislao et al.2005a). En effet, la biodegradation est plus rapide dans unematrice ayant deja ete exposee a des HAP (Carmichael etPfaender 1997; Ma et al. 2003). Un compose organique estsusceptible d’etre biodegrade si les microorganismes pre-sents possedent l’equipement enzymatique adequat (Amellal2004). Les HAP de deux a quatre cycles eux, semblent etrefacilement utilises par les bacteries comme source de car-bone pour leur croissance (Habe et Omori 2003). La majo-rite des voies de degradation etudiees concerne les voiesaerobies (Shuttleworth et Cerniglia 1995; Gibson et Parales2000). L’etape initiale de degradation est identique pour uncertain nombre de HAP. Elle consiste en l’incorporationd’une molecule d’oxygene (O2) sur un cycle ouvert, par l’in-termediaire d’une dioxygenase, et conduit a la formation decis-dihydrodiols (Cerniglia 1992). Les etudes recentes desvoies de degradation aerobique des HAP ont surtout focaliseleurs efforts sur les genes cataboliques homologues de lanaphtalene-dioxygenase, que nous nommerons plus genera-lement genes de HAP-dioxygenases. La plupart des etudesde bioremediation impliquent une biostimulation, ou unebioaugmentation. Avant la biostimulation d’un site conta-mine, il faut que la presence de bacteries degradant lesHAP soit confirmee. L’utilisation d’approche moleculairecomme la « polymerase chain reaction » (PCR), avec desamorces specifiques ciblant des genes presents chez les bac-teries degradantes, est un bon moyen de detection et de ca-racterisation de populations de degradeurs (Widada et al.2002). Tres recemment une methode de PCR quantitativeen temps reel a meme ete developpee pour quantifier speci-fiquement les bacteries Gram+ et Gram– possedant un genede HAP-dioxygenase (Cebron et al. 2008).

Les HAP provenant des cokeries sont tres recalcitrants ala biodegradation (Weissenfels et al. 1992). Les sols pol-lues contiennent peu de matiere organique, ne favorisantainsi pas l’activite bacterienne : c’est pourquoi, des essaissont menes en ajoutant des amendements organiques. Lastimulation de la degradation microbienne reste cependantencore une biotechnologie a l’etude (Namkoong et al.2002). Parmi ces techniques de bioremediation des HAP,le traitement par compostage a ete prouve comme efficace.Il permet en effet de bons pourcentages d’enlevement et untemps de traitement plus court que du « landfarming »(Turlough 2000). Des facteurs de controle sont a considerer

pour ameliorer le compostage de sols pollues : (i) l’incor-poration d’un substrat riche en composes organiques,comme le fumier, les eaux usees municipales, le compost,les biosolides ou les boues municipales (Cai et al. 2007),pour atteindre un ratio C/N compris entre 25:1 et 35:1(Ma et al. 2003; Moretto et al. 2005), (ii) le maintien d’untaux d’humidite constant compris entre 50 % et 60 % (Maet al. 2003; Antizar-Ladislao et al. 2004), (iii) l’ensemen-cement pour augmenter la microflore degradante en ac-croissant et (ou) stimulant la flore indigene (Wong et al.2001; Habe et Omori 2003), (iv) le maintien d’une porositeadequate en ajoutant des agents dilatants (Adenuga et al.1992).

La litterature decrit des ratios varies d’amendements pourrealiser le compostage. Des essais montrent que le meilleurrendement pour eliminer des hydrocarbures petroliers totauxest pour un ratio sol contamine – amendement de 1:0,5(Stegmann et al. 1991). La remediation peut etre accelereegrace a l’ajout de 10 % (p�p–1) de dechets de volailles (Wil-liams et al. 1999; Wong et al. 2001). Une etude recente pre-sente des rendements d’elimination de 60,8 % des HAP en 8semaines avec un sol conditionne avec des dechets verts, se-lon un ratio sol–dechets verts de 0,8:1 (Antizar-Ladislao etal. 2005b). Lors de cette etude, la temperature optimale aete fixee a 38 8C, et la degradation des HAP lourds fut del’ordre de 43 % ± 15 % (Antizar-Ladislao et al. 2005b).Des resultats indiquent que le fumier est l’amendement leplus efficace par rapport aux boues ou au soja (Wan et al.2000). Cependant, deux etudes, de l’effet du co-compostagede fumier de volaille avec du sol contamine, montrent qu’ilreste des HAP lourds a la fin d’une experience de 16 semai-nes en pilote et de 11 mois de landfarming (Atagana 2003,2004). Le fumier et le vermicompost sont reconnus pour en-richir la flore bacterienne mais n’ont que peu d’effet sur ladegradation reelle des HAP (Alvarez-Bernal et al. 2006).Pour optimiser les rendements de depollution, les tests debiodegradation des HAP dans les sols se font au prealableen bioreacteurs (Rutherford et al. 1998), et la densite depulpe la plus efficace serait de 10 % (p�p–1) (Dean-Ross2005). Malgre le fait que plusieurs etudes ont ete effectuees,les conditions les plus adequates de remediation de sols pol-lues par des HAP ne sont pas encore claires. Pour cette rai-son, il a ete decide de tester differentes conditionsexperimentales en laboratoire et, notamment, l’utilisation dulisier de porc comme amendements organiques. L’utilisationde ce rejet organique n’a, en effet, pas ete exploree pour re-hausser la biodegradation de HAP.

Lors de la presente etude, differents amendements organi-ques comme le compost de crevette, le lisier de porc et desboues municipales ont ete testes en ajoutant de la paillecomme agent de texture, ou meme un surfactant pour ame-liorer la biodisponibilite. Au prealable, une acclimatationdes microorganismes presents dans les boues de stationd’epuration a ete faite en y melangeant du sol contamine enHAP. Un autre test en milieu liquide a ete conduit pour tes-ter l’effet des boues et du ratio C/N du milieu sur la biode-gradation des HAP. La finalite de ce projet a ete de mettreen place les premiers essais d’une technique de depollutionde sol en utilisant les principes du compostage et du landfar-ming. L’objectif recherche est de degrader efficacement lesHAP de haut poids moleculaire.

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Materiels et methodes

Echantillonnage et caracterisation des intrants

Sol noirLe sol noir utilise lors de l’acclimatation et des essais A

provient d’un site confidentiel au Canada. Il a ete choisipour sa forte contamination en HAP. Il est compose a 68 %de particules de plus de 1 mm, de 30 % de particules detaille comprises entre 250 et 500 mm et de 2 % de particulestres fines (£250 mm). Les caracteristiques generales des sols,boues et autres intrants sont presentees dans les tableaux 1,2 et 3. Il est a noter que ce sol ne contient pas d’acenaph-tylene. Les rendements d’elimination sont donc bases sur lasomme des 15 autres composes.

Sol Neuves MaisonsLe sol de Neuves Maisons (Meurthe-et-Moselle, France)

utilise provient d’une friche industrielle proche de Nancy.Un echantillon homogeneise a la pelle mecanique et criblea 8 cm a ete constitue le 10 octobre 2004 puis stocke sur lesite experimental du GISFI a Homecourt. Un premier echan-tillonnage a ete realise en decembre 2005, le lot a ete tamisea 5 mm et utilise pour l’essai A. Le lot ainsi echantillonne aete importe au Quebec pour les analyses (no de permisACIA: P-2005-04004). Le second a ete preleve et tamise a5 mm directement sur le site d’Homecourt en septembre

2006 et utilise pour l’essai B. Ce sol est compose a 70 %de particules de plus de 1 mm, de 18 % de particules detaille comprises entre 250 et 500 mm et de 12 % de particu-les tres fines.

Boues d’epuration de BecancourLes boues d’epuration, collectees dans les bassins de reac-

teurs biologiques sequentiels (RBS) de la station de traite-ment des eaux usees de Haute-Becancour (Black Lake,Quebec) en mai 2005, ont ete utilisees pour les essais A etpour la generation de l’inoculum apres acclimatation au solpollue en HAP. Les echantillons ont ete conserves a 4 8Cavant d’etre analyses.

Boues d’epuration de Pont a MoussonLes boues utilisees pour les essais B proviennent de la

station d’epuration de Pont a Mousson (France, 54). Ellesont ete prelevees le 28 septembre 2006 dans le bassin desboues activees. Elles ont ete conservees a 4 8C pendant toutela duree de l’experience.

Autres intrantsLe lisier de porc a ete conserve a 4 8C. Le compost de

crevette et la paille ont ete entreposes a temperature am-biante a l’abri de la lumiere. La paille a ete coupee et tami-see a 3,8 mm. Le surfactant CAS (cocamidopropylhydroxysultaıne, masse molaire 452 g�mole–1) a ete utilise a

Tableau 1. Caracteristiques des sols et des substrats organiques utilises dans cette etude.

Parametres Unites Sol noirSol NeuvesMaisons Inoculum Lisier

BouesBecancour Compost Pailles

Solides totaux % (p�p–1) 88,3 89,0 34,2 2,63 3,00 82,8 99,7Densite g�cm–3 1,14 1,18 1,00 1,00 0,99 0,42 0,07pH — 7,25 6,50 7,25 6,95 7,95 6,60 7,35CECa mequiv.�[100] g–1 17,4 79,8 — — — — —Carbone total (C) g�kg–1 65 92 82 380 277 303 442Azote total (N) g�kg–1 2,35 4,90 4,80 38,8 40,3 16,5 7,50Soufre (S) g�kg–1 1,95 57,6 2,33 8,60 6,95 6,10 1,30Rapport C/N — 27,6 18,7 17,1 9,8 6,9 18,3 59,0

aCapacite d’echange cationique en milliequivalent.

Tableau 2. Teneurs initiales et fractions solubles en metaux dans les boues municipales, le lisier de porc et les sols et lesnormes en vigueur au Quebec.

Metaux

Sol noir Sol Neuves Maisons

Normes MEFa critere C(mg�kg–1)

Teneur initiale(mg�kg–1)

Fraction soluble(mg�L–1)

Teneur initiale(mg�kg–1)

Fraction soluble(mg L–1)

Aluminium (Al) 12 000 7,39±0,32 26 230 2,15±0,36 —Arsenic (As) 23,7 0,00±0,01 57 0,72±0,87 50Cadmium (Cd) 4,02 0,007±0,001 4,60 0,012±0,002 20Chrome (Cr) 31,4 0,081±0,006 409 0,174±0,145 800Cuivre (Cu) 119 0,359±0,018 92,1 0,367±0,102 500Fer (Fe) 16 560 8,26±2,58 143 200 12,27±4,83 —Manganese (Mn) 384 0,283±0,081 3600 49,93±3,67 2200Molybdene (Mo) 2,48 0,023±0,016 10,0 0,060±0,015 40Nickel (Ni) 28,8 0,060±0,001 89,7 0,232±0,014 500Plomb (Pb) 340 0,124±0,022 521 0,230±0,211 1000Zinc (Zn) 270 1,80±0,46 2184 1,51±0,14 1500S metaux 29 760 18,4±3,5 176 400 67,6±10,4 —

aMEF, ministere de l’Environnement et de la Faune.

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une concentration de 0,1 %. Le CAS provient de ChemronCo. (Paso Robles, Californie).

Essais A

AcclimatationL’etape de l’acclimatation des intrants en presence de sol

contamine par des HAP, nommee ici « inoculum », s’est de-roulee dans huit fioles avec chicanes pendant 14 semaines.La temperature a ete maintenue a 38 8C et l’agitation a 150rotations par minute (r�min–1) avec un agitateur giratoire.

Quatre conditions ont ete testees afin de determiner letype d’inoculum utilise par la suite pour les essais en tas.Pour chaque condition, une pulpe a 10 % (p�p–1) a ete prepa-ree avec 20 g de sol noir dans 200 mL de liquide constituesoit : (i) de 200 mL d’eau pour le « controle », (ii) de50 mL de boues d’epuration et 150 mL d’eau pour la condi-tion « boue », (iii) de 50 mL de lisier de porc et 150 mLd’eau pour la condition « lisier » et (iv) de 25 mL de bouesd’epuration, 25 mL de lisier de porc et 150 mL d’eau pourla condition « B + L ».

Des prelevements de 10 mL ont ete effectues aux temps0, 10, 49, 70 et 98 jours. Le pH et le potentiel d’oxydo-re-duction (POR) ont ete mesures dans les differentes condi-tions. Les resultats sont presentes au tableau 4.

Essais de degradation des hydrocarbures aromatiquespolycycliques (HAP) en tas de compost de 16 semaines

Le sol Neuves Maisons et le sol noir ont ete separes parquartage pour former six et huit tas de 750 g de sol places

dans des plats en acier inoxydable de 3 cm de hauteur.Puis, les differents amendements (compost, boues, lisier,paille, surfactant et inoculum ou boues acclimatees) ont etepeses separement et repartis dans chaque plat selon lesconditions presentees au tableau 5, pour obtenir un ratiosol–amendement d’environ 1:0,3.

La temperature de l’etuve a ete maintenue a 30 8C pen-dant 16 semaines. Des contenants d’un volume total de9,5 L d’eau distillee ont ete utilises pour humidifier l’etuve.Des ajouts d’eau ont ete effectues pour compenser l’evapo-ration et maintenir l’humidite des tas a environ 15 %. Unbrassage manuel de 2 min, tous les 3 jours, a servi au main-tien de l’aeration des tas. Des prelevements ont ete realises adivers temps selon la methode d’echantillonnage composite.

Essai B

Acclimatation accelereeLes boues de France ont ete mises en contact de facon

progressive avec le sol Neuves Maisons tamise a 2 mmdans un bioreacteur Biolafitte de 2 L. Au cours du temps,une quantite croissante de sol a ete ajoutee pour une quantitefinale de 150 g de sol dans un volume de 1,5 L de boues.L’acclimatation a dure 18 jours. La temperature a ete main-tenue a 38 8C grace a un bain-marie. L’aeration forcee a eted’environ 0,67 v�v–1�min–1 (volume d’air par volume de re-acteur par minute) et l’agitation moyenne de 500 r�min–1.Le pH a ete suivi et corrige par ajout de soude lorsque desconditions trop acides apparaissaient.

Tableau 3. Teneurs initiales (mg�kg–1) en hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dansles sols et seuils reglementaires en vigueur au Quebec et en France pour des usages commer-ciaux et (ou) industriels.

CompositionSolnoir

Sol Neuves Maisons Normes MEFa

critere CNormesFranceEssais A Essais B

Naphtalene 6,8 29,0 15,2 50 pvlb

Somme des 2 cycles 6,8 29,0 15 50 —Acenaphtene 11,5 55,0 43,5 100 —Anthracene 32,9 38,0 44,7 100 PvlFluorene 14,8 54,9 41,1 100 —Phenanthrene 119 149 114 50 —Somme des 3 cycles 178 297 244 350 —Benzo(a)anthracene 108 78,8 98,7 10 252Chrysene 98,8 82,3 100 10 25 200Fluoranthene 190 135 159 100 PvlPyrene 156 99,3 142 100 —Somme des 4 cycles 553 396 500 220 —Benzo(a)pyrene 97,4 72,6 73,8 10 25Benzo(b,j,k)fluoranthene 153 143 187 10 2520c

Dibenzo(a,h)anthracene 19,5 49,0 115 10 —Somme des 5 cycles 270 264 376 30 —Benzo(g,h,i)perylene 62,9 63,9 47,3 10 —Indeno(1,2,3-c,d)pyrene 87,5 70,1 58,4 10 252Somme des 6 cycles 150 134 106 20 —S HAP 1 160 1 120 1 241 — —

aMEF, ministere de l’Environnement et de la Faune.bpvl, pas de valeur limite.cValeur definie pour le benzo(k)fluoranthene.

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Degradation des hydrocarbures aromatiques polycycliques(HAP) en culture agitee : Effet du ratio C/N

Essai CA-1Cet essai a ete realise en cultures agitees (CA) a

150 r�min–1 et 38 8C pendant 28 jours. Trois rapports C/Nont ete testes : 10, 18, 25. A chacun de ces ratio C/N, deuxconditions ont ete evaluees : avec ajout de boues d’epurationou ajout d’inoculum (boues acclimatees essai B). Les condi-tions ont ete testees en pulpe a 10 % (p�p–1) avec 20 g de solNeuves Maisons, 150 mL d’eau et 50 mL de boues oud’inoculum selon la condition testee.

Les teneurs moyennes du sol brut de Neuves Maisons encarbone total et azote total etaient respectivement de 8,5 %et de 0,46 %, ce qui represente un C/N de 18,7. Pour modi-fier le rapport C/N, differentes quantites d’azote sous formede nitrate d’ammonium ou de carbone sous forme de cellu-lose ont ete ajoutees.

Essai CA-2Cet essai a ete realise dans les memes conditions que CA-1

(150 r�min–1, 38 8C, 28 jours) mise a part la techniqued’echantillonnage. Pour cette experience, trois fioles ont etepreparees par condition. A chaque temps de prelevement,une fiole a ete sacrifiee : le contenu seche, puis homogeneiseet broye avant d’etre echantillonne en vue d’analyses.Cette precaution a ete prise afin de limiter les ecarts types

tres importants dus a l’echantillonnage aleatoire pratiquelors de l’experience precedente.

Lors de cet essai, un controle a ete prepare en pulpe a10 % (p�p–1), avec 20 g de sol Neuves Maisons dans200 mL d’eau distillee en triplicatas pour chaque ratio C/Nteste (10, 18 et 25).

La condition ayant donne le meilleur taux de biodegrada-tion (pour l’essai CA-1 : condition boues) a ete reconduitelors de cet essai pour obtenir un pourcentage de biodegrada-tion plus fiable.

Methodes analytiquesLes solides totaux (ST) ont ete mesures selon le protocole

2540B de APHA (1999). Les lectures de pH ont ete effectueesa l’aide d’un pH-metre Accumet Research modele AR 25 dualchannel pH/ion meter de Fisher Scientific (Nepean, Ontario).Cet appareil est muni d’une electrode de pH Ag/AgCl demarque Cole Parmer (Cole Parmer Instrument, Anjou, Que-bec). Les teneurs en N, C et S ont ete determinees par un ana-lyseur elementaire Leco (modele HCNS-932, St-Joseph,Michigan). Les metaux ont ete determines par spectrophoto-metrie a emission de plasma induit (ICP-AES) sur un appareilVarian (modele Vista AX CCO simultaneous ICP-AES, PaloAlto, Californie). Les digestions des echantillons solides ontete realisees selon la methode MENVIQ.89.12/213.Met 1.3.Un echantillon certifie CRM PQ-1 (lot 7110C513, CANMET,Canadian Certified Reference Materials Project (CCRMP)) a

Tableau 4. Acclimatation des differentes biomasses en fioles agitees pendant 14 semaines a 38 8C pourla biodegradation des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) totaux presents dans le sol noir.

Substrats organiques

pHPotentiel d’oxydo-reduction(POR, mV) [S HAP]f

(mg�kg–1)Enlevement(%)Initial Final Initial Final

Controle 7,7 7,7 73 88 789±255 0Boues 8,0 6,5 57 128 268±32 84±2Lisier 8,3 7,3 –220 103 562±236 32±30Boues + lisier 8,3 7,4 –165 107 402±130 68±7

Tableau 5. Composition (g) des differents tas de compost prepares pour les essais A de biodegradation d’hydrocarbures aromatiquespolycycliques (HAP) dans les sols et elimination des HAP totaux apres 16 semaines de biodegradation a 30 8C.

Tas

Sols

Inoculum Lisier Boues Compost Pailles Surfactant Eau[SHAP]f

(mg�kg–1)Enlevement(%)Noir

NeuvesMaisons

A 750 — 100 — 100 100 30 — — 720±171 27,7±17,1B 750 — 100 — 100 50 30 — — 872±393 16,5±37,5C 750 — 100 — 100 — 30 — — 446±161 59,8±14,5D 750 — — — 100 — 30 — 100 944±338 14,5±30,6E 750 — 100 — 100 — 30 0,76 9 712±455 37,5±41,0F 750 — 100 50 50 — 30 — — 634±371 42,8±33,4G 750 — 100 100 — — 30 — — 735±322 33,7±29,0H 750 — 100 — 100 — 15 — — 518±23 54,2±2,0I — 750 100 — 100 — 30 — — 1232±218 0±16J — 750 — — 100 — 30 — 100 1212±276 0±21K — 750 100 — 100 — 30 0,76 9 917±36 11,0±6,6L — 750 100 50 50 — 30 — — 986±109 7,4±7,3M — 750 100 100 — — 30 — — 801±247 33,5±21,5N — 750 100 — 100 — 15 — — 966±99 7,8±9,5

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egalement ete digere en tant que controle. Des controles dequalite ont ete effectues en analysant des echantillons liqui-des certifies (lot SC0019251, no catalogue 900-Q30-002,multi-elements standard, SCP Science, Lasalle, Quebec).Toutes les analyses ont ete effectuees en duplicata ou entriplicata.

Extraction des hydrocarbures aromatiques polycycliques(HAP) au Soxhlet (essai A)

La determination de la teneur initiale en HAP du sol noir,du sol Neuves Maisons importe au Quebec, des boues deBecancour et des tas, a ete faite sur des echantillons preala-blement extraits au Soxhlet selon la methode no 3540C del’USEPA (1996), puis analyses selon la methode du CEAEQ(2001).

Analyse des hydrocarbures aromatiques polycycliques(HAP) par GC-MS (essai A)

Les analyses de HAP ont ete effectuees par chromatogra-phie en phase gazeuse couplee a un spectrometre de masse(appareil Perkin Elmer, modele Clarus 500) et par chromato-graphie en phase gazeuse couplee a une detection par ionisa-tion de flammes (appareil Varian, modele CP-3800). Lacolonne chromatographique utilisee est une CP Sil-8 CB de30 m de longueur avec un diametre interne de 0,25 mm etune phase stationnaire de 0,25 mm. La temperature de la co-lonne variait de 80 a 325 8C et son debit etait de 1,1 mL�min–1.Le volume d’injection etait quant a lui de 1 mL.

Extraction des hydrocarbures aromatiques polycycliques(HAP) par ASE (essai B)

Cet extracteur (marque Dionex, modele ASE 200) conci-lie une percolation de solvants a haute temperature (100 8C)sous une forte pression (14 000 kPa). Le fluide collecteuretait un melange de 50 % de dichloromethane et 50 %d’acetone. Les echantillons ont ete places dans des cylindresprepares pour l’extraction (filtre fibre de verre, sulfate de so-dium anhydre; silicate d’aluminium et silicate de magnesium(Florisil1), echantillon a analyser). Une evaporation dufluide collecteur est effectuee pour un changement de sol-vant pour l’analyse dans un evaporateur de type Turbo-Vap1LV (Caliper Life Sciences). On recupere les extraitsgrace a une seringue munie d’un filtre SRP 25 de 0,2 mm.Les tubes sont conserves a –20 8C.

Analyse des hydrocarbures aromatiques polycycliques(HAP) par HPLC (essai B)

Les echantillons ont ete analyses avec un HPLC demarque Varian ProStar muni d’un detecteur UV diode arrayde type PDA detector (modele 330). Une colonne en C18 de250 mm de longueur avec un diametre de 4,6 mm et unephase stationnaire de 4 mm a ete utilisee (Waters 92).

La methode d’analyse utilise un gradient d’eluant sur35 min avec une quantite d’eau millipore passant de 40 % a5 %, et d’acetonitrile de 60 % a 95 %. Le debit etait de0,8 mL�min–1 et le volume d’injection de 10 mL. Deux ca-naux d’analyse ont ete utilises soient 210 nm et 239 nm.

Quantification de sous-populations microbiennesexprimant la hydrocarbures aromatiques polycycliques(HAP)-dioxygenase

L’ADN total des echantillons, prealablement conserves

a –80 8C, a ete extrait par une methode de Bead Beatingpar l’action combinee de detergents (SDS, Canadian Tech-nology Accreditation Board) et de billes de verre (Cebron etal. 2008). Pour determiner l’importance de la population debacteries Gram– et Gram+ possedant un gene de HAP-dioxy-genase (PAH-RHDa, Cebron et al. 2008), une quantificationpar PCR en temps reel a ete realisee avec un appareil Bio-Rad (MyiQTM, Mississauga, Ontario).

La PCR en temps reel necessite 50 cycles. L’etape d’hy-bridation se deroule entre 54 et 58 8C, temperatures specifi-ques des amorces utilisees. Un fluorochrome (Sybr Green I)qui se fixe uniquement sur l’ADN double brin et dontl’emission est quantifiee a chaque cycle d’elongation estpresent dans le mix PCR (iQ SYBR Green SuperMix, Bio-Rad). La quantification des genes a ete determinee grace aune droite d’etalonnage faite a partir de concentrationsconnues en ADN (Cebron et al. 2008).

Trois PCR ont ete effectuees : une pour quantifier la po-pulation totale de bacteries grace a la quantification du nom-bre de copies de gene codant pour la petite sous-uniteribosomique (ARN 16S), une seconde ou l’on quantifie lapopulation de degradeurs Gram+ (amorce PAH-RHDa GP :amplification d’un produit de PCR de 292 pb) et une troi-sieme ou l’on quantifie la population de degradeurs Gram–

(amorce PAH-RHDa GN : amplification d’un produit PCRde 306 pb). Le nombre de copies de gene quantifie est diffe-rent du nombre de bacteries impliquees dans la degradation,puisqu’il peut y avoir plusieurs copies de ces genes portespar une meme bacterie.

Resultats et discussion

Teneurs initiales en hydrocarbures aromatiquespolycycliques (HAP) dans les sols

Le tableau 3 presente les concentrations en HAP de laliste USEPA dans les deux sols, ainsi que les normes en vi-gueur pour ces composes selon le critere C du Gouverne-ment du Quebec (MEQ 1999), ainsi que les normesappliquees en France (MEDD 2002). Ce niveau representela limite maximale acceptable pour des terrains a vocationcommerciale, non situes dans un secteur residentiel, et pourdes terrains a usage industriel.

Le sol Neuves Maisons contient plus de HAP ayant troiscycles que le sol noir. Les deux types de sols ont desconcentrations en HAP relativement similaires. Dans lestrois caracterisations, le phenanthrene est en concentrationsuperieure a la valeur cible de 50 mg�kg–1 recommandeepar le critere C. Sa concentration est en moyenne 2,5 foissuperieure a la norme. En ce qui concerne les HAP ayantquatre cycles aromatiques, ils sont tous en concentration su-perieure aux normes, d’un facteur 10 pour le benzo(a)anthra-cene et le chrysene et de 30 a 90 mg�kg–1 pour lefluoranthene et le pyrene. Il en va de meme pour les HAP acinq cycles. La somme des trois composes concernes est en-viron 10 fois superieure a la norme. Le sol noir contient da-vantage de HAP tres lourds (six cycles) que les deux solsNeuves Maisons, mais la difference n’est pas significative.

Acclimatation des souchesL’etape prealable d’acclimatation consiste a mettre en

contact les microorganismes avec les contaminants, de facon

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a favoriser et selectionner des souches microbiennes capa-bles de resister et degrader de fortes teneurs en HAP.

Pour toutes les conditions, le pH diminue suite a l’activitemicrobienne : il y a nitrification. Les differentes valeurs sontindiquees au tableau 4.

Il est a noter que, dans cet article, la charge en HAP n’estpas consideree comme de la matiere organique.

Au cours de l’acclimatation, le POR augmente pour at-teindre une valeur commune pour toutes les experiences (ta-bleau 4); il y a eu consommation de l’exces de matiereorganique carbonee denote par l’augmentation du POR aucours de l’experience.

Il n’y a pas de degradation significative dans le cascontrole. Ces valeurs montrent qu’il n’y pas d’attenuationnaturelle dans les fioles au bout de 14 semaines.

La degradation des HAP dans le cas lisier n’est pas signi-ficative : 32 % ± 30 %. Les valeurs de POR du lisier brutdenotent que le milieu est reducteur voire anoxique. Laflore, alors anaerobie, n’est pas apte a evoluer dans desconditions aerobies. Le lisier n’a donc pas ete retenu commecondition pour l’acclimatation acceleree de l’essai B. En ef-fet, celui-ci contient trop de matiere organique qui empechel’oxygene de penetrer dans le milieu, ce qui ne favorise pasla degradation des HAP. La flore degradante va alors choisirpreferentiellement le substrat le plus facilement assimilable.De plus, les concentrations tres elevees en ions ammoniumdans le lisier ainsi que la presence probable d’antibiotiques(De Liguoro et al. 2003) ont certainement un effet toxiquesur les microorganismes.

Une biodegradation plus importante des HAP a ete cons-tatee avec la condition boues. Elle atteint une valeur d’en-viron 84 %. La flore presente, alors aerobie, reagit bien acette adaptation. Elle reussit a utiliser les HAP pour son me-tabolisme, signe d’un milieu favorable a sa croissance. Lesboues d’epuration ainsi utilisees peuvent servir a apporterdes nutriments essentiels a la proliferation microbienne oumeme des microorganismes. Il s’agit bien dans ce cas d’unprocessus biologique, puisque le temoin ne presente aucunevariation par rapport aux concentrations initiales. Les bouesne presentent pas une charge trop importante en matiere or-ganique : la competition avec l’utilisation des HAP ne vapas etre trop importante par rapport au lisier.

Alternativement, une acclimatation dans le cas B+Lconstitue un bon compromis, puisque la biodegradation a at-teint 68 %. Cela pourrait alors permettre une gestion alterna-tive du lisier de porc, qui represente, au meme titre que lesboues d’epuration, un dechet problematique.

Lors de la seconde acclimatation, les memes conditionsqu’avec le cas boues ont ete reproduites avec le sol NeuvesMaisons (essai B).

Essais de degradation des hydrocarbures aromatiquespolycycliques (HAP) en tas de compost de 16 semaines

Differents tas de compost ont ete prepares pour tester l’in-fluence de chacun des composants sur la degradation desHAP. Les resultats de ces essais sont presentes dans le ta-bleau 5. Les ecarts types tres importants denotent la grandeheterogeneite des systemes etudies a cause notamment : dela multitude des constituants du compost, de la repartitiontres aleatoire des molecules organiques du type HAP, ainsique de la difficulte de representativite de l’echantillonnage.

Sol noirAvec ce sol, les taux de biodegradation sont les plus im-

portants avec des ecarts types faibles. Dans les deux meil-leurs cas, les tas sont composes de 75 % sol, 10 %inoculum, 10 % boues et soit 1,5 % ou 3 % paille (ta-bleau 5). Ces conditions entraınent respectivement 54 % et60 % de biodegradation. La difference de biodegradationvient du fait qu’avec 3 % paille, l’aeration est plus impor-tante dans le tas C. Un apport minimal en oxygene est ne-cessaire aux bacteries degradant les HAP, puisqu’elleseffectuent generalement une degradation aerobie.

Aux vues des resultats, il est possible de denoter un effetde chaque constituant sur le traitement par voie biologiqueen tas.

En comparant les trois tas compostage A, B et C (75 %sol, 10 % inoculum, 10 % boues, 3 % paille), on remarqueque la degradation la plus importante a ete observee en ab-sence de compost de crevettes (tas C). Entre les deux condi-tions avec du compost, la biodegradation etait plus efficaceavec un ajout de 10 % de compost par rapport a un ajout de5 %.

Il y a davantage de biodegradation des HAP avec 0,1 %de surfactant CAS sans ajout de compost (tas E) qu’avec10 % de compost (tas B). Cependant le rendement de decon-tamination du tas E aurait pu etre superieur : la biodegrada-tion a surement ete inhibee : le surfactant ou les HAPsolubilises sont toxiques vis-a-vis des microorganismes, ouil y a eu utilisation de ce surfactant comme source de car-bone et d’energie (Harayama 1997). En revanche, la degra-dation la plus importante a ete notee pour le cas sans ajoutde surfactant, ni de compost (tas C).

Les rendements de degradation des HAP avec 10 % lisierou avec 5 % boues et 5 % lisier sont relativement sembla-bles, avec un meilleur taux pour le melange lisier–boues(tas F). La degradation a du se produire grace aux bacteriesaerobies des boues.

L’essai sans inoculum donne le taux de biodegradation leplus bas, soit environ 15 % (tas D). L’ajout d’inoculum adonc bien permis d’augmenter les rendements de biodegra-dation. Les bacteries ont eu le temps de s’adapter a la nou-velle source de carbone, les HAP, et ont ete aptes a lesdegrader plus facilement.

Aux vues des resultats et en considerant le temps de l’ac-climatation (14 semaines), un test avec une acclimatation ac-celeree a ete choisi pour les essais B.

Cas du tas CLe tas C represente la condition pour laquelle le meilleur

taux de degradation a ete obtenu, soit 60 %, avec une com-position de 75 % sol, 10 % inoculum, 10 % boues, 3 %paille. Le ratio C/N est reste constant a une valeur de 30, etl’humidite a ete maintenue entre 20 % et 25 %. La figure 1presente les rendements de biodegradation de la somme desHAP mesures dans le tas C, ainsi que les tendances selon lenombre de cycles des HAP. Le tableau 6 precise les concen-trations finales de chaque HAP avec les pourcentages debiodegradation associes.

La majorite des cycles ont ete degrades selon la memetendance. De facon tout a fait classique, le naphtalene estdegrade plus rapidement que les autres, puisqu’il s’agit dela molecule la plus simple. Les HAP de cinq et six cycles

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sont tres fortement degrades, a hauteur de 68 % ± 16 %,comme le montre le tableau 6. D’un point de vue stricte-ment reglementaire, seuls le pyrene et le dibenzo(a,h)anthra-cene ont une teneur en deca des exigences imposees par leMEF suite au traitement.

Sol Neuves MaisonsDes rendements de biodegradation des HAP de 0 % a

25 % ont ete obtenus avec le sol Neuves Maisons. La condi-tion pour laquelle la biodegradation est nulle (tas I) corres-pond au cas ayant le mieux fonctionne dans le cas du solnoir. Cette mauvaise degradation provient du fait que lesbacteries n’ont pas ete acclimatees avec le sol Neuves Mai-sons. De plus, ce sol est reconnu comme potentiellementtoxique, aux vues de ses fortes teneurs en metaux (cinq foisplus elevee dans le sol Neuves Maisons que le sol noir, ta-bleau 2). La fraction soluble emanant du sol Neuves Mai-sons est tres probablement toxique pour lesmicroorganismes, et une longue et efficace acclimatation se-rait requise pour obtenir un consortium microbien resistantvis-a-vis des metaux. Cette flore est deja acclimatee auxHAP presents, puisque cette pollution date d’une trentained’annees.

Contrairement aux resultats du sol noir, la biodegradationest plus marquee dans le cas ou un apport de surfactant esteffectue. Dans ce cas, il y a une meilleure disponibilite desHAP pour les microorganismes, qui les degradent a hauteurde 11 % (tas K), contre une degradation nulle en absence desurfactant (tas I) (tableau 5).

Avec ce sol, une meilleure biodegradation des HAP a etedenotee avec du lisier de porc (33,5 % d’enlevement au tasM) plutot que des boues municipales (11 % d’elimination autas K). Aucun enlevement des HAP n’a ete mesure avec unajout de 10 % de boues (tas I), alors qu’avec le sol noir,

cette condition permettait le taux de biodegradation le plusimportant (tas C).

L’essai sans inoculum donne une biodegradation nulle (tasJ). Contrairement au sol noir, l’apport de 1,5 % paille (tasN) donne de meilleurs resultats qu’un ratio de 3 % de cesubstrat (tas I).

Cas du tas MLe tas M represente la condition pour laquelle le meilleur

taux de degradation a ete obtenu avec une composition de75 % sol, 10 % inoculum, 10 % lisier, 3 % paille. Le ratioC/N pour cette condition a ete evalue a 19,5 au cours del’experience, et l’humidite a ete maintenue entre 20 % et25 %. Le tableau 6 precise les concentrations finales enchaque HAP avec les pourcentages de biodegradation asso-cies. La figure 2 presente les rendements de biodegradationde la somme des HAP mesures dans le tas M, ainsi que lestendances selon le nombre de cycles des HAP. D’apres cettefigure, les HAP a deux et trois cycles aromatiques sont de-grades avec la cinetique la plus importante. En revanche, lesHAP ayant quatre cycles ne subissent pas de biodegradationsignificative (1,5 % d’enlevement). Un probleme de quanti-fication au niveau des HAP lourds est sans doute survenu aucours de l’analyse. En effet, certains HAP lourds sont da-vantage degrades que les HAP ayant quatre cycles : c’est lecas du dibenzo(a,h)anthracene qui est elimine a hauteur de76 % ± 11 %. Ce pourcentage est tres eleve par rapport auxautres HAP de cinq cycles. Cela complique l’interpretationde la degradation des HAP lourds, puisqu’en theorie lesHAP les plus legers sont consommes avant les lourds.D’une facon generale, aucune classe de HAP ne suit la cine-tique generale de degradation.

Il est a noter que le tas M est supplemente avec du lisierde porc, alors que le tas C est supplemente avec des bouesmunicipales. En effet, malgre une quantite abondante de ma-

Fig. 1. Enlevement (%) des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) totaux et en fonction du nombre de cycles apres 16 semainesde biodegradation a 30 8C dans le tas C (sol noir).

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tiere organique facilement assimilable dans le lisier de porc,il faut egalement considerer les quantites importantes enzinc et la presence de cuivre (tableau 2), qui peuvent inhiberle metabolisme microbien. Cependant, les boues contiennentdavantage de cuivre que le lisier. L’action inhibitrice du li-sier peut alors provenir de la presence tres probable d’anti-biotiques, provenant d’un traitement veterinaire. Il estegalement possible de conclure que le sol Neuves Maisonsutilise dans le cas du tas M est une cause de l’inhibition dela biodegradation.

Degradation des hydrocarbures aromatiques polycycliques(HAP) en culture agitee : Verification de l’effet du ratioC/N

Essai CA-1L’essai mene en cultures agitees ne represente pas les

conditions retrouvees dans les tas, cependant il permet d’op-timiser l’apport et le transfert en oxygene aux bacteries.

Le meilleur rendement de biodegradation est obtenu pourun ratio C/N de 18, c’est-a-dire sans aucun apport exterieur,et avec ajout de boues d’epuration seules (tableau 7). Dansce cas, il y a une degradation de plus de 20 % pour tous lesHAP, quel que soit leur nombre de cycles. Les pourcentagesde degradation des HAP a deux et six cycles, et des HAP atrois et cinq cycles sont equivalents, respectivement. Lescomposes principalement degrades sont les polluants pre-sents en fortes concentrations : il s’agit du fluoranthene, dubenzo(a)anthracene, du chrysene, du pyrene, du dibenzo(a,-h)anthracene et du benzo(b)fluoranthene.

Les resultats avec ajout d’inoculum different selon les ra-tios C/N. Pour un ratio C/N de 10, aucun changement n’estnotable. Un ratio C/N de 25 n’entraıne que peu de biodegra-dation aux vues de l’ecart type important associe. Un ratioC/N de 18 reste le plus interessant dans le cas ou l’on ajoute

de l’inoculum, puisqu’il y a moins de variation qu’avec unratio C/N de 25. Pour toutes les conditions avec ajout d’ino-culum, les composes exclusivement degrades sont le fluo-ranthene et le pyrene.

Cette experience montre qu’il n’est pas judicieux de mo-difier le ratio C/N dans une pulpe a 10% (p�v–1) lorsque l’onsouhaite obtenir une bonne degradation des HAP.

Essai CA-2Pour n’importe quel ratio C/N sans ajout de boues d’epu-

ration, la degradation est peu significative. L’apport deboues est donc juge comme pertinent au niveau de la flore.Cependant, les modifications du ratio C/N n’ont pas d’effet.Ceux-ci constituent pourtant un apport en nutriments. L’im-portance de l’apport des nutriments via les boues est alorsremise en question.

La condition C/N 18B (avec ajout de boues) reproduitelors de cette seconde experience donne un pourcentage debiodegradation bien inferieur a celui mentionne au cours del’essai CA-1, 26 % contre 53 %. Les polluants les plus de-grades sont toujours ceux presents en plus grande quantite.La technique d’echantillonnage avec sacrifice de fioles per-met donc d’obtenir des resultats davantage significatifs. Eneffet, echantillonner directement dans une fiole (CA-1) nepare pas au probleme de la sedimentation. Celle-ci cree unerepartition heterogene des particules : les lourdes (matiereminerale) au fond et les legeres en surface. Or, les HAP nes’adsorbent pas de la meme maniere sur les particules gros-sieres que sur les fines. De plus, en pulpe les HAP legerspeuvent avoir tendance a se mettre en solution. Pour ces rai-sons, la technique par sacrifice a ete jugee plus pertinente.

Les essais en cultures agitees montrent qu’un apport denutriments n’est pas toujours justifie, ce qui importe c’est leratio C/N intrinseque du sol. En revanche, un apport en bac-teries via des boues est conseille. Les essais de biologie mo-

Tableau 6. Teneurs finales et elimination des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) apres 16 se-maines de biodegradation a 30 8C dans les tas C (noir) et M (Neuves Maisons).

HAP

Sol noir (tas C) Sol Neuves Maisons (tas M)

[HAP]f (mg�kg–1)Enlevement(%) [HAP]f (mg�kg–1)

Enlevement(%)

Naphtalene 2,40±2,49 64±37 8,62±7,45 68±27Somme des 2 cycles 2,40±2,49 64±37 8,62±7,45 68±27Acenaphtene 3,56±1,82 68±16 21,0±4,7 58±9Anthracene 11,7±5,1 64±15 17,5±4,1 52±11Fluorene 4,71±2,55 67±17 19,6±3,9 61±7Phenanthrene 50,8±21,4 57±18 67,7±14,0 53±9Somme des 3 cycles 70,7±30,8 64±16 125,8±26,7 56±9Benzo(a)anthracene 41,4±13,7 60±13 76,3±20,8 0±27Chrysene 41,0±13,8 57±14 77,2±21,8 3±27Fluoranthene 89,5±27,2 51±14 130±30 3±22Pyrene 68,5±21,5 55±14 99,7±25,2 0±25Somme des 4 cycles 240±76,2 56±14 383±98 1,5±25Benzo(a)pyrene 39,3±17,9 57±19 56,9±20,7 17±30Benzo(b,j,k)fluoranthene 47,1±12,1 67±8 133±47 1±34Dibenzo(a,h)anthracene 4,67±3,17 74±17 10,5±5,0 76±11Somme des 5 cycles 91,0±33,2 49±14 200±72,7 23±25Benzo(g,h,i)perylene 16,5±11,2 72±19 30,4±14,1 49±23Indeno(1,2,3-c,d)pyrene 24,7±16,1 70±19 51,4±23,6 21±36Somme des 6 cycles 41,2±27,3 71±19 81,8±37,7 35±29

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leculaire ont alors servi a localiser la population de degra-deurs.

Quantification de sous-populations microbiennesexprimant l’hydrocarbure aromatique polycyclique (HAP)-dioxygenase

Le Tableau 8 presente les resultats obtenus pour la quan-tification de la population de degradeurs microbiens dans lesboues, dans l’inoculum, ainsi que dans le sol Neuves Mai-sons.Les boues possedent une flore globale numeriquementsuperieure a l’inoculum et au sol Neuves Maisons, celui-ciabritant le moins de bacteries. Cependant, il y a une plusforte proportion de bacteries degradant les HAP dans le solNeuves Maisons que dans les autres echantillons. Ce sol,ayant subi une pollution ancienne, a favorise la proliferationde populations specialisees. Il y a effectivement 3,09 % ±1,81 % de degradeurs Gram + et 0,66 % ± 0,42 % de degra-deurs Gram– dans ce sol : la population predominante etantdonc des bacteries Gram+. L’ajout de sol dans les boues lorsde l’acclimatation semble favoriser les bacteries degradantesGram–, car leur proportion passe de 0,01 % a 0,69 % desboues a l’inoculum, alors que les bacteries degradantesGram+ restent en meme proportion malgre l’apport par le sol.

De precedentes etudes ont montre que les bacteries Gram+

possedant un gene de PAH-RHDa GP etaient specialiseesdans la degradation d’une gamme plus large de HAP queles bacteries Gram–. Par exemple, les bacteries Gram+ ontla capacite de degrader les HAP de hauts poids moleculai-res, tels que le fluoranthene, le pyrene et le benzo[a]pyrene(Kanaly et Harayama 2000; Kim et al. 2006). La biogeogra-phie des bacteries degradantes n’est pas encore tres claire,toutefois, les bacteries Gram+ sembleraient etre dominantesdans les sites ayant une pollution aux HAP relativement an-cienne (Uyttebroek et al. 2006), tel que le sol de NeuvesMaisons. L’incubation des boues en presence de sol de Neu-ves Maisons a du favoriser principalement le developpementde bacteries degradantes Gram– specialisees dans la degrada-tion des HAP de faibles poids moleculaires, tel que le naph-talene et le phenanthrene. En effet, la degradation de cesHAP legers est plus rapide et a pu etre initiee lors de la pre-paration de l’inoculum ou l’on remarque l’augmentation dupourcentage de bacteries Gram–, indice d’une croissance si-gnificative des bacteries Gram– presentent initialement dansles boues. En revanche, le pourcentage de bacteries Gram+

reste constant entre les boues et l’inoculum qui n’a recu que10 % de sol de Neuves Maisons.

Fig. 2. Enlevement (%) des HAP totaux et en fonction du nombre de cycles apres 16 semaines de biodegradation a 30 8C dans le tas M (solNeuves Maisons).

Tableau 7. Teneurs finales et elimination des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) totaux dans lesol Neuves Maisons apres 28 jours de biodegradation a 38 8C en cultures agitees.

Conditions Essai

Rapport C/N 10 Rapport C/N 18 Rapport C/N 25

[S HAP]f

(mg�kg–1)Enlevement(%)

[S HAP]f

(mg�kg–1)Enlevement(%)

[S HAP]f

(mg�kg–1)Enlevement(%)

Controle CA-2 1539 0 1433 0 1380 6Inoculum CA-1 981±174 0±37 706±68 30±7 768±272 31±47Boues CA-1 921±101 31±4 722±85 53±11 862±102 19±27Boues CA-2 — — 1218 26 — —

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Sol Neuves Maisons versus sol noirLes deux sols choisis pour cette etude ont une pollution

en HAP relativement similaire, cependant, les resultats debiodegradation sont tres differents. Dans l’essai A, une ac-climatation des bacteries a ete faite a partir du sol noir, etles resultats des traitements par ajouts de substrats organi-ques sont meilleurs pour les tas a base de ce sol. Celaconfirme bien que l’acclimatation est conseillee lors d’un es-sai de biodegradation.

Les caracteristiques du sol Neuves Maisons peuvent enpartie expliquer les resultats de biodegradation. En effet, cesol provient d’une ancienne friche industrielle, il contientdonc les HAP qui n’ont pas pu etre degrades au fil du temps: il s’agit principalement de HAP lourds. Dans cette terre, ily a peu des HAP legers, car ceux-ci ont ete les premiers aetre degrades de facon biologique ou autre. Le problememajeur de cette pollution industrielle ancienne est la non-disponibilite des HAP a la degradation. Que l’on apportetous les nutriments necessaires via les boues ou via le nitrated’ammonium, ou de l’energie carbonee par la cellulose, siles HAP ne sont pas biodisponibles, il n’y aura pas de de-gradation biologique. En effet, les HAP peuvent etre seques-tres ou adsorber sur les particules tres fines du sol. Le solNeuves Maisons compte en effet 18 % de particules tres fi-nes, contre 2 % pour le sol noir.

Les analyses revelent egalement qu’il y a de fortes quan-tites de soufre, de cuivre, de zinc et de fer dans le sol Neu-ves Maisons. En comparant ces valeurs au critere A du MEF(teneur naturelle dans un sol) (MEQ 1999), ce sol s’appa-rente davantage a un melange de sol avec des residus indus-triels qu’a un « vrai sol ». La teneur elevee en soufre denotequ’il a ete echantillonne proche du crassier de l’ancienne co-kerie et indique la presence de residu de charbon ou de sco-ries de charbon en forte quantite. Ces fortes teneurs enmetaux peuvent modifier la biodegradation des HAP. Desetudes ont montre que la presence de metaux, comme lecadmium, le cuivre ou le zinc, dans le sol, augmente la toxi-cite des HAP vis-a-vis des microorganismes (Amellal 2004).La presence de metaux representerait une contrainte impor-tante a la biodegradation des HAP dans les sols entraınantune toxicite importante qui serait a l’origine du disfonction-nement de la technique de depollution.

Enfin, le traitement par compostage requiert l’apport debeaucoup de matiere organique qui peut perturber la biode-gradation par adsorption ou competition de substrat de crois-sance. Cependant, il a ete montre que la presence demicroorganismes degradeurs change les taux de desorptionde contaminants adsorbes sur des surfaces (Calvillo et Ale-

xander 1996). Il s’avere donc que si les HAP se solubilisentlors du traitement, il y aura davantage de desorption de ceuxadsorbes a la matiere organique. Il serait alors possible,grace a l’action de surfactants, de mettre en solution unmaximum de HAP et de les degrader, dans une phaseaqueuse, par des moyens biologiques ou chimiques.

ConclusionsLa presente etude montre que l’ajout de substrat orga-

nique de type boues municipales permet de bons rendementsd’enlevement par rapport a l’ajout de lisier de porc ou decompost de crevettes pour une depollution des HAP dansun sol industriel. Une acclimatation des microorganismes(inoculum) est recommandee par mise en contact avec lamatrice contaminee. Une biodegradation de 60 % a ete obte-nue dans les conditions suivantes : 75 % sol, 10 % inocu-lum, 10 % boues de station d’epuration, ainsi que 3 %paille. Pour cette condition, les HAP lourds ont ete eliminesa hauteur de 68 % ± 16 %.

L’etude de l’effet du rapport C/N en cultures agitees a150 r�min–1 a 38 8C montre qu’il n’est pas pertinentd’ajouter des substrats azotes ou carbones pour obtenir unebonne biodegradation, seul importe le ratio C/N du sol atraiter.

Un sol ayant ete expose a une pollution ancienne est sus-ceptible d’abriter une flore adaptee a la degradation desHAP, comme le montrent les analyses de PCR en tempsreel. La population de degradeurs appartient a des Gram+,et l’acclimatation permet une proliferation d’organismesGram–. Le sol doit cependant offrir des conditions adequatespour le bon developpement des bacteries : un faible tauxd’adsorption sur les particules du sol, une bonne accessibi-lite des contaminants, une faible pollution en metaux, etc.Une pollution par HAP lourds est plus difficile a eliminer.

Tous les traitements mis en œuvre dans cette etude n’ontpas permis d’obtenir des resultats qui satisfont les exigencesdu MEF, exigences relativement severes par rapport a laFrance.

En utilisant des boues d’epuration comme substrat orga-nique et comme apport de flore degradante, cela permettraitune diminution des problemes de surplus de ces dechetsqu’il faut gerer de facon securitaire, et qui engendre souventdes couts eleves.

RemerciementsLes auteurs tiennent a exprimer leurs sinceres remercie-

ments a Mme Myriam Chartier, agente de recherche a

Tableau 8. Populations bacteriennes totales evaluees par la quantification du nombre de copies degene codant pour l’ARN16S et quantification des bacteries Gram+ et Gram– possedant un gene co-dant pour une hydrocarbure aromatique polycyclique (HAP)-dioxygenase (PAH-RHDa) mesureesdans les boues, l’inoculum et le sol Neuves Maisons.

Populations Boues Inoculum Sol Neuves Maisonsa

ARN16S (genes�g–1 sec) 8,28�108 1,32�108 3,13�107

PAH-RHDa GP (Gram+) (genes�g–1 sec) 7,87�105 1,01�105 6,60�105

PAH-RHDa GN (Gram–) (genes�g–1 sec) 8,46�104 9,10�105 1,05�105

Ratio PAH-RHDa GP (Gram+)/ARN16S (%) 0,095 0,077 3,09±1,81Ratio PAH-RHDa GN (Gram–)/ARN16S (%) 0,010 0,689 0,66±0,42

aAnalyses faites sur 20 echantillons.

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l’INRS-ETE, qui a participe a l’elaboration et a la mise enœuvre du protocole experimental a Quebec, ainsi qu’a Ste-phane Delaunay pour ses conseils judicieux.

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