381 p 274 n° 130

ANALYTICAL LETTERS, 18(B13), 1593-1606 (1985) 381 P 274 n° 130

UNIVERSITAS BRUXtLLfcNSIS

DETERMINATION DE L'ACIDE L-ASCORBIQUE A L'AIDE

D'ELECTRODES BACTERIENNES, TISSULAIRES ET ENZYMATIQUES.

K£Y WORDS: bacterial, tissue and enzymic biosensors, L-ascorbic

acid in pharmaceucicals, sensor.

f

B.J. Vincké, M.J. Devleeschouwer°, G.J. Patriarche.

L-ascorbic acid membrane électrodes based upon the use of four

classes of biocatalysts immobilized at an oxygen électrode are eva-

luated and compared in terms of électrode properties and operating

requirements. Isolated ascorbate oxydase enzyme in soluble form and

in covalent binding matrices, peel of cucumber and living bacterial

cells of Enterobacter agglomerans strain, respectively, are employed

as biocatalytic layers. The physico-chemical factors, life times

and interférences are discussed in détails. The low stability of the

soluble enzyme sensor does not allow its analytical utilization,

but the immobilized enzyme, bacterial and tissue électrodes can be

used, even in multivitamin pharmaceutical formulations. The common -6 -4

linear range of those three biosensors are of 4.10 M to 7.10 M

with a précision and a reproducibility of + 3 %.

Institut de Pharmacie Université Libre de Bruxelles, Campus Plaine 205/6 et 205/2°

Boulevard du Triomphe, B-1050 Bruxelles, Belgium.

ABSTRACT

1593

Copyright © 1985 by Marcel Dekker, Inc. 0003-2719/8S/1813-1593$3.50/0

1594 VINCKE, DEVLEESCHOUWER, AND PATRIARCHE

INTRODUCTION

Les réactions enzymatiques, de par leur spécificité, ont été

couplées à de nombreux systèmes de détection tels que la fluori-1 2 3 . , . ,

métrie , 1'électrochimie ' , les mesures enthalpimetriques a 4

l'aide de thermistances , les mesures de fréquence par quartz

piézoélectriques ^ et plus récemment les fibres optiques

Cependant, ce sont les méthodes électrochimiques qui ont rencontré

le plus grand intérêt dans le domaine analytique et qui ont permis 3

la détermination de plus de 40 substrats . Parallèlement aux 7-9

électrodes à enzymes, des électrodes a membranes microbiennes ,

tissulaires '0"'' Q^ ^ organelles 1^>'2 sont développées.

L'importance de l'acide ascorbique (vitamine C) dans le domaine

pharmaceutique et agroalimentaire a donné lieu à de nombreuses 13

méthodes de dosage de celui-ci; citons les méthodes coulometriques

voltarame'triques impulsionnelles différentielles ainsi que l'uti

lisation d'électrodes enzymatiques .

Le but du présent travail est de présenter et de comparer

quatre électrodes biocatalytiques (à enzyme soluble ou immobilisée,

à mésocarpe de concombre ou à cellules bactériennes) riches en ascor-

bate oxydase et permettant de déterminer l'acide L-ascorbique dans

des formes pharmaceutiques. La réaction d'oxydation de la vitamine C

en présence d'ascorbate oxydase (EC 1.10.3.3) est schématisée

ci-dessous : . , , ascorbate

Acide L-ascorbique + 1/2 0^ > acide déhydroascorbique oxydase • ^

Elle peut être suivie stoechiométriquement par la mesure ide la

déplétion en oxygène grâce à une électrode à diffusion gazeuse d'

oxygène. Les caractéristiques et les performances analytiques de ces

quatre biosenseurs seront examinées en détails.

DETERMINATION DE L'ACIDE L-ASCORBIQUE

PARTIE EXPERIMENTALE

1595

Appareillage

Le dispositif de mesure comporte une électrode à diffusion ga

zeuse d'oxygène (0^ électrode Orion research model 97-08-00) dont

la membrane de dialyse est remplacée par une membrane de polypropy-

lène de + 50 im obtenue par pressage à chaud (190°C) sous pression 2 R

(160 kg/cm") pendant 1 minute de polypropylène Novolen BASF. La

différence d'intensité de courant résultant de la réduction de 1'

oxygène à la cathode est convertie linéairement en potentiel et lue

sur l'échelle pX d'un millivoltmetre Orion reseach digital ionanaly-

ser type 601 I. La courbe de variation de pX en fonction du temps

est tracée à l'aide d'un enregistreur E = f(t) (Goërtz Servogor 120)

relié en synchronisation avec le millivoltmètre.

Les mesures sont réalisées sous agitation constante dans une

cellule thermostatisée à 25,0 + 0,2°C.

Les coupes de tissus végétaux ont été effectuées à l'aide d'un

microtome à congélation (Leitz type 1310).

Réactifs_et milieux microbiologi2ues_de croissance

Toutes les solutions sont préparées à partir d'eau bidistillée.

Tous les réactifs utilisés sont de qualité P.A. ou biochimique.

L'ascorbate oxydase extraite de cucumis species est de prove

nance Boehringer (170 U/mg).

La souche d'Enterobacter agglomerans Indole (-) Saccharose (-)

(Erwinia herbicola) est une souche sauvage isolée à partir de thés

pharmaceutiques . Sa culture mère est maintenue à 4°C sur gélo

se inclinée H.I.A. (Difco).

Les milieux de croissance sont de deux types:

a) Milieu d'induction (0,2 % en substrat):

Extrait de levure 1g, Tryptone 1g, NH Cl 2g, KH„P0, Ag, Na,HPO, Ag

Fe (<FeSO^.7H,0) lOmg, Mg (<MgCl2) 28mg, Eau distillée IL.

Cette solution est autoclavée à 121°C pendant 15 minutes. Avant 1'

ensemencement, 0,2 g% d'acide L-ascorbique sont ajoutés extempora-

nément et la solution totale est stérilisée par filtration par

fraction de 100 ml.

1596 VINCKE, DEVLEESCHOUWER, AND PATRIARCHE

b) Milieu B.H.I. (Difco):

Il est utilisé avec ou sans inducteur (0,2 % d'acide L-ascorbique)

1) Electrode bactérienne:

La croissance d'Enterobacter agglomerans est effectuée dans le

milieu d'induction à 0,2 % en substrat pendant 24 heures et sous

agitation orbitale (100 tours min. ') à 27°C. Cent millilitres sont

filtrés sur filtre d'acétate de cellulose Millipore (HAWP 047 SO).

Le filtre saturé est lavé à l'aide de liquide physiologique. Une

partie adéquate du filtre est prélevée et fixée contre la membrane

de polypropylène de l'électrode par le biais d'un embout amovible

de P.V.C.

L'électrode est conservée soit à 4°C dans le tampon phosphate

0,1 M de pH 6 ,5 soit dans son milieu de culture à 27°C sous agitation

2) Electrode tissulaire:

Lors d'un travail se rapportant aux électrodes tissulaires, Smit

et Rechnitz avaient proposé Cucumis sativus comme support mem-

branaire lors du dosage de la cystéine.

Des membranes de 500 à 600 pm sont taillées dans le mésocarpe

de concombre. Celles-ci peuvent être conservées durant plus de deux

semaines dans un tampon phosphate 0,1 M de pH 6 , 5 .

La membrane tissulaire fixée à la surface de l'électrode par

un filet de nylon est maintenue au moyen d'un anneau de caoutchouc.

L'électrode est alors conservée à 4°C dans le tampon phosphate.

3) Electrodes enzymatiques:

0,30 mg d'enzyme (= 51 U) sont dissous dans 50 >J1 de tampon

phosphate 0,1 M et fixé directement à la surface de l'électrode par

l'intermédiaire d'une membrane de dialyse (cellophane 50 Jm) . L'élec

trode est conditionnée pendant 2 heures et stockée dans ce même tam

pon.

DETERMINATION DE L'ACIDE L-ASCORBIQUE 1597

à_£[!22SS_iE!i!2èili2ÎÊ_E§E_liâi^2G^ covalentes:

Deux méchodes d'immobilisation par liaison covalente ont été

réalisées: l'une par un greffage direct de l'enzyme sur un support

insoluble , l'autre par coréticulation avec une protéine inerte 1 9

selon Lubrano et Guilbault sur le même support insoluble d'acé

tate de cellulose. ..vS

- Type I: par greffage direct: Une membrane d'acétate de cellulo-2

se (membrane hydrophyle Tacussel) de 1 cm est imprégnée de 50 pl

de tampon phosphate 0,1 M de pH 6,50 contenant 0,30 mg d'ascorbate

ûxydase. La solution est évaporée sous vide à 4°C. La phase de ré-

ticulation est obtenue par adjonction d'une solution à 2,5 % de

glutaraldéhyde dans le même tampon. Après dessiccation sous vide,

la membrane est plongée dans une solution de glycine 0,1 M durant

3 heures à WC et lavée à l'eau distillée jusqu'à ce que l'eau de

ringage ne présente plus d'absorption spectrale à 280 nm.

- Type II: par coréticulation sur support insoluble: La membrane

d'acétate de cellulose est imprégnée de 14 JJI d'une solution tampon

contenant 50 mg d'albumine d'oeuf et 21,4 mg d'enzyme par ml et de

3 pl d'une solution à 2,5 % de glutaraldéhyde. La membrane est des

séchée à température ambiante durant 1 à 2 heures.

Les membranes enzymatiques sont conservées dans le tampon pen

dant une heure avant d'être fixées sur l'électrode au moyen d'un

filet de nylon. L'électrode est stockée à 4°C dans le tampon.

RESULTATS ET DISCUSSION

L'influence de l'activité enzymatique sur la pente et la linéa

rité de réponse de l'électrode a été réalisée pour les deux types d'

immobilisation enzymatique, sur le nombre de subcultures de la bacté

rie et sur l'épaisseur des coupes de mésocarpe de concombre.

Pour l'enzyme immobilisée, la pente maximale est obtenue à

partir de 10 U d'ascorbate oxydase dans la membrane, indépendament

du type d'immobilisation.Le temps de réponse de l'électrode est

I S W VINCKE, DEVLEESCHOUWER, AND PATRIARCHE

indépendant de la concentration en enzyme dans la gamme de 10 à

170 U et du type d'immobilisation (type I ou II).

Pour l'électrode tissulaire, les activités enzymatiques sont

fort variables d'un concombre à l'autre, comme le montre la pente

maximale qui varie de 5,0 à 6,6ApX/mM, mais le domaine de linéarité

reste constant. Cependant, la pente maximale est constante au sein

d'un même concombre et est obtenue à partir d'une épaisseur de 400 jjm.

Le temps de réponse en phase stationnaire varie au maximum de 1,5 %

entre des épaisseurs de 400 à 1.450 ^m.

En ce qui concerne les électrodes bactériennes, l'ascorbate

oxydase a une activité très variable selon les souches d'Enterobacter

agglomerans testées, mais cette activité est très stable pour une

même souche et s'exprime dès le premier ensemencement en milieu d'

induction. Seule la souche présentant le maximum d'activité a été

utilisée. Lorsque la bactérie croît en milieu B.H.I. avec ou sans

inducteur, la pente de l'électrode diminue de plus de 60 % impli

quant la nécessité d'un milieu pauvre pour effectuer l'induction

enzymatique.

L'effet du pH a été étudié sur les 4 types d'électrodes. Pour

chacune le pH influence peu le domaine de linéarité. Cependant, comme

le montre la figure 1, l'étude de la pente de réponse en fonction du

pH fait apparaître deux types de courbes: celles de l'électrode à

enzyme soluble et à fragment tissulaire qui montrent une forte dé

pendance du pH, de part et d'autre du domaine de pH 5,60 à 6,60, et

celles correspondant aux électrodes bactériennes et à enzymes immobi

lisées mettent en évidence une plus large gamme de pH exploitables

(de pH 5,30 à 7,20). Pour les quatre électrodes, le même pH d'une

valeur de 6,50 peut être utilisé avec succès.

^) ISfiyS2£Ê de_la_tem2érature. '

La figure 2 démontre une influence marquée de la température sur

la réponse de l'enzyme soluble. Pour l'électrode bactérienne, l'on

observe une stabilité de pente entre 25 et 35°C avec une chute bru-

DETERMINATION DE L'A

l'eiUe (

8,0

6,0

H,0

2,0

5,0 6,0 7,0 8,0 pH

Fig. 1 : Influence du pH sur la pente des différentes électrodes: tampon phosphate 0,1 M - 25°C. (1): Electrode à enzyme soluble; (2): Electrode tissu-laire; (3): Electrode à enzyme immobilisée; (4) Electrode bactérienne. , ,

taie à 40°C. Cette diminution de pente à 40°C s'accompagne également

d'une altération irréversible de l'enzyme, comme dans le cas de

l'électrode à enzyme soluble et tissulaire. En ce qui concerne 1'

électrode tissulaire et à membrane enzymatique immobilisée, l'influ

ence de la température est moins marquée. Seule l'immobilisation par

lien covalent de l'enzyme assure une protection efficace à 40°C.

Le domaine de linéarité reste constant pour les quatre électro

des jusqu'à 35°C. A AO^C celui-ci diminue sauf pour l'enzyme immobi

lisée .

Les forces ioniques croissantes du tampon augmentent la sensi

bilité de la réponse aux trois électrodes analytiquement exploitables

1 6 0 0 VINCKE, DEVLEESCHOUWER, AND PATRIARCHE

Pi-nti" (ApX/mM)

. H 1 1 1 1 1 i ^ 20 30 40 Température

(°C)

Fig. 2: Influence de la température sur la pente des différentes électrodes: tampon phosphate 0,1 M pH 6,50. (1): Electrode à enzyme soluble; (2): Electrode tissu-laire; (3): Electrode à enzyme immobilisée; (A): Electrode bactérienne.

comme le montre le tableau I. Cette évolution est similaire pour les

trois, mais elle est plus marquée dans l'ordre: électrode tissulaire >

électrode enzymatique > électrode bactérienne.

Le domaine de linéarité reste constant pour les forces ioniques

de 0,01 à 0,1 M et décroît ensuite pour les valeurs supérieures.

Des tampons de 0,1 M seront choisis, car ils assurent la meilleure

sensibilité pour le domaine de linéarité le plus étendu. Ils possè

dent de plus un pouvoir tampon suffisant pour les solutions aqueuses

et les formes pharmaceutiques de la vitamine C.

Des pentes identiques sont obtenues dans le tampon acétate, ce

qui permet son utilisation dans le cas d'échantillons concentrés en

cations multivalents tels que ions ferriques, cuivriques, calciques.


Tableau I; Influence de la torce ionique et du cype de tampor. sur

la pence de réponse des électrodes - pH o,5û, 25''C.

Type de cacipon ec force ionique

I.M)

Pence de L'éleccrode bactérienne l ApX/iM)

Pence de l'éleccrode cissulaire ( ApX/aM)

Pence de l'éleccrode enzymacique cype II

( ApX/mM)

Tampon pho:àphace

1 ,û 10, 15 8,82 9,62 0 ,5 9,:o 6,98 7,98

0 ,1 3,62 5,63 6.98

0 ,05 3,01 5,Û5 6 , i 3 û,Ol 7 , - 8 3,30 5,6a

Tacpon acécace

0, 1 3,57 5,69 6,84

zinciques etc.. et qui peuvent provoquer la précipitation des

phosphates correspondants.

La stabilité à long terme des électrodes est très variable en

fonction du type de membrane biocatalytique (tableau II). Elle évolue

dans l'ordre suivant: électrode à enzyme soluble < électrode tissu

laire < électrode bactérienne < électrode à enzyme immobilisée.

La régénération de l'électrode bactérienne à 27°C dans son rai-

lieu de croissance n'assure qu'une faible augmentation de sa stabili

té par rapport à la conservation dans le tampon à A°C, à l'encontre 8 18

des travaux antérieurs '

En ce qui concerne l'électrode à enzyme soluble, son instabi

lité, sa faible sensibilité et l'allongement des temps de réponse

rendent celle-ci peu exploitable pour la détermination de l'acide

ascorbique.

Les caractéristiques analytiques des trois autres biosenseurs

sont relativement similaires, à l'exception de la pente élevée de

l'électrode bactérienne. Cette caractéristique peut s'expliquer par

une constante de Michaelis-Menten supérieure (K = 23,6 mM) dans le


Tableau II: Caraccérisciques des électrodes dans le tampon phosphate 0,1M,

25'C. pH 6.50.

Type d'éleccrode Pente Linéarité Temps de réponse Stabilité en et nombre d' (ApX/mM) exprimée à l'état station- jours électrodes testées en moles/L naire exprimé en

minutes

Electrode 8,6 + 0,3 4 lû'*-7 10-* 2,5 a 3,0 10 à n

bactérienne (3)

8,6 (à 4'C)

15 à 16 (par régénération)

Electrode 5,8 0,8 4 10-^-1 .0-5 1,5 à 2,0 5 à 6

tissulaire (9)

Electrode à 0,4 4 ,0-^-5 4,0 à 5,0 2 a 3

enzyme soluble(7)

Electrode à enzy- + 0,2 4 t0"^-9 2,0 à 2,5 16 à 18

ise inmobilisée

type I et II (6)

cas de l'enzyme bactérienne démontré par Volk et Larsen pour

Enterobacter aerogenes par rapport à l'enzyme végétale (K^=1,1 mM)

6) Etude_des interférences. , .i-•

Etant donné que la vitamine C peut être oxydée de façon aspéci-

fique par certaines enzymes, telles les polyphénols oxydases et les 21

cytochromes oxydases en présence de leurs substrats , la présence

de celles -ci a été recherchée pour les trois biocatalyseurs. La

recherche des cytochromes oxydases a été effectuée sur disques R

réactifs d'oxydase test (Biomérieux) et les polyphénols oxydases en

utilisant la L-Dopa comme substrat. Ces réactions sont négatives pour

les différentes électrodes.

Parmi les autres substrats pouvant être oxydés par 1'ascorbate

oxydase tels que l'acide D-isoascorbique, l'acide D-glucoascorbique 22

et l'acide réductinique décrit par Dodds , seul l'acide D-isoas

corbique a été étudié. Comme le montre le tableau III, sa réponse •


varie en fonction de la biomembrane utilisée et est plus faible pour

l'électrode bactérienne.

Les ions cuivriques et ferriques, qui catalysent l'autooxyda-

tion de la vitamine C, interfèrent fortement aux électrodes. Les

ions ferriques diminuent la réponse par leur effet catalytique dans

1'autooxydation de la vitamine C en solution, par contre les ions

cuivriques augmentent la réponse par une oxydation beaucoup plus

rapide impliquant la formation de H.O, au lieu d'H„0 par la réaction

enzymatique ~ . O n obtient en effet un maximum rapide de réponse

qui ensuite décroît progressivement. Le peroxyde d'hydrogène formé

inhibe ensuite l'activité enzymatique de façon irréversible. Aussi

l'action de l'ascorbate oxydase (une cuproprotéine) peut être imitée 21

par des ions cuivriques liés aux protéines inertes . C'est ainsi

qu'une membrane d'albumine liée à 2.10 ^ M de CuSO^, réalisée dans

les mêmes conditions que la membrane de type II, peut oxyder l'acide

ascorbique avec une réponse relative de 30 % par rapport à celle

obtenue par la réaction enzymatique sur la membrane de type II conte

nant 51 U. La cinétique de réponse sera dans ce cas plus lente, d'une

durée de 5 à 6 minutes. 0 n peut distinguer cette oxydation de la

vitamine C par le cuivre de la réaction enzymatique par l'inhibition

de la réponse en présence d'EDTA Na2. En effet, si la réponse à 1' électrode enzymatique est réversiblement diminuée de façon constan-

-5 -3

te pour des concentrations de 1.10 à 1.10 M en EDTA Na2 (tableau

III), la réponse de l'électrode cuivre-protéine inerte est irréversi

blement inhibée de 80 % en présence de 1.10 ^ M en EDTA Na„. 23 •

Gerwin et al. ont montré que le citrate monoanion est un

inhibiteur compétitif de l'ascorbate. L'électrode enzymatique est la

plus sensible à la présence d'acide citrique, mais cette inhibition

est parfaitement réversible.

En ce qui concerne les sucres et alcools rentrant dans la syn

thèse de la vitamine C (D-glucose, L-sorbose, D-sorbitol) ainsi que

d'autres sucres et le gluconate fréquemnentutilisés comme excipients

des formes pharmaceutiques, seuls le glucose et le fructose interfè

rent légèrement et de manière semblable aux électrodes tissulaires

et enzymatiques. Par contre, un plus grand nombre de sucres interfè-


Tableau III: Etude des InLerférences aux différences éleccrodes à 25*C,

pH 6, 30 ân tampon phosphate (pour les ions Fe 3-» 2«-

et Cu utilisa-tion du tampon acétate).

Z de réponse relative

Dé rivés Concentration Electrode Electrode (mM) bactérienne tissulaire immobilisée

• 1,0 Z 1 1.3 Z î 1,1 I

Ac L-ascorbique - AA 0,3 100,0 100,0 100,0

Ac 0-isoascorbique 0,3 25,2 79,8 92,8

AA •*• EHglucose 0,3 » 30 162,5 107,4 104,2

AA + ac. citrique 0,3 • 14,3 99,7 99,0 83.9

AA * EDTA Na^ 0,3 *• 1,0 80,2 85,8 36,6

AA • D-truccose 0,3 + 30 164,3 107,5 104,9

AA • D-galactose 0,3 » 30 128,2 100,9 99,3

AA + lactose 0,3 •>• 30 118,4 100,8 99,4

AA * gluconate de K 0,3 * 30 103,5 99,2 99,9 -

AA * Cu^* 0,3 • 0,1 oiax- 254,5 max- 258,8 max- 271,4

AA * F e ^ * 0,3 • 0,5 76,1 91,1 86,9

Tableau XV: Dosage de la vicamine C dans des préparations vicamiaées.

Quantité Electrode Electrode Electrode déclarée bactérienne tissulaire enzymatique

(mg) Trouvé ° Ecart cvz Trouvé* Ecart cvt Trouvé* Ecart CVI (mg) type (mg) type (mg) type

(mg) (mg) (mg)

A: 500 503,6 9.1 1.8 502,6 12,0 2,4 499,3 11,4 2.3

B: 100 103,1 2.7 2,6 103,1 2.9 2,3 102,4 2.6 2.5

C: 1000 1033,8 25,1 2,4 1026,7 29,8 2,9 1020,5 22,3 2,2

* Moyenne des résultats sur S essais.

DETERMINATION DE L'ACIDE L-ASCORBIQUE 1^05

renc au niveau de l'électrode bactérienne en raison de leur métabo-

lisation.

Il est possible d'éliminer toutes ces interférences par la

méthode des additions standards à l'exception du cuivre.

7) àE2li£âli2D_âiî_Ë25^S^_'^^^ formes_£harmaceuti2ues.

Le dosage de l'acide L-ascorbique a été réalisé sur divers com

primés par la méthode des additions standards. Les résultats sont

rapportés dans le tableau IV.

Comme le montre le tableau, il existe une excellente corréla

tion entre les résultats obtenus sur les diverses électrodes.

CONCLUSIONS

L'étude comparative des quatre types de biocatalyseurs (enzyme

soluble, enzyme immobilisée, tissus végétaux et cellules bactériennes)

a permis de déterminer que les conditions opératoires optimales pour

chaque type de biocatalyseur sont fort semblables. Certaines diffé

rences ont été mises en évidence, en particulier en ce qui concerne

la stabilité à long terme et les interférences. Seules les électrodes

à enzymes immobilisées, bactériennes et tissulaires de par leur plus

longue stabilité ou leur faible coût sont exploitables analytiquement.

Les résultats obtenus avec celles-ci pour le dosage des formes

pharmaceutiques sont en parfaite corrélation.

REMERCIEMENTS

Nos remerciements vont au F.N.R.S. (Fonds National de la Recher

che Scientifique) pour l'aide apportée à l'un d'entre nous (G.J.P.).

Nos très sincères remerciements vont également au Prof. M. Van

Haelun pour l'aide apportée à l'élaboration des coupes au microtome.

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Received May 20, 1985 Accepted May 31, 1985

381 p 274 n° 130

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