biologie des populations de tourterelles à queue carrée sur l'île de la barbade apports de...

UNIVERSITE DE BOURGOGNE

UFR Sciences Vie Terre Environnement

Ecole Doctorale Environnements - Santé - STIC (n°490)

THESE POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE BOURGOGNE

Discipline : Sciences de la Vie

par Karine MONCEAU

le 21 décembre 2009

Biologie des populations de tourterelles à queue carrée

sur l'île de la Barbade

Apports de l'outil moléculaire

Directeur de thèse : Pr. Frank CEZILLY

Co-directeur de thèse : Dr. François-Xavier DECHAUME-MONCHARMONT

JURY

Dominique ALLAINE Rapporteur Professeur, Université Lyon I

Loïc BOLLACHE Examinateur Professeur, Université de Bourgogne

Frank CEZILLY Examinateur Professeur, Université de Bourgogne

François-Xavier

DECHAUME-MONCHARMONT Examinateur Maître de Conférences, Université de Bourgogne

Olivier DEHORTER Examinateur Ingénieur de Recherche CNRS, CRBPO

Philipp HEEB Rapporteur Chargé de Recherche CNRS, HDR, Université Toulouse III

REMERCIEMENTS

En premier lieu, je souhaiterais remercier Frank Cézilly, pour m’avoir fait confiance sur un

sujet qui, je le sais, lui tenait particulièrement à cœur. Je tiens à lui témoigner ici toute ma gratitude

pour son encadrement aussi bien à Dijon qu’à la Barbade (et aussi pour le resto de pierrade où il m’a

amené les jours où le manque de protéines se faisait sentir sur le terrain).

Merci également à François-Xavier Dechaume-Moncharmont (ouf ! ça a tout de même était

compliqué de faire tenir ton nom sur la liste du jury sans que ça dépasse trop !) pour sa disponibilité et

son encadrement. Il m’a également permis de découvrir le monde fabuleux de R dont je ne peux plus

me passer maintenant.

Je remercie tout particulièrement Philipp Heeb et Dominique Allainé pour avoir accepté d’être

rapporteur de mes travaux. Je les remercie d’autant plus qu’ils m’ont tous deux accordés un sursis

réellement nécessaire pour boucler le manuscrit, tout en sachant que de leur côté, cela leur réduisait

leur temps de correction, un temps qui je le sais bien est précieux pour des personnes aussi occupées.

Merci également à Loïc Bollache et Olivier Dehorter d’avoir accepté de participer à mon jury

de thèse et d’examiner mes travaux.

Un grand merci également à Thierry Rigaud, avec qui j’ai beaucoup appris en M2, notamment

à ne pas paniquer lorsque les expériences réalisées ne donnent que des résultats négatifs. Finalement,

cela a été très instructif, même si je sais que le déroulement de mon stage l’avait, à l’époque, quelque

peu stressé. Je ne regrettte certes pas ces satanés microsporidies mais encore moins d’avoir travaillé

sous la direction de quelqu’un qui est pour moi, un grand Monsieur.

Je voudrais également remercier Rémi Wattier (Mr Génétique) pour son soutien, sa

disponibilité et sa bonne humeur.

Merci également à Coraline Caullet, Christine Dubreuil, Maria Gaillard et Julia Geraci pour

leur aide et/ou conseils en génétique et plus particulièrement face au redoutable Licor, qui nous en

aura fait voir de toutes les couleurs.

Je remercie également Morgan David, Maria Gaillard (bis), Estelle Harrang, Sébastien

Motreuil, Jérôme Moreau et George Prato pour leur aide précieuse sur le terrain à la Barbade, avec

pour certains beaucoup d’anicroches techniques durant les trajets !

Merci également à l’équipe canadienne : Laure Cauchard, Kimberley-Anne Côté et Sarah

Overington pour les bons moments passés à la Barbade et à Neeltje Boogert pour les échanges sur les

tourterelles, dommage que nous ne nous soyions jamais croisées là-bas. J’en profite également pour

remercier Louis Lefebvre sans qui Frank n’aurait peut être jamais commencé à travailler sur les

tourterelles à queue carrée.

Je remercie également mes stagiaires, encadrés sur les thématiques liées aux tourterelles :

Aurore Barat, Eloise Colin, Gwladys Doyen et Amélie Slaski ou sur d’autres sujet : Jérémie Cornuau

et Matthias Galipaud (je fais grâce de leur surnom). En tout cas, j’espère qu’ils auront tous gardé un

petit quelque chose que j’aurais pu leur transmettre. En ce qui me concerne cela aura été un véritable

plaisir de travailler avec eux.

Je remercie vivement Emilie Arnoux, Alexandre Bauer, Jean-Sébastien Bolduc, Marie-Jeanne

Perrot-Minnot, Yannick Moret, Jean-Philippe Troussard ainsi que Nathalie Franceschi, Nicolas

Kaldonski et tous les membres précédemment cités de l’équipe Ecologie Evolutive de l’UMR CNRS

5561 Biogéosciences pour leur soutien et leur amitié.

Merci également à tous les étudiants en M1 et M2 que j’ai pu côtoyer ces trois dernières

années et qui contribuent également à la bonne ambiance générale. Désolée de ne pas tous les citer

mais la liste serait trop longue.

Je remercie également les familles Bolduc, Bouvier-Kaldonski, Cézilly, Dechaume-

Moncharmont, Moret, Martinaud, Moreau, Rigaud et Troussard pour tous les bons moments partagés

autour de bonnes victuailles.

Merci également à Vivi, Tauta et Vince car même si on ne se voit pas souvent vous êtes

toujours là.

Je ne remercierais jamais assez mes parents pour m’avoir permis d’aller aussi loin, ainsi que

ma famille et mes proches dont le soutien indéfectible m’a toujours aidé à avancer.

Et la dernière personne que je souhaiterais remercier est Jérôme Moreau qui entre, en fait,

dans plusieurs cases : celle de collègue, d’ami, de famille et surtout de compagnon. Toutes ces

casquettes n’ont sans doute pas dues être facile à porter compte tenu de mon caractère, mais il n’a

jamais raccroché et reste toujours présent. Je lui témoigne ici toute ma gratitude et mon amour.

SOMMAIRE

PREAMBULE 1

CHAPITRE I :

PRESENTATION DU MODELE D ’ETUDE ET DES OUTILS METHODOLOGIQUES 9

I. INTRODUCTION 10

II. METHODE GENERALE : MODELE BIOLOGIQUE ET ACQUISITION DES DONNEES 12

1. La tourterelle à queue carrée, Zenaida aurita 12

2. Capture, acquisition des données morphométriques et prélèvements sanguins 15

3. Préparation des échantillons sanguins pour les analyses moléculaires subséquentes :

l’extraction d’ADN 17

III. SEXAGE ET DIMORPHISME SEXUEL CHEZ LA TOURTERELLE A QUEUE CARREE : LES

PROBLEMES METHODOLOGIQUES 18

1. Sexage moléculaire 18

a. Généralités sur le sexage chez les oiseaux 18

b. Méthodes de sexage moléculaire 19

i. Généralités 19

ii. Mise en place du sexage moléculaire chez la tourterelle à queue

carrée 20

2. Sexage via l’utilisation de données morphométriques : les biais

méthodologiques 26

IV. ETUDE DE LA VARIABILITE INTERINDIVIDUELLE : MISE AU POINT DES MARQUEURS

MICROSATELLITES 29

CHAPITRE II :

POLYMORPHISME DE RESSOURCES CHEZ LA TOURTERELLE A QU EUE

CARREE 32

CHAPITRE III :

HETEROZYGOTIE MULTI -LOCI ET APTITUDE PHENOTYPIQUE 36

I. INTRODUCTION 37

II. MATERIEL & METHODES 41

1. Modèle biologique 41

2. Site d’études, captures, prises de mesures et prélèvements sanguins 42

3. Analyses génétiques 43

a. Généralités 43

b. Analyses préliminaires 43

c. Mesures de l’hétérozygotie 44

4. Relation entre hétérozygotie et aptitude phénotypique 45

a. Hétérozygotie, stratégie d’approvisionnement et âge (adultes et juvéniles) 45

b. Hétérozygotie et asymétrie fluctuante (adultes uniquement) 45

i. Analyses préliminaires 46

α. Erreur de mesure et asymétrie 46

β. Antisymétrie (AS) 47

γ. Asymétrie directionnelle (AD) 49

δ. Indépendance de la différence droite - gauche vis-à-vis de la taille

des individus 49

ii. Test de la relation entre hétérozygotie et asymétrie fluctuante 49

5. Logiciels de traitement des données 49

III. RESULTATS 50

1. Analyses génétiques 50

a. Analyses préliminaires 50

b. Mesure de l’hétérozygotie 52

2. Relation entre hétérozygotie et aptitude phénotypique 53

a. Hétérozygotie, stratégie d’approvisionnement et âge 53

i. Hétérozygotie et stratégie d’approvisionnement 53

ii. Hétérozygotie et âge 53

b. Hétérozygotie et asymétrie fluctuante 55

i. Erreur de mesure et asymétrie 55

ii. Antisymétrie (AS) 55

iii. Asymétrie directionnelle (AD) 58

iv. Indépendance de la différence droite-gauche vis-à-vis de la taille des

individus 58

v. Test de la relation entre hétérozygotie et asymétrie fluctuante 59

α. Chez les mâles 59

β. Chez les femelles 62

IV. DISCUSSION 65

DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES D’ETUDES 70

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 77

ANNEXES 105

1

PREAMBULE

2

Le milieu insulaire

Etymologiquement proche du terme isolement, l’île est définie comme une étendue de

terre bordée de toutes parts d’eau. Le milieu insulaire, par extension de l’origine latine insula,

excite depuis toujours la curiosité et l’imaginaire des hommes par sa singularité. Dans

l’inconscient collectif, l’île est le symbole de l’isolement ultime, tel qu’il est décrit dans

Robinson Crusoe (Defoe 1719). Cette caractéristique majeure du milieu insulaire a également

été largement exploitée notamment pour des raisons de sécurité dans le cadre de détentions

(Alcatraz, le bagne de Cayenne). Les îles sont également souvent associées au terme

paradisiaque décrivant une végétation luxuriante et une faune riche et extrêmement spécifique

ou endémisme. Cette diversité n’a pas échappé à Darwin lors d’une étape dans l’archipel des

Galápagos durant son voyage sur le Beagle et a contribué à l’élaboration de sa théorie de

l’évolution dont nous célébrons cette année les cent cinquante ans (première édition de On the

Origin of Species Darwin 1859). Cependant, certains éléments manquaient pour asseoir sa

théorie de la sélection naturelle.

Du phénotype au génotype

D’un point de vue strictement mécanistique, la théorie de la sélection naturelle

énoncée par Darwin s’appuie sur des observations phénotypiques et manque de preuves

basales et plus précisément des bases génétiques qui, à l’époque, ne sont pas connues. Alors

que Mendel publie ses travaux sur l’hérédité en 1866, ceux-ci restent inconnus pour Darwin et

ce n’est qu’au début du XXème siècle, dans les années trente que des approches génétiques

sont proposées par Fisher, Haldane et Wright, accompagnées du développement de concepts

génétiques théoriques qui sont progressivement intégrés à la théorie de l’évolution de Darwin

(Powell 1987, Ayala & Fitch 1997). Néanmoins, la nature mathématique de ceux-ci n’est pas

abordable par tous les biologistes ce qui est par la suite pallié par la publication de Genetics

and the Origin of Species de Dobzhansky (1937) permettant de faire le lien entre généticiens

et évolutionnistes (Powell 1987, Ayala & Fitch 1997). Cette nouvelle théorie baptisée, théorie

synthétique de l’évolution, utilise une notion qui jusque là restait floue à savoir l’espèce. Bien

PREAMBULE

Préambule

3

que couramment employée, celle-ci n’est pas réellement délimitée (Mayr 1940). En effet,

depuis Aristote (environ 350 avant J.C.) jusqu’à Buffon (1749-1788) en passant par Linné

(1758), la classification du monde vivant est effectuée sur des critères morphologiques et/ou

anatomiques. Mayr (1942) propose alors une définition basant l’unité de l’espèce sur un

ensemble d’individus pouvant se reproduire entre eux et avoir une descendance féconde

(Borges 2005). Cette définition, couramment admise comme une définition biologique

classique, cache en fait sa dimension génétique (γενητικός du grec "apte à procréer"). Par la

suite, l’essor de la génétique, aussi bien d’un point de vue fondamental avec la découverte de

la structure de l’ADN (Watson & Crick 1953) que technique (toujours d’actualité), offre un

nouveau niveau d’analyse puisque qu’elle permet de mettre en évidence des différences et/ou

des similarités potentiellement silencieuses d’un point de vue morphologique (Dobzhansky

1973). Aujourd’hui, les apports de la génétique sont incontestables quelle que soit la

discipline considérée en biologie.

Le milieu insulaire : un laboratoire de l’évolution

Outre la publication des écrits de Darwin et celle des essais de son contemporain

Wallace (1869, 1876, 1880), peu de travaux impliquant le milieu insulaire ont été réalisés

jusqu’à la seconde moitié du XXème siècle. Ce n’est que depuis la publication de la théorie de

la biogéographie insulaire de MacArthur & Wilson (1967) qu’un regain d’intérêt pour ce

milieu se fait sentir, notamment depuis l’avancée des connaissances en matière de génétique

(Monge-Nájera 2008).

Globalement, les îles présentent une grande diversité d’âge, de taille, de forme, de

localisation et de niveau d’isolement ce qui confère à chacune d’elles une combinaison unique

de caractéristiques en termes écologiques (MacArthur & Wilson 1967, Cronk 1997, Whittaker

& Fernández-Palacios 2007). Considéré comme un système isolé et stable, le milieu insulaire

présente un taux d’endémisme important, voire dans certains cas spectaculaire. En 1973,

Dobzhansky évoquait par exemple l’existence d’environ 2000 espèces de drosophiles, dont un

quart d’entre elles étaient présentes sur l’archipel Hawaïen et parmi elles, 17 étaient

endémiques soit (0,85%) alors que cet archipel représente à peine 0,20% de la surface totale

des terres émergées (pour une vision actualisée voir Magnacca et al. 2008). Globalement,

81% des oiseaux, 91% des angiospermes 99% des insectes et des mollusques hawaïens

seraient endémiques de cet archipel (Sohmers & Gustafson 1993 cités dans Whittaker &

https://www.researchgate.net/publication/247608946_Speciation_Phenomena_in_Birds?el=1_x_8&enrichId=rgreq-1adf2ba353932607a81d94bb45929fec-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI2NTU1NTMwOTtBUzoxNDA0ODU5ODk1MDcwNzJAMTQxMDUwNTg3ODk5MQ==

Préambule

4

Fernández-Palacios 2007). Le même cas s’observe aux Galápagos, évoquées précédemment,

où les 13 espèces de pinsons de Darwin (sous-famille des Geospizinae) sont inféodées à cet

archipel (une autre espèce étant présente sur Coco Island au nord de l’archipel) (Grant &

Grant 2008). Ceci ne signifie pas que ces espèces ont colonisé exclusivement ces milieux

mais qu’elles sont issues d’un ensemble de processus ayant pour conséquence une

diversification, voire une spéciation. Dans le cas des pinsons de Darwin, la radiation

adaptative observée a été confirmée génétiquement (marqueurs microsatellites et

mitochondriaux) comme résultant de la colonisation par un ancêtre commun (Petren et al.

1999, Sato et al. 1999, Grant & Grant 2008). Globalement, ce sont les conséquences du

niveau d’isolement et de la plus ou moins grande connectivité des îles qui intéressent les

biologistes évolutionnistes (Losos & Ricklefs 2009).

Dans ce cadre, certains archipels ont été plus étudiés que d’autres et sont considérés

comme des laboratoires de l’évolution en raison de la radiation endémique qu’ils présentent

(Whittaker & Fernández-Palacios 2007, Ricklefs & Bermingham 2008, Losos & Ricklefs

2009). Ceci est le cas par exemple des îles d’Hawaii, archipel le plus isolé des continents.

Situé dans la partie médiane de l’océan Pacifique, cet archipel héberge plusieurs milliers

d’espèces endémiques dont, entre autre, des drosophiles (Magnacca et al. 2008) mais

également des moucherons de la famille des Limoniidae (Nitta & O’Grady 2008). De même,

et peut être avec une valeur historique supplémentaire, les Galápagos ont fait l’objet de

beaucoup d’attention de la part des évolutionnistes et particulièrement pour les pinsons de

Darwin, étudiés depuis plus d’une trentaine d’années par P. et R. Grant et leur équipe de

l’université de Princeton (Grant & Grant 2008 pour une vue d’ensemble). Certains archipels,

à l’inverse de ceux-ci, ont bénéficié de moins d’attention, bien que présentant des

caractéristiques toutes aussi attrayantes.

L’arc Caribéen : un archipel peu étudié

Les Caraïbes forment un archipel de plus d’une centaine d’îles et îlets au large des

côtes ouest du continent américain entre Amérique du Nord et du Sud (figure 1).

Globalement, trois parties peuvent être distinguées (du Nord au Sud) : les Caraïbes du nord

(au large de la Floride incluant les Keys, les Bahamas et îles Turques-et-Caïques), les Grandes

Antilles (les quatre plus grandes îles Cuba, la Jamaïque, Hispaniola et Porto Rico) et les

Petites Antilles (une quarantaine d’îles délimitant l’arc caribéen). D’un point de vue

Préambule

5

historique, sa formation complexe offre une diversité géologique et écologique élevée (Dengo

& Case 1990, Donovan & Jackson 1994, tous deux cités dans Hedges 2001). Au Jurassique (-

170Ma), la division de la Pangée a créé un espace pour l’apparition ultérieure de la plaque

caribéenne au Crétacé où les îles de l’arc proto-antillais issues du volcanisme ont émergé

progressivement sans que ni l’ordre ni le moment exact de leur émergence ne soient connus.

A cette période, et sur environ 30 millions d’années, la plaque proto-antillaise est restée plus

ou moins connectée aux continents nord et sud américains (-100 à -70 Ma). Puis, au début du

Cénozoïque (-60 Ma), elle heurte et fusionne avec la plaque des Bahamas issue du continent

nord-américain et le tout glisse vers l’est. Depuis le Pliocène (environ -5 Ma), l’ensemble se

retrouve donc isolé vis-à-vis de la plaque continentale avoisinante dans une situation

géographique proche de celle que nous connaissons aujourd’hui. Contrairement à la partie

nord de l’archipel (Caraïbes nord et Grandes Antilles) où aucune activité volcanique n’est

connue, certains des volcans situés dans les Petites Antilles sont toujours actifs. Toutefois,

toutes les îles de cette zone géographique ne sont pas de type volcanique comme l’île de

Trinité issue d’un détachement du continent sud-américain ou encore la Barbade provenant

d’un soulèvement tectonique daté d’environ 700 000 ans (Speed 1994 cité dans Lovette et al.

1999).

D’un point de vue biologique, les champignons, protistes, bactéries, invertébrés et

plantes ne sont que peu ou pas étudiés contrairement aux vertébrés plus fortement suivis

notamment pour des aspects phylogéographiques, biogéographiques et de spéciation (Hedges

et al. 1992, Lovette et al. 1999, Hedges 2001, Pramuk et al. 2001, Rodriguez-Durán & Kunz

2001, Hower & Hedges 2003, Dávalos 2004, Ricklefs & Bermingham 2004, Rocca et al.

2004, Glor et al. 2005, Losos et al. 2006, Heinicke et al. 2007, Hedges et al. 2009).

En ce qui nous concerne, nous avons choisi de travailler sur un modèle biologique

vertébré, la tourterelle à queue carrée, Zenaida aurita, colombidé endémique des Caraïbes et

ce pour diverses raisons dont leur proximité à l’homme sur certaines îles. Notre

problématique initiale, consistant en l’étude de la fidélité et des liens du couple chez une

espèce monogame, ne trouve pas son intérêt dans un contexte insulaire en tant que tel mais

plutôt par rapport à la localisation de l’archipel à savoir la zone tropicale car finalement peu

d’études concernant cet axe de recherche s’y sont intéressées (Stutchbury & Morton 2001).

6

Figure 1 : Carte de l’espace caribéen. Les Antilles regroupent l’ensemble des îles comprises dans les pointillés. La Barbade est représentée et

entourée en rouge (modifié d’après Raffaele et al. 2006).

Pré

am

bu

le

6

Préambule

7

De la monogamie à des questions de biologie des populations

En écologie comportementale, un des enjeux majeurs est la compréhension des

systèmes d’appariement et notamment de la monogamie qui est somme toute assez singulière

dans le règne animal tant dans sa distribution taxonomique que dans son maintien évolutif.

Définie comme étant une association d’un mâle avec une femelle pour au moins un épisode

de reproduction, ce régime d’appariement apparait comme un paradoxe car d’un point de vue

adaptatif, les mâles ne devraient pas se restreindre qu’à une seule partenaire (voir Cézilly

2006 pour une revue détaillée de cette problématique). Chez les oiseaux, où la monogamie est

le régime prédominant, la plupart des études ont été réalisées en milieu tempéré où les saisons

rythment la reproduction ce qui ajoute à la difficulté de l’étude de la fidélité, un nouveau

paramètre de séparation des couples, à savoir les coupures potentielles temporaires ou

permanentes des liens entre partenaires. A l’inverse, en milieu tropical, les saisons sont

restreintes. Ainsi, compte tenu de la stabilité du milieu, les couples monogames peuvent

perdurer tout au long de l’année. De cette façon, les causes de séparations éventuelles

("divorces") pourraient être analysées plus aisément sans effet parasite ou du moins pas

imputable à des changements saisonniers. Toutefois, en dépit de ces avantages, peu de travaux

y ont été réalisés (Stutchbury & Morton 2001 pour un aperçu).

L’ambition du projet dans lequel s’inscrivait intialement cette thèse était donc placée

dans l’optique d’effectuer un suivi de couples après les avoir marqués par baguage. Ces

aspects comportementaux devaient constituer la majeure partie de mes travaux de thèse. Pour

cela, nous avons choisi de travailler à la Barbade (figure 1), notamment en raison du soutien

logistique dont la station biologique de Bellairs (Holetown, St James Parish) de l’Université

de McGill (Montréal, Canada) par notre collaboration avec le Pr. Louis Lefebvre (l’Université

de McGill). Cependant, bien que nous ayons effectué un baguage intensif lors de la première

session de capture en 2007 sur l’île de la Barbade (260 oiseaux bagués sur les territoires en

trois mois avec en moyenne deux personnes sur le terrain en permanence), le suivi des

couples s’est révélé plus difficile que ce qui était prévisible à l’origine. En effet, peu de

couples identifiés au cours de la première saison de terrain (six sur un total de 46) ont pu être

retrouvés lors de la session de capture suivante en 2008. De ce fait, le faible taux de

recaptures visuelles compromettait fortement l’obtention de données sur le taux de "divorce".

En parallèle de ce suivi comportemental et des analyses morphométriques sur les couples

bagués, des marqueurs microsatellites ont été développés afin d’analyser les critères

Préambule

8

d’appariement des individus sur des critères génétiques. Compte tenu du fait que nous avons

obtenu un grand nombre de marqueurs (23) avec un niveau minimum de polymorphisme

correct (au moins quatre allèles par locus), une analyse génétique a été associée à la

morphométrie afin d’envisager de nouvelles problématiques. De ce fait, les aspects liés au

régime d’appariement ne seront que peu développés (et même de façon plutôt indirecte au

travers du dimorphisme sexuel) dans le cadre de mes travaux de thèse, réorientée vers une

problématique articulée autour du lien entre génotype et phénotype.

Avant de rentrer dans le vif du sujet, l’étude chez cette espèce a nécessité dans un

premier temps, la mise au point de certaines techniques génétiques (dont les marqueurs

microsatellites et des marqueurs moléculaires d’identification du sexe) mais également une

mise au point technique pour l’exploitation des données morphométriques (chapitre I). Dans

l’ensemble de notre raisonnement, morphologie et génétique sont intimement liées l’une à

l’autre. Ceci est vrai que ce soit en tant qu’outils de diagnostic comme cela est le cas pour

l’utilisation des ressources par les tourterelles au sein de la Barbade (chapitre II) ou au sens

mécanistique pour la relation entre hétérozygotie et aptitude phénotypique (chapitre III).

Finalement, bien que notre fil conducteur ait toujours été la relation phénotype-génotype,

celle-ci a néanmoins été abordée sous des angles très divers. Ainsi, les conclusions et

perspectives retenues à l’issue de chaque chapitre ont été associées afin de présenter une

synthèse critique sur les avancées générées par ces trois années d’études et de présenter un

ensemble de perspectives envisageables à plus ou moins long terme.

9

CHAPITRE I

-

PRESENTATION DU MODELE D’ETUDE

ET DES OUTILS METHODOLOGIQUES

10

CHAPITRE I

-

PRESENTATION DU MODELE D’ETUDE

ET DES OUTILS METHODOLOGIQUES

I. INTRODUCTION

A la publication de l’Origine des Espèces en 1859, Darwin reçut de vives critiques

quant au support de la sélection naturelle. Alors que Mendel publiait ses travaux sur l’hérédité

en 1866, ce n’est qu’une vingtaine d’années plus tard que Weismann, au travers d’une

présentation sur l’hérédité en 1883 à l’Université de Fribourg-en-Brisgau (Allemagne,

Weismann 1891), proposait l’existence d’un élément physique de l’hérédité. Néanmoins, il a

fallu encore attendre 80 ans pour que la structure de l’ADN soit identifiée (Watson & Crick

1953).

L’intime relation entre phénotype et génotype amène les biologistes à repenser leur

vision de l’individu en considérant non seulement ces deux caractéristiques, mais également

l’interaction entre l’environnement et le patrimoine génétique. Les gènes et les produits de

leur expression (protéines) deviennent alors des marqueurs de variations environnementales

(Lambert 1995, Beebee & Rowe 2008). Cependant, une quarantaine d’années a été nécessaire

pour que des techniques initialement réservées aux généticiens et aux biologistes moléculaires

soient introduites en écologie comme outils de diagnostic. Ceci marque l’essor de l’écologie

moléculaire - discipline apparue dans les années 1960 - qui connut une reconnaissance

internationale notamment avec la création en 1992 d’une revue spécifique Molecular Ecology

(Burke et al. 1992, Lambert 1995, Avise 2006).

Les apports des techniques moléculaires ont permis des avancées majeures dans divers

courants tels que la biologie de la conservation qui a, par exemple, permis d’identifier

l’origine de la faible fertilité des guépards africains, Acinonyx jubatus. Par l’utilisation

Chapitre I – Présentation du modèle d’étude et des outils méthodologiques

11

d’outils moléculaires, une baisse de la diversité génétique, consécutive à deux réductions

majeures de l’effectif des populations, a pu être mise en évidence (Menotti-Raymond &

O’Brien 1993). Cependant, les apports les plus spectaculaires concernent sans doute la remise

en question d’un principe considéré jusqu’alors comme universel. Chez les oiseaux, plus de

93 % des espèces de passereaux étaient considérées comme monogames (Lack 1968). Une

revue de la littérature recensant les taux de paternités hors couples - déterminées par

l’utilisation de marqueurs microsatellites - a permis de montrer qu’environ 86 % de ces

espèces pratiquaient les copulations hors couples (Griffith et al. 2002). Ainsi, l’utilisation de

marqueurs moléculaires a permis de rectifier la vision "idyllique" de la monogamie aviaire en

apportant une nuance à la définition de la monogamie telle qu’elle était vue par Lack (1968)

en la qualifiant de monogamie sociale.

Dans l’ensemble, la biologie moléculaire a réellement révolutionné l’écologie et la

biologie évolutive (Ellegren 2008). Toutefois, l’avantage de ces techniques qui est de mettre

en évidence la variabilité se révèle être également une difficulté technique puisque cela

signifie que ces outils doivent être adaptés à leur cible. Or, ceci n’est pas toujours possible

(limitation du matériel biologique, défaut de compétences, de temps ou de financement pour

le développement). Dans le cas des microsatellites par exemple, bien qu’à l’heure actuelle leur

développement puisse être relativement aisé (à raison de temps et/ou d’argent),

l’amplification transpécifique de certains marqueurs peut s’avérer être une alternative

intéressante dans le cas où ceux-ci ont pu être développés chez des espèces proches, du même

genre voire parfois de la même famille (Wilson et al. 2004, Selkoe & Toonen 2006). Ainsi,

bon nombre d’articles introduisant de nouveaux marqueurs microsatellites intègrent une

section concernant l’amplification transpécifique (pour des exemples récents : Hoffman 2009,

Ma et al. 2009, Miles et al. 2009). Globalement, et ce quelle que soit la technique utilisée, la

première étape dans toute analyse moléculaire est de rechercher ce qui est disponible chez des

espèces proches.

Dans le cas de la tourterelle à queue carrée, Zenaida aurita, certaines populations

(Barbade et Porto Rico principalement) ont déjà été étudiées principalement sur des aspects

démographiques, comportementaux et morphologiques (Nellis & Dewey 1978, Nellis et al.

1984, Burger et al. 1989, Wiley 1991, Rivera-Milán 1992, 1996, 1997, 1999, 2001, Carlier &

Lefebvre 1996, Dolman et al. 1996, Lefebvre et al. 1996, 1997, Rivera-Milán & Vásquez

2000, Goldberg et al. 2001, Seferta et al. 2001, Rivera-Milán & Schaffner 2002, Griffin et al.

2005, Sol et al. 2005) mais peu en génétique et uniquement via un séquençage de cibles

mitochondriales (Johnson & Clayton 2000a et b). Comme bon nombre de colombidés, cette

https://www.researchgate.net/publication/7138525_Selkoe_KA_Toonen_RJ_Microsatellite_for_ecologists_a_practical_guide_to_using_and_evaluating_microsatellite_markers_Ecol_Lett_9_615-629?el=1_x_8&enrichId=rgreq-1adf2ba353932607a81d94bb45929fec-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI2NTU1NTMwOTtBUzoxNDA0ODU5ODk1MDcwNzJAMTQxMDUwNTg3ODk5MQ==

https://www.researchgate.net/publication/227624857_Cross-species_amplification_of_microsatellite_loci_in_aphids_Assessment_and_application?el=1_x_8&enrichId=rgreq-1adf2ba353932607a81d94bb45929fec-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI2NTU1NTMwOTtBUzoxNDA0ODU5ODk1MDcwNzJAMTQxMDUwNTg3ODk5MQ==


12

espèce est monomorphe, la question du sexage moléculaire marque donc le début de nos

investigations d’un point de vue génétique chez cette espèce. Par contre, d’autres espèces du

genre Zenaida ont fait l’objet d’analyses génétiques. Cela est notamment le cas de Z.

galapagoensis dont la variabilité génétique dans l’archipel des Galápagos a été étudiée à

l’aide de marqueurs microsatellites initialement développés chez Z. asiatica (Santiago-

Alarcon et al. 2006) De ce fait, ces marqueurs constituaient une piste intéressante pour

débuter, du moins en ce qui concerne l’étude de la variabilité inter-individuelle car en ce qui

concerne le sexage les seuls colombidés sexés génétiquement n’étaient pas aussi proches

phylogénétiquement parlant (Barré et al. 2003, Pike 2005).

La première phase de l’étude entreprise sur la tourterelle à queue carrée a donc été de

mettre en place une ossature méthodologique constituée d’outils aussi bien morphologiques

par l’acquisition de données morphométriques que génétiques via le sexage moléculaire et les

marqueurs microsatellites. Afin d’établir une base générale pour ce chapitre mais également

pour les suivants, nous procédons ici à une brève présentation du modèle biologique et de la

méthode d’acquisition des données ou en d’autres termes du travail de terrain. Par la suite, le

sexage moléculaire ainsi que l’application de cette méthode couplée à des techniques

morphométriques d’un point de vue méthodologique, seront exposés. Enfin, le développement

des marqueurs microsatellites a également été inclus dans ce chapitre. Toutefois, leur

application étant présentée dans les chapitres suivants, aucun exemple concret de leur

utilisation n’a été ajouté ici.

II. METHODE GENERALE : MODELE BIOLOGIQUE ET ACQUISITION

DES DONNEES

1. La tourterelle à queue carrée, Zenaida aurita

La tourterelle à queue carrée est un colombidé d’une taille corporelle (longueur du

corps) d’environ trente centimètres. Elle appartient au genre Zenaida regroupant sept espèces

de tourterelles exclusivement inféodées au Nouveau Monde (tableau 1). Certaines espèces de

ce genre sont largement distribuées à l’échelle du continent américain contrairement à

d’autres qui sont strictement inféodées à des complexes insulaires ce qui est le cas de notre

modèle biologique. Z. aurita est présente dans l’ensemble des Caraïbes (Bahamas, Grandes et

Petites Antilles, Evans 1990, Raffaele et al. 2006).


13

Tableau 1 : Espèces appartenant au genre Zenaida et leur aire de répartition.

Nom vernaculaire

Espèce Français Anglais Localisation

Z. macroura Tourterelle triste Mourning dove Amérique du Nord

Z. auriculata Tourterelle oreillarde Eared dove Amérique du Sud

Z. galapagoensis Tourterelle des Galápagos Galápagos dove Galápagos

Z. graysoni Tourterelle de Socorro Socorro dove Socorro*

Z. asiatica Tourterelle à ailes blanches White-winged dove Amérique du Nord et Centrale

Z. meloda Tourterelle mélodieuse Pacific dove Amérique du Sud

Z. aurita Tourterelle à queue carrée Zenaida dove Caraïbes

* population naturelle éteinte, populations captives en zoo uniquement.

Dans la plupart des îles caribéennes, les tourterelles à queue carrée occupent des

habitats principalement de type forestier mais elles sont généralistes dans leurs préférences de

nidification et d’approvisionnement (Nellis et al. 1984, Burger et al. 1989, Wiley 1991,

Rivera-Milán 1997, 1999), excepté à la Barbade où elles sont relativement anthropophiles,

notamment à cause de la destruction de la quasi-totalité de l’espace forestier (seulement une

faible surface de forêt primitive a été épargnée par la culture de la canne à sucre, Welchman

Hall Gully, St.Thomas Parish) et vivent en milieux faiblement urbanisés dans des parcs et

jardins arborés. Cette espèce est territoriale : les couples s’établissent sur des territoires qu’ils

défendent tout au long de l’année contre l’intrusion de congénères avec un comportement

ritualisé consistant en un lever d’aile ("wing raising", Lefebvre et al. 1996, figure 1).


14

Figure 1 : Comportement ritualisé de défense du territoire par lever d’aile ("wing raising")

chez la tourterelle à queue carrée, Zenaida aurita.

A l’image de bon nombre de colombidés y compris d’autres espèces du genre Zenaida

telles que Z. asiatica (Swanson & Rappole 1992) et Z. galapagoensis (Santiago-Alarcon &

Parker 2007), le dimorphisme sexuel chez la tourterelle à queue carrée est peu ou pas marqué

même si certains aspects du plumage ont pu être utilisés jusque là comme clés potentielles

d’identification sexuelle (del Hoyo et al. 1997, Gibbs et al. 2001, Sol et al. 2005). Toutefois,

ceci suppose que la variabilité interindividuelle du plumage chez Z. aurita ne puisse pas

biaiser l’assignement du sexe. De plus, chez les juvéniles, le sexage est impossible sur des

critères phénotypiques car leur plumage grisonnant permet, certes, leur discrimination vis-à-

vis des adultes, mais ne présente aucune différence entre sexes. Compte tenu du fait que

l’observation de comportements sexuels n’est pas toujours possible, plusieurs méthodes sont

potentiellement réalisables dont le sexage moléculaire et l’utilisation des mensurations des

individus qui ont été abordés un peu plus loin dans ce chapitre.

https://www.researchgate.net/publication/250076790_Ecological_mechanisms_of_a_resource_polymorphism_in_Zenaida_Doves_of_Barbados?el=1_x_8&enrichId=rgreq-1adf2ba353932607a81d94bb45929fec-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI2NTU1NTMwOTtBUzoxNDA0ODU5ODk1MDcwNzJAMTQxMDUwNTg3ODk5MQ==


15

2. Capture, acquisition des données morphométriques et prélèvements

sanguins

Les captures de tourterelles ont été réalisées à l’aide de cages à porte rabattable

("walk-in baited drop traps") appâtées avec du riz cuit mais également avec des clapnets

appâtés avec du pain (figure 2).

Figure 2 : Pièges types utilisés pour la capture des tourterelles à queue carrée, a) cage à porte

rabattable et b) clapnet.

Une fois capturés, les oiseaux ont été bagués avec une combinaison unique de bagues

plastiques (darvic) colorées (A.C. Hughes Ltd., Hampton Hill, United Kingdom) et une bague

aluminium numérotée du Muséum d’Histoire Naturelle de Paris, un programme de baguage

du C.R.B.P.O. (Centre de Recherches par le Baguage des Populations d’Oiseaux) étant en

cours pour cette espèce. Par la suite, l’acquisition des données morphométriques a été

effectuée selon les recommandations du C.R.B.P.O. (Brucy et al. 2007) et ce, en double afin

d’évaluer l’erreur de mesure et la répétabilité de nos mesures (figure 3). La longueur, la

largeur et la hauteur du bec ainsi que la longueur totale de la tête et les tarses (droit et gauche)

ont été réalisées à l’aide d’un pied à coulisse électronique (précision = 0,2 mm). Les mesures

de la longueur des ailes (droite et gauche) et de la queue ont quant à elles été obtenues à l’aide

d’un réglet (précision: ± 1 mm). Une fois les mesures réalisées, deux échantillons de sang

d’environ 40 µl ont été prélevés par ponction de la veine brachiale (entre le radius et l’ulna) à

l’aide d’une aiguille stérile gauge 27 et un capillaire hépariné. Les prélèvements étaient

immédiatement transférés dans 800µl de tampon de conservation adapté aux conditions

tropicales (pas de réfrigération) et constitué de 70% d’éthanol absolu et de 30% de TE (Tris-

EDTA pH 8).

16

Figure 3 : Mesures et prélèvement sanguins effectués sur chaque tourterelle à queue carrée capturée. a) longueur du bec, b) largeur du bec, c)

hauteur du bec, d) longueur total de la tête, e) longueur du tarse, f) longueur de l’aile, g) longueur de la queue, h) prise de sang et i) pesée.

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Une fois le prélèvement terminé, les oiseaux ont été pesés grâce à une balance digitale

de poche PESOLA® MS 500 (précision: ± 0.1 g, Suisse). Une fois l’ensemble du traitement

effectué, les oiseaux étaient relâchés sur leur site de capture.

3. Préparation des échantillons sanguins pour les analyses moléculaires

subséquentes : l’extraction d’ADN

Le sang a été choisi comme support pour les analyses moléculaires pour différentes

raisons. Chez les oiseaux le volume sanguin représente 7 à 10 % de la masse corporelle. Chez

la tourterelle triste, Zenaida macroura, qui est de taille et de masse comparables à Z. aurita,

un prélèvement sanguin d’un volume allant jusqu’à 0,5 ml ne semble pas porter atteinte à

l’oiseau en termes de survie (Bigler et al. 1977). De ce fait, en ne prélevant que 80 µl, la prise

de sang n’est que peu contraignante pour l’individu (excepté le stress de la manipulation). Par

ailleurs, bon nombre d’études se sont penchées sur les conséquences d’une prise de sang sur

des espèces sauvages et globalement, cette technique ne semble pas être dommageable pour

les oiseaux (Hoysak & Wetherhead 1991, Sheldon et al. 2008). Même si de l’ADN peut être

extrait à partir d’autres supports tels que la pulpe des plumes fraichement arrachées, le sang,

même en faible quantité, permet d’obtenir une très grande quantité d’ADN de bonne qualité,

les hématies des oiseaux étant nucléées. Ainsi, le panel d’analyses génétiques potentiellement

réalisables n’est pas limité ce qui n’est pas forcément possible dans le cas des plumes

(Taberlet & Bouvet 1991, Hogan et al. 2007).

Le protocole d’extraction a été modifié d’après le protocole phénol-chloroforme

d’Hillis et al. (1996) afin d’être adapté à nos échantillons, notamment en ce qui concerne le

tampon de stockage. En effet, celui-ci contient de l’éthanol qui est un inhibiteur de la

protéinase K, utilisée pour lyser les parois des hématies. La première étape du protocole était

donc de retirer ce tampon afin de ne garder que le sang. Pour cela, 100 µl de l’échantillon ont

été prélevés et centrifugés à 4000 rpm pendant une minute puis le surnageant contenant

seulement le tampon a été retiré. Au culot, 200 µl de tampon de lyse (Queen’s Lysis Buffer,

Seutin et al. 1991) et 0,1 mg de protéinase K ont été ajoutés et le tout a été laissé à incuber à

55°C pour un minimum de trois heures. Par la suite, un double lavage au phénol-chloroforme

a été réalisé suivi d’un autre uniquement au chloroforme afin d’ôter un maximum de lipides et

de phénol. Entre chaque lavage, le surnageant a été récupéré après centrifugation à 12 000

rpm pendant 8 min à 15°C. A la fin du troisième lavage, 375 µl d’isopropanol glacé (-20°C)

https://www.researchgate.net/publication/233529585_Seutin_G_White_BN_Boag_PT_Preservation_of_avian_blood_and_tissue_samples_for_DNA_analyses_Can_J_Zool_69_82-90?el=1_x_8&enrichId=rgreq-1adf2ba353932607a81d94bb45929fec-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI2NTU1NTMwOTtBUzoxNDA0ODU5ODk1MDcwNzJAMTQxMDUwNTg3ODk5MQ==

https://www.researchgate.net/publication/51140079_Optimizing_the_use_of_shed_feathers_for_genetic_analysis?el=1_x_8&enrichId=rgreq-1adf2ba353932607a81d94bb45929fec-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI2NTU1NTMwOTtBUzoxNDA0ODU5ODk1MDcwNzJAMTQxMDUwNTg3ODk5MQ==

https://www.researchgate.net/publication/227664616_Effects_of_blood_collection_on_wild_birds_An_update?el=1_x_8&enrichId=rgreq-1adf2ba353932607a81d94bb45929fec-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI2NTU1NTMwOTtBUzoxNDA0ODU5ODk1MDcwNzJAMTQxMDUwNTg3ODk5MQ==


18

ont été ajoutés au surnageant afin de précipiter l’ADN. Pour finir, l’ADN a été lavé avec trois

bains successifs d’éthanol 70% glacé (-20°C) couplés à une centrifugation à 15 000 rpm

pendant 5 min à 4°C, puis séché et enfin mis en suspension dans 100 µl un tampon d’élution

(Tris-EDTA ou TE pH8). Les extraits étaient alors utilisables sous un délai d’une demi-

journée, délai minimum nécessaire à leur bonne remise en suspension. Par la suite, leur

conservation s’effectuait à 4°C tant qu’ils étaient utilisés, puis à -20°C pour un stockage sur le

long terme.

III. SEXAGE ET DIMORPHISME SEXUEL CHEZ LA TOURTERELLE A

QUEUE CARREE : LES PROBLEMES METHODOLOGIQUES

1. Sexage moléculaire

a. Généralités sur le sexage chez les oiseaux

Chez les oiseaux, comme nous l’avons vu précédemment, bon nombre d’espèces sont

monogames que ce soit socialement ou génétiquement. Les origines du maintien de ce régime

d’appariement sont multiples. Parmi elles, les soins biparentaux aux jeunes sont souvent

avancés comme une contrainte majeure (celle-ci découlant de l’oviparité) ayant favorisée le

maintien de la monogamie mais la territorialité par exemple, en est une autre (Mock 1985,

Gowaty 1996, Cézilly 2006). Globalement, l’ensemble de ces contraintes tend à réduire la

variabilité du succès reproducteur des mâles monogames comparés aux mâles polygynes et en

conséquences diminuerait l’intensité de la sélection sexuelle et par extension les différences

entre mâles et femelles d’un point de vue phénotypique.

Un faible dimorphisme sexuel et des organes reproducteurs internes font que les

espèces aviaires monomorphe sont difficiles à sexer. Jusque vers la fin du XXème siècle,

diverses méthodes anatomiques par observation des organes sexuels internes (Petrides 1950,

Miller & Wagner 1955, Shamis & Forrester 1977, Bancroft 1984, Malacalaza & Hall 1988,

Swanson & Rappole 1992, Lorentsen & Røv 1994 Small et al. 2005), analyses des

vocalisations (Blakesley et al. 1990, Murie et al. 1991, Bretagnolle & Thibault 1995, Lo

Valvo 2001, Gill & Vonhof 2006, Bourgeois et al. 2007) ou des comportements sexe-

spécifiques (Castoro & Guhl 1958, Chardine & Morris 1989, Desrochers 1990, Hull 1996,


19

Martínez-Gómez & Curry 1998, Flux & Innes 2001, Fletcher & Hamer 2003, Alarcos et al.

2007) mais également des procédures mathématiques telles que l’analyse discriminante

associées aux techniques citées précédemment (tableau 2). Puis dans les années 1990, les

premières techniques moléculaires dédiées au sexage des oiseaux apparaissent et deviennent

quasiment incontournables dès lors que le déterminisme du sexe est nécessaire (pour une

présentation de ces techniques se référer à Dubiec & Zagalska-Neubauer 2006).

b. Méthodes de sexage moléculaire

i. Généralités

Chez les oiseaux non-ratites, le sexage moléculaire est essentiellement basé sur des

variations de séquences du gène CHD1 (codant pour une protéine, la "Chromo-Helicase-DNA

binding protein", Griffiths & Tiwari 1993, Ellegren 1996, Griffiths et al. 1996, Dubiec &

Zagalska-Neubauer 2006). Ce gène est situé sur les deux chromosomes sexuels, Z et W,

présents chez les oiseaux et les séquences arborent un haut degré de conservation entre elles

(Ellegren 1996, Griffiths et al. 1996, Ellegren & Fridolfsson 1997, Griffiths & Korn 1997,

Fridolfsson et al. 1998). A l’inverse des humains où les hommes sont hétérogamétiques, chez

les oiseaux se sont les femelles qui le sont (ZW) alors que les mâles sont homogamétiques

(ZZ). Ainsi, le gène CHD1 est un marqueur intéressant pour le déterminisme du sexe. Chaque

copie du gène (CHD1-W et CHD1-Z) présent sur l’un ou l’autre des chromosomes sexuels

diffère de l’autre par leurs séquences ou la taille d’un intron. Bon nombre de techniques

moléculaires basées sur l’amplification de différentes sections du gène ont été développées à

ce jour (Dubiec & Zagalska-Neubauer 2006). Toutefois, le choix d’une méthode de

visualisation de ce polymorphisme n’est pas évident car il est dépendant de différentes

contraintes techniques inhérentes à la PCR. Dans un premier temps, la conservation des

séquences des amorces doit être vérifiée ce qui se traduit par une bonne qualité

d’amplification pour les copies Z et W (absence d’allèle nul comme pour les microsatellites,

Pemberton et al. 1995). Un autre problème émane du fait que les techniques de PCR

couramment employées sont basées sur la détection d’un polymorphisme de taille des allèles.

Dans certains cas, seul le plus petit allèle est amplifié ("short allele dominance", voir Wattier

et al. 1998). Ceci peut potentiellement poser problème lorsque que l’allèle diagnostique

(spécifique aux femelles) à savoir CHD1-W n’est pas le plus petit. En effet, si CHD1-Z est

préférentiellement amplifié à défaut de CHD1-W, certaines femelles seront identifiées comme


20

mâles. Enfin, le dernier point important est la quantité d’ADN disponible. Si celle-ci n’est pas

suffisante, seulement un des deux allèles peut être aléatoirement amplifié, ce qui, comme

précédemment, peut induire une assignation au mauvais sexe ("allelic drop out", voir Taberlet

et al. 1996). Par la suite, les résultats obtenus via les analyses moléculaires doivent être

confrontés à ceux obtenus par une autre méthode (observations comportementales, anatomie,

vocalises) ce qui ne peut être souvent réalisé que sur un faible nombre d’individus (Robertson

& Gemmell 2006).

ii. Mise en place du sexage moléculaire chez la tourterelle à queue

carrée

Afin de choisir la méthode moléculaire la plus appropriée au sexage des tourterelles à

queue carrée, deux couples d’amorces ont été testés. Le premier couple, P2 (5′-

TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3’) et P8 (5′-CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3′), a été

défini par Griffiths et al. (1998) et le second, 2550F (5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-

3′) et 2718R (5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′), a été défini par Fridolfsson &

Ellegren (1999). Le choix pour ces deux paires d’amorces ne s’est pas fait au hasard. Non

seulement ils amplifient le gène CHD1 sur des portions différentes (incluant chacune un

intron), ce qui offre une base méthodologique pour comparer la qualité des deux techniques

mais ce sont également les plus employés (Griffiths et al. 1998 ont été cités 773 fois contre

335 citations pour Fridolfsson & Ellegren 1999 ; source : Web of Knowledge, octobre 2009).

De plus, le couple 2550F / 2718R a déjà été utilisé pour le sexage chez des colombidés

comme le pigeon domestique, Columba livia domestica (Pike 2005) ou chez le notou, Ducula

goliath (Barré et al. 2003).

Dans un premier temps, trois couples de tourterelles (observations comportementales)

ont permis de tester le couple P2 / P8 puis un groupe de 88 individus (sélectionnés au hasard)

ont été sexés par P2 / P8 et 2550F / 2718R. Les PCR étaient effectuées dans un volume total

de 10 µl composés de 100 ng d’ADN (pas d’"allelic drop-out"), 200 µM de chaque dNTP,

200 nM de chaque amorce, 1X de tampon de réaction et 0,45 U de Taqpolymérase HotMaster

(5-PRIME). L’amplification de l’ADN était effectuée dans un thermocycler T3 (Biometra) et

commençait par une dénaturation initiale à 94°C pour 1 min. 30 suivi de 35 cycles de 20 s. à

94°C, 30 s. à 46°C et 30 s. à 65°C pour terminer avec une élongation finale à 65°C pendant 3

min. Etant donné que les produits issus de l’amplification avec P2 / P8 ne différaient pas en


21

taille, une étape supplémentaire de restriction a été appliquée sur ce couple avant

l’électrophorèse. A cette fin, les produits de PCR issus de P2 / P8 ont été digérés avec une

unité d’enzyme de restriction DdeI pendant 5 h à 37°C, coupant spécifiquement l’allèle

CHD1-W (Griffiths et al. 1996, Bermúdez-Humarán et al. 2002). Les variations de taille des

introns ont été par la suite visualisées après une électrophorèse de 30 min (100 V) sur gel

d’agarose à 3 % dans un tampon TBE 1 X (Tris-borate-EDTA) et une révélation sous lampe

UV après immersion dans un bain de bromure de BET (bromure d’éthidium). Les tailles

obtenues différaient en fonction du couple d’amorces utilisées avec CHD1-W = 290 + 90 pb

et CHD1-Z = 380 pb pour P2 / P8 (après restriction) et CHD1-W = 450 pb et CHD1-Z = 750

pb pour 2550F / 2718R. Sur les 88 individus sexés, les deux méthodes apportent les mêmes

résultats. La différence majeure entre ces deux techniques, outre le temps de manipulation,

était liée au biais potentiellement introduit par le recours à l’enzyme de restriction. En effet, si

l’enzyme ne coupait pas (mauvaise manipulation, inactivation de l’enzyme), les femelles

seraient identifiées comme étant des mâles ce qui implique de réaliser la manipulation deux

fois, du moins sur les individus identifiés comme mâles. De ce fait, le couple d’amorces

retenu pour le sexage chez la tourterelle à queue carrée a été 2550F / 2718 R. De plus, ce

couple d’amorce produit des fragments dont la différence de taille (300bp) est très aisément

détectable sur gel d’agarose à 2%.

Depuis cette étude préliminaire, des travaux impliquant un sexage moléculaire chez

d’autres colombidés réalisé avec ce même couple d’amorces ont été publiés notamment chez

la tourterelle turque, Streptopelia decaocto (Eraud et al. 2008) mais également chez une

espèce appartenant au genre Zenaida, Z. galapagoensis (Santiago-Alarcon & Parker 2007).

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Tableau 2: Exemples d’études incluant un sexage via une procédure mathématique (analyse en composante principale, modèle linéaire

généralisé, régression linéaire et analyse discriminante) et une ou plusieurs méthodes de référence.

Procédures mathématiques Méthodes de sexage de référence

Espèces Anatomie

interne Anatomie externe

Plumage Comportement Vocalises Moléculaire Références

Analyse en composante principale

Biziura lobata McCracken et al. (2000)

Bubo bubo x del mar Delgado & Penteriani (2004)

Chlidonias niger x Shealer & Cleary (2007)

Limosa limosa limosa x Schroeder et al. (2008)

Mycteria leucocephala x Urfi & Kalam (2006)

Phalaropus lobatus x Rubega (1996)

Tringa glareola x Remisiewicz & Wenerberg (2006)

Modèle linéaire généralisé

Calidris maritima x Hallgrimsson et al. (2008)

Régression linéaire

Caracara plancus x Morrison & Maltbie (1999)

Gallinago hardwickii x Ura et al. (2005)

Loxioides bailleui x Jeffrey et al. (1993)

Porphyrio porphyrio melanotus x Millar et al. (1996)

Thryothorus leucotis x x Gill & Vonhof (2006)

Analyse discriminante et régression linéaire

Charadrius montanus x Iko et al. (2004)

Analyse discriminante

Aegolius funereus x Hipkiss (2007)

Alca torda x Grecian et al. (2003)

Alle alle x Jakubas & Wojczulanis (2007)

Anous stolidus x Chardine & Morris (1989)

Buteo jamaicensis x Donohue & Dufty (2006)

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Tableau 2 suite


Espèces Anatomie



Buteo jamaicensis / B. lineatus / Accipiter cooperii x Pitzer et al. (2008)

Calidris alpina x x Meissner & Pilacka (2008)

Calidris canutus x Baker et al. (1999)

Calidris temminckii x Lislevand et al. (2009)

Callaeas cinerea wilsoni x x x Flux & Innes (2001)

Calonectris diomedea x Bretagnolle & Thibault (1995)

Calonectris diomedea x Lo Valvo (2001)

Catharacta antarctica lonnbergi x x Janicke et al. (2007)

Catharus bicknelli x x Frey et al. (2008)

Cerorhinca monocerata, x x Nizuma et al. (1999)

Chersophilus duponti x Vögeli et al. (2007)

Corvus moneduloides x Kenward et al. (2004)

Cyanopica cyanus cooki x Alarcos et al. (2007)

Daption capense x x Weidinger & van Franeker (1998)

Dendrocygna viduata x x Volodin et al. (2005)

Dendrocygna viduata / D. bicolor / D. arborea / D. autumnalis x x Volodin et al. (2008)

Ducula goliath x Barré et al. (2003)

Eudocimus albus x Herring et al. (2008)

Eudyptes schlegeli / E. chrysocome x Hull (1996)

Eudyptula minor x Hocken & Russell (2002)

Eudyptula minor x Arnould et al. (2004)

Falco naumanni x x Rodriguez et al. (2005)

Fulmarus glacialis x Mallory & Forbes (2005)

Fulmarus glacialis / F. glacialoides / Thalassoica antarctica / Daption capense

x x van Franeker & ter Braak (1993)

Gallinula chloropus x Cucco et al. (1999)

Haematopus ostralegus x x Zwarts et al. (1996)

Haematopus ostralegus x van de Pol et al. (2009)

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Tableau 2 suite


Espèces Anatomie



Haliaeetus albicilla x Helander et al. (2007)

Hieraaetus fasciatus x Palma et al. (2001)

Hirundo rustica x Hermosell et al. (2007)

Hylophilus ochraceiceps ochraceiceps / H. decurtatus decurtatus / Xenops minutus mexicanus / Automolus ochrolaemus cervinigularis

x Winker et al. (1994)

Lagopus lagopus x x x Gruys & Hannon (1993)

Larus argentatus x Evans et al. (1995)

Larus atricilla x Hanners & Patton (1985)

Larus cachinnans x Bosch (1996)

Larus californicus x Schnell et al. (1985)

Larus californicus x Rodriguez et al. (1996)

Larus crassirostris x Chochi et al. (2002)

Larus michahellis lusitanius x Arizaga et al. (2008)

Larus michahellis lusitanius x Galarza et al. (2008)

Larus novaehollandiae scopulinus x Mills (1971)

Lonchura striata phaethontoptila / Lonchura striata var. domestica x x Mizuta et al. (2003)

Lymnocryptes minimus x Sikora & Dubiec (2007)

Macronectes giganteus x Copello et al. (2006)

Megadyptes antipodes x Setiawan et al. (2004)

Miliaria calandra x Campos et al. (2005)

Mimodes graysoni x Martinez-Gomez & Cury (1998)

Nestor notabilis x Bond et al. (1991)

Parus atricapillus x Desrochers (1990)

Passerculus sandwichensis x x Wheelwright et al. (1994)

Pelecanus erythrorhynchos x Dorr et al. (2005)

Phalacrocorax albiventer x Malacalaza & Hall (1988)

Phalacrocorax atriceps x x x Svagelj & Quintana (2007)

Phalacrocorax auritus auritus x Glahn & McCoy (1995)

https://www.researchgate.net/publication/240795785_Sexing_White-rumped_Munias_in_Taiwan_using_morphology_DNA_and_distance_calls?el=1_x_8&enrichId=rgreq-1adf2ba353932607a81d94bb45929fec-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI2NTU1NTMwOTtBUzoxNDA0ODU5ODk1MDcwNzJAMTQxMDUwNTg3ODk5MQ==

https://www.researchgate.net/publication/233314915_Sexing_Red-billed_Gulls_from_standard_measurements?el=1_x_8&enrichId=rgreq-1adf2ba353932607a81d94bb45929fec-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI2NTU1NTMwOTtBUzoxNDA0ODU5ODk1MDcwNzJAMTQxMDUwNTg3ODk5MQ==

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25

Tableau 2 suite


Espèces Anatomie



Phalacrocorax carbo x Liordos & Goutner (2008)

Phalacrocorax magellanicus x Quintana et al. (2003)

Plegadis falcinellus x x Figuerola et al. (2006)

Podiceps grisegena x x Kloskowski et al. (2006)

Podiceps nigricollis x Jehl et al. (1998)

Porphyrio mantelli x Eason et al. (2001)

Pseudonestor xanthophrys x Berlin et al. (2001)

Puffinus carneipes x x Thalmann et al. (2007)

Puffinus mauretanicus x Genovart et al. (2003)

Puffinus yelkouan x x Bourgeois et al. (2007)

Ramphastos toco / R. dicolorus x Castro et al. (2003)

Rissa tridactyla x x Jodice et al. (2000)

Rynchops niger x x Mariano-Jelicich et al. (2007)

Spheniscus magellanicus x Bertellotti et al. (2002)

Stercorarius parasiticus x x Phillips & Furness (1997)

Sterna dougallii x Reynolds et al. (2008)

Sterna forsteri x x Bluso et al. (2006)

Sterna hirundo x Nisbet et al. (2007)

Sterna hirundo / S. paradisaea x Fletcher & Hamer (2003)

Sterna paradisaea x Devlin et al. (2004)

Strix aluco x x Hardy et al. (1981)

Strix occidentalis caurina x x Blakesley et al. (1990)

Strix occidentalis caurina x x x Fleming et al. (1996)

Sturnus roseus x Zenatello & Kiss (2005)

Thalassoica antarctic x Lorentsen et Røv (1994)

Thryothorus maculipectus / Henicorhina leucosticta prostheleuca x Winker et al. (1996)

Todiramphus cinnamominus x Kesler et al. (2006)

Troglodytes troglodytes indigenus x Sweeney & Tatner (1996)


26

2. Sexage via l’utilisation de données morphométriques : les biais

méthodologiques

ANNEXE 1

Monceau, K., Cézilly, F. & Dechaume-Moncharmont, F.-X. Sexing birds using discriminant

function analysis based on morphometric measurements: A critical appraisal.

Manuscrit en préparation

Comme présenté en introduction de ce chapitre, plusieurs méthodes de sexage ont été

employées lors d’études sur des espèces aviaires présentant un faible dimorphisme sexuel.

Parmi les méthodes couramment retrouvées dans la littérature, l’analyse discriminante (AD),

procédure statistique de classement des individus, apparait comme étant une méthode rapide

et peu invasive au moment du baguage. Le principe de l’AD est simple dans sa philosophie

mais sa mise en œuvre pratique peut s’avérer dans certains cas un peu technique. Il s’agit de

trouver la combinaison (linéaire ou non) de variables, discriminant au mieux les individus

mesurés. Dans notre cas, l’analyse est effectuée sur un groupe d’oiseaux de sexe identifié

(avec certitude) à l’avance par une méthode alternative (sexage moléculaire) et sur lesquels

une série de mesures morphométriques a pu être effectuée. L’AD permet d’établir une

équation prédisant au mieux le sexe des individus. Grâce à celle-ci, chaque oiseau obtient un

score l’assignant à un groupe, en l’occurrence ici soit aux femelles soit aux mâles. Une fois

cette équation déterminée, le pouvoir discriminant global (ou score de discrimination) peut

être évalué par une méthode de validation.

D’une manière générale et comme pour toute procédure statistique, il convient de

porter une attention particulière aux nombreux biais potentiels pouvant influencer la

pertinence de l’analyse. Dans le cas particulier de l’AD, un examen de la littérature révèle que

les premiers auteurs à utiliser cette technique y étaient très sensibles. Avec la popularisation

de cette méthode et l’augmentation du nombre de logiciels d’analyses statistiques proposant

des algorithmes d’AD (plus ou moins automatisés), certains auteurs semblent avoir négligé de


27

nombreuses recommandations pourtant clairement évoquées par ailleurs dans la littérature

statistique. Celles-ci sont de divers ordres. Tout d’abord, la taille de l’échantillon est un

paramètre incontournable en statistique limitant souvent la puissance des tests. Ainsi,

intuitivement nous nous attendons à ce que le niveau de discrimination augmente avec une

taille d’échantillon croissante. Le second point concerne les erreurs de mesures. Celui-ci est

surtout inhérent à la prise de données morphométriques. Dans notre cas, l’enjeu est de réussir,

à identifier mâles et femelles chez des espèces à faible dimorphisme sexuel et donc chez

lesquelles les différences mesurées sont faibles. De ce fait, l’erreur de mesure pourrait

affaiblir le niveau de discrimination de l’AD en réduisant artificiellement ces différences. Le

troisième point concerne la méthode de réduction du nombre de variables incluses dans la

fonction discriminante finale consistant en une procédure automatique ou non d’élimination

ou insertion "pas à pas" ("stepwise") de variables. En effet, l’utilisation de routines

automatiques, implémentées dans bon nombre de logiciels statistiques classiques, est

fortement remise en cause non seulement dans des revues de statistiques mais également dans

des domaines moins spécialisés comme dans des revues d’écologie (Williams & Titus 1988)

ou de psychologie (Thompson 1995). Enfin le dernier point concerne la méthode de validation

à l’issue de l’AD à proprement parler. En fait, trois grandes familles de méthodes de

validation existent (Eisenbeis 1977). Tout d’abord, la technique de re-substitution consiste à

utiliser directement la population ayant servi à calibrer l’équation discriminante. La raison de

sa popularité réside dans sa grande simplicité. Toutefois, elle présente de nombreux biais

évidents du fait de la circularité gênante consistant à évaluer une fonction avec les données

mêmes ayant servi à sa calibration. De ce fait, le score discriminant obtenu est toujours

surestimé (Eisenbeis 1977, Ryder 1978). La seconde technique envisageable consiste à

effectuer des validations croisées ("leave-one-out procedure" également connu sous le nom de

"jackknife") : un individu de la population des n individus que contient le jeu de données

initial est exclu puis l’équation discriminante est ajustée sur les n-1 individus restants. Enfin,

le score de l’individu initialement retiré de l’analyse est alors estimé. Cette procédure est

répétée pour les n individus de la population. Elle conduit à un score de discrimination non

biaisé et qui devrait donc être moins surévalué que celui obtenu par re-substitution. Cette

méthode de jackknife est assez gourmande en calcul mais elle est maintenant implémentée en

routine sur la plupart des grands logiciels de statistiques (R, SAS, SPSS). La troisième grande

classe de méthodes consiste à diviser le jeu de données en deux sous-échantillons ("sample

splitting"), l’un servant à ajuster l’équation discriminante et l’autre en tester le pouvoir

discriminant. Cette méthode est par définition, elle aussi, exempte de biais et présente


28

l’avantage d’être très intuitive et facile à mettre en œuvre. Pourtant, plusieurs problèmes

peuvent être notés. L’équation et le score discriminant associé sont intimement dépendants du

sous-échantillonnage effectué aléatoirement. En d’autres termes, avec un autre

échantillonnage, l’équation et le score obtenus sont potentiellement différents.

Globalement, une revue de la littérature (85 articles) nous a permis de constater que la

plus grande confusion régnait quant à l’utilisation de routines automatiques de réduction de

variables et à la méthode employée pour l’évaluation du score de discrimination. Dans le

premier cas, une fraction très importante des travaux que nous avons évalués (60%) ont eu

recours aux méthodes automatiques. De même pour les techniques de validation où 43,5% des

travaux rapportaient clairement aucune méthode d’évaluation ou avaient utilisé la technique

de re-substitution, 35,3% avaient utilisé le jackknife, 21,2% le sous-échantillonnage. Cette

diversité des méthodes est d’autant plus problématique, que de nombreux auteurs comparaient

les scores de discrimination de plusieurs études aux méthodes différentes. De plus, seulement

cinq études sur les 85 étudiées évoquaient l’existence de l’erreur de mesure (Jodice et al.

2000, Flux & Innes 2001, Devlin et al. 2004, Kenward et al. 2004, Mallory & Forbes 2005).

A partir de simulations réalisées sur un jeu de données important récoltées sur 525

tourterelles à queue carrée capturées en 2007, les effets de ces quatre paramètres (taille de

l’échantillon, erreur de mesure, réduction pas à pas du nombre de variables et effet de la

méthode d’évaluation du score de discrimination) ont été testés. Cette espèce est d’autant plus

un bon modèle pour ce type d’analyse que le niveau de dimorphisme sexuel qu’elle présente

est faible.

A l’issue des simulations, les effets de la taille d’échantillon sont contradictoires en

fonction de la méthode de validation employée, l’une augmentant le taux de discrimination de

pair avec un effectif croissant, alors que l’autre le diminue. Ainsi, en utilisant uniquement le

jackknife (procédure la moins biaisée), l’erreur de mesure semble fortement diminuer le

niveau de discrimination de l’AD.

En fin de compte, un problème méthodologique récurrent au sein de la littérature

scientifique semble émerger. Il concerne le niveau d’imprécision de certains articles publiés

dont les auteurs omettent consciemment ou non, de préciser la méthode de validation

employée. Derrière cela se cache également un problème lié aux logiciels statistiques

couramment employés tels que Jmp ou Statistica qui ne précisent pas quel type de méthode

est incrémenté dans leur fonction. De ce fait, le taux de discrimination de certaines analyses

pourrait être involontairement surévalué.


29

IV. ETUDE DE LA VARIABILITE INTERINDIVIDUELLE : MISE AU POINT DES MARQUEURS MICROSATELLITES

ANNEXE 2

Monceau, K., Gaillard, M., Harrang, E., Santiago-Alarcon, D., Parker, P., Cézilly, F. &

Wattier, R. 2009. Twenty-three polymorphic microsatellite markers for the Caribbean

endemic Zenaida dove, Zenaida aurita, and its conservation in related Zenaida species.

Conservation Genetics, 10, 1577-1581.

Compte tenu de l’existence de marqueurs microsatellites développés pour Z. asiatica,

polymorphes en transpécifique chez Z. galapogoensis (Santiago-Alarcon et al. 2006), des tests

d’amplification chez Z. aurita ont été réalisés. En parallèle, des marqueurs développés chez le

pigeon domestique, Columba livia (Traxler et al. 2000), dont un était polymorphe chez la

tourterelle des Galápagos (CliµT17, Santiago-Alarcon et al. 2006), ont été ajoutés au groupe

de loci à tester. Ainsi, la qualité d’amplification de 16 microsatellites a été évaluée (tableau

3). Compte tenu du faible taux de réussite (quatre loci exploitables), des marqueurs

spécifiquement développés pour Z. aurita étaient indispensables pour pouvoir bénéficier d’un

plus grand nombre de loci. Les principales étapes du développement de ces marqueurs

(création de la banque, enrichissement pour des motifs microsatellites, séquençage des clones

positifs et définition des amorces) ont été effectuées par la société californienne Genetic

Identification Services (G.I.S., www.genetic-id-services.com). Par la suite, huit individus

issus de la même population ont été typés pour les 33 loci potentiels développés par le G.I.S.

pour tester leur qualité d’amplification et leur niveau de polymorphisme. Sur l’ensemble, dix

n’étaient pas polymorphes ou ne présentaient pas de motifs lisibles. Les 23 restants ont été

testés sur un nombre plus important d’individus afin d’affiner leur niveau de polymorphisme,

de tester la présence d’un déséquilibre de liaison et la conformité de la stucture génotypique

observée avec celle attendue sous l’hypothèse d’un équilibre de Hardy-Weinberg. De même,

des tests d’amplification transpécifique ont été réalisés chez quatre autres espèces du genre

Zenaida : Z. galapagoensis, Z. auriculata, Z. macroura et Z. meloda ainsi que chez une autre

espèce de tourterelle fréquemment rencontrée sous les mêmes latitudes, la colombe à queue


30

noire, Columbina passerina. Pour toutes ces espèces, les échantillons d’ADN nous ont été

procurés par D. Santiago-Alarcon et P. Parker (Université du Missouri, St Louis, Etats Unis

d’Amérique). Les détails techniques d’amplification et de visualisation du polymorphisme

sont présentés en détail dans la note technique (Annexe 2 : Monceau et al. 2009).

Au final, 23 loci microsatellites sont disponibles pour l’étude de la variabilité

génétique chez la tourterelle à queue carrée avec un niveau de polymorphisme allant de deux

(ZaD127) à 11 allèles (Za5). Trois multiplex combinant gammes de variations alléliques non

chevauchantes, niveau de polymorphisme élevé (mimum six alléles), qualité d’amplification,

lisibilité et absence d’allèles nuls ont été constitués. Ainsi, un ensemble de sept à dix

marqueurs a été utilisé par la suite pour nos analyses (voir chapitres II, III).

https://www.researchgate.net/publication/225437536_Twenty-three_polymorphic_microsatellite_markers_for_the_Caribbean_endemic_Zenaida_dove_Zenaida_aurita_and_its_conservation_in_related_Zenaida_species?el=1_x_8&enrichId=rgreq-1adf2ba353932607a81d94bb45929fec-XXX&enrichSource=Y292ZXJQYWdlOzI2NTU1NTMwOTtBUzoxNDA0ODU5ODk1MDcwNzJAMTQxMDUwNTg3ODk5MQ==


31

Tableau 3: Marqueurs microsatellites développés chez le pigeon domestique (Columba liva)

et chez la tourterelle à ailes blanches (Zenaida asiatica). Na représente le nombre d’allèles

obtenus pour le test de polymorphisme.

Locus / N° d’accession

Séquences des amorces Taille

attendues (pb)

Tailles observées

(pb)

Qualité d'amplification

Na

Columba livia

CliµD01 F: GATTTCTCAAGCTGTAGGACT 68-120 - - -

AF188627 R: GTTTGATTTGGTTGGGCCATC

CliµD16 F: GCAGTGATAAAGTTCTGGAACA 85-134 - - -

AF188628 R: GTTTGCCTCACCGTGACATCA

CliµD17 F: TCTTACACACTCTCGACAAG 114-128 - - -

AF188629 R: GTTTCCACCCAAATGAGCAAG

CliµD19 F: CCGTTTCTTCTAATGCAC 171-198 - - -

AF192275 R: GTTTGGATTTCTGGGAGTGTATG

CliµD32 F: GAGCCATTTCAGTGAGTGACA 136-158 - - -

AF188630 R: GTTTGCAGGAGCGTGTAGAGAAGT

CliµT13 F: TCCAGAAGACACAGGCTAGT 190-212 180-1200 mauvaise -

AF188631 R: GTTTGCAAGCCCTGGTTATCTCA

CliµT17 F: ATGGGTTTGGAGATGTTTTG 208-244 220-250 correcte 3

AF188632 R: GTTTGATGGAGTTGCTATTTTGCT

Zenaida asiatica

WE2-17 F: ATC TAC CAG CCG AAG CAA 148 250 correcte 1

- R:GAG GCC AGG ATA AAG CAA CT

WE2-24 F: GGC ATA TCA CAG GAC AAG G 138-140 160 correcte 1

AF260575 R:ACT TTA AAC GCC ACA TTC AC

WU1-36 F: CCT GCC CAG CTA CTG TTT G 144 120-700 mauvaise -

- R:TTC ATG CCT TCA TTC CCA TA

WU7a-117 F: CTCAGTGTAAATATGGCAGGGAATC 194-222 210-290 correcte 7

AF260574 R:CAGGTCTTTTTGGTGGATGTCAC

WUA-38 F: GGA GGG CAC CAG AGT TG 123 190-210 correcte 7

AY428751 R:GAT AAG ACC CGA CTT TCA GC

WUE-1 F: CAG TGT GGC AGG TAC TTC A 133-151 170-190 correcte 3

AF260573 R:CTC ATT AGT GGA CCT TGG AC

WU e107 F: CGC AGG GTC TGT GTG AGT GA 126 150 correcte 1

- R:GCC CAT CCT GCA CCT AAG AG

WUJ22 F: CAG GAG CCA TCG TAC ACA T 148 170 correcte 1

AY428752 R:TGA ATT ACC CCA TCA ACA AG

WUI-69 F: AAGGGATATTATGGCAAAACC 173-189 210 correcte 1

AF260576 R:GAGCAGCAGCCCAGAAT

32

CHAPITRE II

-

POLYMORPHISME DE RESSOURCES CHEZ

LA TOURTERELLE A QUEUE CARREE

33

CHAPITRE II

-

POLYMORPHISME DE RESSOURCES

CHEZ LA TOURTERELLE A QUEUE CARREE

Quel que soit le champ disciplinaire invoqué, la validité d’une expérience scientifique,

d’un point de vue méthodologique, est basée sur trois principes : l’établissement d’un groupe

contrôle, le traitement aléatoire (randomisation, de l’anglais "random" au hasard) ainsi que la

réplication (Johnson 2002, 2006). Bien que l’utilisation d’un groupe témoin soit dans certains

cas discutable, la randomisation ne peut être effectuée que si le traitement est dupliqué

(Johnson 2006). Outre ce paramètre aléatoire, la réplication permet de limiter la surestimation

d’un effet en limitant les erreurs potentielles. Ceci est vrai, d’une part parce qu’une erreur

unique surpasse une moyenne d’erreurs indépendantes, notamment à cause du fait que les

erreurs sont distribuées aléatoirement grâce à la randomisation, mais également car la

variabilité observée sur l’effet mesuré estime l’erreur (Johnson 2006).

Cette définition de la réplication s’applique dans le cadre d’une expérimentation mais un

niveau supérieur de résolution peut être et doit être envisagé à savoir la métaréplication

(Johnson 2002, 2006, McCaffery & Ruthrauff 2004, Tallmon & Mills 2004, Tigreros et al.

ANNEXE 3

Monceau, K., Dechaume-Moncharmont, F.-X., M., Wattier, R. A., Motreuil, S. & Cézilly, F.

Territoriality vs. flocking in the Zenaida dove, Zenaida aurita: Resource polymorphism

revisited using morphological and genetic analyses.

Manuscrit à soumettre à Ecology.

Chapitre II – Polymorphisme de ressources chez la tourterelle à queue carrée

34

2009). Encore appelée réplication conceptuelle (Kelly 2006), elle désigne la réitération d’une

étude complète mais en différents lieux et temps, avec de nouveaux expérimentateurs et

surtout une autre méthode, ceci dans le seul but de renforcer la véracité de l’effet observé en

éliminant un artefact dû à des circonstances particulières. Bien que la métaréplication soit

encore peu pratiquée en biologie évolutive et en écologie (Kelly 2006), quelques études ont

d’ores et déjà été publiées (McCaffery & Ruthrauff 2004, Tigreros et al. 2009). Toutefois,

certaines expériences empiriques nécessiteraient d’être systématiquement dupliquées afin

d’éviter que leur influence ne devienne trop importante au regard de leur légitimité comme

cela est le cas pour l’article de Bateman (1948), cité 1080 fois (source Web of Knowledge), et

récemment remis en cause par Snyder & Gowaty (2007). Néanmoins, comme le précisent

dans ce cas là les auteurs, le but de ce type d’article n’est pas de faire un procès à leur

prédécesseur, mais avant tout d’informer et de faire progresser la recherche sur le thème

considéré (Snyder & Gowaty 2007).

C’est justement dans cet esprit que nous avons décidé d’appréhender sous un autre

angle l’étude réalisée par Sol et al. (2005) sur la ségrégation des ressources observée chez les

tourterelles à queue carrée de la Barbade. Bien que les individus de cette espèce soient

territoriaux et défendent un site tout au long de l’année contre l’intrusion de congénères, une

partie d’entre eux se nourrit en groupe sans qu’il y ait de comportement agonistique (Carlier

& Lefebvre 1996, Dolman et al. 1996, figure 1). En se basant sur des comparaisons

morphologiques, comportementales et écologiques (par l’étude de leurs préférences

alimentaires), Sol et al. (2005) ont déduit qu’il s’agissait d’un cas de polymorphisme de

ressources (Skúlason & Smith 1995, Smith & Skúlason 1996). Toutefois, certains points

méthodologiques sont susceptibles d’être améliorés. Le premier concerne l’absence de

réplication pour ce qui est des stratégies d’approvisionnement car un seul site territorial et un

seul site de nourrissage en groupe ont été échantillonnés et ce sur une seule et même année.

Le second point concerne la méthode de sexage, basée sur la couleur du plumage (del Hoyo et

al. 1997, Gibbs et al. 2001). Chez cette espèce, le dimorphisme sexuel est faible (chapitre I) et

la variation de coloration des plumes peut notamment être imputable à une simple variabilité

interindividuelle. De plus, les juvéniles ne peuvent pas être sexés selon cette méthode et ils

ont donc été exclus de leur analyse morphologique.

Afin, d’améliorer d’un point de vue méthodologique l’étude menée par Sol et al. (2005), un

réplicat pour chaque site a été ajouté, et ce pour deux années consécutives. De plus, nous

avons réalisé un sexage moléculaire de l’intégralité des individus adultes et juvéniles

capturés. Enfin, nous avons également réalisé une analyse complémentaire de différenciation

Chapitre II – Polymorphisme de ressources chez la tourterelle à queue carrée

35

génétique afin de déterminer l’existence potentielle d’un isolement entre sites puisque nous

disposions de marqueurs microsatellites développés chez cette espèce (Monceau et al. 2009,

annexe 2). D’un point de vue général, notre étude correspond à la définition d’une

métaréplication au sens de Johnson (2002), à savoir une réitération d’une étude

précédemment entreprise mais avec une méthodologie propre (au sens personnel du terme).

Les résultats que nous obtenons par notre méthode ne concordent pas avec l’hypothèse

du polymorphisme de ressources défendue par Sol et al. (2005). De plus, les différences

observées d’un point de vue morphologique entre les deux articles pourraient en partie être

imputables à un mauvais sexage lors de la première étude. Globalement, nos travaux montrent

non seulement l’intérêt de la métaréplication qui devrait être plus souvent rencontrée dans la

littérature mais également, et encore une fois, l’intérêt du sexage moléculaire dont nous avons

déjà affirmé l’importance pour les études concernant des espèces aviaires ayant un faible

dimorphisme sexuel.

Figure 1 : Exemple de session de capture sur un site de nourrissage en groupe (Harbour).

36

CHAPITRE III

-

HETEROZYGOTIE MULTI-LOCI

ET

APTITUDE PHENOTYPIQUE

37

CHAPITRE III

-

HETEROZYGOTIE MULTI-LOCI ET

APTITUDE PHENOTYPIQUE

REMARQUE

Ce chapitre a été rédigé comme le serait un manuscrit en construction, les données

présentées ici devant être complétées par des analyses supplémentaires (augmentation du

nombre d’individus et de loci) avant de constituer un manuscrit à soumettre à X.

I. INTRODUCTION

Depuis le début du siècle dernier, une avancée notable des connaissances dans le

domaine des relations génotype-phénotype a été réalisée avec les travaux de Shull décrivant

notamment les qualités de rendements de variétés de maïs "hybride" (Shull 1946, 1948, Crow

1998). Contrairement à son sens premier, désignant le résultat de l’union de deux espèces

proches comme par exemple le mulet (croisement entre une jument et un âne), le mot

"hybride" a tout d’abord été employé en lieu et place du terme hétérozygote (Shull 1946).

L’hétérosis (vigueur hybride), introduit par Shull en 1914 (Shull 1948), désignait et désigne

l’avantage en termes d’aptitude phénotypique d’un individu hétérozygote par rapport à un

homozygote. Toutefois, ceci est défini pour la globalité du génome du porteur. Ainsi, cette

notion est le plus souvent testée via un ensemble de croisements consanguins visant à obtenir

des individus homozygotes afin de les comparer à des individus hétérozygotes, ce qui a,

majoritairement, été développé chez les plantes (Hochholdinger & Hoecker 2007,

Chapitre III – Hétérozygotie multi-loci et aptitude phénotypique

38

Krystkowiak et al. 2009). Néanmoins, cela implique de pouvoir effectuer des croisements

contrôlés afin de maîtriser le pedigree des individus ce qui est, a priori, plus difficile sur des

populations naturelles (voir toutefois Marr et al. 2002). Cependant, depuis l’avènement de

l’écologie moléculaire à la fin du XXème siècle et le développement de techniques de

visualisation de la variabilité génétique, la question du maintien du niveau de polymorphisme

au sein des populations a pu être investie sous un nouvel angle (Mitton 1994). En effet, de

nombreuses études ont tenté de corréler un niveau d’hétérozygotie pour des marqueurs

génétiques (enzymes et microsatellites généralement) avec un ou plusieurs paramètres

reflétant l’aptitude phénotypique des individus (pour une revue se référer à Mitton 1994,

David 1998, Chapman et al. 2009). Les indices représentant l’aptitude phénotypique peuvent

être de différentes natures. Chez les plantes telles que Clematis acerifolia, la surface et le

nombre de feuilles ont été utilisés, compte tenu de leur implication dans la photosynthèse et,

par extension, pour la survie (López-Pujol et al. 2008). Chez les animaux, les paramètres liés

à la survie (âge, durée de vie) ont également été employés mais aussi des traits impliqués dans

la reproduction, le comportement territorial, l’immunité, les traits sexuels (ornementations,

chants), la taille corporelle et les asymétries de développement (Coulson et al. 1998, 1999,

Merilä et al. 2003, Neff 2004a, Seddon et al. 2004, Lieutenant-Gosselin & Bernatchez 2006,

Kempenaers 2007, Da Silva et al. 2008, Mainguy et al. 2009).

Dans le cadre de notre étude sur la tourterelle à queue carrée, la corrélation entre

hétérozygotie et aptitude phénotypique pouvait être testée sous différentes formes. Tout

d’abord, l’hétérozygotie pouvait être comparée entre les deux stratégies d’approvisionnement

pratiquées par les tourterelles à queue carrée à la Barbade. En effet, en milieu tropical, bon

nombre d’espèces défendent leur territoire tout au long de l’année contre des intrusions de

congénères (Stutchbury & Morton 2001), ce qui est notamment le cas des tourterelles à queue

carrée à la Barbade (chapitre II). En conséquence d’un taux de survie adulte supposé être

particulièrement élevé dans ce type de milieu, le remplacement des individus territoriaux

apparait relativement faible, conduisant ainsi à une forte compétition pour l’acquisition d’un

territoire (Greenberg & Gradwohl 1997, Morton et al. 2000, Stutchbury & Morton 2008). De

ce fait, une partie des individus de la population ne possède pas de territoire leur permettant

entre autres de se nourrir. Ceux-ci sont qualifiés de "flotteurs" notamment à cause de leur

prospection sur différents sites territoriaux d’où ils se font activement chassés (Brown 1969,

Winker 1998, Sol et al. 2005). Ces individus peuvent potentiellement s’agréger sur des sites

de nourrissage collectif, tout comme cela a pu être décrit chez Z. aurita (chapitre II). Ainsi,


39

flotteurs et individus territoriaux peuvent différer sur des critères liés à leur capacité à

acquérir et défendre un site, témoins de leur capacité compétitrice (Smith & Arcese 1989,

Stutchbury 1992, Lozano 1994). De ce fait, la capacité à acquérir et défendre un territoire peut

être considérée comme étant le reflet de l’aptitude phénotypique de l’individu, ce qui pourrait

être corrélé à son degré d’hétérozygotie, qui serait donc supérieur chez les territoriaux par

rapport aux flotteurs. Ce type de relation a notamment été démontré chez les tétras lyre,

Tetrao tetrix, chez lesquels les mâles les plus hétérozygotes avaient de meilleures chances

d’obtenir un territoire (Höglund et al. 2002). Toutefois, ceci ne pouvait concerner que les

adultes puisque que nous nous plaçons implicitement dans un contexte de sélection sexuelle,

l’acquisition d’un territoire étant liée à l’initiation de la reproduction. Pour aller plus loin sur

notre modèle d’étude, certains traits tels que la survie sont plus variables dans les premiers

stades de développement notamment à cause du fait que les phénotypes peu aptes à survivre

sont éliminés plus précocement (Koehn & Gaffney 1984, David 1998, Cohas et al. 2009).

Compte tenu de l’avantage que leur confère leur variabilité génétique, les individus

hétérozygotes pourraient avoir une probabilité de survie supérieure à celle des individus plus

homozygotes. Ces derniers disparaissant, la variabilité du niveau d’hétérozygotie dans la

population devrait décroître avec l’âge, entraînant également une augmentation du niveau

moyen comme cela a récemment été montré chez la marmotte des Alpes, Marmota marmota

(Cohas et al. 2009). Dans notre cas, étant donné que nous ne sommes pas en mesure

d’attribuer un âge plus précis que la catégorisation en adultes et juvéniles, cette hypothèse

devrait se traduire par une variabilité du niveau d’hétérozygotie chez les juvéniles supérieure

à celle observée chez les adultes, ceux-ci ayant un niveau moyen supérieur aux jeunes.

Comme cela a été évoqué précédemment, des caractères tels que la survie ou les traits liés à la

reproduction ont souvent été employés pour ce type d’approche. Toutefois, ces paramètres ne

seraient pas pertinents à ce stade de l’étude, étant donné que nous ne disposons pas, à l’heure

actuelle, de suffisamment de données. Néanmoins, ces traits classiques sembleraient pouvoir

être estimés avec une bonne sensibilité par l’analyse de l’asymétrie fluctuante (Lens et al.

2002a). Celle-ci est définie comme étant un écart à la symétrie bilatérale pour les caractères

pairs (Palmer & Strobeck 1986). L’amplitude de ces déviations reflèterait la capacité de

l’individu à produire un phénotype le plus proche de la symétrie bilatérale idéale, quel que

soit le niveau de stress (parasitisme par exemple) rencontré au cours du développement

(Palmer & Strobeck 1992, Clarke 1993, Palmer 1994, van Dongen & Lens 2000, Debat &

David 2001). Par un effet tampon, dû à la plus grande diversité allélique, les individus

hétérozygotes auraient potentiellement un développement plus stable que les homozygotes et


40

en conséquence leur symétrie bilatérale pour les tarses et les ailes serait meilleure (Clarke

1993, Leamy & Klingenberg 2005). Toutefois, cette analyse ne pouvait concerner, encore une

fois, que les adultes car les juvéniles sont, par définition, en cours de développement et donc,

leur morphologie est encore soumise à modification.

Afin de tester nos différentes hypothèses quant à la relation entre génotype et aptitude

phénotypique, un ensemble de marqueurs microsatellites polymorphes ainsi que divers

estimateurs de l’hétérozygotie ont été utilisés. Toutefois, le choix d’un tel indice n’est pas aisé

car ils sont non seulement nombreux, mais également déclinés sous diverses formes et

l’utilisation de chacun peut être soumise à controverse. Par exemple, une mesure basique de la

diversité génétique est la proportion de loci pour lesquels l’individu est hétérozygote (noté par

la suite H, Coltman et al. 1998, Coulson et al. 1998, 1999, Marshall & Spalton 2000, Slate et

al. 2000, Hansson et al. 2001, Rossiter et al. 2001, Höglund et al. 2002, Slate & Pemberton

2002, Foerster et al. 2003, Richardson et al. 2004, Kleven & Lifjeld 2005, MacDougall-

Shackleton et al. 2005, Dowling & Mulder 2006, Freeman-Gallant et al. 2006, Jouventin et al.

2007, Beltran et al. 2008, Da Silva et al. 2008, Ortego et al. 2009, Ruiz-López et al. 2009). Le

problème est que cet indice peut être biaisé lorsque les individus ne sont pas tous typés avec

les mêmes marqueurs, que le nombre de loci est faible et/ou que ceux-ci diffèrent dans leur

niveau de polymorphisme (Aparicio et al. 2006). Pour éviter ces problèmes, Coltman et al.

(1999) ont proposé un indice d’hétérozygotie standardisé par l’hétérozygotie moyenne aux

loci pour lesquels l’individu a été typé (noté par la suite SH) qui a été tout autant utilisé que le

premier (Slate et al. 2000, Amos et al. 2001, Slate & Pemberton 2002, Master et al. 2003,

Kleven & Lifjeld 2005, Tarvin et al. 2005, Cohas et al. 2006, 2007, 2009, Bishop et al. 2007,

Rubenstein 2007, Fossøy et al. 2008, Lyons et al. 2009, Ruiz-López et al. 2009). H ou SH

(souvent regroupés sous la désignation MLH pour "multilocus heterozygosity") ont souvent

été associés et comparés avec un autre paramètre, mean d², introduit par Coulson et al. 1998

(noté par la suite MD, voir Coltman & Slate 2003). Celui-ci, valable uniquement pour les

marqueurs microsatellites, est dérivé d’un indice utilisé au niveau populationnel développé

par Goldstein et al. (1995) et basé sur la relation entre la distance - en unités de répétition -

entre deux allèles et le temps écoulé depuis leur coalescence. Au niveau individuel, MD

représente le niveau de parenté entre les haplotypes des parents de l’individu. Ce dernier a

également été décliné sous différentes formes, par exemple en le standardisant par la variance

de la différence au carré par locus afin de limiter la trop forte influence des loci hautement

polymorphes (Hedrick et al. 2001, Slate & Pemberton 2002). D’un point de vue de la


41

résolution de l’analyse, H, SH et MD sembleraient être tous trois surpassés par l’indice de

parenté interne (noté par la suite IR pour "internal relatedness") développé par Amos et al.

(2001). Cet indice, bien que moins répandu, offre l’avantage d’être également pondéré par les

fréquences alléliques en donnant plus de poids aux allèles rares (Masters et al. 2003, Tarvin et

al. 2005, Oh & Badyaev 2006, Lindstedt et al. 2007, Ortego et al. 2007a, Rubenstein 2007,

Rijks et al. 2008, Acevedo-Whitehouse et al. 2009, Ruiz-López et al. 2009). Enfin, plus

récemment, une nouvelle méthode a été proposée par Aparicio et al. (2006) pour estimer à

l’origine l’homozygotie (noté par la suite HL pour "homozygosity by loci") et, par extension,

l’hétérozygotie prenant en compte la variabilité allélique de chaque locus (Ortego et al. 2007a,

2007b, 2009, Rijks et al. 2008, Acevedo-Whitehouse et al. 2009, Haag-Liautard et al. 2009,

Ruiz-López et al. 2009). Un autre avantage non négligeable de HL est que le niveau de

significativité des corrélations potentiellement observées avec IR serait atteint avec un effectif

moitié moins important (Aparicio et al. 2006).

Compte tenu du fait que le débat reste toujours ouvert quant à l’efficacité de chaque

index d’hétérozygotie (Chapman et al. 2009), le choix d’un indice plutôt qu’un autre est

complexe, notamment compte tenu des qualités et défauts de chacun. De ce fait, nous avons

fait le choix, dans le cadre de notre étude visant à vérifier l’existence d’une relation entre

génétique et aptitude phénotypique, de ne retenir que quatre des cinq indices précédemment

introduits à savoir, SH, MD, IR et HL. H a été délibérément exclu de notre étude dû à son

manque de fiabilité lorsque tous les individus n’étaient pas typés au même loci, ce qui est le

cas dans notre étude.

II. MATERIEL & METHODES

1. Modèle biologique

La tourterelle à queue carrée, Zenaida aurita, est un colombidé endémique des

Caraïbes. Cette espèce est monogame et les couples s’établissent sur des territoires qu’ils

défendent tout au long de l’année contre l’intrusion de congénères (Lefebvre et al. 1996).

Néanmoins, sur certains sites de production et stockage agraire, elles adoptent une stratégie

alternative d’approvisionnement en groupe où peu de comportements agonistiques sont

observés entre congénères (Carlier & Lefebvre 1996, Dolman et al. 1996, Sol et al. 2005,


42

chapitre II). Le dimorphisme sexuel étant peu marqué un sexage moléculaire a été réalisé pour

tous les individus (chapitre I). Pour ce qui est de l’âge, les juvéniles sont facilement

discernables des adultes par leur plumage grisâtre et l’absence de taches iridescentes autour

du cou. Pour plus de détails sur l’espèce et les méthodes de sexage moléculaire, se référer au

chapitre I.

2. Sites d’études, captures, prises de mesures et prélèvements

sanguins

Tout comme les travaux précédents (chapitre I et II), les tourterelles ont été capturées

sur quatre sites distincts sur l’île de la Barbade : deux sites territoriaux, Bellairs et Sunset

Crest et deux sites de nourrissage en groupe, Roberts et Harbour. Etant donné qu’aucune

différence d’ordre génétique ou morphologique n’a pu être mise en évidence précédemment

entre les deux sites territoriaux d’une part et les deux sites de nourrissage en groupe d’autre

part (chapitre II), ceux-ci ont été regroupés afin de n’avoir que deux groupes tests.

La méthode d’acquisition des données morphométriques et des prélèvements sanguins

nécessaires aux analyses moléculaires suivaient le même protocole que celui présenté au

chapitre I. Un point important pour une partie des analyses suivantes est à souligner ici. Les

mesures des tarses et des ailes ont toujours été réalisées en double afin de pouvoir évaluer

l’erreur de mesure ainsi que la répétabilité de celles-ci, toutes les mesures n’ayant pas été

réalisées par le même expérimentateur.

Au total, sur une période de trois ans, 359 tourterelles ont été utilisées pour cette étude

dont 276 adultes et 83 juvéniles. Le détail des effectifs selon les stratégies

d’approvisionnement et les classes d’âge est présenté dans le tableau 1.


43

Tableau 1 : Détails des effectifs de tourterelles à queue carrée utilisés pour l’analyse en

fonction de la stratégie d’approvisionnement, de la classe d’âge (A : adultes et J : juvéniles) et

de l’année de capture.

Stratégie Age Effectifs

2007 2008 2009

Territorial A 60 64 29

J 37 12 12

Nourrissage en groupe A 64 59 0

J 16 6 0

3. Analyses génétiques

a. Généralités

Dans le cadre de l’étude du polymorphisme de ressource (chapitre II, annexe 3) les

individus avaient déjà été typés pour sept marqueurs microsatellites : ZaD1, ZaD11, ZaD104,

ZaD105, ZaD108, ZaD119 et ZaD121. A ceux-ci, trois autres loci ont été ajoutés : ZaA4,

ZaA112 et ZaC11. Pour plus de détails concernant les marqueurs employés ainsi que le

protocole d’amplification et de visualisation du polymorphisme, se référer à Monceau et al.

(2009, annexe 1) ainsi qu’au chapitre I.

b. Analyses préliminaires

Avant de débuter l’analyse, le déséquilibre de liaison (DL) a été testé afin de vérifier

l’indépendance de tous les loci les uns vis-à-vis des autres, mais également l’équilibre

d’Hardy-Weinberg (EHW) pour vérifier l’absence d’un excès trop important d’homozygotes.

Etant donné que les analyses concernant l’asymétrie fluctuante ainsi que la comparaison entre

stratégies d’approvisionnement ne concernaient que les adultes, cette vérification a été

effectuée dans un premier temps pour les adultes puis, par la suite, pour tous les individus

(adultes + juvéniles).


44

c. Mesures de l’hétérozygotie

Les quatre indices suivant l’hétérozygotie ont été calculés pour chaque individu :

• SH : Hétérozygotie standardisée par l’hétérozygotie moyenne des loci typés (Coltman et

al. 1999)

H t / moyenne Ht

avec :

Ht proportion de loci typés hétérozygotes

• IR : Indice de parenté (Amos et al. 2001)

(2H - ∑f i) / (2N - ∑f i)

avec :

H le nombre de loci homozygotes

N le nombre de loci

f i la fréquence de l’allèle i

• MD : Mean d² standardisé par la valeur maximum individuelle observée à chaque locus

(Coulson et al. 1998, Hedrick et al. 2001)

(1 / N) ∑ [(ni1 - ni2)² / (max (ni1 - ni2))²]

avec :

N le nombre de loci

ni1 et ni2 le nombre d’unité de répétitions des allèles 1 et 2

• HL : Homozygotie pondérée par locus (Aparicio et al. 2006)

∑Eh / (∑Eh + ∑Ej)

avec :

Eh l’hétérozygotie attendue aux loci où l’individu est homozygote

Ej l’hétérozygotie attendue aux loci où l’individu est hétérozygote


45

Les corrélations entre paires d’indices ont été effectuées, et ce sur l’ensemble de

l’échantillon (adultes et juvéniles) grâce à un test de Spearman (les variables ne suivant pas

une loi normale) afin de préciser leur relation.

4. Relation entre hétérozygotie et aptitude phénotypique

a. Hétérozygotie, stratégie d’approvisionnement et âge (adultes et

juvéniles)

Après avoir vérifié la normalité des indices, ceux-ci ont été comparés entre stratégies

d’approvisionnement (territoriaux vs nourrissage en groupe), mais également par âge (adultes

vs juvéniles). Dans ce dernier cas, compte tenu du fait que nous nous attendons à ce qu’il y ait

une augmentation du niveau d’hétérozygotie global au stade adulte, un test unilatéral a été

réalisé à la place du test bilatéral.

Etant donné que nous ne disposions que de deux groupes pour tester les différences en

termes de variance entre adultes et juvéniles, un simple test d’homogénéité des variances de

Brown-Forsythe (dérivé non paramétrique du test classique de Levene, Brown & Forsythe

1974 cités dans Hui et al. 2008) a été réalisé.

b. Hétérozygotie et asymétrie fluctuante (adultes uniquement)

Avant de s’intéresser à l’asymétrie fluctuante (AF), plusieurs vérifications ont été

effectuées. Celles-ci comportaient quatre étapes. Tout d’abord, l’effet de l’erreur de mesure

par rapport à l’asymétrie globale a dû être évalué afin de s’assurer que celle-ci n’était pas

supérieure à l’asymétrie observable. Puis, la présence d’autres formes d’asymétrie, à savoir

l’antisymétrie (AS) et l’asymétrie directionnelle (AD) ont dû être écartées (Palmer &

Strobeck 1986, 1992, 2003, Palmer 1994, figure 1). Enfin, l’indépendance des indices d’AF

vis-à-vis de la taille du caractère considéré devait être testée. Ces précautions étaient

nécessaires car l’analyse de l’AF peut être faussée dans le cas où l’erreur de mesure serait trop

importante ou que les autres formes d’asymétrie se mélangeraient et se surimposeraient à

l’AF.


46

Figure 1 : Les différentes formes d'asymétries existantes a) l’asymétrie fluctuante, b)

l’asymétrie directionnelle et c) l’antisymétrie. La courbe en noire représente la part génétique

de variation et la courbe grisée la part totale de variation phénotypique. N représente l’effectif

et (Ri – Li), la différence côté droit – côté gauche (R pour "right" et L pour "left"). D'après

Palmer & Strobeck (1992).

i. Analyses préliminaires

α. Erreur de mesure et asymétrie

Afin de s’assurer que l’erreur de mesure ne surpassait pas l’effet de l’asymétrie, une

ANOVA (Palmer 1994) comparant les tarses ou les ailes en fonction des doubles mesures et


47

des côtés a été effectuée afin de vérifier que l’asymétrie potentiellement existante était

supérieure à l’effet de l’erreur de mesure. Ceci a été réalisé après vérification de la conformité

des assomptions de l’ANOVA (homogénéité des variances par un test de Levene et normalité

par un test de Shapiro-Wilk). De plus, la répétabilité des mesures a été estimée afin de

simplifier les analyses en utilisant les moyennes des doubles mesures (Lessells & Boag 1987).

β. Antisymétrie (AS)

L’antisymétrie (AS) est définie comme un écart à la symétrie bilatérale dû au

développement prononcé d’un caractère, et ce aussi bien à gauche qu’à droite (Palmer &

Strobeck 1986, 1992, 2003, Palmer 1994, figure 1c). L’AS se manifeste par un écart à la

distribution normale des différences droite-gauche. Cet écart peut se traduire de différentes

façons : par une asymétrie de la distribution et/ou par l’aplatissement de celle-ci (figure 2).

Afin de tester la présence d’AS, la normalité de la distribution du caractère a tout

d’abord été testée (test de Shapiro-Wilk). Dans le cas où celle-ci ne suivait pas une loi

normale, la forme générale de la distribution a été testée avec le coefficient d’aplatissement ou

kurtosis (K) puis comparée à la valeur théorique du t de Student pour un degré de liberté

infini (t0,05 ; ∞= 1,96) avec :

tk = K / sK

où K est la valeur calculée de l’aplatissement

sK = √ [(24n(n-1)² / (n-3)(n-2)(n+3)(n+5)] est l’erreur standard de K et n la taille de

l’échantillon.

Si K est négatif, la distribution est platykurtique (distribution large ou bimodale, pic avec

queues courtes) et si K est positif, elle est leptokurtique (aplatie avec un faible pic et de

longues queues) (figure 2a et b).

De même, la symétrie de la distribution a été estimée par le coefficient de symétrie ou

skewness (S) puis comparée à la valeur théorique du t de Student pour un degré de liberté

infini (t0,05 ; ∞= 1,96) avec :

ts = S / sS

où S est la valeur calculée de la symétrie,

sS = √[(6n(n-1) / (n-2)(n+1)(n+3)] est l’erreur standard de S et n la taille de l’échantillon.


48

Si S est positif alors la distribution est étalée vers la droite, et à l’opposé s’il est négatif (figure

2c).

Tous les groupes pour lesquels la normalité n’était pas respectée ne devaient pas être

pris en compte pour une recherche d’AF, l’AS biaisant tous les indices (Palmer 1994).

Figure 2 : Différentes formes d'antisymétrie (AS) a) faible AS avec une distribution

platykurtique, b) forte AS avec une distribution bimodale et c) distribution biaisé ("skewed

distribution") résultant d’un mélange entre AS et AD. La courbe en noire représente la part

génétique de variation et la courbe grisée la part totale de variation phénotypique. N

représente l’effectif et (Ri – Li), la différence côté droit – côté gauche (R pour right et L pour

left). D'après Palmer & Strobeck (1992).


49

γ. Asymétrie directionnelle (AD)

Une asymétrie directionnelle est définie comme une différence de symétrie

systématiquement exprimée d’un même côté (Palmer & Strobeck 1986, 1992, 2003, Palmer

1994, figure 1b). Afin de vérifier son existence, les moyennes des caractères droits et gauches

ont été comparées par un test t.

δ. Indépendance de la différence droite - gauche vis-à-vis

de la taille des individus

Afin d’éviter qu’un effet de la taille du caractère puisse biaiser les résultats,

l’indépendance de la taille a dû être testée. Pour cela, une régression linéaire de la différence

absolue droite - gauche sur la moyenne du caractère a été réalisée après vérification de la

normalité des distributions (test de Shapiro-Wilk).

ii. Test de la relation entre hétérozygotie et asymétrie fluctuante

Tout comme pour l’hétérozygotie, différents indices étaient disponibles. Les plus

couramment employés, du fait de leur simplicité de manipulation et d’interprétation, étaient la

différence droite - gauche (FA4) ainsi que la différence absolue (FA1) (Palmer 1994).

Après avoir vérifié la normalité des indices d’AF (FA1 et FA4) et d’hétérozygotie (test

de Shapiro-Wilk), les régressions linéaires entre ces deux types de variables ont été

effectuées. Afin d’estimer la qualité de celles-ci, la distribution des résidus a été vérifiée afin

de savoir si elle s’écartait de la normalité (test de Shapiro-Wilk).

5. Logiciels de traitement des données

Le traitement des données de génétique des populations, à savoir le déséquilibre de

liaison et l’équilibre d’Hardy-Weinberg, a été réalisé grâce au logiciel GENEPOP (Raymond

& Rousset 1995). L’estimation de la fréquence des allèles nuls (selon la méthode décrite dans

Allen et al. 1995, W. Amos com. pers.), ainsi que le calcul des différents indices

d’hétérozygotie ont été obtenus grâce à la macro Excel "IRmacroN4"


50

(http://www.zoo.cam.ac.uk/zoostaff/amos) développée par W. Amos (Department of

Zoology, Cambridge University, UK).

L’ensemble du traitement statistique des données a été réalisé avec le logiciel R 2.9.1

(R Development Core Team 2008) implémenté des packages "car" et "lawstat" pour les

analyses de variances, "nlme" pour l’erreur de mesure et la répétabilité ainsi que "Hmisc"

pour les outils graphiques.

III. RESULTATS

1. Analyses génétiques

a. Analyses préliminaires

Pour chacun des deux groupes (adultes seuls et adultes + juvéniles), aucun

déséquilibre de liaison entre paires de loci n’a été détecté. Pour l’ensemble des loci, la

diversité allélique était en moyenne de 9,1 allèles par locus (6 à 14 allèles). En ce qui

concerne l’équilibre d’Hardy Weinberg (EHW), tous les loci étaient à l’équilibre, excepté

ZaA112 et ZaC11 dans les deux cas (tableau 2). Pour ZaC11, l’excès d’homozygotes constaté

étaient potentiellement imputable à la présence d’allèles nuls dont la fréquence était

supérieure à 5%, alors que pour ZaA112, l’écart à l’équilibre d’Hardy-Weinberg été causé par

un excès d’hétérozygotes (tableau 2). Pour éviter tous biais dans les analyses, ces deux loci

ont été exclus.


Ch

ap

itre III –

Hé

téro

zygo

tie m

ulti-lo

ci et a

ptitu

de

ph

éno

typiq

ue

51

Tableau 2 : Hétérozygotie observée (Ho) et attendue (He) pour l’ensemble des loci testés. La probabilité du test d’Hardy-Weinberg a également

été précisée (pEHW) ainsi qu’une estimation de la fréquence des allèles nuls (Nul).

ZaA4 ZaA112 ZaC11 ZaD1 ZaD11 ZaD104 ZaD105 ZaD108 ZaD119 ZaD121

Adultes

Ho 0,74 0,84 0,60 0,81 0,82 0,83 0,59 0,80 0,78 0,85

He 0,76 0,75 0,75 0,82 0,78 0,81 0,60 0,86 0,78 0,88

pEHW 0,12 < 0,01 < 0,0001 0,36 0,75 0,83 0,65 0,02 0,70 0,34

Nul 0,02 -0,06 0,11 < 0,01 -0,03 -0,02 < 0,01 0,04 < 0,01 0,02

Adultes + juvéniles

Ho 0,72 0,85 0,60 0,81 0,79 0,83 0,61 0,81 0,77 0,82

He 0,75 0,75 0,75 0,82 0,78 0,81 0,60 0,86 0,77 0,88

pEHW 0,06 < 0,0001 < 0,0001 0,18 0,92 0,43 0,87 0,03 0,38 0,07

Nul 0,02 -0,07 0,11 0,01 -0,01 -0,01 -0,01 0,03 < 0,01 0,04


52

b. Mesure de l’hétérozygotie

Aucune des distributions des quatre indices d’hétérozygotie (SH, MD, IR et HL)

suivait une loi normale (test de Shapiro-Wilk : SH : W = 0,95 ; p < 0,0001 ; MD : W = 0,97 ;

p < 0,0001 ; IR : W = 0,97 ; p < 0,0001 ; et HL : W = 0,96 ; p < 0,0001). Ces indices étaient

tous corrélés entre eux à des degrés variables (corrélations de Spearman p < 0,0001 pour

toutes les corrélations, n = 359, figure 3), SH, IR et HL étant les plus corrélés (ρ > 0,90). Une

attention particulière est à apporter ici au fait que SH ait été négativement corrélé à IR et HL

qui étaient en fait des indices d’homozygotie contrairement à SH qui représentait bien

l’hétérozygotie. De ce fait, lorsqu’IR et HL diminuaient, l’homozygotie diminuait et donc

l’hétérozygotie augmentait.

Figure 3 : Corrélations entre les différents indices calculés pour l’hétérozygotie. Les

coefficients de corrélation indiqués dans la demi-matrice supérieure correspondent aux

coefficients de corrélation ρ de Spearman.


53

2. Relation entre hétérozygotie et aptitude phénotypique

a. Hétérozygotie, stratégie d’approvisionnement et âge

i. Hétérozygotie et stratégie d’approvisionnement

Aucune différence, en termes de niveau d’hétérozygotie mesurée par SH, MD, IR et

HL n’a été décelée entre stratégies d’approvisionnement (test de Wilcoxon, SH : W = 9828,5 ;

p = 0,52 ; MD : W = 9589 ; p = 0,79 ; IR : W = 8563 ; p = 0,20 et HL : W = 8722 ; p = 0,30).

ii. Hétérozygotie et âge

Les variances de SH, MD, IR et HL ne différaient pas entre juvéniles et adultes même

si une tendance à la réduction du stade juvénile au stade adulte était observée pour IR et HL

(tableau 3).

Les médianes étaient différentes selon SH, IR et HL (test unilatéral de Wilcoxon : SH :

W = 9912,5 ; p = 0,03 ; IR : W = 12960 ; p = 0,03 et HL : W = 13184 ; p = 0,02 ; figure 4)

mais pas selon MD (W = 11053 ; p = 0,31 ; figure 4). En fin de compte, les adultes tendaient à

avoir une hétérozygotie supérieure à celle observée chez les jeunes avec une possible

réduction de la variance du stade juvénile au stade adulte.

Tableau 3 : Déviations absolues de la médiane des différents indices d'hétérozygotie.

L’homogénéité des déviations à la médiane a été testée au moyen d'un test de Brown-Forsythe

dont le score ainsi que la probabilité associée sont respectivement représentés par B et p.

Juvéniles Adultes B p

SH 0,24 0,24 3,34 0,07

MD 0,07 0,07 0,57 0,57

HL 0,19 0,15 3,84 0,05

IR 0,21 0,18 3,86 0,05


54

Figure 4 : Variations du niveau d'hétérozygotie mesuré par SH, MD, IR et HL entre juvéniles

et adultes. La médiane est symbolisée par la barre noire en gras, les boîtes représentent 25 à

75% des individus (1er et 3ème quartiles), les barres d’erreurs délimitent 90% des valeurs et

enfin, les ronds blancs signalent les points extrêmes. Dans tous les cas, 83 juvéniles et 276

adultes ont été testés. Pour rappel, HL et IR sont à l’origine des indices d’homozygotie et sont

inversement proportionnel au niveau d’hétérozygotie.


55

b. Hétérozygotie et asymétrie fluctuante

i. Erreur de mesure et asymétrie

Que ce soit pour les ailes ou les tarses, l’interaction entre le réplicat de la mesure et le

côté était significative, indiquant que l’erreur de mesure ne surpassait pas l’asymétrie (ailes :

F275, 1103 = 7,62 ; p < 0,0001 et tarses : F275, 1103 = 1,96 ; p < 0,0001). Globalement, l’erreur de

mesure était faible (2,50 < EM < 6,50 %) excepté pour les tarses droits où elle était un peu

plus importante (22,59%). Néanmoins, la répétabilité dans les deux cas étant bonne (0,77 < R

< 0,98), la suite des analyses a donc été réalisée sur la moyenne des doubles mesures.

ii. Antisymétrie (AS)

Pour l’ensemble des individus, la différence signée entre côté droit et côté gauche ne

suivait pas une loi normale, aussi bien pour les ailes que pour les tarses (tableau 4) et ce

même après transformation (logarithme ou Box-Cox). La présence d’AS a donc été détectée

chez les mâles pour les ailes et chez les femelles pour les tarses (tableau 4). En ce qui

concerne les mâles, un individu présentait un score extrême (figure 5a). L’analyse a donc été

reconduite après avoir exclu cet individu, l’écart entre l’aile droite et l’aile gauche pouvant

dans ce cas être expliquée par le mauvais état des plumes (notamment au niveau des rémiges

primaires). Cependant, bien que la distribution en ait été améliorée (figure 5b), celle-ci ne

suivait toujours pas une loi normale (W = 0,98 ; p = 0,04). Dans le cas des femelles, rien ne

semblait désigner l’existence de points extrêmes pouvant potentiellement biaiser les analyses

(figure 6). Les origines de la forme leptokurtique de ces distributions étant variées (Palmer &

Strobeck 1992, 2003), seuls les tarses pour les mâles et les ailes pour les femelles ont été

conservés pour les analyses subséquentes.

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Tableau 4 : Résumé des résultats concernant l'antisymétrie.

Ailes Tarses

Groupes Effectif

Normalité Skewness Kurtosis Normalité Skewness Kurtosis

W p S ts p K tk p W p S ts p K tk p

Global 276 0,77 < 0,0001 -3,67 -25,03 < 0,0001 41,3 141,39 < 0,0001 0,97 < 0,001 -0,38 -2,60 < 0,01 5,05 17,28 < 0,0001

Mâles 125 0,69 < 0,0001 -4,31 -19,88 <0,0001 38,1 88,60 < 0,0001 0,98 0,07 - - - - - -

Femelles 151 0,98 0,08 - - - - - - 0,96 <0,0001 -0,61 -3,10 < 0,001 6,56 16,72 < 0,0001

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Figure 5 : Distribution des différences droite – gauche pour les ailes des mâles adultes pour a) l’ensemble de l’effectif et b) après le retrait du

point extrême. Pour les deux graphiques, l’amplitude des classes est identique (0,2 cm).


58

Figure 6 : Distribution des différences droite – gauche pour les tarses chez les femelles

adultes. L’unité de mesure est le mm.

iii. Asymétrie directionnelle (AD)

Que se soit pour les tarses des mâles ou les ailes des femelles, aucune asymétrie

directionnelle n’a été détectée (respectivement test t : t = 0,23 ; df = 124 ; p = 0,81 et t = 1,24 ;

df = 150 ; p = 0,22).

iv. Indépendance de la différence droite-gauche vis-à-vis de la

taille des individus

Chez les mâles comme chez les femelles, les différences absolues droite - gauche ne

suivaient pas une loi normale (test de Shapiro-Wilk : tarses mâles : W = 0,88 ; p < 0,0001 et

ailes femelles : W = 0,80 ; p < 0,0001). Une transformation racine carrée a donc été effectuée

afin de minimiser au maximum l’écart à la normalité. Toutefois, même après transformation,


59

la normalité n’était toujours pas respectée (tarses mâles : W = 0,98 ; p = 0,03 et ailes

femelles : W = 0,97 ; p < 0,0001). Les deux autres variables représentant la moyenne des

caractères considérés (moyenne des tarses pour les mâles et moyenne des ailes pour les

femelles) étant distribuées normalement, les régressions entre les différences absolues (|D –

G|) contre moyenne du caractère ( [D + G] / 2) ont tout de même été réalisées avec néanmoins

un contrôle de la distribution des résidus. Pour les tarses des mâles, les résidus étaient

distribués normalement (W = 0,99 ; p = 0,32) et la régression était significative (R² = 0,053 ;

123 df ; p < 0,01). Dans ce cas, les deux indices d’AF (FA1 et FA4) ont dû être standardisés

par la moyenne du caractère pour les analyses suivantes. En ce qui concerne les ailes des

femelles, la taille corporelle ne semblait pas influencer l’asymétrie (R² = -0,006 ; 149 df ; p =

0,76). A noter cependant, que les résidus de cette régression n’étaient pas distribués

normalement.

v. Test de la relation entre hétérozygotie et asymétrie fluctuante

α. Chez les mâles

Pour cette analyse, comme nous l’avons vu précédemment, les indices d’AF, FA1 et

FA4, ont dû être standardisés par la moyenne du caractère considéré, en l’occurrence la taille

moyenne des tarses. Parmi les indices que ce soit pour l’AF (FA1 et FA4 standardisés) ou

l’hétérozygotie (SH, MD, IR et HL), seules les distributions de FA4 et IR suivaient une loi

normale (tableau 5). De ce fait, une transformation racine carrée a été appliquée aux autres

indices afin de tenter de les normaliser. Ceci a permis de restaurer la normalité de MD et de

réduire l’écart pour FA1 (tableau 5). En ce qui concernait SH et HL, cette transformation

n’améliorant pas leur distribution, la variable d’origine a été conservée (tableau 5).

Aucune des huit régressions envisageables avec chacun des quatre indices

d’hétérozygotie et des deux indices d’AF était significative (tableau6, figure 7). Dans tous les

cas, les résidus des régressions suivaient bien une loi normale (tableau 6).


60

Tableau 5 : Résumé des tests de normalité de Shapiro-Wilk (avec W la valeur du test et p sa

probabilité associée) chez les mâles.

Avant transformation Après transformation

W p W p

FA1 st. 0,88 < 0,0001 0,98 0,04

FA4 st. 0,98 0,07 - -

SH 0,95 < 0,001 0,94 < 0,0001

MD 0,97 < 0,01 0,98 0,06

IR 0,98 0,16 - -

HL 0,96 < 0,01 0,87 < 0,0001

Tableau 6 : Régression de l’asymétrie fluctuante des tarses (FA1 et FA4 standardisés) sur

l’hétérozygotie (SH, MD, IR et HL) chez les mâles. Pour chacune des régressions la normalité

de la distribution a été testée par un test de Shapiro-Wilk dont W est le score et p la

probabilité associée.

√FA1 = √[|D – G| / ((D + G)/2)] FA4 = (D – G) / [(D + G)/2]

Régression Résidus Régression Résidus

R² p W p R² p W² p

SH -0,0080 0,90 0,98 0,05 -0,0016 0,37 0,98 0,07

√MD 0,0007 0,30 0,98 0,13 -0,0069 0,70 0,98 0,08

IR -0,0055 0,57 0,98 0,10 0,0022 0,40 0,98 0,07

HL -0,0078 0,84 0,98 0,05 0,0001 0,31 0,98 0,07

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Figure 7 : Représentation graphique des régressions de l’asymétrie fluctuante (AF) des tarses (FA1 et FA4 standardisés) sur l’hétérozygotie (SH,

MD, IR et HL) chez les mâles. Les indices d’AF sont disposés par ligne (FA1 en haut et FA4 en bas) et les indices d’hétérozygotie par colonne

(de gauche à droite : SH, MD, IR et HL). Les droites de régressions sont représentées en rouge. Les statistiques de ces régressions sont présentées

au tableau 6.


62

β. Chez les femelles

Parmi les indices que ce soit pour l’AF (FA1 et FA4) ou l’hétérozygotie (SH, MD, IR

et HL), seule la distribution de FA4 suivait une loi normale (tableau 7). De ce fait, une

transformation racine carrée a été appliquée aux autres indices afin de tenter de les normaliser.

Ceci a permis de restaurer la normalité de MD et de réduire l’écart pour FA1 et IR (tableau 7).

En ce qui concernait SH et HL, cette transformation n’améliorant pas leur distribution, la

variable d’origine a été conservée (tableau 7).

Sur les huit régressions envisageables avec chacun des quatre indices d’hétérozygotie

et des deux indices d’AF, aucune était significative (tableau 8, figure 8). Les résidus issus des

régressions incluant FA1 ne suivaient pas une loi normale contrairement à ceux issus des

régressions impliquant FA4 (tableau 8).

Tableau 7 : Résumé des tests de normalité de Shapiro-Wilk (avec W la valeur du test et p sa

probabilité associée) chez les femelles.

Avant transformation Après transformation

W p W p

FA1. 0,88 < 0,0001 0,95 < 0,0001

FA4 0,98 0,08 - -

SH 0,94 < 0,0001 0,93 < 0,0001

MD 0,97 < 0,01 1 0,60

IR 0,97 < 0,01 0,95 < 0,01

HL 0,95 < 0,0001 0,90 < 0,0001


63

Tableau 8 : Régression de l’asymétrie fluctuante des ailes (FA1 et FA4) sur l’hétérozygotie

(SH, MD, IR et HL) chez les femelles. Pour chacune des régressions la normalité de la

distribution a été testée par un test de Shapiro-Wilk dont W est le score et p la probabilité

associée.

√FA1 = √|D – G| FA4 = (D – G)

Régression Résidus Régression Résidus

R² p W p R² p W² p

SH -0,006 0,76 0,96 < 0,001 -0,006 0,88 0,99 0,13

√MD -0,004 0,50 0,96 < 0,001 0,007 0,15 1,00 0,57

√IR -0,013 0,99 0,94 < 0,01 -0,010 0,60 1,00 0,85

HL -0,005 0,61 0,96 < 0,0001 -0,006 0,86 0,99 0,14

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Figure 8 : Représentation graphique des régressions de l’asymétrie fluctuante (AF) des tarses (FA1 et FA4 standardisés) sur l’hétérozygotie (SH,

MD, IR et HL) chez les mâles. Les indices d’AF sont disposés par ligne (FA1 en haut et FA4 en bas) et les indices d’hétérozygotie par colonne

(de gauche à droite : SH, MD, IR et HL). Les droites de régressions sont représentées en rouge. Les statistiques de ces régressions sont présentées

au tableau 8.


65

IV. DISCUSSION

Dans ce chapitre, nous avons analysé la relation potentielle entre l’hétérozygotie de

l’individu et son aptitude phénotypique en utilisant pour les deux facettes plusieurs indices

afin de maximiser l’efficacité de cette détection. Quel que soit l’indice d’hétérozygotie

employé ou le facteur proximal représentant la qualité de l’individu, les relations entre ces

deux paramètres semblaient majoritairement rares et de faible amplitude. En effet, bien que la

littérature soit abondante en la matière, une méta-analyse récente a montré que sur 481 effets

recensés (issus de 58 articles publiés) seulement 24% étaient significatifs (Chapman et al.

2009). De ce fait, l’utilisation de plusieurs indices en parallèle afin de maximiser les chances

de détection est une pratique largement répandue (pour un exemple se référer au tableau 1 de

Coltman & Slate 2003). Toutefois, cela n’a pas permis dans notre cas, une multiplication des

résultats positifs.

Globalement, notre étude soulevait plusieurs interrogations que ce soit d’un point de

vu des résultats mais également des techniques employées et des choix d’analyses.

Hétérozygotie et aptitude phénotypique : un bilan léger

Dans un premier temps, la qualité des individus a été testée au travers de leur capacité

à détenir un territoire. Effectivement, en milieu tropical, la survie des individus est supérieure

à celle observée en zone tempérée, en conséquence de quoi, les territoires libres constituent

une ressource limitée d’où la forte compétition pour leur accession (Greenberg & Gradwohl

1997, Morton et al. 2000, Stutchbury & Morton 2008). Néanmoins, ce trait ne semblait pas

être en relation avec l’hétérozygotie. Par contre, la survie des juvéniles semblerait être

affectée par la diversité génétique. Chez les marmottes des Alpes, Cohas et al. (2009) ont

également mis en évidence une diminution de la variance de l’hétérozygotie avec l’âge mais

ceci était également accompagné d’une augmentation du niveau moyen de diversité génétique

individuelle. La réduction de la variabilité du niveau d’hétérozygotie, observée entre les

juvéniles et les adultes, supposait alors l’existence d’une "purge" des juvéniles de qualité

inférieure sous l’effet de pressions sélectives plus fortes dans les premiers stades de

développement ("filter effect" de Koehn & Gaffney 1984, David 1998). Toutefois, dans notre

cas, une tendance à la diminution de la variabilité de l’hétérozygotie a effectivement été

détectée accompagnée d’une augmentation du niveau médian. Toutefois, dans le cas de la


66

variance, il ne s’agissait que de tendances. Si ce point était confirmé, notamment par

l’utilisation d’un plus grand nombre de marqueurs et d’un échantillon de taille supérieure

(surtout pour les juvéniles), celui-ci suggèrerait l’existence d’une mortalité des juvéniles les

plus homozygotes par rapport au niveau médian de la population. Cependant, même dans ce

cas de figure, ce résultat nécessitait tout de même d’être tempéré étant donné qu’il ne

s’agissait ici que d’une analyse corrélative. En effet, la survie des juvéniles per se n’a pas été

testée directement mais elle a été estimée, ou du moins explicitée, au travers du passage du

stade juvénile au stade adulte. De ce fait, l’analyse devrait non seulement être réitérée sur un

échantillon plus important en augmentant le nombre de loci testés mais elle mériterait d’être

également complétée par un suivi populationnel afin de définir les probabilités de survie de

chaque groupe.

La seconde partie de notre analyse visait à évaluer l’existence d’une relation entre la

stabilité du développement des individus, au travers de l’asymétrie fluctuante (AF) et leur

niveau d’hétérozygotie. Toutefois, aucune relation n’a pu être mise en évidence. Cependant,

la détection d’une forme de distributions leptokurtique (cf. figure 2) pour les ailes des mâles

et les tarses des femelles soulève quelques interrogations. D’un point de vue théorique, cette

forme particulière peut être causée par i) la présence de points extrêmes, ii) d’une erreur de

mesure variable, iii) d’un mélange entre AF et AS, iv) de l’hétérogénéité de la dépendance de

la taille du caractère considéré ou v) de l’hétérogénéité due à une véritable instabilité de

développement (Palmer & Strobeck, 2003). Pour ce qui est du premier point, cette vérification

a déjà été réalisée. Dans le cas des femelles, le biais pourrait être la conséquence de l’erreur

de mesure plus importante pour les tarses droits. Toutefois, même à 22% (la moyenne sur

l’étude étant à 8,59%), cette erreur de mesure restait inférieure à ce qui a pu être recensé dans

la littérature comme par exemple, dans l’étude de Merilä & Björklund (1995) où l’erreur de

mesure était en moyenne de 44% (Kruuk et al. 2003). D’autre part, même s’il s’avérait que ce

phénomène puisse trouver son origine dans un problème imputable à la prise de mesure

comme une erreur de mesure différente entre expérimentateurs par exemple, cela devrait

toucher de façon homogène les mâles et les femelles et ce pour les deux caractères

indistinctement. Ceci n’étant pas le cas, la conclusion la plus parcimonieuse serait que ces

particularités pour les tarses des femelles et les ailes des mâles soient imputables aux

hypothèses iii) à v) et seraient donc chacune à tester. La première étape pour ces vérifications

serait d’identifier l’origine du mélange et/ou de l’hétérogénéité observée.

Globalement, l’effet de l’hétérozygotie aux marqueurs que nous avons testés ne

semblait pas avoir d’influence ni sur l’AF ni sur les stratégies d’approvisionnement qui chez


67

les tourterelles à queue carrée apparaissaient comme étant une bonne valeur approchée de la

qualité individuelle. Par contre, la survie des juvéniles apparaitrait comme en partie

dépendante de leur génotype.

D’un point de vue général, certains des estimateurs l’AF ou les indices d’hétérozygotie

peuvent être et sont souvent discutés dans la littérature ce qui pourrait potentiellement

nuancer certains des résultats négatifs obtenus ici.

Aptitude phénotypique et hétérozygotie : le choix des bons indices

Dans un premier temps, l’AF, d’un point de vue théorique, offre l’avantage d’être un

estimateur dont la valeur "idéale" est connue (Palmer 1996) et l’acquisition des données ne

nécessite pas de long suivi en capture - marquage – recapture (Lens et al. 2002b). Toutefois,

la méthode d’analyse nécessite une attention particulière afin d’éviter toute possibilité de

mauvaise interprétation due à la présence d’autres formes d’asymétrie notamment en ce qui

concerne la taille de l’échantillon, pouvant limiter le pouvoir statistique (Van Dongen 1999)

mais également pour l’erreur de mesure (Palmer & Strobeck 1986, Palmer 1994, van Dongen

1999, Lens et al. 2002b, Kruuk et al. 2003). En ce qui concerne notre analyse, le traitement

statistique a été réalisé en intégrant ces problèmes potentiels. Cependant, un élément clé dans

cette réalisation était manquant à savoir l’établissement de la relation entre l’AF et l’aptitude

phénotypique. En effet, l’absence d’un patron général (commun à tous les organismes)

concernant la relation entre AF et aptitude phénotypique ou plus précisément le fait que

certaines études soient parvenues à démontrer l’existence d’une relation entre ces deux

paramètres ne permet pas de conclure qu’en règle générale l’AF est représentative de la

qualité de l’individu (van Dongen et al. 1999, Lens et al. 2002b, van Dongen 2006). De même

que l’absence de relation ne signifie pas que celle-ci n’existe pas, par exemple en étant trop

faible pour être détectée (Lens et al. 2002a, Slate & Pemberton 2002, Kruuk et al. 2003). De

ce fait, avant de conclure sur l’existence ou non d’une relation entre AF et hétérozygotie, la

question serait de savoir si l’AF représente ou non une bonne valeur approchée de l’aptitude

phénotypique chez Z. aurita. Pour tester cela, une évaluation de la relation entre l’AF et un

paramètre tel que la survie, ou toute autre mesure directe de l’aptitude phénotypique, serait

nécessaire.


68

Dans le cas de l’hétérozygotie, plusieurs indices ont été publiés. Avec notre jeu de

données, nous avons pu constater que SH, IR et HL sont tous les trois très corrélés comme

cela a déjà été montré dans le cadre d’une méta-analyse récente (Chapman et al. 2009).

Globalement, ces trois indices se comportaient de manière équivalente, même si HL semblait

être plus sensible que SH et IR comme le définissait Aparicio et al. (2006). Finalement, parmi

les quatre indices testés, seul MD (mean d² standardisé) se distinguait par une variabilité plus

importante. Cependant, bien que corrélé aux trois autres, tous les résultats issus d’une analyse

l’incluant étaient non significatifs. Ceci soulève la question de la validité de cet indice dans ce

type d’analyse, question abondamment discutée dans la littérature. En effet, l’utilité et

l’efficacité de mean d² dans le cadre d’une mise en évidence de croisements consanguins a

souvent été remise en question (Hedrick et al. 2001, Coltman & Slate 2003). En fait, cet

indice serait plus approprié pour estimer la divergence entre deux lignées sur un temps

important et serait plus adapté à l’évaluation de l’hétérozygotie dans le cas où les complexes

de gènes coadaptés seraient rompus par métissage avec des individus provenant d’autres

populations ("admixture model", Coulson et al. 1998, Neff 2004b). En fin de compte, les

conditions pour lesquelles mean d² serait adéquat semblent être relativement restrictives (un

modèle mixte de populations, un taux de mutation faible, des tailles de sous-populations

importantes et un temps de divergence élevés, Tsitrone et al. 2001). Selon Goudet & Keller

(2002), le produit du taux de mutation du marqueur considéré µ et de la taille des sous-

populations considérées N doit être supérieur à 1 pour que mean d² soit plus corrélé à

l’aptitude phénotypique que ne l’est la proportion H de loci d’hétérozygotes en elle-même.

Toutefois, comme l’ont fait remarquer les auteurs, ceci nécessite que les sous-populations

comptent plus de 10 000 individus, le taux de mutation observé dans le cas de marqueurs

microsatellites en milieu naturel étant compris entre 10-4 et 10-3 mutations par génération

(Weber & Wong 1993). De plus, dans ce cas de figure, l’effet de la consanguinité serait

rapidement (cinq générations) dilué par le mélange de ces populations (Goudet & Keller

2002). Globalement, tant que le processus de mutation des microsatellites n’est pas précisé, le

débat concernant l’utilité et l’acuité de cet indice restera sujet à controverse (Slate et al. 2000,

Slate & Pemberton 2002, Chapman et al. 2009).

D’un point de vue plus général, un élément particulier peut laisser perplexe. Chapman

et al. (2009) ont détecté, dans une revue récente de la littérature, un biais de publication en

faveur des relations hétérozygotie – aptitude phénotypique significatives au détriment de

travaux présentant des effets moindres ou pas de relation du tout. Le problème majeur dans ce


69

cadre de travail est que la base même du support génétique dont la plupart des études se

servent à l’heure actuelle est un support neutre de la sélection et surtout représentant une

infime partie d’un génome pouvant être excessivement complexe. Dans quelle mesure et avec

quelle certitude est-il possible de conclure à un effet de l’hétérozygotie sur l’aptitude

phénotypique globale d’un organisme ? Dans la recherche de relation entre hétérozygotie et

aptitude phénotypique, une hypothèse de base est implicitement formulée à savoir que la

diversité génétique mesurée à un nombre variable de loci est une bonne estimation du niveau

de consanguinité de l’individu (ou d’hétérozygotie globale). Toutefois, ce présupposé

semblerait être loin d’être soutenu par l’ensemble de la communauté scientifique. En effet,

l’hétérozygotie mesurée à l’aide de plus d’une dizaine de marqueurs de types microsatellites

serait trop faiblement corrélée avec le degré de consanguinité pour être également corrélée

avec l’aptitude phénotypique (Balloux et al. 2004), ce qui pourrait apporter un élément de

réponse au fait que les corrélations observées sont généralement faibles (Coltman & Slate

2003). De même, une étude récente a montré qu’en fonction des microsatellites utilisés pour

l’analyse, les résultats étaient ou non significatifs (Masters et al. 2009). Ce dernier exemple

montre bien la fragilité de la relation entre hétérozygotie et aptitude phénotypique mais

renforce également le fait que la diversité génétique mesurée à quelques loci n’est en rien

représentative de l’ensemble du génotype (excepté dans certaines conditions, voir Ruiz-López

et al. 2009).

Finalement, quelle que soit la technique employée, ses conditions d’application ainsi

que ses limites doivent être prises en compte. Certaines d’entre elles passent comme un effet

de mode, parfois au détriment de leur validité scientifique. Dans le cas de l’asymétrie

fluctuante, l’enthousiasme pour ce nouveau paradigme a peut-être été tellement grand que

finalement certaines études ont été publiées uniquement parce que par chance, dans la masse

d’analyses effectuées, un résultat a été trouvé (Palmer 1996, Simmons et al. 1999). Par un

effet boule de neige, et surtout par le fait que les résultats négatifs soient rarement publiés

(Kotze et al. 2004), la littérature est devenue plus qu’abondante jusqu’à noyer les

informations les plus pertinentes. Comme nous l’avons déjà évoqué au premier chapitre, le

seul remède connu pour pallier ce genre de problème est de bien considérer la validité de sa

méthode ainsi que celle des analyses statistiques (Simmons et al. 1999).

70

DISCUSSION GENERALE

ET

PERSPECTIVES D’ETUDES

71

DISCUSSION GENERALE

ET

PERSPECTIVES D’ETUDES

Cette étude représentait le point de départ des investigations sur la tourterelle à queue

carrée qui, comme cela a déjà été mentionné précédemment, n’avait jamais fait l’objet

d’études autres que morphologiques, comportementales et démographiques (Nellis & Dewey

1978, Nellis et al. 1984, Burger et al. 1989, Wiley 1991, Rivera-Milán 1992, 1996, 1997,

1999, 2001, Carlier & Lefebvre 1996, Dolman et al. 1996, Lefebvre et al. 1996, 1997, Rivera-

Milán & Vásquez 2000, Goldberg et al. 2001, Seferta et al. 2001, Rivera-Milán & Schaffner

2002, Griffin et al. 2005, Sol et al. 2005). De ce fait, un panel d’outils méthodologiques tant

au niveau morphométriques que génétiques a donc dû être mis en place (chapitre I) afin de

pouvoir débuter d’autres analyses spécifiques (chapitre II & III). Néanmoins, au cours du

cheminement de ces trois années de travail, ces aspects méthodologiques ont finalement

revêtu une part plus importante que celle que nous pensions leur accorder dans ce manuscrit.

La méthodologie à la base de la recherche

En parcourant de nouveau le préambule de cette thèse, la partie méthodologique devait

seulement occuper le premier chapitre. Toutefois, a posteriori, ces aspects s’étendent au-delà

de ce chapitre, non pas que cela ait été là notre principale préoccupation mais juste que

finalement, aux détours de certaines questions, nous nous sommes rendus compte de

l’importance de ces tenants et aboutissants. Finalement, le message présenté ici n’est en rien

un jugement de valeur vis-à-vis des études présentant des incohérences méthodologiques mais

plutôt un signal d’alarme car bon nombre d’avertissements passent souvent inaperçus soit

dans le domaine considéré, soit dans des revues de disciplines que nous n’avons pas

l’habitude de consulter (en sciences économiques notamment pour les aspects statistiques).

Discussion générale et perspectives d’études

72

Dans le cas de l’analyse discriminante par exemple, cette technique ainsi que les problèmes

que nous avons abordés la concernant (annexe 1), relatifs entre autre aux méthodes de

validations ainsi qu’à la réduction des variables, sont connus, et ce depuis fort longtemps, par

les mathématiciens "purs" ainsi que par les économistes (Eisenbeis 1977). En ce qui concerne

la littérature en ornithologie, nous avons pu constater que certains auteurs maîtrisaient bien le

sujet et tenaient compte de ce qui était réalisé dans d’autres disciplines. Le problème est qu’au

fil du temps, ces "bonnes pratiques" ont plus ou moins disparu. Diverses hypothèses sont

possibles, notamment le fait que l’utilisation de logiciels statistiques permette d’exécuter

diverses procédures complexes avec une grande simplicité. Toutefois, si l’utilisateur ne

dispose pas d’un minimum de connaissances statistiques, cela peut aboutir à des conclusions

erronées ou à la mauvaise utilisation d’une procédure. Ceci est notamment le cas pour

l’analyse discriminante. En fonction du logiciel employé, les techniques de validation

diffèrent. Par ignorance, certains auteurs auraient finalement cité leurs prédécesseurs sans

connaître spécifiquement les détails techniques de la procédure, parfois même sans vérifier la

source initiale, juste en se basant sur la validité d’une étude déjà publiée.

Néanmoins, un autre principe de la recherche scientifique est que rien n’est jamais

figé, ni gravé ad vitam æternam dans le marbre notamment en fonction des techniques

employées. Ceci est finalement bien illustré par l’étude du polymorphisme de ressources chez

Z. aurita sur l’île de la Barbade où une partie de la population se nourrit et défend un territoire

alors que d’autres tourterelles s’agrègent sur des sites de stockage de grains pour se nourrir en

groupe (chapitre II, annexe 2). Cette étude trouve ses fondements dans les travaux de Sol et

al. (2005) dans lesquels les tourterelles étaient sexées sur la base d’un supposé dimorphisme

sexuel au niveau du plumage de ces oiseaux. De plus, aucun réplicat était effectué pour les

deux sites d’études (un site territorial et un site de nourrissage en groupe). Notre intention à

l’égard de cette publication n’était en rien de la pointer du doigt en jugeant le travail effectué

mais au contraire d’améliorer la connaissance de ce sujet et, éventuellement de rectifier le tir.

Par l’ajout de réplicats et l’introduction de techniques moléculaires (sexage moléculaire et

microsatellites), la vision que nous avions des stratégies d’approvisionnement des tourterelles

à queue carrée de la Barbade a évolué. Bien que nous ne sachions toujours pas définir avec

précision cette situation, l’hypothèse du polymorphisme de ressource a néanmoins pu être

écartée. Cette étude est une illustration de l’intérêt d’une métaréplication à savoir améliorer la

connaissance en réexaminant une problématique avec de nouvelles méthodes (Johnson 2002,

2006, Kelly 2006). Toutefois, comme le souligne Palmer (2000), les lignes éditoriales de

revues scientifiques ne semblent pas encourager la publication d’études réplicatives excepté


73

dans le cas où les conclusions peuvent créer une émulation. En d’autres termes, les points

cruciaux de la publication, du moins dans les meilleures revues (Palmer 2000), sont le niveau

de significativité des tests statistiques mais surtout l’originalité des résultats. De ce fait, une

étude réplicative peut être publiée dans le cas où les résultats obtenus infirment les travaux

précédents. Par ce système, vantant l’originalité et la forte significativité des études, bon

nombre de travaux présentant des effets faibles, non significatifs et négatifs sont rejetés. La

difficulté à publier des résultats issus d’études réplicatives ou des travaux tendant à contredire

la "théorie du moment" contribue à créer un biais de publication (Palmer 2000, Møller &

Jennions 2001, Jennions & Møller 2002a, 2002b, Koricheva 2003) que nous avons déjà

évoqué au cours du troisième chapitre pour la relation entre hétérozygotie, aptitude

phénotypique et asymétrie fluctuante (Coltman & Slate 2003, Chapman et al. 2009). Le

problème majeur est que finalement, les études publiées ne reflètent pas les connaissances que

l’ensemble de la communauté scientifique pourrait avoir. Par extension, les revues

bibliographiques ne dévoilent qu’une partie cachée de l’iceberg. Pour ce qui est des méta-

analyses, donnant en fin de compte une vision plus précise que l’analyse de la littérature,

celles-ci devraient systématiquement intégrer une correction, telle que la méthode "trim &

fill" préconisée par Jennions & Møller (2002a) afin de limiter les effets de ce biais (Møller &

Jennions 2001, Jennions & Møller 2002b, Tomkins & Kotiaho 2004, Chapman et al. 2009).

Globalement, outre les aspects purement méthodologiques à soigner lors de l’élaboration du

protocole expérimental puis au moment de l’analyse des données, ce sont les mentalités de

l’ensemble de la communauté scientifique et surtout des éditeurs de revues scientifiques qui

devraient être modifiées vis-à-vis des résultats négatifs ou non significatifs. A partir du

moment où l’ensemble du protocole et du traitement des données est correctement effectué,

un résultat négatif ou non-significatif est un résultat avant tout, méritant d’être publié au

même titre qu’un résultat significatif. Bien que ceci soit foncièrement accepté par tous, peu

d’articles ont été publiés dans les journaux développés à cet effet tels que Journal of Negative

Results - Ecology & Evolutionary Biology, créé en 2004 (Kotze et al. 2004). Même si un réel

enjeu de connaissance existe, ce journal a publié en moyenne, depuis sa création, moins de

deux articles de recherche par an (neuf articles au total sur cinq volumes publiés).

Dans le cadre de nos travaux, une attention particulière a été portée aux méthodes afin

de construire des bases solides pour pouvoir mener une étude chez Zenaida aurita sur le long

terme. Pour cela, divers outils et techniques ont été adaptés afin d’être utilisés en routine

(chapitre I). Parmi ceux-ci, les outils moléculaires permettant le sexage ainsi que les

microsatellites pour le génotypage des tourterelles à queue carrée sont sans doute le point


74

crucial de cette étude. L’apologie de ces méthodes n’est sans nul doute plus à faire car elles

font aujourd’hui partie intégrante de la caisse à outils du biologiste, que ce soit pour

l’écologie ou la biologie évolutive. Ces méthodes moléculaires seules ou associées aux

mesures morphométriques permettent d’élargir l’horizon quant aux différents thèmes

potentiellement abordables sur une espèce monogame insulaire, largement répartie au sein de

l’archipel d’où elle est endémique. Les possibilités de recherche étant multiples, je me

restreindrai ici à seulement deux axes, le premier en génétique des populations et le second en

écologie comportementale, disciplines pour lesquelles l’apport de la génétique a sans doute

été déterminant dans la progression des connaissances.

La tourterelle à queue carrée dans l’arc caribéen

La tourterelle à queue carrée est, comme cela a été présenté dans le chapitre I, une

espèce commune dans les Antilles, avec une présence plus ou moins marquée de la Floride au

sud des Petites Antilles (Allen 1950, Emlen 1977, Evans 1990, Raffaele et al. 2006). Sa large

répartition en fait une espèce idéale pour l’étude de l’impact des différences biotiques et

abiotiques sur la différenciation morphologique et génétique. En effet, chacune des îles

possède une identité propre en termes "d’environnements compétitifs" ce qui, sous l’effet de

la sélection, ne favorise pas le même type d’individus (Grant 2001). Ainsi, sous l’effet d’une

réduction plus ou moins importante du flux de gènes entre les différents isolats constituant

l’archipel, une différenciation génétique et/ou morphologique plus ou moins prononcée

devrait être observée entre les populations de tourterelles à queue carrée issues de ces

différentes îles. Des travaux préliminaires réalisés par deux étudiantes (master 1ère et 2ème

année) comparant les tourterelles de la Barbade et celles de la Guadeloupe ont d’ores et déjà

mis en évidence une différenciation tant aux niveaux morphologique que génétique grâce aux

outils moléculaires dont nous disposons (Harrang 2008, Colin 2009). Des données concernant

Sainte Lucie devraient rapidement pouvoir être également intégrées afin de préciser l’analyse.

Deux autres îles ont également été prospectées pour l’échantillonnage en 2009 : Saint Martin

et la Jamaïque. Toutefois, trop peu d’individus ont pu être capturés pour être utilisés

(respectivement deux et trois tourterelles). Dans ce cadre, une extension de la zone

d’échantillonnage devra être envisagée. Cependant, ceci nécessite non seulement des moyens

financiers mais également des moyens humains car, finalement, la situation à la Barbade (i.e.

le fait que les tourterelles soient relativement anthropophiles), facilite tout de même


75

grandement la question du baguage, ce qui n’est à l’évidence pas le cas dans les îles comme

Saint Martin et la Jamaïque.

Par ailleurs, une recherche annexe visant à rechercher des parasites sanguins chez les

tourterelles à queue carrée a également été effectuée sur les individus de la Barbade et de la

Guadeloupe. Aucun des individus de la Barbade était porteur de parasites tels que

Plasmodium sp. et/ou Haemoproteus sp. (plus de 150 individus testés) contrairement aux

individus de la Guadeloupe chez lesquels environ 50% de prévalence a été observée pour une

des populations testées (données non publiées). A la Barbade, deux lignées d’Haemoproteus

sp. ont été relevées (Fallon et al. 2005, Svensson & Ricklefs 2009) et plusieurs espèces vivant

en sympatrie avec les tourterelles à queue carrée en sont porteuses telles que la colombe à

queue noire, Columbina passerina, le sucrier à ventre jaune, Coereba flaveola, le sporophile

cici, Tiaris bicolor, le sporophile de la Barbade, Loxigilla barbadensis et le quiscale merle,

Quiscalus lugubris (Fallon et al. 2005, Svensson & Ricklefs 2009). Celle-ci est également

présente dans toutes les Petites Antilles dont la Guadeloupe (Fallon et al. 2005). Comme cela

a déjà été montré chez le moineau domestique, Passer domesticus (Loiseau et al. 2008), un

allèle particulier du CMH (Complexe Majeur d’Histocompatibilité) conférant une résistance à

cette lignée d’Haemoproteus sp. pourrait être présent à la Barbade mais absent ou rare à la

Guadeloupe. Ainsi, le développement de marqueurs du CMH pourrait être ici un atout et

ceux-ci seraient également utilisables dans un tout autre contexte qui est celui de la sélection

sexuelle.

Le choix du partenaire : un retour aux origines

L’idée originale de l’étude de la monogamie et notamment du choix du partenaire chez

la tourterelle à queue carrée n’a certes pas été abordée expérimentalement dans l’ensemble du

manuscrit, mais des travaux préliminaires sur les couples, également entrepris par deux

étudiantes (master 1ère et 2ème année), ont été réalisés (Slaski 2008, Doyen 2009).

Globalement, les associations entre mâles et femelles ne semblaient pas se faire selon des

traits simples (voir néanmoins les résultats obtenus pour les ailes et la queue, Doyen 2009).

D’autres caractères tels que les taches iridescentes sur le plumage de part et d’autre du cou

des individus pourraient également être testés mais supposent de pouvoir établir une méthode

de mesure compatible avec les conditions du terrain. Un élément que nous n’avons jamais

dissocié du phénotype au fil de ce manuscrit, le génotype, est également une piste à suivre.


76

D’un point de vue du choix du partenaire, chaque sexe bénéficie à choisir un partenaire ayant

un patrimoine génétique différent afin d’optimiser l’hétérozygotie ou du moins minimiser la

consanguinité de leur descendance (Brown 1997, 1999, Kempenaers 2007). Cependant, dans

ce cas de figure, les marqueurs les plus appropriés devraient être soumis à la sélection

naturelle ce qui n’est, a priori, pas le cas des marqueurs microsatellites (voir néanmoins

Selkoe & Toonen 2006 pour une remarque à ce sujet). Par contre, les marqueurs du CMH,

évoqués précédemment, peuvent jouer un rôle important dans le choix du partenaire compte

tenu de leur implication dans le système immunitaire (pour des exemples récents se référer à

Eizaguirre et al. 2009 et Bos et al. 2009). Toutefois, le développement de ces marqueurs

nécessite du temps et des compétences. Ce travail n’ayant été entrepris que très récemment,

aucun résultat préliminaire ne peut être abordé ici.

To be continued…

Dans l’ensemble, nul ne doute aujourd’hui de l’utilité des outils moléculaires compte

tenu de leur apport incontestable en écologie et en biologie évolutive. Néanmoins, la

génétique seule n’explique pas tout et finalement l’environnement agit comme un sculpteur

façonnant une statue correspondant à son univers. Sortie de son contexte écologique aucune

relation liant le phénotype et le génotype dans un contexte évolutif ne peut être généralisée.

Les techniques qui ont été soit développées ici ou tout simplement adaptées et/ou testées chez

la tourterelle à queue carrée constituent des bases solides pour un projet de grande ampleur tel

que celui qui a été initialement pensé et qui est voué à prendre d’autant plus d’envergure que

d’autres outils, tels que les marqueurs du CMH, seront efficients. Bien qu’aucune prédiction

quant à la pérennité des recherches ne puisse être formulée, cette étude est promise à

foisonner en un questionnement illimité. Maintenant, compte tenu du fait que les outils sont

disponibles (du moins en grande majorité), le travail de terrain que ce soit au niveau des

captures mais également des observations pour le dénombrement des couples serait à

améliorer, notamment par un suivi systématique des individus identifiés comme tel. En effet,

l’intégralité des travaux doit pouvoir s’appuyer sur un nombre important de tourterelles

baguées chaque année pour conforter la robustesse de nos analyses. Ceci constitue donc un

point important à confirmer mais également à améliorer afin de pouvoir obtenir des suivis de

populations et plus précisément de couples sur les sites territoriaux de la Barbade.

77

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105

ANNEXES

ANNEXE 1

Monceau, K., Cézilly, F. & Dechaume-Moncharmont, F.-X. Sexing birds using discriminant

function analysis based on morphometric measurements: A critical appraisal.

Manuscrit en préparation

SEXING BIRDS USING DISCRIMINANT FUNCTION ANALYSIS 1

BASED ON MORPHOMETRIC MEASUREMENTS : A CRITICAL APPRAISAL 2

3

MONCEAU K., CEZILLY , F. & DECHAUME-MONCHARMONT, F.-X. 4

5

Université de Bourgogne, 6

Equipe Ecologie Evolutive, UMR CNRS 5561 Biogéosciences 7

8

Abstract 9

Despite the existence of alternative techniques, sexing birds using discriminant function 10

analysis based on morphometric measures remains a popular method among field 11

ornithologists. However, behind the apparent standardization and relative simplicity of the 12

technique, lie several subtle differences and pitfalls that have been somewhat neglected in 13

many published studies. Using a large data set on the Zenaida dove (Zenaida aurita), we 14

compare three methods commonly used to estimate the proportion of correctly classified 15

males and females by DFA: resubstitution, jack-knife or sample splitting. Simulations based 16

of 525 adults molecularly sexed birds showed that these procedures may lead to opposite 17

conclusions, especially when sample size is small. We call for caution in the use of 18

resubstitution techniques which are clearly over-optimistic. We instead recommend the use of 19

jack-knife cross-validation procedure, and we stress out the importance of large data sample 20

size. Finally, we show that moderate measurement error only marginally affects the accuracy 21

of the discriminant score. 22

23

Keyword : Morphometrical sexing, discriminant function analysis, cross-validation, sample 24

size effect, measurement effect 25

INTRODUCTION 26

27

Sex-related differences in the ecology of behaviour of bird species are crucial to our 28

understanding of sexual selection and mating systems (Andersson 1994), and may also have 29

important consequences in terms of management and conservation (Zavalaga & Parades 1997, 30

Fernandez-Juricic et al. 2009). Therefore, distinguishing sexes is of paramount importance in 31

avian studies. However, although sexual dimorphism can be conspicuous, especially in the 32

case of polygynous species, differences between male and female birds are often tenuous, or 33

escape the human eye (Cuthill et al. 1999). Several techniques have therefore been developed 34

to alleviate this difficulty, such as anatomical examination (Petrides 1950, Miller & Wagner 35

1955, Shamis & Forrester 1977, Bancroft 1984, Malacalaza & Hall 1988, Swanson & 36

Rappole 1992, Lorentsen & Røv 1994, Small et al. 2005), vocalization analyses (Blakesley et 37

al. 1990, Murie et al. 1991, Bretagnolle & Thibault 1995, Lo Valvo 2001, Gill & Vonhof 38

2006, Bourgeois et al. 2007), or sex-specific behaviour analyses (Castoro & Guhl 1958, 39

Chardine & Morris 1989, Blakesley et al. 1990, Desrochers 1990, Hull 1996, Martínez-40

Gómez & Curry 1998, Flux & Innes 2001, Fletcher & Hamer 2003, Gill & Vonhof 2006, 41

Alarcos et al. 2007). Such techniques tend, however, to be time-consuming, and do not 42

always allow perfect sex assignation. Molecular techniques (Griffiths & Tiwari 1993; see 43

Dubiec & Zagalska-Neubauer 2006 for a recent review), on the other hand, are thought to be 44

more reliable, but require training and a licence to collect blood or tissues, and imply financial 45

costs to process samples. 46

Consequently, sexing based on morphometrics remains a popular technique among 47

field ornithologists. Indeed, small, albeit significant, differences in biometrics often exist 48

between males in females of monomorphic bird species, offering the possibility to 49

discriminate between sexes using statistical inference. To that end, various statistical analyses 50

have been used, such as logistic regression (Jeffrey et al. 1993, Iko et al. 2004, Ura et al. 51

2005, Gill & Vonhof 2006), principal component analysis (Rubega 1996, McCracken et al. 52

2000, Remisiewicz & Wennerberg 2006, Urfi & Kalam 2006, Shealer & Cleary 2007, 53

Schroeder et al. 2008), or generalised linear model (Hallgrimsson et al. 2008). However, 54

discriminant function analysis (DFA) remains the most commonly used procedure, and over 55

the last 40 years, more than one hundred studies on sex determination or sex dimorphism 56

using DFA have been published (source: Web of Science). DFA provides equations including 57

at least one component allowing the parting in two categories or more (Fisher 1936). 58

Classification of individuals of known sex in relation to morphological measurements using 59

DFA provides subsequently a quick and relatively easy determination of gender in individuals 60

of unknown sex. 61

However, caution should be exerted when resorting to morphometric measurements 62

and DFA to sex birds. In particular, both sample size (Toft & Shea 1983, Rotenberry & Wiens 63

1985) and measurement error (ME) (Lougheed et al. 1991) require particular attention. 64

Indeed, discriminating rate is known to increase with increasing sample size (Morrison 1984), 65

and various rules of thumb have been recommended to determine minimum sample size 66

(Morrison 1984). Following Bailey & Barnes (1990), ME can be defined as the variability of 67

a repeated measurement of a particular character taken on the same individual, relative to its 68

variability among individuals in a particular group. ME can arise from random or systematic 69

error that affects measurements, or systematic variation between two different measurers. 70

Repeated measurements on several subjects are thus required to quantify measurement error. 71

However, despite the fact that the need for repeated measures has been emphasized (see 72

Lessells & Boag 1987), few published studies using DFA mention ME, and its potential effect 73

on discrimination rate is rarely investigated (Flux & Innes 2001, Devlin et al. 2004, Kenward 74

et al. 2004; see however Mallory & Forbes 2005). However, differences within group or 75

among individuals can be biased due to ME, increasing the risk of type II error (Bailey & 76

Byrnes 1990, Lougheed et al. 1991, Yezerinac et al. 1992, Arnqvist & Mårtensson 1998). For 77

example, Francis & Mattlin (1986) have shown that discriminant power could fall from 89 % 78

to less than 50 % when a small amount of bias exists, due to measurement error. So far, the 79

simultaneous effects of sample size and ME on sex determination from morphometrics have 80

not been considered in avian studies. In addition, various statistical methods can be used to 81

estimate the proportion of correctly classified males and females by DFA, but their use is 82

rarely justified in the avian literature (see below). 83

Here, we address the problem using a twofold approach. First, using statistical 84

analyses and simulations, we analyze a large data set obtained in the Zenaida dove (Zenaida 85

aurita), to look at the relation between discriminant power and variation in sample size, 86

measurement error, and classification method. Second, we review the literature to assess the 87

proportion of published studies relying on adequate methodology, and provide 88

recommendations for future studies. 89

90

91

MATERIAL AND METHODS 92

93

SEXUAL DIMORPHISM AND SEX DETERMINATION IN THE ZENAIDA DOVE 94

95

The Zenaida dove is widely distributed through the Caribbean islands (Bahamas, 96

Greater and Lesser Antilles), the coast of the Yucatán Peninsula and adjacent islands. It 97

generally feeds on the ground in agricultural or urban areas, or in wood lands (Wiley 1991, 98

Rivera-Milán 1997, 1999, Sol et al. 2005). The species is sexually monomorphic, and 99

supposed differences in plumage coloration between males and females (del Hoyo et al. 1997, 100

Gibbs et al. 2001) have not received confirmation. 101

102

Captures and measurements 103

Zenaida doves were caught in four locations in the western part of the island of 104

Barbados: two locations where doves hold territories (Bellairs Research Institute and Sunset 105

Crest area, both in St James Parish) and two where they feed in large flocks at grain storage 106

facilities (Barbados Mills Compounds and Roberts Manufacturing Co. Ltd., both in St 107

Michael Parish). Captures were made from March to April in 2007 at the four locations using 108

walk-in baited drop traps (Goldberg et al. 2001, Sol et al. 2005). Birds were first banded with 109

an unique combination of colour plastic bands (A.C. Hughes Ltd., Hampton Hill, United 110

Kingdom) and one numbered aluminium ring from the National Museum of Natural Life 111

History of Paris. Then, the following characters were measured twice: three dimensions of the 112

bill at nostrils (length, depth and width), head plus bill length, left and right tarsus length, left 113

and right wing length, and tail (fig. 1). All measurements were made with a digital calliper 114

(precision: ± 0.2 mm), except for wings and tail length which were measured with a ruler 115

(precision: ± 1 mm). Blood sample (40 µl twice) for molecular sex determination was 116

obtained by puncture of the brachial vein and collected with sodium heparinised haematocrit 117

capillary tube (Hirschmann Laborgeräte, Germany). Samples were stored in 800 µl of a 118

special buffer containing 70% of absolute ethanol and 30% of Tris-EDTA buffer (TE, pH 8). 119

Weight was measured with a PESOLA® digital pocket scale MS 500, (Precision: ± 0.1 g, 120

Switzerland). All, birds were released where they were caught. An additional sample caught 121

in March 2006 was used only for testing molecular methods (see next section for details). 122

123

124

Molecular sexing 125

DNA extraction protocol was modified from Hillis et al. (1996). One hundred 126

microliters of blood in storage buffer were centrifuged at 4000 rpm for 1 min to pellet blood 127

cells. Supernatant was discarded before adding 200 µl of Queen’s Lysis buffer (Seutin et al. 128

1991) and three units of proteinase K. Samples were incubated at 55°C for at least three 129

hours. A double phenol-chloroform extraction was applied followed by another chloroform 130

extraction and then 150 µl of aqueous phase were transferred in 375 µl of -20°C cold 131

isopropanol for precipitating DNA. Jellyfishes (precipitated DNA) were transferred in a new 132

tube, washed three times with -20°C cold 70% ethanol, dried for 15 min at room temperature 133

and resuspended into 100 µl of Tris-EDTA buffer (pH 8). 134

Two sets of primers were initially tested for sexing Zenaida doves. The first one was 135

P2 (5′-TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3’) and P8 (5′-CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3′) 136

defined by Griffiths et al. (1998). All individuals caught in 2006 were sexed with P2 / P8 at 137

least once and 21 (randomly chosen) were sexed twice to control. Then, 88 samples (also 138

randomly chosen) were tested with the second set of primers 2550F (5′-139

GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′) and 2718R (5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′) 140

defined by Fridolfsson & Ellegren (1999) for confirming results and evaluate PCR accuracy 141

with both set of primers. In all cases, PCR were performed using 3 µl of DNA mixed with 5 142

U/µl of HotMasterTM Taq polymerase (Eppendorf®), Taq HotMaster buffer 10 X 143

(Eppendorf®), dNTPs at 5mM, Pf and Pr both at 5 µM. PCR program was the same for both 144

set of primers: 30 at 94°C, 30 s at 94°C, 45 s at 46°C, 45s at 65°C and 5 min at 65°C. Then 145

PCR products were put on a 3% agarose gel and revealed with ethidium bromide under UV. 146

Results with P2/P8 were not obtained directly. After PCR, only one band (around 380 pb) was 147

visible for all individuals on 3% agarose gel. Two enzymes can be used Hae III or Dde I. The 148

last one was chosen because the restriction site has been demonstrated to be conserved on 149

CHD1-W in different genus (Griffiths & Tiwari 1993, Griffiths et al. 1996, Bermúdez-150

Humarán et al. 2002). Therefore, Dde I was applied on each PCR product: 2µl of PCR 151

product with 10µl of enzyme buffer, 9 µl of performed like this: 5h at 37°C and the last 10 152

min. at 65°C. Results were given after run on 3% agarose gel: two bands, were then visible 153

for one individual of each pair (female) and only one (Z). Sex identification with P2 / P8 154

coupled with DdeI (88) matched perfectly with sex identification using 2550F / 2718R. 155

Because 2550F / 2718R were easier to use than P2 / P8, birds caught in 2007 were all sexed 156

with those primers. 157

158

Analysis of sexual dimorphism 159

A total of 525 adults (294 females, 231 males) were used for morphometric analysis. 160

Normality (Shapiro-Wilk test) and homoscedascity (Levene test) were first checked. 161

Repeatability and measurement error were assessed using F ratios from type II ANOVA 162

(Lessells & Boag 1987, Bailey & Byrnes 1990, Yezerinac et al. 1992, Arnqvist & Mårtensson 163

1998, Señar 1999). As repeatability was satisfactory for all measurements (table 2), we used 164

the mean of first and second measurement of each parameter in subsequent analyses. 165

Each character was compared between males and females using a t test. Mean 166

different index (MDI) was used as an index of sexual dimorphism index and computed as: (Xf 167

/ Xm) x 100, with Xf et Xm corresponding to the means for the considered characters for 168

female and male respectively (Delestrade 2001, Helfenstein et al. 2004, Haggerty 2006). 169

170

Discriminant function analyses 171

We performed discriminant function analysis (DFA) on the 525 molecularly sexed adults 172

using the eight morphometrical parameters listed in table 2. Due to violation of the 173

assumption of homogeneity of variance-covariance matrices (box’s M test, χ²190 = 267.1, p = 174

0.0002), we performed quadratic DFA (Stevens 1992) using qda function from MASS 175

package (Venables & Ripley 2002) for R language (R Development Core Team 2009). 176

We compared three methods commonly used in bird sexing to estimate the proportion 177

of correctly classified individuals by a DFA: resubstitution, jack-knife or sample splitting. In 178

the first method, the sex of each individual is predicted using the discriminant function 179

calculated from the complete data set. With jack-knife (or leave-one-out) method, the sex of 180

an individual is predicted from the discriminant equation calculated after that individual has 181

been removed from the data set. This procedure was repeated until a sex was assigned to each 182

individual (Tabachnick & Fidell 1996). With sample splitting, the data set was randomly 183

divided in two sub-samples, and the training set (two third of the individuals) was used to 184

compute the discriminant function, while the remaining data were used to assess the accuracy 185

of the discriminant function (Picard & Berk 1990). 186

187

Simulations 188

We used simulations first to study the effect of the sample size on the estimated 189

accuracy of DFA classification. We defined 100 sample sizes ranging from 25 to 520 190

individuals, regularly spaced every five individuals. For each sample size, we randomly 191

selected 500 different sub-samples from the complete data set. For each one of these 50000 192

sub-samples, we performed DFA and assessed the discriminant rates based on resubstitution, 193

jack-knife or sample splitting methods. 194

We performed another series of simulations to address the effect of measurement 195

errors, using this time the complete data set (n = 525 individuals). For each bird, each 196

parameter was estimated as the mean of two measures. Measurement error corresponds to the 197

difference between the first and the second measure. This difference followed a normal 198

distribution centred around zero and of standard deviation σ. We simulated an increase in 199

measurement error by adding a random noise to every parameter. This random noise followed 200

a normal distribution with mean µ = 0 and standard deviation σ’ = k σ, proportional to the 201

corresponding standard deviation σ observed on the original data. We called measurement 202

noise coefficient, the coefficient of proportionality k. For a given simulation of data set, the 203

measurement noise coefficient k was the same for every parameter, but the standard deviation 204

σ was different for each parameter. Thus, the distributions used for the random generation of 205

the noise were different for each parameter. A coefficient k = 0 means that no random noise 206

has been added to the measures and we used the original data set. Note that it was not possible 207

to have an index lower than 0 because data accuracy in our simulations cannot exceed that of 208

data actually collected in the field. It was then only possible to simulate less accurate data. For 209

value of coefficient k, we simulated 500 data sets and performed a DFA on each data set. For 210

every DFA, the proportion of correctly sexed individuals was estimated using the jack-knife 211

procedure. 212

213

214

L ITERATURE SURVEY 215

A literature survey concerning studies involving DFA for sex identification or sexual 216

dimorphism in birds was done using Web of Science and additional references. From 1977 to 217

present, 85 papers were reviewed containing 105 analyses (see table 1). At the first reading, 218

papers differed in the DA procedure used for discriminant score evaluation in the use or not of 219

automated stepwise variable reduction. Due to this large variety, different kinds of 220

information were retained for subsequent analyses: the bird species and its family, the total 221

sample size, the discriminant rate, the validation process and the variable reduction (table 1). 222

Measurement error was also noted when it was mentioned. 223

224

RESULTS 225

226

Measurement error, repeatability and sexual dimorphism 227

228

Measurement error was low for all traits (less than 11%), except for bill depth for 229

which ME was around 22% (table 2). Males and females were significantly different for all 230

morphological traits and mean differences index (MDI) was above 95% for all characters 231

(table 2). 232

233

Discriminant function analysis 234

235

Effect of the method of validation and sample size 236

Consider the DFA based on the complete original data set (n = 525 adults). The 237

estimated proportions of correctly classified birds were only marginally different according to 238

the validation method. Resubstitution method estimated a proportion of correctly sexed adults 239

of 80.95% (87.41% of the females and 72.73% of the males). Jack-knife cross-validation led 240

to an estimated proportion of 80.38% (86.39% for the females and 72.73% for males). Sample 241

splitting method depends strongly on the random selection of training and test sets. A 242

bootstrapped estimate based of 500 iterations lead to a mean (+/- standard deviation) 243

proportion of correctly classified birds of 79.1 +/- 3.51 % (79.13 +/- 2.6 % of the females and 244

79.05 +/- 4.69 % of the males). 245

246

Effect of sample size 247

The differences between the three methods were far from negligible for small sample 248

size (figure 1). The estimated the proportions of correctly sexed birds were the most 249

optimistic when using the resubstitution method, and, more surprisingly, decreased with 250

increasing sample size (figure 1a). For small data set (n < 60 birds), the mean estimate was 251

greater than 90% of correctly classified adults. On the contrary, the mean estimates with jack-252

knife (figure 1b) or sample splitting (figure 1c) methods were consistent, and increased with 253

increasing sample size: the more birds were measured, the more accurate the discriminant 254

function was. A noticeable difference between these two methods was related to the variance 255

of the estimates. Variance was always much bigger with sample splitting, even for large data 256

set. 257

258

Effect of measurement error 259

When adding random noise to the data in order to simulate increasing measurement 260

error, the proportion of correctly classified individuals decreased (figure 2). However, this 261

decrease was quite slow. Setting a coefficient of proportionality k = 1 means that we added to 262

every variable a random noise with a standard deviation equal to the corresponding observed 263

standard deviation. With this added random noise, the measurement error of every parameter 264

approximately doubled. For example, the error for bill depth increased from 21.8% (raw data) 265

to 45.2% (with added noise), and the error for wing length increased from 1.25 % (raw data) 266

to 3.25% (with added noise). Despite this drop of accuracy in the measures, the mean 267

proportion of correctly classified individuals only decreased from 80.38% to 79.36%, a 268

proportional decrease of the original precision of less than 1.3% corresponding to 269

approximately five additional adults incorrectly classified. Moreover, in many simulations 270

increasing the measurement errors actually increased the discriminant score. 271

272

273

274

Literature survey 275

276

Thirty-one families including 77 different species were represented in our subset of the 277

existing literature. Sample size varied greatly from ten birds to 1891 (mean = 141.15) and 278

discriminant went from 63 to 100% (mean = 89.57%). Although a threshold of 30 individuals 279

is usually recommended, published studies using DFA did not systematically respect this 280

criteria (table 1). All types of validation procedure were represented, but not in equal 281

proportion: 43.5% relied on resubstitution (including cases were no particular method was 282

clearly mentioned), whereas jackknife and sample splitting accounted for 35.3% 21.2% of the 283

studies, respectively. Concerning stepwise variable reduction, 60% of the reviewed papers 284

used automatic procedure implemented in statistical software packages. Finally, measurement 285

error was mentioned in less than 6% of the papers. 286

287

288

DISCUSSION 289

290

Every study we have reviewed referred to the estimated proportion of correctly sexed 291

individuals in order to validate the discriminant equations they recommended for 292

morphometrical sexing. There are a number ways in which this proportion can be estimated, 293

and yet the choice of a particular validation method instead of another is sometimes perceived 294

as a minor question, more related to statistician debates than to field biology. For example, 295

jack-knife cross-validation and resubstitution techniques are believed to be largely consistent, 296

the latter being slightly more optimistic than the first one. On the contrary, our simulations 297

show that the validation techniques may have far from negligible effects on the analysis 298

predictions, and may even lead to completely opposite conclusions, especially for small to 299

medium sample size. 300

Mean and variance of estimated DFA rates have already be reported to be highly 301

variable according to the validation procedure used. It has been largely publicized in 302

statistical (Johnson & Wichern 1992, Huberty 1994, Manly 1994, Wehberg & Schumacher 303

2004) and applied (Eisenbeis 1977, Lance et al. 2000) literature that reclassification of the 304

original sampled used in construction the discriminant rule as a mean to estimate expected 305

error rates (resubstitution) lead to a biased and overly optimistic prediction. In one of the 306

oldest papers using DFA for birds sexing, Ryder (1978) explicitly raised the problem of 307

resubstitution and recommend not using it especially in case of comparison between studies. 308

But as the technique grew more popular within the ornithologist community, this advice has 309

been clearly overlooked. However, the fact that a package offers a particular validation 310

procedure is clearly not a sufficient reason to use it as a ‘black-box’ that makes a decision 311

without any explanation (Piraux & Palm 2001, Venables & Ripley 2002). 312

In accordance with previous studies (Huberty 1994, Lance et al 2000, Hastie et al. 313

2009), the bias tends to decrease as the size of the sample increases. Nevertheless, the bias 314

remained particularly sensitive to data of small or intermediate size (less than 200 individuals 315

in the present study). Only sub-sampling techniques (such jack-knife cross-validation or 316

sample splitting of the data into training and test sets) provide an unbiased estimate of the 317

model performance (Hand et al 2001, Piraux & Palm 2001, Wehberg & Schumacher 2004, 318

Hastie et al 2009). Estimates of the discriminant score based on jack-knife procedure and 319

sample splitting should therefore be preferred over apparent discriminant score based on 320

resubstitution. But these two sub-sampling techniques are not completely interchangeable. 321

When we split the sample and used only a portion of it, the resulting estimates was expected 322

to have high variance. Indeed, using a very large training set ensuring a precise computation 323

of the discriminant function, restrains the validation to a small test set. On the contrary, using 324

a large test set and a smaller training set, leads to a less precise computation of the 325

discriminant function. It is commonly recommended to randomly split the data in a large 326

training set of about two third of the original data set, letting the remaining third for the test 327

set (Picard & Berk 1990). Such procedure leads to a mean estimate of the proportion of 328

correctly classified individuals consistent with the mean estimate using jack-knife procedure. 329

However, the variance was much bigger, especially for large sample sizes. This is why jack-330

knife cross-validation should also be preferred against sample splitting procedure. 331

Assessment of discriminant performance is of crucial importance in practice, since it 332

gives a measure of the quality of the model ultimately chosen equation for sexing birds. Field 333

biologists are extremely sensitive to the proportion of misclassified birds using a published 334

discriminant equation or another. If the risk of error was reported to be high, one would prefer 335

to use alternative and sometimes more expensive, time consuming (behavioral or molecular 336

sexing) or (laparoscopy) invasive techniques. It is also possible that many authors restrained 337

themselves from publishing DFA with low discriminant score. Our simulations with data set 338

of small to medium size emphasize the large variance in the estimated proportion of 339

misclassified bird. Even with less-biased techniques such jack-knife cross-validation or 340

sample splitting, a low (or high) discriminant success can perfectly be obtained by chance. 341

In the discussion of many papers, the discriminant scores were also frequently 342

compared to previous studies, most of the times in order to claim that their new discriminant 343

function lead to better classification success, sometimes by increasing the previous one only 344

by few percents. It is obvious that such precise comparisons are totally meaningless if 345

different techniques are used to estimate the discriminant score. Even if the same validation 346

procedure has been followed, one should keep in mind that the estimates may be highly 347

variable in relation to the sample size. The absence of consensus about the validation 348

techniques and large disparity among predicted discriminant scores according to the most 349

commonly used techniques, as well as the effects of sample size, should be taken into account 350

in future meta-analyses. 351

Another use of discriminant scores comparison is also highly questionable. Some 352

authors compared apparent error (from resubmission procedure) and error estimated by 353

sample splitting in order to detect possible sampling bias (e.g. Hanners & Patton 1985). As 354

long as these two error rates were not too different, they concluded to the absence of sampling 355

bias. However, our simulations showed that important differences between these two 356

estimates are possible even in absence of particular sampling bias, especially for small data 357

sets. 358

Large sample sizes were previously requested for accurate prediction of the sex ratio 359

in natural population (Brennan et al 1991). Moreover, our simulations stressed out the crucial 360

importance of large sample sizes in DFA. Analysis lead not only to a more discriminant 361

equation with a higher jack-knifed discriminant score, but also a more accurate estimates of 362

this score because its variance shrinks with increased sample size (Wehberg & Schumacher 363

2004). Several authors carefully adjusted the number of birds measured and the number 364

morphological parameters in order to have a sample size at least three times bigger than the 365

number of variables used in the DFA (Williams & Titus 1988, McGarigal et al. 2000), but this 366

criterion is sometimes claimed to be arbitrary (James & McCulloch 1990). There is a large 367

variability of performance estimations among samples from different sizes. Especially 368

discriminant rate from small data sets might be highly unreliable (Isaksson et al. 2008). For 369

small sample sets relative to the number of variables, the analysis leads to poor discriminant 370

rate. This result is known as the curse of dimensionality (Bellman 1957), and is consistent 371

with previous observation (Marks & Dunn 1974). 372

Morphometrics measures are costly in time and stressful for the birds. Field biologists 373

have to limit themselves on a small set of morphological parameters easy to measure. It is 374

why many authors use automated stepwise procedures in order to identify a reasonable set of 375

variables (60 % of the papers listed table 1). A common procedure is to measure many 376

morphological variables on a large number of individual. Then stepwise discriminant function 377

analysis is applied to examine differences between sexes, and to rank the morphological 378

variables according to their "importance". But biologists should be extremely cautious with 379

the output of such automated analysis. Stepwise methods tend to capitalize on sampling error, 380

and tend to yield results that are not replicable (Thompson 1995). Moreover, there is no 381

reason for the stepwise procedures to lead to the best equation to sex their model species. At 382

best, one should consider the equation as a “suggested” reduced set of parameters, not 383

necessarily the most discriminating nor the simplest (Derksen & Keselman 1992). One should 384

then consider it as a selection of a subset of variables among others that does an adequate job 385

of prediction, and keep in mind that, even if predictive models can eventually be developed, 386

there is no guarantee that they will be useful for later studies (James & McCulloch 1990). 387

Automated stepwise procedures are not reliable for assessing the relative importance of 388

variables and they are not able to select from a set of variables those that are most influential. 389

Thus, several authors strongly recommend not using any stepwise procedure at all (James & 390

McCulloch 1990, Snyder 1991, Thompson 2001). The fact that some statistical packages offer 391

such routine is clearly not a sufficient reason to use them. Indeed, one peer-reviewed journal 392

even made it an editorial policy to summarily reject any article that uses the technique 393

(Babyak 2004). Several authors underlie the crucial importance of large data set and 394

recommend alternative procedures based on combination of variables into biologically 395

meaningful groups. Scientific judgment must play a leading role in variables selection (James 396

& McCulloch 1990, Babyak 2004). If stepwise procedures are nevertheless used, Manly 397

(1994) advises to check its validity by rerunning it several times with randomized subsamples 398

of individual to see how significant are the results obtained. 399

Most importantly, the greatest danger of the use of stepwise analysis is of leaping 400

directly from routine procedure to straightforward conclusions about biological causes. In any 401

case, the fact that some variables were selected by the stepwise procedure does not mean that 402

they are more important than non-selected predicators. 403

Another conclusion of this study is the relative moderate effects of measurement errors 404

on the discriminant score. A simulated large increase in the measurement errors in our data 405

only marginally increased the estimated proportion of misclassification. Nevertheless, an 406

estimation of measurement errors has been rarely done in the paper we have reviewed and we 407

greatly need more data in order to conclude on the importance of the effect of such errors on 408

the accuracy of DFA. 409

The aim of this paper was to underlie many pitfalls that should be avoided and make 410

simple recommendations already well known from professional statisticians but apparently 411

somewhat neglected by field biologists. Despite the fact that DFA is extremely popular in the 412

ornithology literature, and constitute a standard technique for sexing birds, it is far from a 413

monolithic technique. The large disparity in methods for discriminant score estimation, the 414

sensitivity to sample size, and, to a lesser extent to measurement error, raise reasonable 415

doubts about usefulness of inter-studies comparisons and/or meta-analyses. 416

417

ACKNOWLEDGEMENTS 418

We are particularly grateful to Mr Steve A. Devonish and Natural Heritage 419

Department for allowing us to conduct our study in Barbados. We thank the Centre de 420

Recherches par le Baguage des Populations d’Oiseaux (Paris, France), and particularly 421

Olivier Dehorter and Denis Couvet, for providing us with metal rings and authorization to 422

ring Zenaida doves in the Caribbean. We also wish to thank Alison Mayers and Wayne 423

Worrell for hospitality, Richard Haynes, Victor Small, Sylvester Rowe, and Pat Odle for 424

logistic assistance, Laure Cauchard, Jérôme Moreau, Sébastien Motreuil, and Georges Prato 425

for assistance in catching and ringing doves, and Maria Gaillard and Rémi Wattier for help 426

and advice on molecular sexing. KM was supported by a doctoral grant from the Ministère de 427

la Recherche et de l'Enseignement Supérieur. Financial support was partly provided a 428

research grant from ANR (programme blanc, "Monogamix"). 429

430

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Table 1 : References cited using discriminant analyses in different family and species. Sample size, discriminant rate, validation and stepwise 810

procedures employed by authors were noted. Three different validation procedures were identified: jackknife (J), sample splitting (SS) and 811

resubstitution (resub). Stepwise procedure was quoted as automated (A) or none (N) including all other case different from A (hand made or no 812

stepwise procedure). 813

Family / Species Sample size Discrimination rate (%) Validation procedure Stepwise procedure References

Accipitridae Aquila adalberti 38 94,70 J A Ferrer & de la Court (1992)

Buteo jamaicensis 121 97,00 resub A Donohue & Dufty (2006) Buteo jamaicensis 50 98,00 resub A Donohue & Dufty (2006)

Haliaeetus albicilla 182 96,38 resub A Helander et al. (2007) Hieraaetus pennatus 81 84,00 J N Balbontin et al. (2001) Hieraaetus pennatus 41 100,00 J N Balbontin et al. (2001)

Alcedinidae Todiramphus cinnamominus 41 73,00 resub N Kesler et al. (2006)

Alcidae Alca torda 80 78,75 J A Grecian et al. (2003)

Alle alle 141 70,20 J A Jakubas & Wojczulanis (2007) Ardeidae

Ardea alba 76 89,50 J A Herring et al. (2008) Callaeidae

Callaeas cinerea wilsoni 131 82,60 resub A Flux & Innes (2001) Charadriidae

Charadrius montanus 190 63,00 resub A Iko et al. (2004) Columbidae

Ducula goliath 58 74,10 J N Barré et al. (2003) Zenaida galapagoensis 125 97,50 J A Santiago-Alarcon & Parker (2007)

Corvidae Corvus brachyrhynchos 74 91,90 resub N Clark et al. (1991) Corvus brachyrhynchos 30 79,50 resub N Clark et al. (1991)

Corvus frugilegus 156 98,70 resub N Green (1982) Table 1 (continued)


Corvus monedula 95 93,70 resub N Green & Theobalt (1989)

Corvus moneduloides 22 90,90 J A Kenward et al. (2004) Cyanopica cyanus 62 90,00 resub A Alarcos et al. (2007) Cyanopica cyanus 54 90,00 resub A Alarcos et al. (2007)

Emberizinae Miliaria calandra 103 96,10 resub N Campos et al. (2005)

Fringillidae Pseudonestor xanthophrys 51 97,00 J A Berlin et al. (2001)

Hirundinidae Hirundo rustica1 581 90,20 SS N Hermosell et al. (2007) Hirundo rustica2 1891 91,60 SS N Hermosell et al. (2007)

Hydrobatidae Oceanodroma furcata 120 89,00 SS N Boersma & Davies (1987)

Laridae Larus argentatus 480 96,80 resub N Coulson et al. (1983) Larus argentatus 316 92,00 SS N Evans et al. (1995) Larus argentatus 73 99,30 SS A Fox et al. (1981) Larus argentatus 54 98,15 resub A Shugart (1977)

Larus argentatus argenteus 134 97,8 resub A Migot (1986) Larus atricilla 76 93,00 SS N Evans et al. (1993) Larus atricilla 122 95,30 SS A Hanners & Patton (1985)

Larus cachinnans 181 100,00 J A Bosch (1996) Larus crassirostris 237 96,60 resub N Chochi et al. (2002) Larus delawarensis 59 95 SS A Ryder (1978) Larus delawarensis 93 97,85 resub A Shugart (1977)

Larus fuscus 121 97,50 resub N Coulson et al. (1983) Larus michahellis lusitanius 155 89,50 resub A Arizaga et al. (2008)

Larus ridibundus 411 94,40 resub A Palomares et al. (1997) Larus ridibundus 143 90,20 resub A Palomares et al. (1997)

Rissa tridactyla 45 95,60 resub N Coulson et al. (1983) Rissa tridactyla 303 84,16 SS N Jodice et al. (2000)

Mimidae Mimodes graysoni 35 100,00 J A Martínez-Gómez & Curry (1998)

Paridae Parus atricapillus 314 93,70 SS A Desrochers (1990)

Table 1 (continued)


Pelecanidae Pelecanus erythrorhynchos 188 97,00 J A Dorr et al. (2005)

Phalacrocoracidae Phalacrocorax albiventer 84 96,50 resub A Malacalaza & Hall (1988)

Phalacrocorax auritus auritus 80 95,70 SS A Glahn & McCoy (1995) Phalacrocorax bransfildensis 84 97,70 resub N Casaux & Baroni (2000)

Phalacrocorax carbo 81 95,10 J N Liordos & Goutner (2008) Phalacrocorax carbo sinensis 51 96,10 resub A Koffijberg & van Eerden (1995)

Phoenicopteridae Phoenicopterus minor 18 94,00 resub A Childress et al. (2005) Phoenicopterus minor 40 93,00 resub A Childress et al. (2005) Phoenicopterus minor 96 98,00 resub A Childress et al. (2005)

Podicipedidae Podiceps grisegena 76 80,00 resub A Kloskowski et al. (2006) Podiceps nigricollis 427 85,70 resub N Jehl et al. (1998)

Procellariidae Calonectris diomedea 94 93,70 J N Bretagnolle & Thibault (1995) Calonectris diomedea 211 95,00 resub N Lo Valvo (2001)

Fulmarus glacialis 63 95,00 J A Mallory & Forbes (2005) Macronectes giganteus 64 100,00 resub N Copello et al. (2006) Macronectes giganteus 40 100,00 resub N Copello et al. (2006) Puffinus mauretanicus 52 90,00 J A Genovart et al. (2003)

Puffinus yelkouan 60 80,00 J A Bourgeois et al. (2007) Thalassoica antarctica 129 92,00 resub N Lorentsen & Røv (1994)

Psittacidae Nestor notabilis 61 85,50 resub A Bond et al. (1991)

Rallidae Fulica americana - 100,00 SS N Boersma & Davies (1987)

Gallinula chloropus 10 90,00 resub N Cucco et al. 1999 Porphyrio mantelli 37 89,20 J N Eason et al. (2001)

Rynchopidae Rynchops niger 78 97,90 resub N Mariano-Jelicich et al. (2007)

Scolopacidae Calidris alba 49 92,00 resub A Maron & Myers (1984)

Calidris alpina 56 91,42 SS N Meissner (2005)

Table 1 (continued)


Calidris alpina alpina 80 98,75 J A Meissner & Pilacka (2008) Calidris alpina pacifica 200 91,5 J N Brennan et al. (1984)

Calidris canutus4 112 75,90 resub N Baker et al. (1999) Calidris canutus5 90 80,00 resub N Baker et al. (1999) Calidris canutus6 85 67,10 resub N Baker et al. (1999)

Calidris temminckii 43 86,00 J A Lislevand et al. (2009) Gallinago gallinago delicata 334 88,97 J A McCloskey & Thompson (2000)

Spheniscidae Eudyptes chrysocome 117 93,20 J N Hull (1996)

Eudyptes schlegeli 138 97,10 J N Hull (1996) Eudyptula minor 400 91,10 SS A Arnould et al. (2004) Eudyptula minor 43 94,8 SS A Renner & Davis (1999)

Pygoscelis adeliae 45 89 resub A Kerry et al. (1992) Pygoscelis papua 35 91,4 J A Renner et al. (1998)

Spheniscus humboldti 223 97 SS A Zavalga & Paredes (1997) Spheniscus magellanicus 266 78,00 J N Bertelloti et al. (2002) Spheniscus magellanicus 331 97,00 J N Bertelloti et al. (2002) Spheniscus magellanicus - 94,00 SS N Boersma & Davies (1987)

Sternidae Anous stolidus 49 90,00 resub A Chardine & Morris (1989) Sterna forsteri 84 86,00 J A Bluso et al. (2006) Sterna hirundo 105 80,00 resub N Coulter (1986) Sterna hirundo 122 72,60 resub A Fletcher & Hamer (2003)

Sterna paradisea 166 74,00 J A Devlin et al. (2004) Sterna paradisea 71 71,60 resub A Fletcher & Hamer (2003)

Strigidae Aegolius funereus 41 96,9 SS N Hayward & Hayward (1991) Aegolius funereus 135 70,00 resub A Hipkiss (2007)

Bubo bubo 50 90,70 resub N del mar Delgado & Penteriani (2004) Strix aluco 142 81,00 resub N Hardy et al. (1981)

Strix occidentalis caurina 133 90,20 J N Blakesley et al. (1990) Sturnidae

Acridresubes javanicus 69 72,50 J A Counsilman et al. (1994) Acridresubes tristis 90 84,00 J A Counsilman et al. (1994)

Dumetella carolinensis 242 78 SS A Suthers & Suthers (1990) Table 1 (continued)


Tetraonidae Lagopus leucurus alexandrae 48 87,00 SS A Gruys & Hannon (1993) Lagopus leucurus alexandrae 49 89,80 SS A Gruys & Hannon (1993)

Threskiornithidae Eudocimus albus 130 77,00 J A Herring et al. (2008)

Plegadis falcinellus 198 84,90 J A Figuerola et al. (2006) Turdidae

Catharus bicknelli 193 83,10 SS A Frey et al. (2008) Catharus bicknelli 128 79,10 SS A Frey et al. (2008)

1 from Spain 814 2 from Denmark 815 3 from Wadden sea (Germany) 816 4 from Lagoa do Peixe (Brasil) 817 5 from Delaware Bay (USA) 818

Table 2. Comparison between males and females for all characters 819

Mean differences index (MDI) and measurement error (ME) also quoted. Sample size: males = 231 and females = 291 820

Characters Males

(mean ± SD)

Females

(mean ± SD) t test p ME (%) MDI1

Bill length (mm) 10.67 ± 0.48 10.45 ± 0.51 -5.07 < 0.0001 7.92 97.94

Bill width (mm) 4.07 ± 0.22 3.93 ± 0.26 -6.61 < 0.0001 9.63 96.56

Bill depth (mm) 4.15 ± 0.21 3.98 ± 0.21 -8.85 < 0.0001 21.86 95.90

Head plus bill length (mm) 48.59 ± 0.99 47.40 ± 1.02 -13.42 < 0.0001 3.65 97.51

Tarsus (mm) 26.75 ± 0.86 25.94 ± 0.77 -11.30 < 0.0001 4.21 96.97

Wing (cm) 15.31 ± 0.54 14.74 ± 0.46 - 12.93* < 0.0001 1.25 96.28

Tail (cm) 10.38 ± 0.56 9.94 ± 0.56 -8.94 < 0.0001 4.07 95.76

Body mass (g) 149.19 ± 15.21 141.80 ± 13.95 -5.78 < 0.0001 - 95.05 1 Mean index calculated as (mean female / mean male) x 100, see text for details. 821

822 823 824 825 826

Caption for figures 827

828

Figure 1. Simulation of the effect of the sample size on the estimated proportion of correctly 829

classified individuals (discriminant rate). From the complete data set (n = 525 individuals), 830

smaller sub-samples were randomly selected (size ranging from 25 to 520 individuals, with 831

500 sub-samples per size). For each of these 50000 sub-samples, we performed a DFA and 832

we evaluated the discriminant rate according to three methods: (a) resubstitution, (b) jack-833

knife cross-validation, (c) sample splitting in which two third of the data set were used as 834

training sample and the remaining third as test sample. Each grey dot represents one analysis. 835

Each dot has been slightly randomly jittered to reduce overplotting. The thick line represents 836

the mean discriminant rate computed from the 500 DFA validations performed for each 837

sample size. The horizontal dotted line represents the discriminant rate estimated from the 838

complete data set. 839

840

Figure 2. Simulation of the effect of measurement errors on the jack-knifed estimate for 841

proportion of correctly classified individuals (discriminant rate). The complete data set 842

(n = 525 individuals) was used. We added to every parameter a random noise normally 843

distributed with standard deviation σ’ = kσ, proportional to the standard deviation σ of the 844

corresponding parameter. A noise coefficient k = 0 means that no noise has been added to the 845

original data. For each value of k, we simulated 500 data sets. Each grey dot represents one 846

DFA performed on one simulated data set. The thick line represents the mean discriminant 847

rate computed from the 500 DFA performed for every given value of k. 848

849

Figure 1 850

Monceau et al. 851

Figure 2

Monceau et al.

ANNEXE 2

Monceau, K., Gaillard, M., Harrang, E., Santiago-Alarcon, D., Parker, P., Cézilly, F. &

Wattier, R. 2009. Twenty-three polymorphic microsatellite markers for the Caribbean

endemic Zenaida dove, Zenaida aurita, and its conservation in related Zenaida species.

Conservation Genetics, 10, 1577-1581.

ANNEXE 3

Monceau, K., Dechaume-Moncharmont, F.-X., Wattier, R., Motreuil, S. & Cézilly, F.

Territoriality vs. flocking in the Zenaida dove, Zenaida aurita: Resource polymorphism

revisited using morphological and genetic analyses.

Manuscrit à soumettre à Ecology

Monceau et al. 40 pages

Resource use in Zenaida doves 1

Territoriality vs. flocking in the Zenaida dove, Zenaida aurita: 2

Resource polymorphism revisited using morphological and genetic analyses 3

4

KARINE MONCEAU, FRANÇOIS-XAVIER DECHAUME-MONCHARMONT, REMI WATTIER, 5

SEBASTIEN MOTREUIL, AND FRANK CEZILLY 6

7

Université de Bourgogne, 8

Equipe Ecologie Evolutive, UMR CNRS 5561 Biogéosciences. 9

10

11

Abstract. Evidence for resource polymorphism, i.e. inter- or intra-specific 12

differentiation in phenotypic characters in relation to resource use, has accumulated in fish, and 13

to a lesser extent, in amphibians, but remains scarce in birds. One noticeable exception, 14

however, is the case of Zenaida doves (Zenaida aurita) in Barbados. There, doves either 15

aggressively defend year-round territories or feed in flocks at grain-storage sites (where large 16

amounts of corn spillage are available), with little, if any, aggression. Sol et al. (2005; Ecology 17

86: 2397-2407) concluded that the existence of alternative foraging tactics in Zenaida doves 18

was a case of resource polymorphism, primarily driven by competition for territories, forcing 19

less competitive individuals to use suboptimal resources. We repeated and expanded the study 20

by Sol et al. (2005) through adding replications in space and time for each type of foraging 21

tactic. Compared to the previous study, the use of molecular makers allowed unambiguous 22

sexing of both adults and juveniles. We also used microsatellite markers to assess potential 23

genetic differentiation between flock-feeding and territorial doves. Our results confirm that, 24

irrespective of sex, territorial adults are larger than adults feeding in flocks, whereas the reverse 25

was observed in juveniles. Contrary to previous evidence, however, we found a consistent and 26


significant excess of females among flock-feeding adults, whereas the sex ratio did not differ 27

from unity among territorial birds, and among both territorial and flock-feeding juveniles. In 28

addition, body condition of birds did not differ between birds feeding in flocks and birds 29

feeding on territories. Finally we found no evidence for genetic differentiation between birds 30

feeding in flocks and birds feeding on territories. We argue that resorting to the concept of 31

'resource polymorphism' might be inadequate to characterize the existence of alternative 32

foraging tactics in Zenaida doves in Barbados. Instead, we propose that the phenomenon is 33

better explained by alternative resource use during ontogeny and age and sex-related 34

differences in the benefits associated with holding a territory. The present study illustrates the 35

importance of metareplication in population biology and ecology. 36

Key words: alternative resource use, competition, genetic differentiation, 37

metareplication, morphometrics 38

39

INTRODUCTION 40

Understanding how variation in resource levels influences morphological diversity and 41

divergent natural selection is of primary interest in ecological and evolutionary research, as it 42

may ultimately result in speciation events (Schluter 2000, Bolnicki and Fitzpatrick 2007). 43

Various mechanisms may link resource use and morphology. In particular, both the invasion of 44

"open" niches in a heterogeneous environment and the relaxation of inter- or intra-specific 45

competition are thought to favour the evolution of resource polymorphism, i.e. inter- or intra-46

specific differentiation in phenotypic characters in relation to resource use (Skúlason and Smith 47

1995, Smith and Skúlason 1996, Pfennig et al. 2007). Although it has been suggested that 48

resource polymorphism may play an important role in population divergence and speciation in 49

vertebrates (Smith and Skúlason 1996), the extent of empirical evidence varies between 50

taxonomic groups. Whereas resource polymorphism has been regularly reported in fish 51

(Ruzzante et al. 2003, Proulx and Magnan 2004, Olsson et al. 2007, Parsons and Robinson 52


2007, Svanbäck et al. 2008) and, to a lesser extent, in amphibians (Maerz et al. 2006, Pfennig 53

et al. 2007), its importance in birds remains poorly documented. 54

The few cited examples of resource polymorphism in birds involve the existence of 55

discrete morphs, based on bill size or shape (Smith and Temple 1982, Goss-Custard and Durell 56

1983, Smith 1990, Borras et al. 2008), or plumage colour (Rohwer 1990, Roulin 2004). One 57

noticeable exception, however, is the resource polymorphism reported by Lefebvre and 58

collaborators (Dolman et al 1996; Lefebvre 1996; Carlier and Lefebvre 1996, 1997; Sol et al 59

2005) in Zenaida doves (Zenaida aurita) on the island of Barbados (West Indies). Barbados 60

hosts a very limited avifauna and has practically no pristine habitats left due to intense 61

agriculture and development. On the island, Zenaida doves usually establish year-round 62

feeding territories that they defend against conspecifics and, to a lesser extent, other columbid 63

species (Columbina passerina, and more recently, Columba squamosa), while showing more 64

tolerance towards unrelated avian species (Loxigilla noctis, Molothrus bonariensis, Quiscalus 65

lugubris; Dolman et al 1996; F. Cézilly, unpublished data). In contrast, where food availability 66

is particularly high, doves gather in large numbers and feed in flocks with relatively little 67

aggression. This is especially the case at some isolated grain storage facilities on the island, 68

where large amounts of seed spillage attract Zenaida doves and a few other bird species. Based 69

on a comparison of morphological traits between flocking and territorial individuals and 70

additional experiments, Sol et al. (2005) concluded that the existence of alternative foraging 71

tactics in Zenaida doves in Barbados was a case of resource polymorphism driven by 72

competition for territories, where less competitive individuals, irrespective of age and sex, are 73

forced to exploit a sub-optimal resource. However, Sol et al's (2005) study was based on only 74

one territorial and one flock-feeding site, which limits its generality. In addition, their 75

conclusions on male and female differences, as well as the probable lack of genetic 76

differenciation between territorial and flock-feeding populations (see also Dolman et al 1996; 77


Carlier and Lefebvre 1996, 1997), were based on observational and morphological data, not the 78

genetic analyses that would be much more appropriate. 79

The present study re-examines the evidence for resource polymorphism in Zenaida 80

doves in Barbados, as part of a long-term study on the behavioral ecology and population 81

biology of the species. In this paper, we expand on the earlier study of Sol et al. (2005) by 82

adding replications in space and time for each type of foraging tactic. In addition, we use 83

molecular makers to unambiguously sex all individuals of the four sites we studied, adults and 84

juveniles alike. Because resource polymorphism is expected to affect gene flow (Skúlason and 85

Smith 1995), we also measured the extent of genetic differentiation between territorial and 86

flock-feeding Zenaida doves using recently developed microsatellite markers (Monceau et al. 87

2009). Recent evidence suggests that rapid niche expansion and resource polymorphism can be 88

associated with genetic divergence at very small spatial scales in vertebrates (McCormack and 89

Smith 2008, Bergek and Björklund 2009), even in the presence of gene flow (Señar et al. 90

2006). 91

92

METHODS 93

ZENAIDA DOVES IN BARBADOS 94

95

The Zenaida dove is widely distributed through the Caribbean islands (Raffaele et al. 96

1998). Although its primary habitat consists of wooldands and scrub thickets (Wiley 1991, 97

Rivera-Milán 1997, 1999), on several islands, including Barbados, the species has largely 98

colonized open coastal areas and gardens. In Barbados, Zenaida doves typically feed from 99

seeds on the ground, alone or in pairs (Lefebvre et al. 1996), but may exploit opportunistically 100

alternative food sources, such as leftover bread or cooked rice. 101

Both sexes are similar in appearance, with males being slightly larger than females 102

(Wiley 1991, F. Cézilly, unpubl. data). Juveniles can easily be distinguished from adults 103


through the absence of iridescent patches on each side of the neck (Sol et al. 2005), the 104

presence of grey-like first feathers, and high-pitched vocalizations. 105

Birds defend their territory against conspecifics by running or flying towards them, and 106

eventually attacking them with wing slaps and pecks. Escalated contests between territory 107

owners and intruders involve ritualized displays such as ground pecking and wing-raising. 108

During the latter, birds typically flick one wing contra-lateral to the opponent, while walking 109

parallel to each other (Goldberg et al. 2001). 110

111

Study area 112

For each foraging tactic, i.e. territorial feeding and flock-feeding, two distinct sites were 113

sampled over two consecutive years (2007 and 2008), thus resulting in replications in space 114

and time. Territorial birds were studied at the Bellairs Research Institute (St. James Parish 115

13°11'30.87"N / 59°38'21.55"W) and the adjacent Folkestone Park (collectively referred to as 116

'Bellairs' hereafter), and in the Sunset Crest area (13°10'55.06"N / 59°38'11.80"W), a 117

residential location consisting in small to medium-sized villas surrounded by gardens and parks 118

(referred to as 'Sunset Crest' hereafter). The distance between the two sites is about 1500 m. 119

Flock-feeding birds were studied at the Barbados Mills compound Deep Water Harbour (St 120

Michael Parish, 13° 6'38.99"N / 59°37'46.06"O, designated as Harbour hereafter), and at 121

Roberts Manufacturing Compagny Ltd. (Lower Estate, St. Michael Parish, 13° 7'52.46"N / 122

59°34'48.66"O; referred to as 'Roberts' hereafter). Both sites include large facilities for storage 123

of animal feed and grain. The territorial sites are about 8 km north from Harbour and northwest 124

from Roberts, whereas the distance between the latter two sites is about 5 km (Fig. 1). Our 125

study thus includes the two sites studied by Sol et al 2005, Bellairs and Deep Water Harbour, 126

as well as a replicate of each. Contrary to Sol et al (2005), we did not distinguish between 127

territory holders and floaters at the Bellairs and Sunset Crest sites. 128

129


Captures 130

All captures were made from March to May in both 2007 and 2008, for a total of 857 131

birds, all ages confounded (586 in 2007 and 271 in 2008). Zenaida doves were caught using 132

walk-in baited drop traps (as used by Sol et al. 2005) and single-catch closing net bird traps. 133

Birds were banded with a unique combination of color plastic bands (A.C. Hughes Ltd., 134

Hampton Hill, United Kingdom) and one numbered aluminium ring from the Muséum 135

National d’Histoire Naturelle de Paris. Each banded bird was then measured (see below), 136

weighed to the nearest 0.1g (using a PESOLA® digital pocket scale MS 500), and blood 137

sampled (see below). All birds were released where they had been caught. 138

139

140

MORPHOLOGICAL DATA 141

142

Repeatability and measurement error 143

The following morphological characters were measured: bill length, depth and width at 144

nostrils, tarsus length (left and right), wing length (left and right). All measurements were 145

made using a digital calliper (accuracy: ± 0.2 mm), except for wing length which was 146

measured with a ruler (accuracy: ± 1 mm). All measurements were taken twice by the same 147

person. Repeatability (R) and measurement error (ME) were later assessed using ANOVA II 148

(Lessells and Boag 1987, Bailey and Byrnes 1990, Yezerinac et al. 1992, Sokal and Rohlf 149

1995, Arnqvist and Mårtensson 1998, Señar 1999, Zar 1999). Since repeatability was 150

significant and measurement error was moderate for both adults (R range: 0.79 – 0.98 and ME 151

range: 2 – 11 %, except bill depth 20%) and juveniles (R range: 0.76 – 0.99 and ME range: 152

0.48 – 5.5 %, except bill depth 24%), the means of double measurements were used in the 153

analyses. In addition, right and left measurements were significantly correlated for both tarsus 154

length (Pearson’s product-moment correlation, adults: r = 0.85, n = 783, P < 0.0001, juveniles: 155


r = 0.93, n = 74, P < 0.0001) and wing length (Spearman’s correlation coefficient, adults: rs = 156

0.91, n = 783, P < 0.0001 and juveniles: rs = 0.92, n = 74, P < 0.0001). Therefore, the means of 157

the right and left measurements were used for analysis. 158

159

Morphological specialization for feeding 160

Following Sol et al. (2005), we assessed the extent of morphological specialization for 161

feeding from differences in bill shape between groups. A bill morphology index (BMI) was 162

computed from a principal components analysis (PCA) on standardized values of bill 163

measurements (bill length, depth and width), using wing length as control for body size. All 164

variables were log-transformed and standardized (Venables and Ripley 1999). Correlations 165

between the first contribution and components loading were then tested. As homoscedasticity 166

(Levene’s test) was verified in both adults and juveniles, the influence of sex, year, foraging 167

tactic (i.e. territorial vs. flock feeding), and site (nested in foraging tactic) on BMI was assessed 168

using a nested ANOVA I, coupled with a stepwise backward procedure based on likelihood 169

ratios comparison in order to retain only the main significant effects. Then, Tukey Honestly 170

Significant Differences (HSD) test was performed to identify whether groups differed from 171

each other. 172

173

Competitive ability – wing length 174

As wing-flicking appears to be an important component of territorial display (see 175

introduction), competitive ability was assessed from wing length. This character was normally 176

distributed in adults. However variances were not homogeneous, even after transformation, 177

when comparing between the two foraging tactics. A global linear model (GLM) including sex, 178

year, foraging tactic and site was then performed (model assumptions were verified through 179

analysing the distribution of residuals). In juveniles, homoscedasticity was verified, and a 180

nested ANOVA I was then performed with the same parameters than the one used in the 181


analysis of bill morphology. Both GLM and ANOVA were coupled with stepwise backward 182

procedure and Tukey HSD post hoc analyses. 183

184

Overall body size comparison 185

Following Sol et al. (2005), a body size index (BSI) was computed from the first factor 186

of a PCA procedure including wing length, tarsus length, and bill length (log transformed 187

data). Contrary to Sol et al. (2005), body mass was not included in the PCA, as it should not be 188

considered as an indicator of body size (Alisauskas and Ankney 1990, Piersma and Davidson 189

1991, Green 2001). Correlations between the first contribution and components loading were 190

tested. As homoscedasticity (Levene’s test) was verified for both adults and young individuals, 191

the influence of sex, year, foraging tactic and site on BSI was compared between using a nested 192

ANOVA I (like BMI and wing length comparison) coupled with stepwise backward and Tukey 193

HSD post-hoc test. 194

To further assess the extent of morphological differentiation between individuals 195

feeding on territories and individuals feeding in flocks, we performed discriminant function 196

analyses (DFA), separately for each sex and age class. Quadratic discriminant analyses were 197

performed since the assumption of homogeneity of the variance-covariance matrices was not 198

met (Stevens 1992), except for adult males for which a linear discriminant function was used 199

(Box’s M test: adult males: Mbox = 6.89, χ² = 6.83, df = 6, P = 0.34; adult females: Mbox = 200

14.48, χ² = 14.36, df = 6, P = 0.03; juvenile males: Mbox = 21.45, χ² = 18.22, df = 6, P < 0.01 201

et juvenile females: Mbox = 15.14, χ² = 13.62, df = 6, P = 0.03). For each DFA, reliability was 202

assessed using the cross-validation procedure (Tabachnick and Fidell 1996). 203

204

Differences in payoffs between foraging tactics 205

Following Sol et al. (2005), we assessed potential differences in payoff between the two 206

foraging tactics through the comparison of body condition. Body condition was defined as 207


body mass controlled by body size (Jacob et al. 1996), using BSI as a covariable (García-208

Berthou 2001). The effects of sex, years, foraging tactic and site were tested in an ANCOVA, 209

followed by stepwise backward procedure. Residuals from the regression of log of body mass 210

against log of BSI were used for post-hoc tests. 211

212

Data on morphology were analysed with software R version 2.8.0. (R Development 213

Core Team 2008) and the packages “car” for Levene’s test, “MASS” for linear regression, 214

quadratic and linear discriminant analyses, “nlme” for ANOVA II, and “stats” et “multcomp” 215

for GLM analyses and Tukey HSD test; all other current functions were provided by R basic 216

packages. 217

218

219

MOLECULAR ANALYSES 220

221

Blood samples (40 µL twice) were obtained by puncture of the brachial vein and 222

collected using sodium heparinised capillary tube (Hirschmann Laborgeräte, Germany). 223

Samples were kept in 800 µl of storage buffer (70% ethanol and 30% of Tris-EDTA buffer pH 224

8) and kept at 4°C for about two months before being processed. 225

226

DNA extraction 227

One hundred microliters of blood in storage buffer were centrifuged at 4000 rpm for 1 228

minute to pellet blood cells. The supernatant was discarded before adding 200 µL of Queen’s 229

Lysis buffer (Seutin et al. 1991). Samples were incubated at 55°C with 0.1 mg of proteinase K 230

overnight. DNA was then extracted based on a standard phenol-chloroform method, as 231

described in Hillis et al. (1996). DNA was resuspended into 100 µL of Tris-EDTA (pH 8). 232

233


Molecular sex identification and sex ratios 234

Sex was identified through size variation of introns of the Chromo-Helicase-DNA 235

binding protein genes (CHD1-Z and CHD1-W) using 2550F/2718R primer pair (Fridolfsson 236

and Ellegren 1999). PCRs were carried out in 10 µL volume including ca 100 ng DNA 237

template, 200 µM each of dNTP, 200 nM each of primer, 1X reaction buffer and 0.45 U 238

HotMaster DNA polymerase (5-PRIME). A T3 thermocycler (Biometra) was used beginning 239

with an initial denaturation at 94°C for 1.5 min, followed by 35 cycles of 20 s at 94°C, 30 s at 240

46°C and 30 s at 65°C, and a final extension step at 65°C for 3 min. Intron size variation was 241

easily scored (CHD1-W = 450 pb and CHD1-Z = 750) on 6 cm long 3 % agarose gels (TBE 242

1X) run for 30 min at 100V. Accuracy of typing was assessed through verifying the 243

congruence of sexing results with another primer pair P2/P8 (Griffiths et al 1998) for a subset 244

of individuals (Monceau et al. in prep). 245

Sex ratio in adults and juveniles were assessed using binomial tests and then compared 246

between years, foraging tactics and sites using Chi square tests or Fisher’s exact tests. 247

248

Microsatellite genotyping 249

About 30 adult individuals were randomly chosen from each site for each year (247 250

individuals in total), resulting in eight sampling units allowing both spatial and temporal 251

comparisons. Polymorphism was scored at seven microsatellite markers (ZaD121, ZaD108, 252

ZaD11, ZaD119, ZaD104, ZaD105 and ZaD1) specifically developed for Z. aurita (Monceau 253

et al. 2009). PCR and genotyping were as described in Monceau et al. (2009). 254

255

Genetic differentiation 256

Linkage disequilibrium between loci was first investigated for each sampling units. 257

Then, departure from Hardy-Weinberg equilibrium was investigated using Fisher’s exact test 258

for each sampling unit, as well as for the all data set considered as a single unit, allowing for 259


detection of a possible Wahlund effect. Both pairwise and overall genetic differentiation 260

between sampling units were evaluated using Fisher’s exact test (Raymond and Rousset 1995) 261

and FST-statistics (Weir and Cockerham 1984). An estimate of the effective migration rate 262

among sampling units (Nm) was calculated from the equation Nm = (1- FST)/4 FST after Wright 263

(1969). Analyses were processed using ARLEQUIN v. 2.000 software (Schneider et al. 1997). 264

Fisher’s exact test probabilities were approximated by Markov chain. Departure from null 265

value for FST was tested through permuting genotypes between sampling unit, and 0.05 266

significant level was adjusted with Bonferroni’s correction for multiple comparisons. Finally, 267

we evaluated whether genetic differentiation was more pronounced when comparing between 268

sites where birds used a different foraging tactic than when comparing between sites where 269

birds used the same foraging tactic. To that end, Fst values were calculated for all pairs of sites, 270

and compared using the Osx statistic implemented in FSTAT software (Goudet 1995), after 271

pooling data from the two years. 272

273

274

RESULTS 275

276

Differences in age and sex composition between foraging tactics 277

278

At each site, age composition did not differ between 2007 and 2008 (Fisher’s exact test: 279

Bellairs: P = 0.07, Roberts: P = 0.23, Harbour: P = 1 and Sunset Crest: P = 0.17). Data from 280

the two years were therefore pooled for subsequent analyses (Table 1). The proportion of 281

juveniles among all individuals captured was significantly lower than that of adults in all sites 282

(Binomial test, P < 0.0001 for each site). The proportion of juveniles differed significantly 283

between Bellairs and the three other sites (Chi² test: χ² = 37.06, df = 1, P < 0.0001), while there 284

was no difference between the two flock-feeding sites (χ² = 0.13, df = 1, P = 0.71). 285


Sex ratio in juveniles did not differ between years at any site (Fisher's Exact Test, 286

Bellairs: P = 0.15, Sunset Crest: P = 0.64, Roberts: P = 1 and Harbour: P = 0.07), justifying 287

data pooling in subsequent analyses. A balanced sex ratio was observed in both territorial and 288

group-feeding sites (Table 2), without significant difference between replicates for each 289

foraging tactic (Fisher's Exact Test, territorial feeding: P = 0.56; flock-feeding: P = 0.41). 290

There was no significant difference in sex ratio between juveniles foraging on territories or in 291

flocks (Chi² test, χ² = 0.05, df = 1, P = 0.83). 292

Sex ratio in adults did not differ between years at any site (Chi² test, Bellairs: χ² = 0.73, 293

df = 1, P = 0.39, Sunset Crest: χ² = 0.06, df = 1, P = 0.80, Roberts: χ² = 3.47, df = 1, P = 0.06 294

and Harbour: χ² = 1.29, df = 1, P = 0.26), and data were pooled. A balanced sex ratio was 295

observed in the two territorial sites (Table 2) with no difference them (χ² = 0.28, df = 1, P = 296

0.60). In contrast, the sex ratio in both Roberts and Harbour was significantly female-biased 297

(Table 2), with no difference between sites (χ² = 0.23, df = 1, P = 0.63). Overall, there was a 298

significant difference in sex ratio between birds feeding in territories and birds feeding in 299

groups (χ² = 11.21, df = 1, P < 0.001). 300

301

302

Feeding specialization – bill morphology 303

In both adults and juveniles, BMI represented a large part of the total variance observed 304

(Table 3; juveniles: 54.21%; adults: 43.07%). Only foraging tactic had an influence on BMI in 305

juveniles (F1, 73= 6.91, P < 0.05, Tukey HSD P < 0.05), with bill being longer and thicker, but 306

thinner at the base, in juveniles feeding in groups compared to those captured on territories. In 307

adults, BMI differed between sexes (F1, 782= 281.42, P < 0.0001, Tukey HSD test, P < 0.0001), 308

with bill shape being globally thinner in females than in males in both territorial and group-309

feeding birds (F1, 782= 28.36, P < 0.0001, Tukey HSD test, P < 0.0001), while no significant 310

interaction was observed between sex and foraging tactic. ANOVA and Tukey HSD tests also 311


revealed that flock-feeders’ bills were larger in 2008 than in 2007 (F1, 782= 20.52, P < 0.0001, 312

Tukey HSD P < 0.001) whereas the situation was reversed for territorial birds (2007 > 2008, 313

Tukey HSD P < 0.05). 314

315

Competitive ability – wing length 316

Neither sex, foraging tactic, or site had an influence on wing length in juveniles (Fig. 2a 317

left column sex: F1,73 = 0.470, P = 0.50; foraging tactic: F1,73 = 2.62, P = 0.11; site: F2,73 = 1.50, 318

P = 0.23 ). In adults, GLM and post hoc test (Tukey HSD test, all P values < 0.0001) revealed 319

that, within each foraging tactic, males had longer wings than females. Overall, territorial birds 320

had longer wings than group-feeding ones, and males feeding in groups had longer wings than 321

territorial females (Table 4 and Fig. 2a right column). For each comparison, no difference 322

between years was detected. 323

324

Overall morphological differentiation 325

Body size index (BSI) and variables included in PCA were all negatively correlated in 326

both juveniles and adults (Table 3). In both age categories, BSI represented a large part of total 327

variance observed (juveniles: 69.71%; adults: 52.28%). Juveniles feeding in groups were larger 328

than those caught on territories (F1, 73= 4.49, P < 0.05, Tukey HSD test, P < 0.05; Fig. 2b left 329

column). In adults, males were larger than females (F1, 782= 317.86, P < 0.0001, Tukey HSD 330

test, P < 0.0001; Fig. 2b right column) and, overall, territorial birds were larger than birds 331

feeding in groups (F1, 782= 5.83, P < 0.05, Tukey HSD test, P < 0.05; Fig. 2b right column). 332

ANOVA and Tukey HSD tests indicated that the significant interaction between site and year 333

of capture was due to the largest body size of adult birds feeding in groups in 2008 compared 334

to 2007 (F2, 782= 15.94, P < 0.0001; Tukey HSD test, P < 0.001; Fig. 2b right column). 335


A posteriori classifications performed on the basis of the discriminant functions were 336

rather poor, correctly classifiying only 72.09% of adult males, 64.13% of adult females, 60% 337

of juvenile males, and 54.54% of juvenile females. 338

339

Resource payoffs - body condition 340

In juveniles, variation in body mass was only explained by variation in body size (F1, 341

73= 61.17, P < 0.0001), and was independent of foraging tactic and sex. A negative relationship 342

between body mass and BSI (Spearman’s rank correlation test ρ = - 0.58, P < 0.0001), 343

indicated that body mass increased with body size, since BSI was negatively correlated with all 344

its components (see Table 1 and Fig. 3a). In adults, BSI (F1, 782= 200.83, P < 0.0001) and, to a 345

lesser extent, the interaction between year and site (F1, 782= 4.77, P < 0.05) had a significant 346

effect on body mass. Body mass of adults increased with body size in the same way than 347

juveniles (Pearson’s product-moment correlation between body mass and BSI: r = - 0.45, P < 348

0.0001). Post hoc test also failed to identify any difference between groups. Overall, body 349

condition did not differ according to foraging tactic, sex, or age (Fig. 3b). 350

351

Genetic differentiation 352

Genotyping at seven microsatellite loci for 30 individuals for each sampling sites and 353

years (that is eight sampling units) revealed a high level of polymorphism with an average of 354

9.43 (6-14) alleles per locus (Appendix A). No evidence for linkage disequilibrium was 355

detected in any sampling unit. No multi-loci deviation from Hardy-Weinberg equilibrium 356

(HWE) was detected (Appendix A), in each sampling unit considered separately (Fisher’s 357

exact tests, all P ≥ 0.60) or when data from all sampling units were pooled (Fisher’s exact test, 358

P = 1.00). There was no difference in allele frequencies, either when comparing between pairs 359

of sampling units (Fisher’s exact test, all P ≥ 0.48), or overall (Fisher’s exact test: P = 0.70) 360

(Appendix B). Similarly, pairwise Fst-values between sampling units (-0.006 to 0.011) were 361


small, and not significantly different from zero. A large (Slatkin 1985) absolute number of 362

migrants was estimated between sites, with a minimum of 46.2 effective migrants per 363

generation (Appendix B). Globally, the four sampled sites could be considered as one 364

genetically homogenous population in space as in time. 365

366

DISCUSSION 367

368

Metareplications, i.e. replications of entire studies addressing the same phenomenon in 369

the same species, remain scarce in ecology (Johnson 2002, McCaffery and Ruthrauff 2004, 370

Kelly 2006). However, a single study, even well designed and executed, can lead to spurious 371

results (Johnson 2006). Revisiting the evidence for the existence of a resource polymorphism 372

in Zenaida doves in Barbados provides a different picture from what was reported by Sol et al. 373

(2005) on the same population. 374

Although we were able to confirm the larger size of territorial adults, irrespective of 375

their sex, compared to adults feeding in flocks, other results differ from those obtained by Sol 376

et al. (2005). First, contrary to earlier findings, age and, especially, sex composition of doves 377

did significantly differ between the two foraging tactics. We found a larger proportion of 378

juveniles on territorial sites compared to areas where birds feed in flocks in the present study, 379

whereas Sol et al. (2005) observed no such difference. However, the effect is largely due to the 380

unusually high proportion of juveniles in Bellairs in 2007 in the present study. This might be 381

simply explained by stochastic differences in productivity between years. Indeed, variation in 382

breeding chronology in Zenaida doves has been observed between Caribbean islands (Nellis et 383

al. 1984, Wiley 1991), and between years for the same island (Nellis et al. 1984). 384

The difference between the present study and that of Sol et al. (2005) for what concerns 385

the proportions of males and females engaged in each foraging tactic, on the other hand, is 386

most probably due to the method used for sexing birds. Sol et al. (2005) relied on differences in 387


the color of the back, supposedly less reddish in females than in males. In contrast, we relied 388

here on molecular markers to assign a sex to each captured dove. The second method is 389

generally considered to be more reliable (Griffiths and Tiwari 1993, van de Pol et al. 2009). 390

Consistency in female-biased sex-ratio in areas where birds feed in flock over two consecutive 391

years further indicates that the phenomenon is not an artifact. Disparate sex ratios in studies of 392

the closely-related mourning dove, Z. macroura, have been previously attributed to errors in 393

assigning genders from external appearance (Schulz et al. 1995). Relying on molecular markers 394

for sex identification may then provide a more reliable estimate of variation in sex-ratio 395

between Zenaida doves engaged in alternative foraging tactics. 396

Results between the present study and that of Sol et al. (2005) also differ for what 397

concerns variation in body condition between birds feeding on territories and birds feeding in 398

flocks. Whereas Sol et al. (2005) observed differences in body condition between birds caught 399

on territories and birds caught when feeding in groups, and a lower body condition in males 400

compared to females, no such effects were observed in the present study. The observed 401

interaction between year and site suggests, however, that body condition may fluctuate in time 402

and space at the population level. The observed discrepancy between the present study and that 403

of Sol et al. (2005) could be due to a difference in the calculation of BMI between the two 404

studies. Sol et al. (2005) included weight in their index of body size, whereas, following 405

recommendations from Piersma and Davidson (1991) and Green (2001), the same variable was 406

not included in the present study. However, adding body weight in the computation of the body 407

size index did not affect our conclusions (results not shown). Therefore, our results indicate 408

that the two types of foraging strategies have equal payoffs, at least as assessed from the body 409

condition of individuals, as previoulsy done by Sol et al. (2005). Indeed, feeding in flocks at 410

grain storage facilities may provide benefits and costs. At both Harbour and Roberts, birds 411

have access all day long to very large quantities of food, particularly maize. Maize is very rich 412

in lipids, and columbids use lipids better than carbohydrates as energy sources (Goodman and 413


Griminger 1969, Sales and Janssens 2003a). Indeed, maize has very high digestibility and is 414

readily stored in the body of columbid species as fat (Hullar et al. 1999, Sales and Janssens 415

2003b). Fat provides the energy necessary for muscle function (George and Jyotti 1955) and is 416

an important component of crop milk (Shetty and Hedge 1991). In addition, birds might be less 417

vulnerable to predators when feeding in flocks than when feeding alone or in pairs on 418

territories. Evidence suggests that columbids feeding in large flocks benefit from both the 419

"dilution" (Foster and Treherne 1981) and "many eyes" (Pulliam 1973) effects, and, 420

consequently, achieve higher rates of food acquisition than when feeding alone or in small 421

groups (Phelan 1987, Cézilly and Brun 1989, Sadedin and Elgar 1998, Dias 2006). In addition, 422

we never saw any mangoose (Herpestes javanicus) or feral cats (Felix catus) at the two sites 423

where doves forage in flocks, whereas both predators are frequently seen in areas where doves 424

defend territories, and have been seen attacking and capturing doves (F. Cézilly pers. obs., J. 425

Moreau pers. com.; see also Nellis et al. 1984). On the other hand, non-selective culling 426

campaigns occasionally conducted at least at the Harbour site could result in high mortality 427

among birds feeding in flocks (L. Lefebrve pers. com.). To what extent the balance between 428

costs and benefits differ between the two foraging tactics is then difficult to establish, and even 429

more so in the absence of a more direct mesure of fitness such as survival rate or breeding 430

success. Future studies could then use radiotracking to follow individual birds feeding on 431

territories or in flocks, in order to provide information on their breeding activity, reproductive 432

output and mortality. 433

Finally, genetic analyses failed to reveal any significant level of genetic differentiation 434

between individuals feeding on territories and individuals feeding in groups, as previously 435

hypothesied by Sol et al. (2005) based on casual observations of birds moving between 436

territorial and flock feeding sites. Given the large sample size, the number of microsatellite loci 437

used in the present study and their degree of polymorphism, we are confident that even a low 438

level of genetic differentiation would have been detected if present. Studies on resource 439


polymorphism have revealed a variable amount of gene flow among sympatric morphs (Smith 440

and Skúlason 1996, Dynes et al. 1999). However, there is some evidence that variation in 441

spatial distribution linked to variation in feeding habits can promote partial reproductive 442

isolation, non-random mating in vertebrates, and genetic differentiation in vertebrates. For 443

instance, Dynes et al. (1999) observed a significant genetic differentiation between pelagic and 444

littoral forms of brook charr (Salvelinus fontinalis) in a lake of moderate size and depth. 445

Similar results have been obtained for the Arctic char (S. alpinus) in Icelandic lakes (Gíslason 446

et al. 1999). More recently, Bergek and Björklund (2009) reported congruent morphological 447

and genetic differentiation at a microgeographic scale in the perch (Perca fluviatilis). In citril 448

finches (Serinus citronella), a strong genetic and morphological differentiation has been 449

observed at a reduced geographical sale (< 5km), in spite of current gene flow (Señar et al. 450

2006). 451

Taken together, our results suggest that the existence of alternative foraging tactics in 452

Zenaida doves in Barbados does not conform quite well to the concept of "resource 453

polymorphism", as ordinarily defined in the ecological literature (Skúlason and Smith 1995, 454

Smith and Skúlason 1996). Confirming earlier results (Sol et al. 2005), we found no evidence 455

for the existence of discrete morphs linked to each foraging strategy in Zenaida doves, as often 456

reported in true cases of resource polymorphism (Skúlason and Smith 1995, Smith and 457

Skúlason 1996, Whiteley 2007; but see Maerz et al. 2006). Sol et al. (2005) argued, however, 458

that birds feeding in flocks were mainly "floaters" and/or small sized individuals forced by 459

intraspecific competition to use lower rewarding resources. The argument was partly based on 460

the observation that individuals classified as "floaters" on territories were smaller than 461

territorial individuals, but did not differ in size from flock-feeding animals. Such a pattern may 462

arise, however, from a larger proportion of females among both "floaters" and group feeding 463

birds, as observed for the latter in the present study. In addition, territorial females could be 464


more likely than males to engage in extraterritorial forays, particularly during their fertile 465

period (see Humbird and Neudorf 2008), and be incorrectly classified as "floaters". 466

But more importantly, the assumption that floating is an inferior strategy compared to 467

holding a territory might deserve further consideration (Brown and Long 2007). Freed from 468

spatial constraints, floaters might be better able than sedentary birds to find and exploit 469

patchily distributed food resources. Thus, a more parsimonious explanation for the existence of 470

alternative foraging tactics in Zenaida doves in Barbados, is that flock feeding is simply a 471

facultative strategy, conditioned by local food availability, and sex and age-related variation in 472

benefit associated with holding a territory. Juveniles and young adults with a low resource 473

holding potential and poorly developed parental abilities may benefit more in the short term 474

from exploiting a rich and predictable resource than from attempting to defend a territory. 475

Adult females may also be less able to defend a territory when unpaired, and engage more than 476

males in flock feeding, thus explaining the larger proportion of females among flock-feeders. 477

Difference in body size between birds caught when feeding alone or in pairs and birds caught 478

when feeding in flocks may then reflect not only variation in competitive ability but also 479

differences in age between adult birds. Indeed, evidence shows that wing length can increase 480

significantly with age for several years in birds (Pienkowski and Minton 1973, Merom et al. 481

1999, Pérez-Tris and Telleria 2001). If flock-feeding is an alternative strategy particularly 482

rewarding for young adults, we would expect that a significant proportion of flock-feeding 483

birds would eventually become territorial later on. Out of 400 birds ringed at Roberts or 484

Harbour, nine were resigthed on territorial sites (seven on one occasion, and two on two 485

occasions) one or two years later. 486

The present study illustrates both the importance of metareplication (Johnson 2002) and 487

the value of molecular tools in population biology and behavioral ecology (Hughes 1998, 488

Parker et al. 1998). In addition, it suggests that caution should be exerted when referring to 489


well-defined ecological concepts such as "resource polymorphism" to interpret 490

intrapopulational variation in foraging strategy. 491

492

493

ACKNOWLEDGMENTS 494

495

We are particularly grateful to Mr Steve A. Devonish and Natural Heritage Department 496

for allowing us to conduct our study in Barbados. We thank the Centre de Recherches par le 497

Baguage des Populations d’Oiseaux (Paris, France), and particularly Olivier Dehorter and 498

Denis Couvet, for providing us with metal rings and authorization to ring Zenaida doves in the 499

Caribbeans. We also wish to thank Alison Mayers and Wayne Worrell for hospitality, Richard 500

Haynes, Victor Small, Sylvester Rowe, and Pat Odle for logistic assistance, and Nicole 501

Atherley, Laure Cauchard, Maria Gaillard, Estelle Harrang, Marc Lavoie, Kirk Mayers, Jérome 502

Moreau, Georges Prato, and Amélie Slaski for assistance in catching and ringing doves. We are 503

particularly grateful to Louis Lefebvre for very constructive and useful comments on an earlier 504

draft. We also thank Neeltje Boogert, Sarah Overrington, and Daniel Sol for useful discussions. 505

KM was supported by a doctoral grant from the Ministère de la Recherche et de 506

l'Enseignement Supérieur. Financial support was provided by CNRS and the Institut Buffon 507

(Université de Bourgogne). 508

509

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Captions for tables 712

713

714

Table 1: Juveniles and adults distribution in all sites according to their foraging strategies. 715

Foraging tactic / Site Juveniles (%) Adults (%) Sample size

Territorial

Bellairs 21.23 78.77 146

Sunset Crest 6.71 93.29 313

Group-feeding

Roberts 6.22 93.78 193

Harbour 4.88 95.12 205

716


Table 2: Binomial tests for sex ratios for juveniles and adults. Sample size includes birds 717

caught in 2007 and 2008. Significant results are in bold. 718

Juveniles Adults

Foraging tactic / Site Females Males p value Females Males p value

Territorial

Bellairs 17 14 0.72 58 57 1.00

Sunset Crest 14 7 0.19 137 155 0.32

Group-feeding

Roberts 6 6 1.00 106 75 0.03

Harbour 7 3 0.34 120 75 0.002

719

720


Table 3: Coefficients of correlation between components loading for bill morphological index 721

(BMI) and body size index (BSI) as first factor of principal component analysis (PCA). 722

Positive correlation implies principal component index and character evolve in the same way 723

whereas negative coefficient implies that the increased for a character is reflected by the 724

decreased of principal component index. 725

Correlation between ACP index

and Juveniles Adults

Bill morphological index (BMI)

Bill length 0.58 - 0.47

Bill width - 0.52 - 0.45

Bill depth 0.18 - 0.54

Wing length 0.60 - 0.53

Body size index (BSI)

Bill length -0.57 - 0.50

Tarsus length -0.53 - 0.61

Wing length - 0.62 - 0.61

726


Table 4: GLM summary for adults’ wing length comparison 727

Estimate Standard

error t value P value

Intercept 14.65 0.03 470.55 < 0.0001

Sex 0.41 0.05 8.89 < 0.0001

Year 0.09 0.06 1.61 0.11

Foraging tactic 0.28 0.05 5.77 < 0.0001

Sex x Foraging tactic 0.18 0.06 2.83 < 0.01

Year x Foraging tactic - 0.17 0.07 - 2.31 < 0.05

728


Captions for figures 729

730

731

Figure 2: Study area. T in brackets specifies areas where Zenaida doves were territorial and 732

GF stand for group-feeding sites where they feed in flocks. 733

734

735

Figure 2: Comparison (box plot) between type of sites and sex for (a) wing length and (b) 736

body size index (BSI) for both juveniles (left column) and adults (right column). GF stand for 737

group-feeding areas and T for territorial sites. Juveniles sample size was divided as follow GF 738

females = 13, T females = 31, GF males = 9 and T males = 21. Adults individuals were divided 739

as follow: GF females = 226, T females = 195, GF males = 150 and T males = 212. Boxes 740

represented 50% of all values. Medians and means were respectively represented with plain 741

line and black point. Dash lines were standing for standard error and open circles represented 742

extreme values. To interpret BSI graphical representation, please refer to correlation table 743

(Table 1). 744

745

746

Figure 3: Body condition comparison between type of sites and years for a) juveniles and b) 747

adults. GF stand for group-feeding areas and T for territorial sites. Juveniles sample size was 748

divided as follow GF females = 13, T females = 31, GF males = 9 and T males = 21. Adults 749

individuals were divided as follow: GF females = 226, T females = 195, GF males = 150 and T 750

males = 212. Boxes represented 50% of all values. Medians were with plain line. Dash lines 751

were standing for standard error and open circles represented extreme values. 752

753


754

755

Figure 1 756

Monceau et al. 757

758

759


760

Figure 2 a left 761

Monceau et al. 762

763


764

Figure 2 a right 765

Monceau et al. 766

767

768


769

Figure 2 b left 770

Monceau et al. 771

772

773


774

Figure 2 b right 775

Monceau et al. 776

777


778

Figure 3 a 779

Monceau et al. 780

781

Figure 3 b

Monceau et al.

Appendixes

Appendix A: Sample size (N), number of alleles (A), observed (Ho) and expected (He)

heterozygosity and p-value from Fisher’s exact test of Hardy Weinberg equilibrium (p HWE)

for each locus and population for both sampling years 2007 and 2008. Significant values after

Bonferroni’s correction are in bold (p = 0.007).

2007 2008

Bellairs

(30)

Sunset

Crest (30)

Roberts

(32)

Harbour

(32)

Bellairs

(32)

Sunset

Crest (32)

Roberts

(29)

Harbour

(30)

ZaD121

Ho 0.83 0.83 0.90 0.87 0.87 0.63 0.93 0.80

He 0.91 0.84 0.88 0.86 0.88 0.82 0.89 0.88

p HWE 0.19 0.99 0.13 0.87 0.57 0.04 1.00 0.22

ZaD108

Ho 0.79 0.79 0.75 0.93 0.69 0.77 0.86 0.79

He 0.87 0.82 0.84 0.86 0.87 0.88 0.86 0.86

p HWE 0.06 0.81 0.46 0.73 0.17 0.003 0.52 0.34

ZaD11

Ho 0.81 0.81 0.83 0.90 0.80 0.69 0.78 0.79

He 0.73 0.77 0.78 0.82 0.79 0.79 0.77

p HWE 0.82 0.87 0.73 0.07 0.26 0.67 0.49 0.52

ZaD119

Ho 0.79 0.79 0.77 0.93 0.59 0.74 0.76 0.83

He 0.77 0.81 0.75 0.77 0.80 0.80 0.81 0.75

p HWE 0.87 0.63 0.85 0.15 0.04 0.22 0.39 1.00

ZaD104

Ho 0.93 0.90 0.91 0.72 0.85 0.81 0.79 0.78

He 0.83 0.84 0.80 0.79 0.79 0.83 0.84 0.78

p HWE 0.79 0.90 0.33 0.57 0.86 0.06 0.58 0.65

(Appendix A continuation)

2007 2008

Bellairs

(30)

Sunset

Crest (30)

Roberts

(32)

Harbour

(32)

Bellairs

(32)

Sunset

Crest (32)

Roberts

(29)

Harbour

(30)

ZaD105

Ho 0.73 0.57 0.65 0.56 0.63 0.43 0.64 0.46

He 0.65 0.59 0.66 0.56 0.59 0.53 0.62 0.63

p HWE 0.69 0.88 0.83 0.67 0.57 0.18 0.39 0.09

ZaD1

Ho 0.87 0.83 0.75 0.84 0.87 0.81 0.86 0.76

He 0.84 0.84 0.81 0.81 0.82 0.82 0.84 0.76

p HWE 0.41 0.80 0.88 0.85 0.87 0.007 0.86 0.27

All loci

Mean

Ho 0.82 0.79 0.79 0.82 0.76 0.70 0.80 0.74

Mean

He 0.81 0.78 0.79 0.78 0.80 0.78 0.81 0.78

p HWE 1.00 1.00 1.00 0.60 1.00 1.00 1.00 1.00

Appendix B: Pairwise genetic differentiation between populations: exact test / Fst value (above diagonal) and absolute number of migrant (below

diagonal). Significant level after Bonferroni’s correction p = 0.002. None of the Fst-values was significant.

2007 2008

Bellairs Sunset Crest Roberts Harbour Bellairs Sunset Crest Roberts Harbour

2007

Bellairs - 1.00 / 0.002 1.00 / 0.001 0.54 / 0.007 1.00 / -0.010 1.00 / -0.006 1.00 / -0.002 1.00 / 0.003

Sunset

Crest 266.45 - 1.00 / 0.008 0.48 / 0.008 1.00 / 0.004 1.00 / - 0.011 1.00 / 0.003 1.00 / 0.011

Roberts 500.88 63.47 - 0.50 / 0.002 1.00 / 0.0001 1.00 / 0.004 1.00 / 0.002 1.00 / 0.005

Harbour 72.25 70.15 208.40 - 0.54 / 0.004 0.51 / 0.002 0.59 / 0.001 0.58 / 0.0005

2008

Bellairs ∞ 113.71 3553.21 111.09 - 1.00 / -0.002 1.00 / -0.003 1.00 / 0.008

Sunset

Crest ∞ ∞ 120.77 304.49 ∞ - 1.00 / 0.004 1.00 / 0.006

Roberts ∞ 149.8 241.28 820.63 ∞ 134.02 - 1.00 / 0.009

Harbour 146.51 46.18 107.2 1014.05 62.83 88.44 53.29 -

biologie des populations de tourterelles à queue carrée sur l'île de la barbade apports de...

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