dizerta ČnÁ prÁca · 2005. 10. 18. · pŘÍrodov ĚdeckÁ fakulta masarykovy univerzity v brn...

PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERZITY V BRN Ě

KATEDRA FYZIOLOGIE A ANATOMIE ROSTLIN

DIZERTA ČNÁ PRÁCA

FYZIOLOGICKÉ VLASTNOSTI LIŠAJNÍKOVÝCH FOTOBIONTOV RODU TREBOUXIA

Mgr. Peter Váczi

Školiteľ: Prof. RNDr. Jan GLOSER, CSc.

Konzultant: Doc. Ing. Miloš BARTÁK, CSc.

BRNO 2005

PREHLÁSENIE Prehlasujem, že som zadanú dizertačnú prácu s témou: “Fyziologické vlastnosti lišajníkových fotobiontov rodu Trebouxia“ spracoval samostatne s použitím citovanej literatúry. V Brne, 17. marca 2005 ……………………………………… Mgr. Peter VÁCZI

POĎAKOVANIE Moja vďaka patrí predovšetkým:

• Prof. RNDr. Janovi Gloserovi, CSc. (školiteľ) za odborné vedenie a cenné rady

v priebehu môjho doktorského štúdia a pripomienky pri spracovávaní dizertačnej práce.

• Doc. Ing. Milošovi Bartákovi, CSc. (konzultant) za pomoc a odborné rady pri experimentálnej práci v priebehu doktorského štúdia, za cenné rady a pripomienky pri spracovávaní publikácií a dizertačnej práce.

• Doc. RNDr. Martinovi Bačkorovi, Ph.D. pomoc a cenné odborné rady pri experimentálnej práci a poskytnutie kmeňov lišajníkových fotobiontov.

• RNDr. Ondřejovi Komárkovi, Ph.D. za cenné rady, odborné diskusie a pomoc v experimentálnej práci.

• Kolegom Mgr. Linde Seidlovej, Mgr. Hanke Vráblíkovej, Mgr. Josefovi Hájkovi, Ph.D. za cenné diskusie o experimentoch.

• Všetkým ostaným zamestnancom Katedry fyziológie a anatómie rastlín PřF MU. • Fondu Rozvoja Vysokých Škôl MŠMT ČR za finanční podporu grantu č. 560/2003

„Vliv osmotického stresu na fotochemické a biochemické procesy fotosyntézy u fotobiontů izolovaných z různých druhů foliózních lišejníků“

V neposlednom rade patrí moja vďaka mojej manželke Zuzane a dcérke Annamárii za oporu v priebehu celého štúdia.

ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK ETR rychlosť toku elektrónov

F0 základná fluorescencia chlorofylu vyvolaná meracím pulzom na zatemenej vzorke

F0' základná fluorescencia chlorofylu vyvolaná meracím pulzom na vzorke aklimovanej k aktinickému žiareniu (zmeraná tesne po jeho vypnutí)

FM maximálna fluorescencia chlorofylu vyvolaná saturačným pulzom na predzatemnenej vzorke

FM ' maximálna fluorescencia chlorofylu vyvolaná saturačným pulzom na vzorke aklimovanej k aktinickému žiareniu

FM '' maximálna fluorescencia chlorofylu vyvolaná saturačným pulzom na vzorke aklimovanej k aktinickému žiareniu (meraná po jeho vypnutí)

FS fluorescencia v ustálenom stave na vzorke vystavenej aktinickému žiareniu

FV maximálna variabilná fluorescencia chlorofylu meraná na predzatemnenej vzorke

FV' maximálna variabilná fluorescencia chlorofylu meraná na vzorke aklimovanej k aktinickému žiareniu

FV/FM maximálny výťažok primárnych fotochemických procesov v PS II

F0/FM relatívna základná fluorescencia chlorofylu vyvolaná meracím pulzom na zatemenej vzorke

ΦΦΦΦ II kvantový výťažok fotochemických reakcií v PS II

ΦΦΦΦC02 kvantový výťažok CO2 fixácie

Chl chlorofyl

LED žiarenie emitujúca dióda (súčasť fluorometra)

LHC II svetlozberny komplex fotosystému II

OER rýchlosť vývinu kyslíku

OEC kyslík vyvíjajúci komplex pri PS II

NPQ koeficient nefotochemického zhášania fluorescencie chlorofylu

PN rýchlosť čistej fotosyntézy

PN max maximálna rýchlosť čistej fotosyntézy

PPFD hustota toku fotosynteticky aktívneho žiarenia

PS I fotosystém I

PS II fotosystém II

qT+I koeficient zhášania fluorescencie chlorofylu závislý na stavových prechodoch a fotoinhibícii

qE koeficient energeticky závislého zhášania fluorescencie chlorofylu

WSD vodný sytostný deficit

ΨΨΨΨ vodný potenciál

OBSAH Abstract 1

1. Úvod 3

2. Literárny prehľad 6 2.1. Lišajníky 6 2.1.1. Všeobecná charakteristika lišajníkov 6 2.1.2. Stavba stielky 7 2.1.3. Morfológia stielky 7 2.1.4. Rozmnožovanie lišajníkov 8 2.1.5. Rýchlosť rastu vo vzťahu k prostrediu 9 2.2. Sekundárne produkty metabolizmu 10 2.3. Vzťah mykobionta a fotobionta 11 2.4. Symbiotická lišajníková riasa – Trebouxia 13 2.4.1. Charakteristika rodu 13 2.4.2. Známe druhy rodu Trebouxia Puymaly 1924 14 2.4.3. Existuje voľne žijúca Trebouxia sp. 17 2.5. Fyziologické vlastnosti Trebouxia sp. 19 2.5.1. Nároky na živiny a ich využitie 19 2.5.2. Faktory ovplyvňujúce rast rias Trebouxia sp. v kultúre 21 2.6. Ulraštruktúra fotobiontov 22 2.7. Izolácia fotobiontov 24 2.8. Kultivácia fotobiontov 26 2.9. Lišajníky vo vzťahu k substrátom s vysokým obsahom kovov 28 2.9.1. Kompartmentalizácia ťažkých kovov u lišajníkov 29 2.9.2. Mechanizmy akumulácie kovov 29 2.9.3. Mechanizmy akumulovania kovov stielkami lišajníkov 31 2.10. Toxicita tažkých kovov u rias 32 2.10.1. Mechanizmy tolerancie ťažkých kovov u rias 33 2.10.2. Vplyv prostredia na toxicitu ťažkých kovov u rias 38 2.11. Dehydratácia a osmotický stres 40 2.11.1. Vplyv dehydrácie na fyziologické procesy lišajníkov 40

3. Materiál a metódy 42 3.1. Izolácia a kultivácia fotobiontov rodu Trebouxia 42

3.2. Tolerancia vybraných kmeňov lišajníjkových fotobiontov Trebouxia erici na meď 44 3.2.1. Selekčná procedúra 44 3.2.2. Porovnanie rastu kultúr 44 3.2.3. Svetelná mikroskopia 46

3.2.4. Stanovenie koncentrácií chlorofylu a a chlorofylu b, pomeru chlorofylov a / b a vyjadrenie degradácie chlorofylu 46 3.2.5. Ko-tolerančné testy toxicity kovov 47 3.2.6. Štatistická analýza 47 3.3. Charakterizácia rastových/produkčných nárokov lišajníkových fotobiontov 48 3.3.1. Kultivácia rias v podmienkach skrížených gradientoch teploty a svetla 48 3.3.2. Meranie parametrov produkcie a rastu kultúr 50

3.4. Vplyv ožiarenosti a osmotického stresu na lišajníkovú symbiotickú riasu Trebouxia erici 53 3.4.1. Kultivácia fotobionta 53 3.4.2. Navodenie osmotického stresu 53

3.4.3. Súbežné meranie ΦII a OER 53 3.4.4. Parametre fluorescencie Chl vo vzťahu k osmotickému stresu 56

4. Výsledky 57 4.1. Súhrn zmien v metodike izolácie a kultivácie lišajníkových fotobiontov 57

4.2. Tolerancia vybraných kmeňov lišajníjkových fotobiontov Trebouxia erici na meď 59 4.2.1. Porovnanie rastu kultúr 59 4.2.2. Svetelná mikroskopia 62 4.2.3. Obsah chlorofylu 62 4.2.4. Ko-tolerančné testy toxicity kovov 63 4.3. Charakterizácia rastových/produkčných nárokov lišajníkových fotobiontov 66 4.3.1. Rast kultúr rias v podmienkach skrížených gradientov teploty a svetla 66

4.3.2. Závislosť parametrov fluorescencie chlorofylu na teplotných a svetelných podmienkach kultivácie 67

4.4. Vplyv ožiarenosti a osmotického stresu na lišajníkovú symbiotickú riasu Trebouxia erici 74 4.4.1. Fotosyntéza vo vzťatu k radiácii: 74

4.4.2. Vzájomný vzťah ΦII a OER 74 4.4.3. Vplyv osmotika na parametre fluorescencie Chl 75

5. Diskusia 77 5.1. Tolerancia vybraných kmeňov lišajníjkových fotobiontov Trebouxia erici na meď 77 5.2. Charakterizácia rastových/produkčných nárokov lišajníkových fotobiontov 81

5.3. Vplyv ožiarenosti a osmotického stresu na lišajníkovú symbiotickú riasu Trebouxia erici 83

6. Súhrn a závery 87 7. Zoznam použitej literatúry 90 8. Prílohy 98

Peter Váczi Fyziologické vlastnosti lišajníkových fotobiontov rodu Trebouxia

1

ABSTRACT Lichens are poikilohydric symbiotic associations of fungi (mycobionts) and algae

or cyanobacteria (photobionts). Photobionts are generally considered as more sensitive to

the fluctuation in environmental conditions (e.g. temperature, light, presence of polutants)

and the key element in a lichen sensitivity to environmental factors. The study is focused

on the most frequent algal photobiont species – Trebouxia and its physiological

characteristics. In this intention, the set of experiments on Trebouxia response to light,

temperature, heavy metals and osmotic stress were made.

To obtain isolated lichen photobiont culture, the method of differential

centrifugation was used. The isolation procedure was modified: a step of filtration (filter

pore size 11µm) of photobiont suspension was added after centrifugation. The isolation

method was optimalized for photobionts of lichens with foliose and fruticose thallus type.

Lichen photobionts species from lichens of Lasallia pustulata, Umbilicaria hirsuta,

Umbilicaria antarctica (foliose thallus type), and Usnea antarctica (fruticose thallus type)

were obtained. The photobionts cultures were innoculated and recently long term

cultivated in Petri dishes on agar plates of BBM medium.

For the experiments of studying copper tolerance, a tolerant and wild photobiont

strains of Trebouxia erici were used. The tolerant strain was obtained by cultivation in a

stepwise increasing copper concentration in the medium up to 4 mM. On three copper-

containing media analysis showed significantly higher inhibition of growth and

physiological parameters in the wild strain than in a strain in which a copper tolerance was

developed. Differences between strains were observed in cell dimensions, chlorophyll a

and chlorophyll a+b contents, as well as the chlorophyll a/b ratio and level of chlorophyll

degradation. However, the effect on wild type was significantly higher. Co-tolerance of the

studied strains to other heavy metals was not observed.

To characterize conditions required by lichen photobionts for optimal growth and

production, the method of algal cultivation in crossed gradients of temperature and light

was established. Algal strains were cultivated in serological microarrays. The growth and

primary photosynthetic production at the level of photosystem II were determined by

image analysis of photogrammetrical records and induced chlorophyll fluorescence

imaging analysis within experiment. Preliminary results showed the temperature and light

of 16-18 °C and 20-40 µmol.m-2.s-1 optimal for growth of Trebouxia sp.. These results


2

corresponded to the results obtained by chlorophyll fluorescence imaging. Majority of

chlorophyll fluorescence parameters which reflected photochemical processes of

photosynthesis, reached their maximum at the mentioned light and temperature. This

finding indicated the optimum of photochemical procesesses of photosynthesis under such

conditions.

The relation between oxygen evolution rate (OER) and quantum yield of

photochemical processes in photosystem II (ΦII) was examined in lichen symbiotic alga

Trebouxia erici exposed to different irradiances and osmotic stress (2 M sucrose for 60 h).

In experiment, simultaneous measurements of OER and ΦII were done. Linear relationship

was found between OER and ΦII in control cell suspension. Within irradiance range of 0 -

500 µmol m-2 s-1, under osmotic stress, OER and ΦII were reduced significantly. The

relation between OER and ΦII was curvilinear due to strong osmotically-induced inhibition

of OER at high irradiance. The highest used irradiance (500 µmol m-2 s-1) caused

photoinhibition in osmotically-stressed T. erici because non-photochemical quenching

(NPQ) increased substantially. Under such conditions energy-dependent quenching

represented a major part of NPQ increase. Osmotic stress led also to the reduction of the

capacity of photochemical processes in PS II (FV/FM) and the increase in F0/FM. These

changes indicated negative effects of osmoticum on the structure and function in

photosynthetic apparatus of T. erici.

Key-words: lichen photobiont isolation, Trebouxia, copper tolerance, growth analysis,

cultivation in crossed gradients, chlorophyll fluorescence, osmotic stress,

oxygen evolution


3

1. ÚVOD

Lišajníky (liéken) poprvýkrát spomína v gréckej literatúre okolo roku 300 p.n.l.

Theophrastos, ktoré popisuje ako výrastky na kôre olivovníkov. Niektoré lišajníky sa už od

dávna pridávali do bylinných zmesí a prvé záznamy o ich využití v medicíne pochádzajú

už zo začiatku šestnásteho storočia.

Sú to asociácie vreckatej (Ascomycetes) alebo v niekoľkých prípadoch bazídiovej

(Basidiomycetes) huby – mykobionta a jedného alebo viacerých fotosyntetických partnerov

– fotobiontov, ktorým je zväčša zelená riasa alebo sinica. Týto partneri spolu vytvárajú

integrovanú stielku špecifickej štruktúry, ktorá môže obsahovať unikátne, jedným alebo

oboma biontami tvorené sekundárne metabolity (AHMADJIAN 1993). Ojedinelosť

a špecificita tohto zoskupenia ho priam predurčuje k štúdiu v modernej biológii.

Lišajníky sú dominantnou životnou formou na asi 8% terestrických ekosystémov

(LARSON 1987). Často osídľujú niky s extrémnymi podmienkami prostredia polárnych

oblastí, púští, vysokých pohorí či skalných útesov. Pre úspešný rast na týchto stanovištiach

musia byť adaptované na široké rozmedzie teplôt, meniace sa podmienky vlhkosti

a osvetlenia.

Tieto poikilohydrické organizmy sú považované za citlivé biomonitory znečistenia

ovzdušia. Atmosféra je všeobecným zdrojom znečistenia ťažkými kovmi (SEAWARD

& RICHARDSON 1989). Avšak niektoré lišajníkové komunity je možné nájsť i na

substrátoch bohatých na ťažké kovy (pozostaky po ťažbe kovov). Tieto často obsahujú

významné množstvá železa, medi, zinku, olova a mangánu alebo menšie množstvá

antimónu, ortuti, kadmia a striebra (NASH 1989, PURVIS & HALLS 1996).

Napriek veľmi intenzívnemu štúdiu lišajníkov v laboratórnych (Lange a MATTHES

1981, LANGE et al. 1988, GAUSLAA & SOLHAUG 1988) i v terénnych (KAPPEN 1983, 1989,

1993a, KAPPEN et al. 1995, SCHROETER & SCHEIDEGGER 1995) podmienkach, sú súčasné

znalosti o ich fotosyntéze a enviromentálnych faktoroch, ktoré ju obmedzujú len útržkové.

Fotobionty sú všeobecne považované za výraznejšie citlivé na podmienky

prostredia než mykobionty, a sú teda kľúčovým elementom v citlivosti lišajníkov

k enviromentálnym stresom. Predpokladom pre bližšie štúdium rastu a fyziologických

procesov fotobiontov je získanie izolovanej kultúry. Bunky fotobionta môžu byť viac či

menej úspešne izolované zo všetkých druhov lišajníkov.


4

Najfrekventovanejšími fotobiontami lišajníkov sú druhy jednobunkových zelených

rias rodu Trebouxia.

Trebouxia sp. bola často študovaná s dôrazom na jej fylogenézu a asociácie

s mykobiontom, vytvárajúc lišajníky rôznych druhov (ROMEIKE et al. 2002, OPANOWICZ &

GRUBE 2004).

V priebehu posledných desaťročí boli fyziologické charakteristiky Trebouxia sp.

analyzované predovšetkým na úrovni celej lišajníkovej stielky, a to vo vzťahu k obsahu

fotosyntetických pigmentov (CZECZUGA et al. 2004), schopnosti produkcie polyolov a ich

vzájomnej výmeny medzi biontami (DAHLMAN et al. 2003). Fotosyntetickú aktivitu

lišajníkových fotobiontov študovli PALMQVIST (1993), PALMQVIST et al. (1997, 1998)

a SMITH & GRIFFITHS (1998). Tieto štúdie boli z väčšej časti zamerané na vplyv

mechanizmu koncentrácie uhlíku na rýchlosti čistej fotosyntézy buniek Trebouxia

v závislosti na ožiarení a dostupnosti CO2. Napriek spomínaným štúdiám, informácie

o vzťahu fotochemických a biochemických procesov fotosyntézy, za pôsobenia rôznych

stresových faktorov (dehydrácia, vysoké ožiarenie, atď) u Trebouxia sp. sú stále

obmedzené.

Niektoré štúdie zaoberajúce sa fotosyntetickou odpoveďou lišajníkov na dehydráciu

využívali indukovaný osmotický stres (JENSEN et al. 1999), pretože fyziologické dôsledky

osmotického stresu sú podobné atmosférickej dehydrácii (CALATAYUD et al. 1997).

Fotobionty v lišajníkovej stielke s narastajúcim osmotickým stresom znižujú PN (CHAKIR

& JENSEN 1999) a vykazujú pomalé ale stále detekovateľné primárne fotochemické

procesy fotosyntézy, prezentované predovšetkým ΦII, pri extrémne nízkom vodnom

potenciále (Ψ od –15 do –30 MPa; BARTÁK & GLOSER 2004, HÁJEK et al. 2005). GREEN et

al. (1998) zistili nelineárny vzťah medzi fluorometrickými (ΦII, ETR) a gazometrickými

(ΦCO2 nebo ΦvývinuO2) charakteristikami fotosyntézy lišajníka Umbilicaria aprina.

Popisovaná závislosť sa u meraní pri jednotlivých teplotách (rôzna intenzita dehydrácie)

menila, čo poukazuje na nutnosť ďalšieho skúmania v tejto oblasti.

Významným faktorom pri štúdiu lišajníkov a izolovaných biontov je ich

poikilohydrická povaha a vysoká náročnosť na kontrolu podmienok pri charakterizácii

fyziologických parametrov. Prínosnými sú preto koncepcie súbežného stanovovania

viacerých fyziologických parametrov.


5

Ciele dizertačnej práce

Predkladaná dizertačná práca sa zaoberá štúdiom fyziologických vlastností

lišajníkových symbiotických rias rodu Trebouxia. Práca si kladie za cieľ prispieť

k prehĺbeniu poznatkov o vplyve teploty, svetla, toxicity ťažkých kovov a osmotického

stresu na rast a procesy primárnej fotosyntetickej produkcie u lišajníkových fotobiontov.

Uvedená problematika bola riešená v sérii experimentov, ktorých cieľom bolo detailne

preskúmať predovšetkým nasledujúce problémy (hypotézy):

• Charakterizovať optimálne teplotné a svetelné podmienky rastu a primárnej

fotosyntetickej produkcie u lišajníkových fotobiontov rodu Trebouxia.

• Overiť možnosť tolerancie ťažkých kovov v kultivačnom médiu u lišajníkových

fotobiontov rodu Trebouxia.

• Posúdiť vplyv ožiarenosti a osmotického stresu na lišajníkové fotbionty rodu

Trebouxia.

• Overiť nelinearitu vzájomného vzťahu fotochemických a biochemických procesov

fotosyntézy u lišajníkového fotobionta rodu Trebouxia.


6

2. LITERÁRNY PREH ĽAD

2.1. LIŠAJNÍKY

2.1.1. Všeobecná charakteristika lišajníkov*

Lišajníky (lichenizované huby, Lichenes) majú medzi rastlinami výnimočné

postavenie, pretože sú životným spoločenstvom (asociáciou) huby (mykobiont)

a fotosyntetizujúceho symbiotického partnera (fotobiont). Vedecký názov lišajníku

neoznačuje celú asociáciu, ale viaže sa výlučne na lichenizovanú hubu, zatiaľ čo fotobiont

má svoje vlastné rodové i druhové meno.

Mykobiontom sú najčastejšie (viac ako 90%) zástupci vreckatých húb

(Ascomycetes) a v niekoľkých prípadoch bazídiových húb (Basidiomycetes). Fotobiontom

je najčastejšie zelená riasa (fykobiont), asi u 8% lišajníkov je to sinica (cyanobiont).

Najfrekventovanejšími fotobiontami sú z jednobunkových zelených rias rody Trebouxia,

Myrmecia a Coccomyxa, z vláknitých zelených rias Trentepohlia. Žltozelených riasy sú

zastúpené len jediným rodom Heterococcus, z hnedých rias Petrodroma,

z jednobunkových siníc je najhojnejšia Gleocapsa, z vláknitých Nostoc a Scytonema

(AHMADJIAN 1993).

Lišajníky majú z pravidla jediného fotobionta (TSCHERMAK-WOESS 1988). Asi

u 500 lišajníkov je zelená riasa primárnym fotobiontom a sinice sú prítomné ako

sekundárny N2 fixujúci symbiont (TSCHERMAK-WOESS 1988, HONEGGER 1991).

Mykobiont odoberá fotobiontovi produkty jeho fotosyntetickej činnosti,

sprostredkuváva mu príjem vody a v nej rozpustených anorganických látok, zaisťuje

ochranu proti výparu a chráni fotobionta pred vysychaním.

* Kapitola bola prehľadne spracovaná podľa: ČERNOHORSKÝ et al. 1956, SVRČEK et al. 1976, HAWKSWORTH & H ILL 1984, AHMADJIAN 1993, KREMER & MÜHLE 1997, ZÁHOROVSKÁ et al. 1998, LIŠKA 2000, PALMQVIST 2001


7

2.1.2. Stavba stielky

Morfológia stielky je veľmi rozmanitá. Jednoduchú stavbu má stielka homeomerická

(rovnorodá), v ktorej sú bunky (prípadne vlákna) voľne rozptýlené medzi hýfami

mykobionta a nevytvárajú tak zreteľnú vrstvu, dobre odlíšiteľnú od ostatných častí stielky.

Pre vnútornú stavbu väčšiny lišajníkov je typická heteromerická (vrstevnatá) stavba

stielky, v rámci ktorej bunky (prípadne vlákna) fotobionta tvoria samostatnú vrstvu.

Tvar homeomerickej stielky určuje spravidla fotobiont, zatiaľ čo tvar heteromerickej

stielky mykobiont.

U heteromerickej stielky býva diferencovaná:

1. vrchná kôrová vrstva (vrchná kôra, vrchný kortex) – je tvorená hýfami

mykobionta, jednotlivé (pevné, izodiametrické)bunky k sebe tesne priliehajú a majú

zhrubnuté bunkové steny. Kôrová vrstva má predovšetkým ochrannú funkciu.

2. vrstva fotobionta – bunky fotobionta sú riedko obrastené hýfami mykobionta,

ktoré buď neprenikajú alebo môžu prenikať haustóriami do buniek fotobionta.

3. vrstva stžňová (dreň, medula) – je tvorená riedko usporiadanými hýfami

mykobionta prepletenými do vatovitej štruktúry s veľkým množstvom medzibunkových

priestorov. Dreňová vrstva slúži predovšetkým ako zásobáreň vody.

4. spodná kôrová vrstva (spodná kôra, spodný kortex) – má podobnú stavbu

a vrchná kôrová vrstva. Býva vyvinutá u väčšiny lupeňovitých a kríčkovitých lišajníkov,

u kôrovitých lišajníkov chýba (prirastajú k substrátu priamo dreňou).

2.1.3. Morfológia stielky

Homeomerické stielky bývajú rôsolovité (vplyvom slizu cyanobionta), vláknité,

leprariovité (práškovité, rozpadavé). Podľa morfológie sa spravidla rozdeľujú len

heteromerické stielky. Je možné rozlíšiť 3 základné typy:

Kôrovitá stielka – je zvyčajne celou svojou plochou tesne prirastená k substátu alebo je

vrastená do substrátu (horniny, kôry) a nemožno ju od neho bez poškodenia oddeliť.

Utvára povlaky, zrniečka, bradavičky alebo políčka. Niektoré druhy majú stred stielky

kôrovitý, okraje ± šupinaté alebo laločnaté. Kôrovitá stielka sa od lupeňovitého typu

stielky líši neprítomnosťou rhyzín a kôry na spodnej strane.


8

Lupeňovitá (foliózna) stielka – je prevažne plochá, prirastá k podkladu zvyčajne len

strednou časťou stielky, je zreteľne lupeňovitá alebo laločnatá so zreteľne odlíšenou

lícovou a rubovou stranou. Na podklad je buď pritlačená, alebo od neho na okrajoch ±

odstáva. Na spodnej strane sú zvyčajne vyvinuté rhyziny a kôra.

Krí čkovitá (frutikózna) stielka – prirastá k podkladu len v jednom mieste a zreteľne od

neho odstáva. Býva zložená z oblých, stužkovitých, strapcovitých alebo rúrkovitých,

väčšinou bohato rozvetvených častí. Je charakteristická radiálnou stavbou (v priereze

tvoria vrstvy kôrová, riasová a dreňová sústredné kruhy).

Osobitným typom je dvojtvárna stielka niektorých lišajníkov (napr. Baeomyces,

Cladonia), skladajúca sa z kôrovitej, šupinatej až lupeňovitej prízemnej stielky a z od

podkladu nápadne odstávajúcej, rozlične utváranej stielky – podécium ().

vchná kôrovávrstva

spodná kôrovávrstva s rhizinami

vrstva rias

stržeň

vchná kôrovávrstva

spodná kôrovávrstva s rhizinami

vrstva rias

stržeň

Obr. 1. Priečny rez lupeňovitou stielkou lišajníka Umbilicaria hirsuta (fotobiont risa z rodu Trebouxia).

Nomarského diferenciálny interferenčný kontrast. Mierka je 100 µm. [Foto prevzaté z HÁJEK 2002]

2.1.4. Rozmnožovanie lišajníkov

Pohlavne sa môže rozmnožovať len mykobiont. Nová stielka vznikne za

predpokladu, že sa hýfa klíčiaca zo spór (ascospóry, bazídiospóry) opätovne stretne

s príslušným fotobiontom. U niektorých lišajníkov (Endocarpon, Staureothele) sa

vytvárajú hymeniálne gonídie, ktoré zaisťujú spoločné šírenie buniek fotobionta spolu so

spórami mykobionta a uľahčujú tak vytváranie stielok. Omnoho účinnejšie a častejšie je


9

u lišajníkov vegetatívne rozmnožovanie, ktoré umožňuje súčasné šírenie oboch partnerov

naraz. Najčastejším typom je fragmentácia stielky (spôsobená napríklad vetrom, zverou)

a následný rast nových stielok z úlomkov.

Niektoré lišajníky vytvárajú špeciálne orgány vegetatívneho rozmnožovania (izídiá,

schizídiá, sorédiá). Izídiá sú drobné, rozlične utvárané výrastky na vrchnej strane stielky.

Ich vnútorná stavba zodpovedá heteromerickej stielke. Mechanickým vplyvom sa ľahko

odlamujú, sú unášané vodou alebo vetrom a vytvárajú základ novej stielky. Schizídiá sú

výrastky podobné izídiám. Vznikajú vyhrnutím a vydvihnutím vrchných častí lalokov

alebo políčok, na mieste odchlípenia ostáva holá časť stržňa (drene). Sorédiá sú malé,

mikroskopické zrnká tvorené zhlukmi buniek fotobionta (gonídie), obklopené spleťou

hubových vlákien. Sorédiá nemajú takú diferencovanú stavbu ako izídiá, sú drobnejšie

a ľahšie, čo umožňuje ich jednoduchšie šírenie (vetrom, vodou) na väčšie vzdialenosti.

Obr. 2. Spôsoby vegetatívneho rozmnožovania lišajníkov [Prevzaté z LIŠKA 2000] 2.1.5. Rýchlosť rastu vo vzťahu k prostrediu

Rast lišajníkov sa často vyjadruje lineárnym meraním (mm rok-1), tj. ako prírastok

polomeru u lupeňovitých (folióznych) a kôrovitých (krustóznych) lišajníkov, alebo ako

prírastok dĺžky vrcholu u kríčkovitých (frutikóznych) druhov. Lupeňovité druhy prirastajú

0,5 – 4 mm rok-1, kríčkovité druhy 1,5 – 5 mm rok-1 a kôrovité druhy 0,5 – 2 mm rok-1

(HALE 1973), ale mnoho lišajníkov nespadá do tohto rozsahu a vykazujú menšiu rýchlosť

rastu stielky (NASH 1996).

Rast lišajníkov je vhodné vyjadrovať ako relatívny prírastok plochy alebo

hmotnosti vztiahnutý k počiatočnej ploche alebo hmotnosti. Týmto postupom bolo zistené,

že epifytické druhy ako napríklad Lobaria oregana (RHOADES 1977) a Lobaria

pulmonaria (MUIR et al. 1997) môžu zvýšiť biomasu o 30-50% za rok. Podobnú vysokú

rýchlosť rastu bola tiež zaznamenaná u geofytických druhov Peltigera a Nephroma


10

(SUNDBERG et al. 1999) a u Cladonia portentosa (HYVÄRINEN & CRITTENDEN 1998).

Avšak, ročné prírastky niesú vždy také vysoké, u niektorých druhov bývajú pod 2-3% za

rok (RENHORN et al. 1997, PALMQVIST & SUNDBERG 2000). Rýchlosti rastu kolísajú tiež

medziročne, odchýlky sú i medzi jednotlivými stanovišťami a dokonca aj medz

jednotlivými časťami stielky (ARMSTRONG 1993).

Poikilohydrické lišajníky niesú schopné kontrolovať obsah vody v stielke. Rast

lišajníkov preto silne závisí na dostupnosti vody v prostredí (ARMSTRONG 1974,

HYVÄRINEN & CRITTENDEN 1998, MUIR et al. 1997, RENHORN et al. 1997).

Za vlhka je rast lišajníkov primárne limitovaný žiarením. Napríklad lišajník

Lobaria pulmonaria rástol rýchlejšie na jar ako na jeseň a rýchlejšie v blízkosti

odlesneného okraja ako uprostred lesného porastu (RENHORN et al. 1997). Teplota je pre

rast a produktivitu lišajníkov menej dôležitá než voda alebo žiarenie (NASH 1996),

prinajmenšom v boreálnej a miernej klíme. Teploty nad 20 - 25°C, ktorým sú často

vystavované lišajníky v trópoch, môžu významne znížiť čistý zisk uhlíku v dôsledku

zvýšenej rýchlosti respirácie (LANGE et al. 1994, ZOTZ et al. 1998). PALMQVIST

& SUNDBERG (2000) testovali hypotézu, či môže rast lišajníkov priamo súvisieť s úhrnom

žiarenia, ktoré lišajníky prijímajú v priebehu vegetačnej sezóny ak sú vlhké a metabolicky

aktívne. Výsledky ich štúdie naznačujú, že straty energie v priebehu procesov od absorpcie

žiarenia do finálnej akumulácie v biomase sú u lišajníkov a vyšších rastlín podobné. Autori

tiež zistili, že efektivita využitia žiarenia lišajníkmi je znížená ak je obmedzená dostupnosť

dusíku. Spravidla dochádza k redukcii hustoty buniek fotobionta v stielke. Vyššie

spomínané výsledky ukazujú, že jak dostupnosť žiarenia, tak i dusíku, môžu patriť

k najdôležitejším faktorom ovplyvňujúcim rast lišajníkov.

2.2. SEKUNDÁRNE PRODUKTY METABOLIZMU

Lišajníky často vytvárajú špecifické sekundárne produkty metabolizmu (je

známych viac ako 700 sekundárnych metabolitov – PURVIS & WEDIN 1999). Tieto látky

vytvára spravidla mykobiont (len v symbióze s fotobiontom, ani jedna izolovaná zložka ich

sama nevytvára). Môžu slúžiť ako filter chrániaci bunky fotobionta pred nadmerným

žiarením (GAUSLAA & SOLHAUG 2004) alebo môžu mať význam v obrane voči herbivorom

(GAUSLAA 2005), prípadne môžu mať zásobnú či odpadnú funkciu. U mnohých z nich boli


11

preukázané antibiotické (FRANCOLINY et al. 2004), prípadne toxické účinky (proti

bakteriám a iným hubám, ROMAGNI et al. 2000). Úloha sekundárnych produktov

metabolizmu ako regulátorov fyziológie a metabolizmu biontov nieje jasná. Dostupné

údaje ukazujú, že môžu fotobionty stimulovať alebo inhibovať (viď podrobnejšie práce

KINRAIDE & AHMADJIAN 1970, RAVINSKAYA & VAINSTEIN 1976, VAINSTEIN &

TAKHTADZHYAN 1981, VAINSTEIN 1985, 1986, LAWREY 1986).

Kryštály sekundárnych metabolitov sú lokalizované na hýfach mykobionta, môžu

sa vyskytovať tiež na povrchu buniek rias i vnútri týchto buniek (AVALOS & V ICENTE

1987, VICENTE & LEGAZ 1987).

2.3. VZŤAH MYKOBIONTA A FOTOBIONTA

V lišajníkovej stielke rastie fotobiont koordinovane s mykobiontom, takže je

bunkám fotobionta v rastúcich oblastiach stielky dovolené deliť sa alebo sú dokonca

k deleniu stimulované. V nerastúcich oblastiach stielky je delenie buniek fotobionta

obmedzené alebo inhibované (PALMQVIST 2001). Mechanizmy zodpovedné za tieto

procesy nie sú dosiaľ úplne objasnené. Doposiaľ sú známe tri možné mechanizmy, ktorými

môže mykobiont ovplyvňovať rast populácií buniek fotobionta (HONEGGER 1993b):

1. veľké odčerpávanie uhlíkových metabolitov z buniek fotobionta do mykobionta

by pravdepodobne mohlo spôsobovať obmedzenie delenia buniek fotobionta.

2. delenie buniek by mohlo byť obmedzené v dôsledku nedostatku minerálnych

živín v bunkách fotobionta.

3. produkty mykobionta, napríklad fenolické sekundárne metabolity, by mohli

špecificky inhibovať delenie buniek fotobionta (HONEGGER 1993b).


12

Obr. 3. Lišajníky: symbiont - riasa [Prevzaté z AHMADJIAN 1993, upravené]

Obr. 4. Lišajníky: symbiont - sinica [Prevzaté z AHMADJIAN 1993, upravené]


13

2.4. SYMBIOTICKÁ LIŠAJNÍKOVÁ RIASA – TREBOUXIA

Najbežnejším fotobiontom lišajníkov sú zelené jednobunkové riasy rodu Trebouxia.

Ich systematické zaradenie je nejasne. Sú zaradzované buď do radu Pleurasrales

(MATTOX & STEWARD 1984) alebo radu Microthamniales (MELKONIAN & PEVELING

1988). Podľa typu pyrenoidu a tvaru chloroplastu bolo dosiaľ popísaných 27 druhov z rodu

Trebouxia. Niektorý autori (ARCHIBALD 1975, HILDRETH & AHMADJIAN 1981,

AHMADJIAN 1990) uvádzajú mnohojadrové bunky u niektorých druhov Trebouxia sp..

Naproti tomu, ETTL & GÄRTNER (1984) udávajú, že všetky známe druhy Trebouxia sp. sú

vždy jednojadrové.

2.4.1. Charakteristika rodu

Bunky sú jednotlivé alebo v skupinách od tetrád až po veľké komplexy, guľovitého

až elipsoidného alebo oválneho tvaru, ojedinele i asymetrické. Tenká bunková stena, len

zriedka jednostranne zhrubnutá, bez slizového obalu. Chloroplast u mladých buniek

nástenný, u zrelých buniek viac alebo menej centrálny so zvlneným alebo vrúbkovaným

okrajom, zväčša trochu odchlípeným od bunkovej steny. S jedným alebo viacerými

jednoduchými, štrukturovanými alebo viacnásobnými pyrenoidmi. Škrob je uložený

väčšinou vo forme zrniečok v stróme chloroplastu. Jadro je vždy uložené excentricky

v zreteľnej vychlípenine chloroplastu. Nepohlavné rozmnožovanie sa uskutočňuje cez

autospóry a nahé, pohyblivé dvojbičíkaté zoospóry, so stigmou alebo bez stigmy (ETTL &

GÄRTER 1995).

Trebouxia sp. sa rozmnožuje predovšetkým vegetatívne (viď obr..). K pohlavnej

reprodukcii dochádza v kultúrach Trebouxia sp. zriedka. Boli pozorované fúzie medzi

gamétami, vytvorené zygoty mali vždy dva oddelené chloroplasty a vyvíjali sa normálnym

vegetatívnym spôsobom (AHMADJIAN 1967b). GALLE (1968) popísal fúziu gamét

v axenickej kultúre u fotobionta lišajníku Cladonia magyarica. Ostatní autori, však,

pohlavné rozmnožovanie vo svojich kultúrach Trebouxia sp. nepozorovali (GÄRTNER

1985, FRIEDL & GÄRTNER 1988).


14

2.4.2. Známe druhy rodu Trebouxia PUYMALY 1924 Syn.: Cystococcus Nägeli sensu auct.; Chlorococcum Meneghini sensu BRAND & STOCKMAYER 1925, non MENEGHINI 1843; Pseudotrebouxia ARCHIBALD 1975

T. aggregata (ARCHIBALD) GÄRTNER 1985 Kmene: UTEX 180, CCAP 219/1d Fotobiont u: Xanthoria sp., X. parietina, Parmelia sulcata a ďalšie

stredoeurópske Parmelie, spolu s Gleocapsa sanguinea u Euopsis granatina, Lecidea fuscoatra

T. anticipata AHMADJIAN ex ARCHIBALD 1975 Kmene: UTEX 903, 904, CCAP 219/3 Fotobiont u: Parmelia rudecta (USA)

T. arboricola PUYMALY 1924 Kmene: CCAP 219/1a, SAG 219/1a Fotobiont u: voľnežijúca na kôre, tiež fotobiont u stredoeurópskych Parmelii

T. asymmetrica FRIEDL & GÄRTNER 1988 Fotobiont u: Diploschistes albescens

T. corticola (ARCHIBALD) GÄRTNER 1985 Kmene: UTEX 909 Fotobiont u: známa len voľnežijúca na kôre

T. crenulata ARCHIBALD 1975 Kmene: CCAP 219/1b, 219/2 Fotobiont u: Xanthoria aureola, niektoré Parmelie

T. decolorans AHMADJIAN 1960 Kmene: UTEX 781, 901, CCAP 219/4 Fotobiont u: Xanthoria parietina (USA, Taliansko), Buellia punctata (USA)

T. erici AHMADJIAN 1960 Kmene: UTEX 910, 911, 912, ASIB M 025, M 027, CCHU 3752, 4239 Fotobiont u: druhy z rodu Cladonia

T. excentrica ARCHIBALD 1975 Kmene: UTEX 1714 Fotobiont u: Cladonia, Huilia tuberculosa, Lecidea metzleri, Lepraria sp.,

Stereocaulon dactylophyllum var. Occidentale (USA) T. flava ARCHIBALD 1975

Kmene: UTEX 181, CCAP 219/1c Fotobiont u: Physcia pulverulenta

T. galapagensis (HILDRETH & AHMADJIAN) GÄRTNER 1985 Kmene: UTEX 2230 Fotobiont u: Ramalina sp. z Galapág

T. gelatinosa AHMADJIAN ex ARCHIBALD 1975 Kmene: UTEX 905, 906, ASIB M 035 Fotobiont u: Parmelia sp. (USA a Stred. Európa)

T. gigantea (HILDRETH & AHMADJIAN) GÄRTNER 1985 Kmene: UTEX 2231 Fotobiont u: Caloplaca cerina (USA), v Stred. Európe Parmelia sp.,

Menegazzia terebrata, Platismtia glauca T. glomerata (WARÉN) AHMADJIAN 1960

Kmene: UTEX 894, 895, 896, 897, CCAP 213/3, CCHU 3925, 4019, TI-217 Fotobiont u: Cladonia, Cladia, Stereocaulon, Huilia, Lecidea, Chaenotheca,

Calicium, Cyphelium


15

T. higginsiae (HILDRETH & AHMADJIAN) GÄRTNER 1985 Kmene: UTEX 2232 Fotobiont u: Buellia straminea z Galapág

T. impressa AHMADJIAN 1960 Kmene: UTEX 892, 893 Fotobiont u: v USA Physcia stellaris, v Európe Parmelia sp., Usnea

longissima, Gypsoplaca macrophylla T. incrustata AHMADJIAN ex GÄRTNER 1985

Kmene: UTEX 784 Fotobiont u: Lecanora dispersa (USA), Lecanora sp. (Európa)

T. irregularis HILDRETH & AHMADJIAN 1981 Kmene: UTEX 2236 Fotobiont u: Stereocaulon sp. (Island), Stred. Európa Parmelia sp.,

Parmeliopsis sp., Platismatia sp., Cetraria sp., Hypogymnia sp. T. italiana ARCHIBALD 1975

Kmene: CCAP 219/5b Fotobiont u: Xanthoria parietina (Taliansko)

T. jamesii (HILDRETH & AHMADJIAN) GÄRTNER 1985 Kmene: UTEX 2233 Fotobiont u: Schaereria tenebrosa (Wales), Stred. Európa Parmelia sp.,

Cetraria sp., Parmeliopsis placorodia, Platismatia glauca, Psudevernia furfuracea a ďalšie

T. magna ARCHIBALD 1975 Kmene: UTEX 902, CCAP 213/3 Fotobiont u: Pilophorus acicularis (USA)

T. phycobiontica TSCERMAK-WOESS 1980 Kmene: SAG B 26.81. Fotobiont u: Anzina carneonivea

T. potteri AHMADJIAN ex GÄRTNER 1985 Kmene: UTEX 900, CCAP Fotobiont u: Lecanora rubina (USA), Pertusaria (Bermudy), Toninia

a Rhizocarpon (Česká Republika, Japonsko) T pyriformis ARCHIBALD 1975

Kmene: UTEX 1712, 1713 Fotobiont u: Cladonia sp. a Stereocaulon sp. (USA), Cladonia (Európa)

T. showmanii (HILDRETH & AHMADJIAN) GÄRTNER 1985 Kmene: UTEX 2234 Fotobiont u: Lecanora hagenii (USA)

T. simplex TSCHERMAK-WOES 1975 Kmene: SAG B 101.80. Fotobiont u: Chaenotheca chrysocephala (Rakúsko, Taliansko)

T. usneae (HILDRETH & AHMADJIAN) GÄRTNER 1985 Kmene: UTEX 2235 Fotobiont u: Usnea filipendula (USA)

(podľa ETTL & GÄRTER 1995)


16

Obr. 5. Rozmnožovacie cykly Trebouxia sp. (Prevzaté z FRIEDL 1989b):

1 - volne pohyblivá (bičíkatá) zoospóra 2 - prechod zoospóry do kľudového štádia a tvorba nepohyblivej vegetativnej bunky 3 - zrenie vegetatívnej bunky Cyklus A 4, 5 - delenie vegetatívnej bunky a vytvorenie (vývoj) autospór (6) a zoospór (7) 8 - rozdelenie skupín autospór na jednotlivé bunky a - zoosporangium (po rozrušení uvoľňuje zoospóry) b - sporangium obsahujúce zoospóry, z ktorých sa vyvíjajú malé vegetatívne bunky c - úvodná fáza tvorby autospór, resp. zoospór d - novo uvoľnené vegetatívne bunky zo skupiny autospór Cyklus B 4 - delenie vegetatívnej bunky 5 - vytvorenie zoosporangia, v ktorom sa môžu vyvíjať buď volne pohyblivé zoospóry (6) alebo uzavreté zoospóry (7)


17

Obr. 6 Suspenzia buniek Trebouxia erici kultivovaných v BBM médiu. A – veľká zrelá vegetatívna bunka.

B- prasknutá bunka s aplanospórami. Mierka je 5 µm. 2.4.3. Existuje voľne žijúca Trebouxia sp.

V odbornej literatúre doposiaľ existuje spor, či Trebouxia sp. existuje ako voľne

žijúca (t.j. neasociované s mykobiontom). Bolo by logické predpokladať, že áno, pretože

potom by bolo možné očakávať, že huba pochádzajúca z lišajníkových askospór sa môže

reasociovať so zodpovedajúcou (vhodnou) riasou. Podľa AHMADJIAN (1967a, 1977) žiadne

populácie voľne žijúcej Trebouxia sp. neexistujú. Niekoľko autorov (NAKANO 1971a, b,

TSCHERMAK-WOESS 1978, BUBRICK & GALUN 1984) pozorovalo bunky Trebouxia sp. bez

prítomnosti hubových hýf, avšak tieto bunky pravdepodobne pochádzali z úlomkov stielok

(propagulí), u ktorých asociované hýfy odumreli. Pokiaľ sa Trebouxia sp. nevyskytuje ako

voľne žijúca, odkiaľ teda pochádza? Táto otázka bola skúmaná niekoľkými autormi (napr.

AHMADJIAN 1988, MATTOX & STEWART 1984). Ich štúdie ukázali blízky vzťah medzi

Trebouxia sp. a vláknitou riasou Pleurastrum terestre. Podľa týchto autorov je Trebouxia

sp. štruktúrou svojich vegetatívnych buniek natoľko podobná Pleurastrum, že by mohli

byť zaradené do jedného rodu. Takto by Trebouxia sp. mohla byť považovaná za

lichenizovanú formu Pleurastrum. Blízky vzťah medzi Trebouxia sp. a Pleurastrum


18

podporuje tiež analýza sekvencie molekúl ribozomálnej RNA u Trebouxia gigantea

(KANTZ et al. 1990).


19

2.5. FYZIOLOGICKÉ VLASTNOSTI TREBOUXIA SP.

Trebouxia sp. je často študovaná hlavne s dôrazom na jej fylogenézu a asociácie

s mykobiontom, vytvárajúc lišajníky rôznych druhov (napr.: ROMEIKE et al. 2002,

OPANOWICZ & GRUBE 2004). V priebehu posledných desaťročí boli analyzované

fyziologické charakteristiky Trebouxia sp. na úrovni celej lišajníkovej stielky, vo vzťahu

k obsahu fotosyntetických pigmentov (CZECZUGA et al. 2004), schopnosti fotosyntetickej

produkcie polyolov a vzájomnej výmeny polyolov medzi fotobiontom a mykobiontom

(DAHLMAN et al. 2003). Na izolovaných a in vitro kultivovaných populáciách Trebouxia

bol v priebehu poslednej dekády študovaný toxický vplyv ťažkých kovov (BAČKOR et al.

1998, BAČKOR & DZUBAJ 2004). Fotosyntetická aktivita riasového a sinicového

lišajníkového fotobionta bola študovaná PALMQVIST (1993), PALMQVIST et al. (1997, 1998)

a SMITH & GRIFFITHS (1998). Tieto štúdie boli z väčšej časti zamerané na význam karbon

koncentračného mechanizmu v rýchlosti čistej fotosyntézy buniek Trebouxia v závislosti

na ožiarenie a dostupnosť CO2. Napriek hore citovaným štúdiám informácie o vzťahu

fotochemických a biochemických procesov fotosyntézy u Trebouxia sp. sú stále nejasné.

Okrem toho, poznatky o fotosyntéze Trebouxia sp. za pôsobenia rôznych stresorov sú dosť

obmedzené.

2.5.1. Nároky na živiny a ich využitie

Navzdory symbiotickému charakteru života sú požiadavky na kultiváciu ako

i reakcie fotobiontov v kultúrach podobné nelichenizovaným riasam a siniciam. Pre

väčšinu fotobiontov je význačné, že vystupujú ako výhradný dodávatelia fotosyntetických

produktov pre lišajníkové stielky. Jedinou výnimkou je Trebouxia preferujúca heterotrofiu

(AHMADJIAN 1993).

Zdroje uhlíka a vitamínov

Jednotlivé druhy z rodu Trebouxia rastú dobre na médiách s obsahom fruktózy,

galaktózy, glukózy či manitolu ako zdroj uhlíka (FOX 1967, AHMADJIAN 1977, ARCHIBALD

1977). Najlepším zdrojom organického uhlíka pre väčšinu fotobiontov je glukóza.

Trebouxia erici rastie najrýchlejšie na médiách s 2% glukózy. Na médiách s vysokou

koncentráciou glukózy (testované až po 30%) sú bunky fotobiontov menšie (s priemerom 3


20

- 6 µm). Tolerancia k vysokým koncentráciám cukrov naznačuje, že bunky môžu

zabraňovať príjmu cukrov impermeabilitou membrán alebo dokážu udržiavať

metabolizmus za nízkeho obsahu vody (FOX 1967).

Ajkeď niektoré fotobionty dokážu rásť na médiách s octanom sodným ako zdrojom

uhlíka (ARCHIBALD 1977), soli organických kyselín všeobecne nepodporujú výraznejší rast

kolónií. MCCOY (1978) zistil u fotobiontov z rodu Trentepohlia zintenzívnenie rastu

vplyvom arabinózy, glukózy a ribózy. Lišajníkové fotobionty nevyžadujú externé zdroje

vitamínov (AHMADJIAN 1977, ARCHIBALD 1977). Bolo zistené, že fotobionty v kultúrach

vylučujú biotín a thiamín, čo sa dobre zlučuje so zistením, že mnohé mykobionty na tieto

vitamíny deficientné (AHMADJIAN 1967a, b).

Zdroje dusíka

Najlepšími zdrojmi organického dusíka sú pre kultivované fotobionty (napr.:

Trebouxia, Chlorella a Stichoccus) alanín, arginín, asparagín, glycín a peptón (AHMADJIAN

1977). Dobrým zdrojom anorganického dusíka sú amóniové soli. Trebouxia rastie najlepšie

na kultivačnom médiu s obsahom organického zdroja dusíka a uhlíka. ARCHIBALD (1977)

zistila, že optimálne využitie anorganických a organických zdrojov dusíka v rámci rodu

Trebouxia varíruje. Popísala vzájomný vzťah medzi preferovaním určitej formy dusíka

fotobiontami a druhmi lišajníkov, z ktorých boli izolované. Takže, spôsob utilizácie bol

viac podobný v rámci rôznych druhov rias izolovyných z rovnakého lišajníka, než

u rovnakých rias izolovaých rias z rôznych lišajníkov. Trentepohlia – fykobiont z Pyrenula

nitida rástol rovnako dobre na organickom, tak i anorganickom dusíku (MCCOY 1978).

Vplyv hormónov

IAA v koncentrácii 0,1 mg/l zvyšuje rast Trebouxia erici o 47%, kým za

spolupôsobenia 0,1 mg/l kinetínu sa rast zvýšil len o 30%. IAA v koncentrácii 1,0 mg/l

mierne inhibuje rast riasy, ale po pridaní 0,1 mg/l kinetínu sa účinok inhibície zmiernil.

Koncentrácia kinetínu 1,0 mg/l inhibuje rast spomínaného fotobionta nezávisle na pridaní

IAA (REMMER et al. 1986).

Heterotrofný rast

Väčšina druhov rodu Trebouxia je schopných rásť heterotrofne za tmy na

organických médiách. Niektoré druhy rastú porovnateľne za svetla i za tmy (ARCHIBALD


21

1977). Kultúra T. erici pestovaná za tmy na organickom médiu vykázala 30% pokles

obsahu fotosyntetických pigmentov (FOX 1967). TAPPER (1981, 1983) popísal

u fotobiontov rodu Trebouxia v podmienkach in situ systém pre príjem glukózy

a metylamínu. Príjem glukózy sa uskutočňuje zároveň s výdajom ribitolu a príjem

metylamínu prebiehal približne päťkrát rýchlejšie ako u mykobionta.

Fakt, že Trebouxia rastie dobre v heterotrofných kultúrach prispieva k hypotéze,

podľa ktorej by mohla existovať v in situ podmienkach ako obligátny alebo fakultatívny

heterotrof . Je možné uvažovať o tom, že by fotobiont v lišajníku mohol byť zásobovaný

živinami mykobiontom a súčasne by poskytoval hube väčšinu svojich fotosyntetických

produktov. Dôkaz, že by bunky Trebouxia mohli existovať ako heterotrofy in situ

pochádza zo štúdií umelých syntéz lišajníkov, kde bolo popísané prežívanie týchto

fotobiontov v zmiešaných kultúrach pestovaných za tmy počas niekoľko mesiacov

(AHMADJIAN & JACOBS 1987) a z pozorovaní chionofilných lišajníkov, ktoré hojne rastú

v hlbokých úžinách pozdĺž pobrežných oblastí Antarktického polostrova (KAPPEN 1993a,

b). Tieto lišajníky sú v priebehu zimy zavalené až 3-metrovou vrstvou snehu a odkryté na

menej než 2 mesiace počas Antarktického leta. Nariek tejto dlhotrvajúcej pokrývke, keď

LAMB (1970) nazbieral vzorky týchto lišajníkov spod vysokej pokrývky snehu uprostred

zimy a zistil, že bunky fotobionta Trebouxia boli jasne zelené bez zjavných známok

narušenia.

2.5.2. Faktory ovplyvňujúce rast rias Trebouxia sp. v kultúre

Žiarenie

Rýchlosť čistej fotosyntézy a rast Trebouxia sp. fotobiontov u lišajníkov

s pigmentovanou kôrou (napr. Caloplaca halocarpa a Lecanora dispersa) poklesla vo

vysokých hodnotách žiarenia. Naopak u lišajníkov s nepigmentovanou kôrou (Cladonia

cristellata) sa pokles rýchlosti čistej fotosyntézy neprejavil (SHOWMAN 1972). Citlivosť

fotobiontov na žiarenie podporujú predchádzajúce zistenia bádateľov, ktorý pozorovali

fotovyblednutie niektorých Trebouxia sp. fotobiontov za vysokého žiarenia (AHMADJIAN

1967a,b).


22

Teplota a pH

Optimálne teploty rastu Trebouxia sp. fotobiontov závisia na geografickej polohe

stanovišťa lišajníku, z ktorého sú izolované. Tie, ktoré z druhov mierneho pásma, rastú

dobre pri 18-20 °C, zatiaľ čo fotobionty antarktických druhov sú obligátne psychrofily

s teplotným optimom okolo 15 °C (SCHOFIELD & AHMADJIAN 1972, OCAMPO-FRIEDMAN

et al. 1988). Optimálny rozsah pH pre riasy rodu Trebouxia sp. je 4,0 – 7,4; kým pre

Nostoc je to 6,0 – 9,9.

2.6. Ulraštruktúra fotobiontov

Bunková stena a cytoplazmatická membrána

Bunkové steny lišajníkových fotobiontov majú špeciálnu dôležitosť, pretože sú

miestami symbiotických interakcií s mykobiontami. Procesy ako rozpoznávanie, adhézia,

permeabilita, rezistencia k enviromentálnym extrémom a ukladanie sekundárnych

metabolitov sú funkcie bazálne spojené s bunkovou stenou fotobionta. Aj keď je známe

pomerne málo o jej štruktúre a chemikom zložení, je zrejmé, že adaptácie bunkovej steny

vznikli následkom symbiózy (AHMADJIAN 1993).

Štúdie ultraštruktúry bunkovej steny fotobionta Trebouxia ukázali prítomnosť

niekoľkých rozdielne elektrón-denzných vrstiev a vonkajšieho fibrilárneho obalu (BROWN

& W ILSON 1968, JACOB & AHMADJIAN 1971, BEN-SHAUL et al. 1969). KÖNIG & PEVELING

(1984) zistili, že bunkové steny rias z rodu Trebouxia pozostávajú z piatich vrstiev, ktoré

majú viac-menej fibrilárnu stavbu. Sú to vnútorná vrstva (S1, 600 nm) zväčša celulózová

s istým podielom proteínov, necelulózová polysacharidová vrstva (S2, 160-200 nm),

sporopolenínová vrstva (S3, 50-80 nm), ďalšia necelulózová polysacharidová vrstva (S4,

40-50 nm) a vonkajšia nepravidelná pošva (S5) obsahujúca druhovo špecifické

monosacharidy, ktoré môžu byť zapojené do lektín-viažucich procesov a rozpoznávania

biontov (KÖNIG & PEVELING 1980, PEVELING & KÖNIG 1985).

WITHROW & AHMADJIAN (1983) pozorovali dvojvrstevnú bunkovú stenu

u fotobionta Trentepohlia u lišajníka Chiodecton sanguineum a v miestach kontaktu

s hubou zistili zthrubnutia vnútornej bunkovej steny. Tieto štruktúry zistil tiež MATTHEWS

et al. (1989), ktorý pozoroval dvoj alebo trojvrstevné bunkové steny u troch rodov

trentepohliovitých fotobiontov. U mykobionta Coenogonium interplexum boli zistené


23

občasné stenčeniny v mieste kontaktu s bunkami fotobionta (Trentepohlia) (MEIER &

CHAPMAN 1983), kým u Trypethelium eluteriae, endoperidermálneho lišajníka, boli

najtenšie bunkové steny stržňových hýf spojených s peridermálnymi bunkami rastliny

(LAMBRIGHT & TUCKER 1980).

Plazmodezmy sú bežné u fotobiontov z rodov Cephaleoros, Phycopeltis

a Trentepohlia zo subtropických kôrovitých lišajníkov (Matthews et al. 1989) a môžu byť

využité k identifikácii trentepohliovitých fykobiontov.

Bunkové steny fotobionta u Parmelia sulcata a Ramalina maciformis vykazujú

významnú flexibilitu, ktorá spočíva v tom, že pri vysychaní stielky spľasnú a pri rehydrácii

opäť získajú sférický tvar (BROWN et al. 1987, BÜDEL & LANGE 1991). Adaptívna hodnota

tejto ich vlastnosti je nejasná.

Delenie chloroplastov u kultúr Trebouxií skúmalo niekoľo štúdií. JACOB &

AHMADJIAN (1971) zistili mikrotubulám-podobné štruktúry pozdĺž periférie chloroplastu

buniek Trebouxia erici. CHIDA & UEDA (1991) popísali filamenty, ktoré vystupovali ako

kontraktilné a konstrikčné elementy chloroplastu Trebouxia potteri.

Cytoplazmatická membrána mrazom popraskaných buniek Trebouxia fotobionta

lišajníka Hypogymnia physodes často obsahuje ryhy, brázdy a intermembránové častice.

Ryhy sú najčastejšie pozorovateľné u buniek zo suchých stielok (PEVELING & ROBENEK

1980, FIECHTER & HONEGGER 1988). Bunková stena fotobionta sa kultivovaním stenšuje,

pravdepodobne v dôsledku rýchlejšieho rastu buniek. Niektoré kultivované fotobionty sa

pravdepodobne zbavujú nadbytočného materiálu bunkových stien (AHMADJIAN & JACOBS

1983). Podľa SMITH (1967) uhľovodíky, ktoré sú normálne uvoľňované lichenizovanými

riasami môžu byť kultivovanými bunkami využité na syntézu materiálu bunkovej steny.

Pyrenoidy a pyrenoglobuly

Všetky fotobionty z rodu Trebouxia majú pyrenoidy, ktoré obsahujú elektrón-

denzné globuly – pyrenoglobuly (JACOBS & AHMADJIAN 1971). Tieto globuly sú vždy

spojené s tylakoidami, na rozdiel od plastoglobúl, ktoré sa vyskytujú v stróme

chloroplastov, mimo lamelárneho systému tylakoidov (LICHTENTHALER 1968). Medzi

počtom pyrenoglobúl a množstvom prítomných tylakoidných membrán je nepriama úmera

(FISHER & LANG 1971). Bunky rastúce za nízkej intenzity ožiarenia majú viac

pyrenoglobúl a menej membrán než bunky vystavené vysokým intenzitám fotosynteticky

aktívneho žiarenia.


24

Ultraštruktúra pyrenoidu ma významnú taxonomickú hodnotu v rámci druhov

rodov Trebouxia a Pleurastrum (FRIEDL 1989a, WUJEK 1975). V porovnávacej štúdii

pyrenoidov z 26 druhov rodu Trebouxia FRIEDL (1989a, b) rozlišoval osem typov

pyrenoidov. Každý typ mal charakteristické usporiadanie tylakoidných lamel

prechádzajúcich matrixom pyrenoidu. Morfológia pyrenoidu bola stála jak

u kultivovaných, tak i u fotobiontoch v stielkach. Kultivované bunky mali však zvyčajne

jeden pyrenoid, kým v bunkách v stielkach bolo pyrenoidov viac alebo boli vetvené.

Rozdiely boli tiež v prítomnosti, resp. absencii, ako aj veľkosti pyrenoglobúl (AHMADJIAN

& JACOBS 1983).

2.7. IZOLÁCIA FOTOBIONTOV

Výber a príprava lišajníkového materiálu

Bunky fotobionta môžu byť viac či menej úspešne izolované zo všetkých druhov

lišajníkov. V mnohých prípadoch nieje nutné použiť pre izoláciu čerstvý materiál. Rôzni

autori udávajú, že je možné úspešne izolovať fotobionty i z lišajníkového materiálu

skladovaného niekoľko rokov za sucha a za tmy (napr. v herbári). Znalosť anatómie

lišajníkovej stielky poskytuje dôležité informácie pre izoláciu fotobionta. V prípade

heteromerickej stielky často možné mechanicky odstrániť vrstvy bez zelených buniek

fotobionta a tak znížiť kontamináciu predovšetkým bunkami mykobionta. Veľké množstvo

cudzích mikroorganizmov môže byť zo stielky odstránené prúdom vody, doporučuje sa

premývanie v priebehu 1 hodiny (YAMAMOTO et al. 1987).

Pre izoláciu fotobionta z lišajníkov je vhodné stielku nastrihať na malé kúsky.

YAMAMOTO et al. (1987) použil napr. 1 cm okrajových častí stielky u kríčkovitých alebo

1 cm2 u lupeňovitých lišajníkov.

Homogenizácia

Pripravený lišajníkový materiál musí byť mechanicky rozrušený. Pri homogenizácii bola

úspešne použitá ako trecia miska (YAMAMOTO et al. 1987), tak i Elvehjen-Potterov

homogenizátor (ASCASO 1980). Pri „mikropipetovej metóde“ (AHMADJIAN 1967a, b,


25

1993) sú fragmenty vrstvy fotobionta homogenizované medzi dvoma podložnými

sklíčkami a jednotlivé bunky sú izolované mikropipetou.

Čistenie homogenátu a selekcia fotobiontov

V prípade homogenátu obsahujúceho zmes rôznych buniek (buniek fotobionta,

mykobionta i kontaminácie) sa odporúča filtrovať hrubý homogenát cez niekoľko vrstiev

sterilnej gázy.

Existujú tri hlavné metódy pre selekciu fotobiontov z homogenátu:

Yamamotova metóda (YAMAMOTO et al. 1987, 1993) je založená na filtrácii

homogenátu cez sterilné filtre s veľkosťou pórov 500 µm. Táto suspenzia je ďalej

filtrovaná cez filter s veľkosťou pórov 150 µm a usadenina na filtri je trikrát premývaná

sterilnou vodou (alebo minerálnym médiom). Po premytí sú bunky fotobionta prenesené na

minerálne (anorganické) agarové kultivačné médium.

U mikropipetovej metódy sú bunky fotobionta s využitím mikropipety (ideálny

priemer 50 - 75 µm) prenesené v kvapke sterilnej vody na podložné sklíčko pre získanie

zriedenej suspenzie fotobionta a jednotlivé bunky sú prenášané na minerálne médium. Táto

metóda je náročná na manuálnu zručnosť a kvôli malému inokulu (niekoľko buniek) je i

dosť zdĺhavá, ale umožňuje dosiahnuť žiadaný výsledok už v prvom kroku. Detaily o tejto

metóde sú uvedené v prácach AHMADJIAN (1967a, 1967b, 1993) a ďalej u ETTL &

GÄRTNER (1995).

Je mnoho protokolov využívajúcich centrifugačné metódy, obzvlášť diferenciálnu a

gradientovú centrifugáciu.

Diferenciálna centrifugácia (DREW & SMITH 1967; RICHARDSON & SMITH 1968;

ORUS & ESTÉVEZ 1984) je často využívaná. Nízkorýchlostná centrifugácia (cca. 100 x g) je

všeobecne využívaná k odstráneniu veľkých fragmentov stielky. Pre priamy odber buniek

fotobionta zo supernatantu sa využíva vyššia rýchlosť centrifugácie (cca. 400 x g).

Podmienky centrifugácie je však nutné optimalizovať pre konkrétny druh lišajníkového

fotobionta. Po centrifugácii je vhodné supernatant so suspenziou fotobionta prefiltrovať

cez teflonové filtre (veľkosť pórov 50 - 10µm) a izolované bunky premyť sterilnou vodou

(alebo minerálnym médiom) a preniesť na kultivačné médium.

Gradientová centrifugácia je konvenčná metóda využívaná pre získavanie veľmi

čistých čerstvo izolovaných fotobiontov. ASCASO (1980) študovala využitie CsCl2

gradientu pre izoláciu Trebouxií. Po rozrušení stielky sú bunky fotobionta resuspendované


26

do roztoku sacharózy (0,25 M, 2ml) a opatrne vrstvené na roztok CsCl2 (1550 g.cm-3, 3

ml). Po 10 minútovej centrifugácii pri 4500 rpm sú bunky čistého fotobionta odoberané

z rozhrania sacharóza-CsCl2 a prenesené na kultivačné médium. Pre vytvorenie gradientu

hustoty je možné použiť i iné látky (napr. Percoll). U tejto metódy je nutné dať pozor na

použitie látok s možnými vplyvmi na metabolizmus buniek fotobionta (CALATAYUD et al.

2001).

Využitím mikropipetovej, Yamamotovej alebo centrifugačných metód je možné už

v prvej inokulácii získať čisté kultúry fotobiontov (BAČKOR et al. 1998). Všeobecne môžu

byť fotobionty kultivované na mnohých typoch médií (AHMADJIAN 1967a, 1967b, 1993).

2.8. KULTIVÁCIA FOTOBIONTOV

Pre kultivovanie fotobiontov sa používa agarové Boldovo bazálne médium (BBM)

(AHMADJIAN 1993). Médium obsahuje na liter: 0,75 g NaNO3; 0,175 g KH2PO4; 0,075 g

K2HPO4; 0,075 g MgSO4 . 7H2O; 0,025 g CaCl2. Z mikroprvkov sa na 1 liter média

pridáva: 11,42 mg H3BO3; 4,98 mg FeSO4 . 7H2O; 8,82 mg ZnSO4 . 7H2O; 1,44 mg MnCl2

. 4H2O; 0,71 mg MoO3; 1,57 mg CuSO4 . 5H2O; 0,49 mg Co(NO3)2 . 6H2O; 50 mg EDTA

a 31 mg KOH.

Kolónie bežných fotobiontov (napr. Trebouxia) kultivovaných na anorganických

médiách sú viditeľné po 2 - 4 týždňoch, ale niekedy až po 2 mesiacoch po inokulácii.

Rastúce kolónie musia byť preočkované na nové médium približne po 6 týždňoch.

BBM médium môže byť modifikované zvýšením koncentrácie dusíka – BBM3N

médium (NaNO3 = 30 g.l-1), ktoré zvyšuje logaritmickú fázu rastu fotobiontov.

Modifikáciou BBM média je i Trebouxia médium (AHMADJIAN 1993), pripravované

pridaním 10 g peptónu (prípadne asparagínu alebo kazeínu ako zdrojov organicky

viazaného dusíku) a 20 g glukózy na 1 liter BBM média.

Rastové podmienky sú rôzne a optimum musí byť určené individuálne. Všeobecne

môžu byť kultúry fotobiontov kultivované pri 15-25°C, nižších intenzitách osvetlenia (50 -

500 Lux) a pri pH 6 - 7 (u lišajníkov z kyslých substrátov menej) (YOSHIMURA et al. 1987;

FRIEDL 1989b; AHMADJIAN 1993; YAMAMOTO et al. 1993).

Konkrétne individuálne určenie optimálnych podmienok rastu autotrofov

postupným testovaním v suspenziách (KOMÁREK & RŮŽIČKA 1969) má za následok


27

exponenciálny zvýšenie počtu variant. Preto je výhodné využiť pre tieto účely kultiváciu

na skrížených gradientoch teploty a svetla (YARISH et al. 1979, LUKAVSKÝ 1982), prípadne

na agarových platniach s koncetračným gradientom živín (BRYSON & SZYBALSKY 1952)

alebo pH (SACKS 1956), ktoré poskytuje možnosť paralelného testovania obrovského

množstva variánt v definovaných podmienkach s minimalizáciou vplyvu zmien vedľajších

faktorov na jednotlivé varianty.

Pre charakterizovanie ekologických nárokov autotrofných organizmov rastúcich

v kultúrach in vitro (teda i lišajníkových fotobiontov) je možné s výhodou využiť

kultiváciu na skrížených gradientoch svetla a teploty, tak ako to popísali LUKAVSKÝ

(1982). Zariadenie popisuje ako plechový (hliníkový) blok obdĺžnikového pôdorysu

naplnený molitanom nasýteným vodným roztokom etanolu, z jednej strany vyhrievaný

a z druhej chladený. Tým dosiahol postupné rozdelenie teplôt jedným smerom. Chladenie

i ohrev bol regulovaný termostatom, takže bolo možné nastaviť ľubovoľný rozdiel medzi

minimálnou maximálnou teplotou. Osvetlenie bloku zabezpočovali sodíkové výbojky

namontované z jednej strany kolmo na vzniknutý gradient teplôt. Pri osvetlení bloku

z jednej strany vznikol medzi protiľahlými stranami kultivačného zariadenia gradient

intenzity osvetlenia. Vzniknutý kultivačný priestor bol prekrytý platňou z plexiskla, ktorá

napomáhala udržaniu nastavených podmienok kultivácie. Intenzitu dopadajúceho žiarenia

bolo možné znížiť použitím archov priesvitného papiera. V kultivačnom priestore

zariadenia bolo možné na agarových pôdach v rozostavených Petriho miskách paralelne

(počas niekoľkých týždňov) kultivovať autotrofné organizmy (predovšetkým riasy a

sinice) v rôznych, definovaných podmienkach osvetlenia a teploty (KVÍDEROVÁ &

LUKAVSKÝ (2001).


28

2.9. LIŠAJNÍKY VO VZ ŤAHU K SUBSTRÁTOM S VYSOKÝM OBSAHOM

KOVOV

V rámci Európy sú dobre známe spoločenstvá lišajníkov vyskytujúcich sa

predovšetkým na substrátoch s vysokým obsahom železa, prípadne na substrátoch

s vysokým obsahom medi, olova a striebra. LANGE & ZIEGLER (1963) informovali

o obsahu železa v lišajníkových stielkach z niekoľkých lokalít v SRN (napr. Harz

Mountains) v rozsahu 0,6 až 5,5% suchej hmotnosti. Vo Švédsku (Raumundberget,

Harjedalen Contry) a v Nórsku (Gjersvik, Nord Trondelag) v okolí opustených meďných

baní informoval PURVIS (1984) o nasledujúcich druhoch: Acarospora rugulosa, Aspicilia

alpina, Aspicilia mashiginensis, Aspicilia subsorediza, Lecidea inops, Lecdea lactea,

Lecida paupercula, Lecidea theiodes a Rhizocarpon birgittae a zistil u druhov A. rugulosa

a L. lactea koncentrácie medi 5,9% a 5,3%.

V Anglicku, v okolí Conistonských meďných baní, PURVIS & JAMES (1985)

informovali o 97 druhoch lišajníkov. Autori zistili výraznú variáciu v druhovom zložení

v spojení s variáciou v zložení minerálneho substrátu. Druhy typické pre železité substráty

(Acarospora sinopica, Lecidea silacea, Rhizocarpon oederi a Tremolecia atrata)

absentovali alebo boli vzácne na substrátoch s vysokým obsahom medi, na ktorých bola

Lecidea inops osobitne bežná.

Existuje množstvo ďalších roztrúsených informácií o vysokých koncentráciách

medi v lišajníkových stielkach. Napríklad v Kalifornii, CZEHURA (1977) zistil koncentrácie

medi 1,1 až 2,3% u lišajníku Lecanora cascadensis. Z viníc strednej Európy je známy druh

Lecanora vinetorum výnimočný koncentráciou medi až 5 000 µg .g-1, tolerujúci fungicídy

obsahujúce meď. HICKMOTT (1980) popísal niekoľko druhov (napr. Candelariella,

Lecanora, Physcia,…) rastúcich priamo na umelých olovnatých substrátoch.

Lišajníky vyskytujúce sa na metalických substrátoch akumulujú významné

koncentrácie kovov a vytvárajú osobité zoskupenia druhov. Mnohé druhy vykazujú

vysoký stupeň špecificity pre tieto substráty, preto môžu mať často narušenú distribúciu

v dôsledku dostupnosti (nedostatku) týchto substrátov. Jeden z najlepších príkladov

toxicity na zinok bol popísaný NASH (1975) v okolí zinkovej rafinérie v Palmertone,

Pennsylvánia (USA). Blízko tavných pecí v zóne intenzívneho vplyvu polutantov (zinok,

kadmium, SO2) prežívalo 9 druhov, oproti tomu v kontrolnej lokalite bolo nájdených 84

druhov lišajníkov. Iba dva z prežívajúcich druhov, Micarea trisepta na skalách


29

a Scoliciosporum chlorococcum na stromoch boli na znečistenej lokalite početnejšie, ba ich

početnosť v ramci tejto lokality presahovala početnosť v lokalite kontrolnej.

2.9.1. Kompartmentalizácia ťažkých kovov u lišajníkov

Lokalizácia iónov ťažkých kovov v rámci stielky je dôležitým údajom pre

definovanie pojmu vlastnej tolerancie k ťažkým kovom. Ióny kovov je možné nájsť

v rôznych oddieloch lišajníka, avšak nie sú rovnomerne distribuované vo všetkých častiach

lišajníkovej stielky., BUCK & BROWN (1979) na základe analýz jednotlivých frakcií

extraktu z lišajníkov odhadli distribúciu katiónov v stielke do (1) intercelulárnej

a povrchovej frakcie, (2) iónomeničovej frakcie, (3) intracelelárnej frakcie a (4) reziduálnej

frakcie. Využili (1) dve ½ h extrakcie v deionizovanej vode pre determináciu

intercelulárnej a povrchovej frakcie, (2) dve h vymývania v 20 mM NiCl2 pri pH 5,4 pre

determinovanie iónov viazaných k extraceluárnym ión-viažucim miestam, (3) 30-minútové

pôsobenie vriacej deionizovanej vody pre rozrušenie bunkových membrán a uvoľnenie

intracelulárnych iónov a (4) povarenie reziduálnej frakcie v koncentrovanej kyseline

dusičnej pre jej vysušenie a opätovné rozpustenie v 1 M kyseline dusičnej a následnej

solubilizácie prvkov reziduálnej frakcie. Do akej miery spomínané extrakčné procedúry

prebehli a následne i vyššie uvedená kompartmentalizácia by ešte malo byť podrobnejšie

preskúmané. Napríklad predpoklad, že reziduálna frakcia je primárnou časťou

intracelulárnej frakcie by nemusel byť správny. Externý nános častíc (i iónov kovov) na

biologických objektoch je pravdepodobne bežný jak v neznečistenom (napr.: atmosférický

aerosol morského, či pôdneho pôvodu) tak i v znečistenom prostredí. Z toho dôvodu by

doporučované premývanie spôsobilo odstránenie veľkej časti častíc zachytených

lišajníkovou stielkou.

2.9.2. Mechanizmy akumulácie kovov

Lišajníky na rozdiel od cievnatých rastlín nedisponujú vaskulárnym transportným

systémom pre podporu príjmu iónov z pôdneho roztoku. Okrem toho, na povrchu

lišajníkovej stielky sa na rozdiel od cievnatých rastlín nenachádza vosková kutikula, i keď

väčšina lišajníkov má vrchnú kôrovú vrstvu zloženú z husto posplietaných hubových hýf.


30

Z týchto dôvodov, ako príjem vody, tak i príjem iónov kovov u lišajníkov prebieha v rámci

celého povrchu stielky. Základné mechanizmy akumulácie kovov u lišajníkov sú dôkladne

zhrnuté BROWN & BECKETT (1984) a je možné medzi nich zaradiť:

Iónová výmena

Ióny kovov sa primárne vyskytujú vo forme katiónov, i keď existuje niekoľko

príkladov výskytu vo forme aniónov. Kinetika a termodynamika (definovaná ako kapacita

príjmu, elektronegativita a valenciou) príjmu katiónov je dobre preskúmaná. Dosiahnutie

nasýteného stavu nastáva po niekoľkých minútach. Katióny sú primárne viazané

extracelulárne vzhľadom k cytoplazme fotobionta či mykobionta na katiónové iónomeniče,

ktorými sú karboxylové a hydroxykarboxylové zvyšky, v rámci bunkovej steny

v priemerných množstvách 6 – 25 µmol.g-1 pre Umbilicaria a 59 – 77 µmol.g-1 pre

Peltigera a 36 – 58 µmol.g-1 pre druhy rodu Cladonia. Z kompetičných experimentov

vyplýva, že sa afinita iónov k iónomeničom mení v poradí monovalent triedy A > divalent

triedy A > hraničný divalent > divalent triedy B (GADD 1988).

V podmienkach depozície za sucha, BOONPRAGOB et al. (1989) zistil, že i

extacelulárne ukladanie aniónov bolo pomerne vysoké (viac ako 200 µmol.g-1). V ďalšej

štúdii zameranej na nekovové anióny sa nepodarilo presne špecifikovať kompartmenty, v

rámci ktorých sú anióny distribuované. Je pravdepodobné, že aniónomeniče musia takisto

existovať v rámci bunkovej steny, ale nie sú dosiaľ identifikované.

Intracelulárny príjem

Oproti príjmu (zachytávaniu) iónov prostredníctvom iónomeničov, intracelulárny

príjem obyčajne predstavuje podstatne menší tok iónov. Napríklad po 2,5 h expozícii

roztoku Cd, intracelulárny príjem predstavoval menej než 10% celkového príjmu.

Intracelulárny príjem s časom vzrastá (niekoľko hodín) podľa Michaelis-Mentenovej

kinetiky rovnováhy. Preto intracelulárny príjem je považovaný za prenášačmi

sprostredkováný proces (BROWN & BECKETT 1984).

Zachytávanie častíc

U lišajníkov je významný v rámci objemu stielok značný podiel intercelulárnych

priestorov (napr. až 18% u Xanthoria parietina zistených COLLINS & FARRAR 1978).

Častice môžu byť tak často zachytávané (ukladané) v rámci týchto priestorov. Množsto


31

lišajníkov má lineárny vzťah medzi koncentráciou Ti a Al. Pretože smernica tejto závislosti

približne odráža známy pomer 12 z 13 hlavných prvkov nachádzajúcich sa v zemskej kôre.

NIEBOER et al. (1978) vyvodil, že zachytávanie prachu z pôdy je častým javom

u lišajníkov. V okolí zdrojov znečistenia je možné dokázať analýzou častíc z lišajníkových

stielok použitím elektrónového skenovacieho mikroskopu a elektrón-analytických prób

(príp. röntgenovou difrakciou), že častice majú pôvod v jednotlivých zdrojoch znečistenia

v regióne.

2.9.3. Mechanizmy akumulovania kovov stielkami lišajníkov

Okrem vyššie spomínaných mechanizmov s dôrazom na intracelulárne a

extracelulárne štruktúry, je u lišajníkov možný výskyt ďalších typov kompartmentalizácie

kovov na úrovni lišajníkových pseudopletív.

Lišajníky, ktoré majú dobre vyvinutú spodnú kôrovú vrstvu majú obyčajne zo

spodnej vrstvy vystupujúce hýfy, nazývané rhiziny, ktorými je lišajníková stielka

prichytená k podkladu.

U lišajníkov vyskytujúcich sa na pôdach sú rhyziny v priamom kontakte s pôdou

a teda ako u neznečistených, tak i znečistených biotopov rhyziny často obsahujú vyššie

koncentrácie kovov (Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb a Zn), ktoré je možné nájsť i v ďalších typoch

lišajníkových pseudopletív (GOYAL & SEAWARD 1981). Tieto skutočnosti, spolu so

zistením silnej korelácie medzi biologickou dostupnosťou tzv. kovovej pôdnej frakcie

znamená, že translokácia kovov sa uskutočňuje cez rhyziny. Tento predpoklad bol

následne potvrdený i priamym experimentom (GOYAL & SEAWARD 1982). U omytých

stielok s odstránenými rhyzinami ďalej analyzovali distribúciu kovov medzi fotobiontovou

a mykobiontovou frakciou a zistili výrazne vyššiu (2 – 6x) hladinu Fe u mykobionta, ale

výrazne vyššie (1,7 – 4x) hladiny Cu, Mn, Ni, Zn u fotobionta (GOYAL & SEAWARD 1981)

V prípade, kedy má depozícia z atmosféry významný vplyv na akumuláciu kovov,

je ich akumulácia vo vrchnej kôre často vyššia. Niektoré rádionuklidy ako napríklad Cs137,

ukladané s následným vyžarovaním radiácie do atmosféry bolo zistené vo vyššej

koncentrácii práve vo vrcholových častiach stielky dutohlávok. Podobne Al, kov zistený

v popole z erupcie sopky Mount St. Helens (Washington, USA), bol prítomný vo vyšších

koncentráciách vo vrchnej kôrovej vrstve lišajníkov z exponovanej oblasti (MOSSER et al.


32

1983). V prípade izolovaných kovov môže dochádzať k ich akumulácii na vrchnej kôrovej

vrstve.

2.10. TOXICITA TAŽKÝCH KOVOV U RIAS

Pomerná toxicita ťažkých kovov bola sumarizovaná RAI et al. (1981). Najčastejšie

uvádzaný rad celkovej toxicity kovov je Hg > Cu > Cd > Ag > Pb > Zn, pričom relatívna

pozícia Cu a Cd sa môže líšiť (REED & GADD 1989). Väčšina ostatných ťažkých kovov je

menej toxická než spomínaná skupina (RAI et al. 1981). Naproti tomu, organokovové

zlúčeniny často vykazujú zvýšenú toxicitu u rias, spojenú s len obmedzeným dopadom na

živočíchy, napr. cicavce, i keď mnoho organokovových zlúčenín je prchavých a môžu sa

teda z prostredia vytratiť (REED & GADD 1989).

Toxicita (tolerancia) voči ťažkým kovom bola študovaná na škále zelených rias,

vrátane lišajníkových fotobiontov (napr. DE FILIPPIS et al. 1976, 1981, MACFIE et al. 1994,

MACFIE & WELBOURN 2000, BECK 1999).

Sladkovodné potoky môžu mať zvýšené hladiny ťažkých kovov v dôsledku

vymývania a zvetrávania prirodzeného podložia alebo v dôsledku industriálnych aktivít.

Takéto biotopy často vykazujú redukovanú eukaryotickú riasovú flóru. Najdôležitejšími

druhmi zelených makrorias v zinkom obohatených potokoch sú Hormidium rivulare,

Stigeoclonium tenue, Ulothrix moniliformis a Mougeotia sp. Červená makroriasa Lemanea

fluviatilis patrí tiež medzi abundantné druhy v mnohých na kovové polutanty bohatých

horných tokoch riek.

Ťažké kovy môžu vystupovať ako hybná sila usmernenej selekcie vedúcej k vzniku

metal-tolerantných ekotypov. Prvý krát bola tolerancia k medi popísaná u hnedej

makroriasy Ectocarpus siliculosus. Tolerantné ekotypy E. siliculosus je možné izolovať

z lodí ošetrených nátermi proti nárastom na báze medi a z prírodných biotopov bohatých

na meď (REED & GADD 1989)

Medzi metal-tolerantné ekotypy sladkovodných rias patria izoláty z rodov

Chlorella a Scenedesmus, pochádzajúcich z kovmi obohatených lokalít blízko Sudbury,

Kanada, so zvýšenou toleranciou k meď a nikel a meď tolerujúci kmeň Chlorella vulgaris

z opustených medených baní v Cornwell, UK. Tolerancia k zinku u Chlorella a tolerancia

ku kadmiu u Euglena sa zdá geneticky podmienená (GENTER 1996). Zelené riasy


33

Hormidium rivulare a Stigeoclonium tenue taktiež vykazujú genetickú variáciu s ohľadom

na toleranciu k zinku. Okrem šiestich rôznych populácií H. rivulare z poriečnych lokalít

s rozsiahlym znečistením na zinok bohatými vyplaveninami z uzavretých olovených baní.

Podobne, S. tenue zo zinkom znečistených lokalít vykazuje v kultúre zvýšenú toleranciu

k zinku (REED & GADD 1989).

2.10.1. Mechanizmy tolerancie ťažkých kovov u rias

LANGE & ZIEGLER (1963) navrhli, že jednotlivé mechanizmy tolerancie ťažkých

kovov u rias (i lišajníkov ako celok) je možné zahrnúť do nasledujúcich skupín: (1)

základná cytoplazmatická tolerancia, (2) cytoplazmatická imobilizácia a detoxifikácia

iónov chemickým zlučovaním a (3) transport iónov do extracytoplazmatických oblastí

plazmalemy prípadne až bunkovej steny. V súčastnosti existujú dôkazy o niektorých

ďalších mechanizmoch zahŕňaných do poslednej spomínanej možnosti, ale len relatívne

málo dôkazov pre prvé dve možnosti.

Schopnosť rias prežiť a reprodukovať sa v kovmi znečistenom prostredí môže

závisieť na genetickej adaptácii v priebehu dlhšieho časového obdobia a to mutáciami,

genetickými zmenami, selekciou, atp. alebo zmenami vo fyziológii v dôsledku

exponovania kovom. „Tolerancia“ a „rezistencia“ sú voľné často zameniteľné pojmy.

Pojem „rezistencia“ je niekedy využívaný v spojitosti s priamou odpoveďou na vystavenie

kovom, zatiaľ čo „tolerancia“ vyjadruje skutočnú vlastnosť organizmu alebo fyzikálno-

chemický charakter prostredia. Je veľmi ťažké definovať tieto pojmy exaktne a je nemožné

navrhnúť rozsahy koncentrácií ťažkých kovov, ktoré by použitie týchto pojmov vymedzili.

V tejto kapitole je pojem tolerancie využívaný v širšom zmysle zahrňujúc špecifické

mechanizmy rezistencie ako i nepriame mechanizmy, napr. nepriepustnosť (REED & GADD

1989). Ťažké kovy sa môžu vyskytovať v akvatických ekosystémoch v rozpustenej forme

(v rátane voľných iónov, iónových komplexov, chelatované s anorganickými alebo

organickými ligandami) alebo v časticovej forme (napr.: koloidy, agregáty, zrazeniny)

a relatívny podiel týchto komponentov môže mať vplyv na celkovú toxicitu daného

prostredia, preto je toxicita na meď často skôr závislá na aktivite voľných hydratovaných

Cu2+ iónov v roztoku, než na koncentrácii medi (GENTER 1996). Ťažké kovy uplatňujú

škodlivé účinky rôznym spôsobom, aj keď všetky hlavné mechanizmy toxicity sú

následkom koordinácie viacerých vlastostí iónov kovov. Vplyv toxicity ťažkých kovov

u rias môžeme rozdeliť na (1) irevereverzibilný nárast priepustnosti plazmalemy, ktorý


34

vedie k úniku bunkových roztokov (K+, organické osmotiká) a zmenám v bunkovom

objeme; (2) redukovanie intenzity fotosyntetického elektrónového transportu

a fotosyntetickej fixácie uhlíku; (3) inhibícia spotreby kyslíka pri respirácii; (4) narušenie

procesov príjmu živín; (5) inhibícia enzýmov v dôsledku substitúcie esenciálnych iónov

kovov; (6) inhibícia syntézy proteínov; (7) abnormálny morfologický vývin

a ultraštruktúrne zmeny (mitichondriálnych kríst, granulácie, multijadrovosti a zmeny vo

veľkosti vakuol a chloroplastov); (8) poškodenie pohyblivosti a strata bičíka a (9)

degradácia fotosyntetických pigmentov spojená s redukciou rastu a v extrémnych

prípadoch smrti buniek. U heterocystických dusík fixujúcich siníc môžu toxické hladiny

ťažkých kovov redukovať nitrogenázovú aktivitu v spojení s degradáciou heterocýst/lýzou

buniek, resp. v niektorých prípadoch zvýšenou tvorbou heterocýst (REED & GADD 1989).

Extracelulárne väzby a vyzrážanie

Vplyv extracelulárnych organických zlúčenín na redulovanie toxicity ťažkých

kovov bol prvý krát popísaný u sladkovodnej sinice Anabaena cylindica. U fytoplanktónu

extracelulárne produkty znižujú toxicitu kovov len v prípade dostatočne vysokej hustoty

buniek, to naznačuje, že ich význam môže byť limitovaný rozriedením. Vysoká

koncentrácia ďalších organických zlúčenín môže znižovať toxicitu ťažkých kovov, čo

môže byť dôležité v určitých vodných ekosystémoch, napríklad v blízkosti ústí odpadných

vôd, i keď takéto lokality sú často bohaté na ťažké kovy (GENTER 1996, REED & GADD

1989).

Riasy môžu taktiež produkovať špecifické železo-chelatujúce siderofóry.

Nedostatok železa spôsobil u Anabaena sp. extracelulárnu produkciu siderofórov a tieto

zlúčeniny môžu vystupovať ako silné meď-viažúce činidlá (Clarke et al. 1987).

Antagonistický vzťah medzi ťažkými kovmi a príjmom železa riasami môže spôsobovať

produkciu takýchto látok a takto modifikovať toxicitu ťažkých kovov (GENTER 1996).

Akokoľvek, v porovnaní so siderofórami prokaryotických siníc sú organické chelátory

uvoľňované mnohými eukaryotickými riasami len slabými komplexotvornými činidlami.

V určitých prípadoch sa môže na bunkových povrchoch rias môže vyskytnúť

kryštalizácia kovov. Takto je napr. Cyanidium caldarium schopné sa zbaviť medi, niklu,

hliníka a chrómu z acidických banských splašiek vyzrážaním sulfido-kovových

mikrokristálov na povrchu bunky. Táto rias môže byť vhodným organizmom pre obnovu

odstránenie kovov zo znečistených splaškových vôd (WOOD & WANG 1985).


35

Extracelulárny organický materiál je u niektorých kmeňov rias zodpovedný za

zvýšenú toleranciu k ťažkým kovom. Na meď citlivý izolát Chlorella vulgaris v médiách

obsahujúcich toxické hladiny medi sprvu vylučoval väčšie množstvo extracelulárneho

materiálu ako tolerantný izolát. Avšak, predĺžená inkubácia viedla k zvýšeniu produkcie

extracelulárnych organických zlúčenín tolerantným kmeňom. Okrem toho, tolerantné

bunky produkovali organický materiál s väčšou afinitou k medi a redukovali voľné Cu2+

ióny z média s viac ako dvojnásobnou účinnosťou oproti netolerantnému kmeňu (HALL et

al. 1989).

Niektoré riasy produkujú hojné množstvá polymérov, ktoré vytvárajú veľké

extracelulárne agregáty. Sú to často polysacharidy s vlastnosťami aniónov, a sú schopné

viazať katióny ťažkých kovov. Význam takýchto vrstiev v rezistencii k ťažkým kovom

u rias sa teší vyššej pozornosti, predovšetkým u siníc. Carrageenan (sulfát galaktánu

objavený u červených mucinogénnych rias) dokáže viazať množstvo ťažkých kovov vďaka

vysokej schopnosti katión-meniča. Určité zložky štruktúry bunkových stien rias môžu

vystupavať podobne ako katióno-meniče. U Scenedesmus obliquus majú bunkové steny

vlasnosti slabo kyslých katióno-meničov, avšak niektoré ťažké kovy (napr. kadmium)

môžu byť akumlované v forme neutrálnych komplexov. U Vaucheria sp. sú dôležitými

extracelulárnymi väzobnými procesmi iónová a kovalentná väzba k skupinám na

bunkových povrchoch (napr.: karboxyl/sulfátové a amino/karboxylové skupiny) (REED &

GADD 1989).

Viazanie kovov môže byť dvojfázovým procesom. Najprv hrajú úlohu interakcie

medzi iónmi kovov a reakčnými skupinami a následne prebieha neústrojné ukladanie

zvýšeného množstva kovov. To môže viesť k akumulácii veľkého množstva kovov, čo

znamená, že takýto príjem nemôže byť interpretovaný výhradne z hľadiska fenoménu

iónovej výmeny (GENTER 1996, REED & GADD 1989).

Množstvá ťažkých kovov zachytené pasívnym mechanizmom a väzbou na bunkové

povrchy rias môžu tvoriť len manšiu časť v porovnaní s intracelulárnou akumuláciou

metabolicky-závislými procesmi (napr. iba 20% podiel extraprotoplastovej sopcie ortuti

u Synedra ulna a cadmia u Eremosphaera viridis). Naproti tomu u niektorých rias (napr.:

Chlorella vulgaris) v priebehu krátkodobej inkubácie tvorí až 80% naakumulovaných

ťažkých kovov frakcia v rámci bunkovej steny. Vysoké hladiny medi zachytenej

v bunkovej stene boli zistené u rias Mougeotia, Microspora a Hormidium tvoriacej až 50%

celkového obsahu medi v bunke (REED & GADD 1989).


36

Zmena priepustnosti membrán a exklúzia

Za „pomalú“ fázu akumulácie ťažkých kovov je často považovaný

intraprotoplastový príjem, naproti tomu za „rýchlu“ fázu sú považované fyzikálne väzby

a biosorpcia. V mnohých prípadoch, keď bola študovaná dynamika akumulácie kovov,

rýchla fáza nemohla byť vysvetľovaná výhradne ako efekt rastu a povrchovej adsorpcie

alebo zmenami v afinite k väzobným miestam v rámci bunkovej steny a tak vyjadruje

aspoň z časti aktívny (na metabolizme závislý) príjem. V určitých prípadoch algicídne

koncentrácie ťažkých kovov môžu idukovať pasívnu akumuláciu kovov vnútri protoplastu

prostredníctvom permeabilizácie bunkového membránového systému a exponovaním voči

ďalším väzobným miestam pre kovy.

Pre niektoré ťažké kovy bol u rias popísaný aktívny transportný systém.

U Anabaena cylindrica je špecifický vysoko afinitný (KS = 17 µmol.m-3) systém aktívneho

príjmu niklu schopný koncentrovať nikel s faktorom 2 700, je inhibovaný tmou

a metabolickými inhibítormi a je citlivý na zmeny membránového potenciálu. Podbný

aktívny transportný systém bol popísaný u Anacystis nidulans pre kadmium. U Chlorella

pyrenoidosa nebol aktívny príjem kadmia ovplyvnený širokým spektrom dvojmocných

katiónov ale bol úplne inhibovaný zatemnením alebo ochladením pod 4 °C. Ďalšie štúdie,

napríklad u Dunaliella salina ukázali, že horčík je kompetitívny inhibítor príjmu kadmia

a je možné, že tieto ióny sú prijímané bežným transportným systémom. Antagonizmus

medzi príjmom železa a kadmia u morskej rozsievky Thalassiosira weissflogii môže

ovplyvňovať transportný systém železa pri akumulácii kadmia touto riasou. Akumulácia

zinku a kadmia makroriasami je všeobecne považovaný za aktívny príjem (REED & GADD

1989).

Pokles intracelulárnej akumulácie ťažkých kovov bol u niektorých rias považovaný

za mechanizmus tolerancie, napríklad u k medi tolernatného kmeňa Chlorella vulgaris bol

príjem medi nižší než u kmeňa senzitívneho. Niektoré meď tolerujúce kmene Scenedezmus

sp. môžu tiež využívať mechanizmus exklúzie, vykazujúc redukciu intracelulárnej

akumulácie. Naproti tomu, ďalšie izoláty Chlorella sp. a Scenedesmus sp. z na meď

bohatých jazier prijímali väčšie množstvá kovov než netolerantné kmene, čo nepodporuje

hypotézu o exklúznom mechanizme tolerancie u týchto ku kovom tolerantných

fytoplanktónnych rias. Avšak,progresívne zvýšenie tolerancie k zinku u Chlorella sp. bolo

interpretovanév zmysle vývinu exklúznych mechanizmov. U mnohých iných rias rozvoj


37

tolernacie ku kovom nieje spojený so znížením príjmu kovu (GENTER 1996, REED & GADD

1989).

Intracelulárna detoxifikácia

Možnosť intracelulárnej detoxifikácie ťažkých kovov u rias zaujímala menšiu

pozornosť ako väzba na povrchy a transport. A predsa, v sú známe prípady, že kovy sú

transportované interne a lokalizované v protoplaste. U niektorých rias môže intracelulárna

lokalizácia zahŕňať vyzrážanie v rámci špecifických miest v protoplaste. Napríklad meď je

prednostne akumuloaná vnútri vakuol a jadra ku kovom tolerantného kmeňa Scenedesmus

acutiformis čo môže viesť tiež k ukladaniu v jadrách týchto rias. Kdmium je lokalizované

v jadrách Porphyra umbilicalis a vo fyzódoch Fucus vesiculosus. Ďalším príkladom môže

byť príjem uránu u Synechococcus elongatus, ktorý vedie k tvorbe denzných

intracelulárnych nánosov. U Anabaena cylindrica, Plectonema boryanum a niektorých

eukaryotických rias môže byť prijatý hliník a kadmium v protoplaste izolovaný v rámci

polyfosfátových teliesok (REED & GADD 1989).

Ďalším z aspektov intracelulárnej kompartmentalizácie je syntéza kovy-vižúcich

proteínov, ktoré môžu mať významnú úlohu pri detoxifikácii. U Synechocuccus sp. bol

kadmium-viažúci proteín (Mr = 8 100) syntetizovaný ako odpoveď na exponovanie

kadmiu. Podobné kovy-viažúce proteíny sa vyskytujú i u eukaryotických rias, napríklad

u k medi tolerantného kmeňa Scenedesmus acutiformis a kadmium-tolerantnej Chorella

pyrenoidosa. Rezistencia ku kadmiu u Dunaliella bioculata môže v sebe rovnako zahŕňať

pôsobenie intracelulárnych kadmium-viažúcich proteínov. Doterajšie štúdie

charakterizovali kovy viažúce peptidy z širokého spektra rias, vrátane Chlorella fusca, S.

acutiformis a Porphyridium cruentum, kategorizujúc ich do skupiny fytochelatínov

(peptidy so základnou štruktúrou (γ-Glu-Cys)n-Gly, kde n = 2 až 11), ktoré viažu ióny

ťažkých kovov koordinačnou väzbou s tiolovými skupinami (REED & GADD 1989).

Modifikácie kovov

Mikroorganizmy môžu uskutočňovať chemické transformácie ťažkých kovov,

procesmi ako je oxidácia, redukcia či metylácia a tieto mechanizmy môžu významne

ovplyvňovať rezistenciu. U baktérií je najčastejšie študovaným rezistenčným

mechanizmom zahŕňajúcim transformáciu je enzymatická redukcia Hg2+ na menej toxickú,

prchavú elementárnu formu Hg0. V tomto smere je len málo dát dostupných pre riasy, hoci


38

sú tieto organizmy pravdepodobne významnou mierou zapojené do toku kovov v prostredí.

K ortuti rezistentný kmeň z rodu Chlorella odparuje viac ako dvakrát viac Hg2+ ako

senzitívny kmeň a väčšina tejto aktivity je enzymatického zálkladu a je stimulovaná

svetlom. Acelulárne extrakty boli rovnako schopné odparovať Hg2+ a fenylortuťnatý acetát

(GENTER 1996, REED & GADD 1989).

Množstvo mikroorganizmov, vrátane rias, sú pravdepodobne zapojené do

biometylácie ťažkých kovov a polokovov, napr. As, Cd, Hg, Pb, Se a Sn. Metylácia môže

byť dôležitým detoxifikačným mechanizmom predovšetkým kvôli tomu, že s jej pomocou

môže byť pozmenená prchavosť, rozpustnosť a toxicita daných prvkov. Arzén môže byť

niektorými morskými riasami príjmaný a premieňaný na rôzne organické zlúčeniny,

ktorých tvorba môže tvoriť základ ich detoxifikačnej stratégie (REED & GADD 1989).

2.10.2. Vplyv prostredia na toxicitu ťažkých kovov u rias

Toxicita a biologická dostupnosť ktoréhkoľvek z ťažkých kovov je závislá na jeho

fyzikálnochemickom stave. Jedna z najvýznamnejších enviromentálnych premenných je

pH. V acidických podmienkach majú kovy tendenciu výskytu vo toxickejšej forme

voľných hydratovaných iónov, kým v alkalickom prosterdí (napr. morská voda) sa môžu

vyzrážať do nerozpustných komplexov. V mnohých prípadoch preto nárast pH má za

následok zníženie toxicity kovov (RAI et al. 1981) a naopak (napr.: toxicita zinku a ortuti

u Chlorella vulgaris). V iných prípadoch môže byť toxicita redukovaná nízkym pH

prostredia. Pokles príjmu kadmia u Stychococcus bacillaris v podmienkach nízkeho pH bol

spôsobený znížením transmembránového potenciálu, hnacej sily akumulácie tohto kovu.

Navyše, H+ ióny môžu konkurovať voľným iónom kovov v miestach príjmu a tak so

zvyšujúcim sa pH znižovať ich toxicitu. Rast rias v kyslých, na ťažké kovy bohatých

vyplaveninách z baní je ďalším dôkazom, že nízke pH nie je vždy spoejené so zvýšením

toxicity (PETERSON et al. 1984).

Akumulácia ťažkých kovov a ich toxicita môže byť narušená i prítomnosťou

ďalších katiónov. Toxicita medi, zinku, kadmia a ortuti u rias je často redukovaná soľami

vápnika alebo horčíka, predovšetkým v dôsledku koprecipitácie/tvorenia komplexov, čo

môže z časti vysvetľovať zníženie toxicity spojenej so zvýšením tvrdosti sladkých vôd.

Navyše, priama kompetícia medzi Ca2+ alebo/a Mg2+ a katiónmi kovov môže taktiež

znižovať akumuláciu a toxicitu ťažkých kovov. Koncentrácia živín môže mať tiež vplyv na

toxicitu kovov. Fosfor (vo forme fosfátu) znižuje toxicitu ťažkých kovov u širokého


39

spektra rias z rôznych skupín v dôsledku vyzrážania. Naopak, v podmienkach limitácie

živinami, ťažké kovy môžu znížiť schopnosť rias využiť limitujúce živiny. Prítomnosť

organických zlúčenín (riasového či iného pôvodu) môže tiež často znižovať toxicitu kovov.

Biologické faktory môžu mať taktiež vplyv na toxicitu kovov. Hustota suspenzie

rias často negatívne koreluje s toxicitou v dôsledku zvýšeného množstva väzobných miest

na bunkových povrchoch. Akumulácia ťažkých kovov môže byť vyšia u rastúcich kultúr,

než u stacionárnych. V kontraste s tým, staršie časti stielok rias často pijímajú väčšie

množstvá ťažkých kovov než mladšie, rýchlejšie rastúce oblasti. U niektorých morských

rias (napr. Fucus, Laminaria), často využívaných k biomonitoringu ťažkých kovov, je

známa dokonca schopnosť koncentrovania kovov z okolitého prostredia s faktorom 103 až

104. Je však nepravdepodobné, že by akýkoľvek prirodzený bioindikátor dokázal

kedykoľvek verne odrážať obsah ťažkých kovov vo všetkých typoch vodných prostredí.

Pretože, za istých okolností môže byť akumulácia určitých ťažkých kovov u rias z kovmi

znečistených lokalít nižšia ako u rias z neznečistených vôd (napr. v dôsledku vplyvu

ďalších polutantov a ťažkých kovov). No pravdaže, tieto organizmy môžu byť s výhodou

použité k zhodnoteniu biologickej dostupnosti ťažkých kovov v prostredí (RAI et al. 1981,

REED & GADD 1989).


40

2.11. DEHYDRATÁCIA A OSMOTICKÝ STRES

2.11.1. Vplyv dehydrácie na fyziologické procesy lišajníkov

Lišajníky, poikilohydrické organizmy, ktoré sú v rôznej miere (druhovo-špecificky)

adaptované na dehydráciu (postupné vysychanie stielok). Napriek tomu silná dehydrácia

stielok (viac ako 40 % WSD-vodného sýtostného deficitu) predstavuje pre tieto organizmy

významný stres, vedúci k poklesu fyziologických procesov, napríklad fotosyntézy

(DELTORO et al. 1998, PALMQVIST & SUNDBERG 2000). Funkčné zmeny vo

fotosyntetickom aparáte lišajníkového fotobionta, vyvolané dehydráciou je možné

sledovať pomocou metód indukovanej fluorescencie chlorofylu in vivo (napr. SASS et al.

1995) s pomocou série fluorescenčných parametrov (FV/FM - fluorescenčný pomer

variabilnej k maximálnej fluorescencie chlorofylu, ΦII - kvantový výťažok elektronového

transportu PS II, qN- koeficient nefotochemického zhášania fluorescencie chlorofylu).

K dehydrácii u lišajníkov môže dôjsť vplyvom vysokej teploty (KAPPEN 1981), pri

nízkych teplotách (KAPPEN 1989, 1993, SCHROETER et al. 1994) a za vysokého

osmotického stresu (JENSEN et al. 1999). Postupná dehydrácia stielok lišajníkov (vyjadrené

poklesom relatívneho obsahu vody RWC zo 100% na 0%) vedie u väčšiny doposiaľ

študovaných druhov lišajníkov k postupnému poklesu FV/FM , ΦII a naopak nárastu qN

(SASS et al. 1995, TUBA et al. 1995). Strata vody zo stielky lišajníka je spojená

s inaktiváciou fotosyntetickej výmeny plynov a stratou variability fluorescencie chlorofylu.

Následné zvlhčenie vodou vedie v priebehu niekoľkých minút k obnove aktivity

fotosyntézy (LANGE et al. 1989) a dochádza k návratu parametrov fluorescencie chlorofylu

(FV/FM, ΦII, qN) k hodnotám pred vystavením dehydrácii.

Na úrovni celej lišajníkovej stielky bol však vplyv rôznych stresov na rýchlosť čistej

fotosyntézy (PN) často študovaný v in situ podmienkach (LANGE 2002, 2003a, b, RENHORN

et al. 1997). Vplyv dehydrácie lišajníkových stielok na PN študovali napíklad: HEBER et al.

(2000), MACKENZIE & CAMPBELL (2001), RASHER et al. (2003), a ďalší. Niektoré štúdie

lišajníkov zaoberajúce sa fotosyntetickou odpoveďou na dehydráciu využívali indukovaný

osmotický stres (JENSEN et al. 1999), pretože fyziologické dôsledky osmotického stresu sú

podobné atmosférickej dehydrácii (CALATAYUD et al. 1997). Fotobionty v lišajníkovej

stielke znižujú svoju PN s narastajúcim osmotickým stresom (CHAKIR & JENSEN 1999)


41

a vykazujú pomalé ale stále detekovateľné fotochemické procesy fotosyntézy,

prezentované predovšetkým ΦII, i za extrémne nízkeho vodného potenciálu (Ψ od –15 do –

30 MPa; BARTÁK & GLOSER 2004, HÁJEK et al. 2005).

V našej štúdii, ktorá je súčasťou tejto dizertačnej práce, sme sa zamerali na vplyv

osmotického stresu (simulujúc tak rozsah dehydračného stresu u vysychajúcich

lišajníkových stielok) indukovaného v laboratórnych podmienkach na primárne

fotosyntetické procesy Trebouxi erici. Predpokladali sme v kontexte s výsledkami

prezentovanými CHAKIR & JENSEN (1999), že narastajúci osmotický stres spôsobí pokles

ΦII. Ďalej sme vyšetrovali vzájomný vzťah medzi fotochemickými a biochemickými

procesmi fotosyntézy, prezentovanými rýchlosťou vývinu kyslíku (OER). Predpokladali

sme, že vzťah medzi ΦII a OER bude za fyziologických podmienok (teplota, ožiarenosť)

lineárny. Zatiaľ čo za osmotickým stresom navodenej dehydrácie bude možné u suspenzie

buniek Trebouxia očakávať výrazné odchýlky od linearity tohto vzťahu. Usudzovali sme

tak na základe experimentálneho dôkazu z terénnej štúdie (GREEN et al. 1998), kde bol

vzťah medzi ΦII a kvantovým výťažkom fotosyntézy (ΦCO2) u Umbilicaria aprina (zelená

rias ako fotobiont) nelineárny.


42

3. MATERIÁL A METÓDY

3.1. IZOLÁCIA A KULTIVÁCIA FOTOBIONTOV RODU TREBOUXIA

Na izoláciu buniek fotobionta z lišejníkovej stielky jsme použili modifikovanú a

pre nami využívané riasy rodu Trebouxia optimalizovanú metódu diferenciálnej

centrifugácie (DREW & SMITH 1967, YAMAMOTO et al. 1987) doplnenou o následné

filtrovanie získaného bunkového extraktu (Obr.7).

Nazbieraný lišajníkový materiál bol uskladnený pri teplote 5 °C a ožiarenosti 10

µmol m-2.s-1. Pred izoláciou fotobiontov boli stielky lišajníkov dôkladne premývané pod

silným prúdom vody (najmenej 10 min.) a potom umiestnené mezi dvoma archami

vlhkého filtračného papieru do doby, než sa dosiahol stav optimálnej hydrácie stielky (pri

izbovej teplote). Stav hydráce stielky bol overený metódou merania fluorescencie

chlorofylu in vivo, za optimálnej hydrácie stielky bol považovaný stav, v ktorom boli

zistené maximálne hodnoty variabilnej fluorescencie chlorofylu (Fv) a kvantového

výťažku fotochemických reakcií fotosystému II (ΦII).

Pripravený lišajníkový materiál bol nastrihaný na malé kúsky (1 cm2) a potom

homogenizovaný v trecej miske s prídavkom malého množstva (1 – 2 ml) BBM média.

Hrubý homogenát bol prefiltrovaný cez niekoľko vrstiev sterilnej gázy. Potom

nasledovala fáza selekcie fotobiontov pomocou diferenciálnej centrifugácie (centrifúga

Universal 32 R, Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, SRN). Získaný bunkový homogenát bol

centrifugovaný pri 500 rpm (27 g) 1 min. kvôli odstráneniu veľkých fragmentov stielky.

Resuspendovaný supernatant bol centrifugovaný pri 2000 (440 g) rpm 3 min. Získaný

sediment bol ďalej homogenizovaný s prídavkom BBM média na Vortexe (1/2 min.) a

centrifugovaný počas 1 min. pri 1000 (100 g) rpm. Tento krok bol opakovaný celkovo 4-

krát a potom nasledovalo čistenie suspenzie fotobiontov zo sedimentu filtráciou cez

nylonové filtre (priemer pórov 11 µm ) a premývanie pomocou 3 násobného objemu

sterilného BBM média (ako prefiltrovaný objem kultúry). Z filtra získaná suspenzia

fotobiontov bola inokulovaná na BBM kultivačné médium.

Bunkové kultúry fotobiontov boli kultivované na agarovom BBM médiu v Petriho

miskách, v klimaboxe pri 20°C a ožiarenosti 30 µmol m-2 s-1 s fotoperiodou 16/8 (deň/noc).


43

Obr. 7 Schéma postupu izolácie buniek fotobionta.

Homogenizácia - nastrihanie stielky na kúsky (1 cm2)

- homogenizácia v trecej miske s prídavkom BBM

- filtrácia hrubého homogenátu cez sterilnú gázu

- optimalizovaná metóda diferenciálnej centrifugácie (Drew a Smith 1967, Yamamoto et al. 1987)

Selekcia buniek fotobionta

Centrifugácia 500rpm, 1min. >> supernatant

Centrifugácia 2000rpm, 3min. >> sediment

>> sediment 1/2min. Vortex

Centrifugácia 1000rpm, 1min. >> sediment

1/2min. Vortex >> filtrácia cez 11µm filtre Premytie sterilným médiom BBM

Inokulácia na kultivačné médium

4x

Kultivácia - na agarovom BBM médiu v Petriho miskách, pri teplote 20°C, osvetlení 200 µmol.m-2.s-1 s fotoperiódou 16/8 (deň/noc)


44

3.2. TOLERANCIA VYBRANÝCH KME ŇOV LIŠAJNÍJKOVÝCH

FOTOBIONTOV TREBOUXIA ERICI NA MEĎ

3.2.1. Selekčná procedúra

Zásobné kultúry lišajníkového fotobionta Trebouxia erici Ahmadjian (UTEX 911)

boli udržiavané na agarovom Boldovom bazálnom médiu (BBM) (AHMADJIAN 1993).

Axenická kultúra tohto kmeňa (tu považovaná za divokú) bola v priebehu 1 hodiny

homogenizovaná jemným miešaním na magnetickej miešačke (výsledná hustota 104 – 106

buniek na 1 ml média) a potom napipetovaná (50 µl bunkovej suspenzie) na povrch

agarových platní s 3N Trebouxia médiom (AHMADJIN 1993). Pre selekciu rezistentného

kmeňa sme do 3N Trebouxia média pridali meď s dosiahnutím celkovej koncentrácie 100

µM.l -1. V kontrolnom médiu bola prítomná meď v nutričnej koncentrácii (6,3 µM.l -1).

Riasy rastúce na agarových platniach s koncentráciou medi 100 µM.l -1 boli po troch

týždňoch preočkované na agarové platne s tou istou koncentráciou medi ako i na platne

s dvojnásobnou koncentráciou tohto kovu. Obsah medi v médiu bol postupne pri každom

transfere kolónií zvyšovaný o 100 µM.l -1. Konečná koncentrácia medi, ktorá bola

využívaná pri kultivácii tohto „tolerantného“ kmeňa je 4mM.l-1. Paralelne s tolerantným

bol divoký kmeň kultivovaný na nutričnej koncentrácii medi v médiu. Boli využívané

médiá s pH 6,5 (predtým otestované ako optimálne).

Kultúry boli udržiavané pre 24 °C za 16/8-hodinovej fotoperiódy a 30 µmol.m-2.s-1

umelej radiácie (biele svetlo).

3.2.2. Porovnanie rastu kultúr

Niekoľko inokulačných kľučiek z oboch kultivovaných kmeňov T. erici rastúcich

na pevnom médiu sme preniesli do 50 ml tekutého Trebouxia média a resuspendovali

jemným miešanim na magnetickej miešačke počas 1 hodiny. K inokulácii boli využité 15-

dňové kultúry v logaritmickej fáze rastu. Homogenita suspenzií oboch kultúr bola overená

mikroskopicky a početnosť buniek oboch kmeňov bola spočítaná pomocou Bürkerovej

komôrky. Hustota kultúr bola upravená pridaním sterilizovaného média na konštantnú

hodnotu (106 buniek v 1ml média). z každej zo suspenzií bolo 50 µl využítých jako


45

inokulum pre determináciu rastu kultúr na Trebouxia agarovom médiu a na celulózo-

acetátových diskoch. Tekuté kultúry boli inokulované 500 µl suspenzie fotobionta.

Rast na agarovom Trebouxia médiu

Agarové 3N Trebouxia médium s nutričnou koncentráciou medi bolo pripravené

podľa AHMADJIAN (1993) a porozlievané do Petriho misiek s priemerom 7 cm (pH 6,5;

objem 5 ml). Podobne bolo pripravené i 3N Trebouxia médium s prídavkom medi (4

mM. l-1; pH 6,5, objem 5 ml).

Rast na celulózo-acetátových diskoch umiestnených na povrchu agarového Trebouxia

média

Bola využitá metóda popísaná GOLDSMITH et al. (1997). Obidva typy Trebouxia

média boli pripravené podľa hore popísaného návodu. Na povrchu každej Petriho misky

(pre každý kmeň a variantu) bolo umiesnených 5 predvážených, sterilizovaných, 13-mm

celulózo-acetátových diskov. Pre stanovenie dynamiky rastu (merané po 7, 14 a 21 dňoch)

boli využité tri sady Petriho misiek. Riasy boli opatrne inokulované do prostred každého

z diskov. Na povrchu agaru každej z Petriho misiek bol umiestnený kontrolný disk (bez

inokula). Toto usporiadanie umožňovalo zistiť hydráciu diskov a odlíšiť ju od hrubej

čerstvej hmotnosti fotobionta.

Rast v tekutom Trebouxia médiu

Pripravené 3N Trebouxia médium bolo rozpipetované do Erlenmeyerových baniek

a bolo vysterilizované. Podobne bolo pripravené i médiu s prídavkom medi v celkovej

koncentrácii 0,5 mM.l-1 (vopred overené).

Rastové experimenty analyzovali: Rast na agrovom Trebouxia médiu zhodnotený

subjektívne, na základe vizuálneho pozorovania prírastku biomasy – rast bol hodnotený

ako výborný, dobrý, pomalý a zanedbateľný. Rast na celulózo-acetátových diskoch bol

posudzovaný po ich odvážení a determinovaní čistej čerstvej hmotnosti narastených

kolónií. Rast fotobionta v tekutom Trebouxia médiu bol analyzovaný na základe zistenej

hodnoty PCV (packed cell volume). Z každej suspenzie kultúry fotobionta bolo

odobraných 10 ml a scentrifugovaných v kónickej centrifugačnej skúmavke. Po

centrifugácii (2 500 rpm, 10 min.) a opatrnom odstránení supernatantu, bolo pridaných


46

ďalších 10 ml suspenzie pre následné centrifugovanie. Po zjednotení celej napestovanej

kultúry bola zaznamenaná hodnota PCV.

Aktivita iónov

Pre vypočítanie zastúpenia jednotlivých foriem a aktivity iónov Cu2+ v kultivačnom

médiu bol s výhodou použitý modelačný software GEOCHEM-PC. Vypočítané hodnoty

pre nutričnú koncentráciu medi (6,3 µM.l -1) sú: aktivita voľných Cu2+ 3,94.10-14,

koncentrácia voľných Cu2+ 6,47.10-14 mol.l-1, pre kultivačné médium s prídavkom medi

(celková koncentrácia 4 mM.l-1): aktivita voľných Cu2+ iónov 5,00.10-6 a koncentrácia

voľných Cu2+ 8,33.10-6 mol.l-1. Približne 63,5% Cu2+ bolo pevne viazané s PO42-, 32,1%

pevne viazané s OH-, 4,16% viazané v komplexoch s EDTA, 0,03% v komplexoch s OH-,

0,01% komplexne viazané s SO42- a cca. 0,21% bolo vo forme voľného kovu.

3.2.3. Svetelná mikroskopia

Rozmery buniek oboch kmeňov, kultivovaných na nutričnej a zvýšenej koncentrácii

(4 mM.l-1) medi v agarovom Trebouxia médiu, boli stanovené využitím techník svetelnej

mikroskopie. Veľkosti jódom ofarbených buniek boli stanovované v olejovej imerzii při

1000-násobnom zväčšení.

3.2.4. Stanovenie koncentrácií chlorofylu a a chlorofylu b, pomeru chlorofylov

a / b a vyjadrenie degradácie chlorofylu

Pre posúdenie vplyvu medi na obsah chlorofylov u oboch testovaných kmeňov T.

erici sme použili 21-dňové kultúry rastúce na agarovom Trebouxia médiu v kontrolnej

variante a s prídavkom medi 4 mM.l-1 (celková koncentrácia). Pre extrakciu chlorofylov

bolo použitých 20 mg (čerstvej hmotnosti) buniek fotobionta extrahovaných v 5 ml dimetyl

sulfoxidu (DMSO) s prídavkom polyvinylpyrolidónu (PVP, 2,5 mg.l-1 pre minimalizovanie

degradácie chlorofylu v priebehu extrakcie) za tmy v priebhu 1 hodiny pri 65 °C.

V prípade potreby, pre účinnejšiu extrakciu chlorofylov, bol pred inkubáciou materiál

vzorky krátko (max. 20 s) homogenizovaný pomocou ultrazvuku. Po inkubácii a ochladení

na teplotu miestnosti bol extrakt zriedený v pomere 1:1 s čerstvým DMSO a u výsledného

extraktu bola otestovaná turbidita pri 750 nm (vždy menej ako 0,01). U extraktov bola

zmeraná absorbancia pri 665, 648, 435 a 415 nm. Koncentrácie chlorofylu a, chlorofylu b


47

a chlorofylu a+b boli vypočítané využitím rovníc odvodených zo špecifických

absorpčných koeficientov pre čisté chlorofyly a a b (BARNES et al. 1992). Pomer

chlorofylu a/b bol využitý ako parameter pre posúdenie fyziologickej aktivity buniek rias.

Pomer optických hustôt extraktu meraných pri 435 a 415 nm (O.D. 435 / O.D. 415) bol

interpretovaný ako feofytinizačný kvocient, ktorý vyjadruje pomer chlorofylu a ku

feofytínu a. Podobne, pomer O.D. 665 nm a O.D. 665 zmeranej po acidifikácii 60 µl 1N

HCl za tmy v priebehu 10 minút, bol využitý ako parameter pre vyjadrenie špecifickej

feofytinizácie chlorofylu a.

3.2.5. Ko-tolerančné testy toxicity kovov

V testoch tolerancie boli podobným spôsobom ako meď, využité i kobalt, zinok,

kadmium a ortuť. V prípade kobaltu bola využitá výsledná koncentrácia v agarovom

Trebouxia médiu 4 mM.l-1 (v objeme média 5 ml). V prípade ostatných kovov boli využité

ich koncentrácie 1 mM.l-1 a 3 mM.l-1 (celkový objem média 5 ml).

3.2.6. Štatistická analýza

Rozdiely v odpovedi na prítomnosť medi v médiu medzi dvoma kmeňmi T. erici

boli porovnané s využitím jedno-cestnej analýzy rozptylu (multiple range tests, software

STATGRAPHICS 5.0, hranica významnosti 95% a 99% LSD).


48

3.3. CHARAKTERIZÁCIA RASTOVÝCH /PRODUKČNÝCH NÁROKOV

LIŠAJNÍKOVÝCH FOTOBIONTOV

3.3.1. Kultivácia rias v podmienkach skrížených gradientoch teploty a svetla

Pre zistenie optimálnych teplotných a svetelných podmienok pre rastu fotobionta T.

erici sme využili techniku kultivácie na skrížených gradientoch. Použili sme špeciálne

zostavené zariadenie – kultivačný stôl s termostaticky riadeným lineárnym gradientom

teploty (Labio, Praha, Česká Republika), založené na modernizácii prístupu, ktorý popísal

LUKAVSKÝ (1982), a KVÍDEROVÁ & LUKAVSKÝ (2001). Zariadenie popisuje schéma na

Obr. 8. Radiačné podmienky zabezpečovala sústava štyroch neónových trubíc (Osram,

L36W/20) zatienených pauzovacím papierom.

V experimente sme použili kultúry lišajníkových fotobiontov z rodu Trebouxia – T.

erici (čistý kmeň UTEX 911), T. irregularis (z osobnej zbierky Dr. Bačkor), presne

neurčený druh z rodu Trebouxia izolovaný z lišajníka Umbilicaria antarctica, druh zelenej

vláknitej riasy, možného lišajníkového fotobionta, Trentepohlia umbrina, druhy z rodov

Coccomyxa, Clepsormidium, a prírodnú vzorku aerofytickej zelenej riasy Desmococcus

vulgaris (determináciu rias previedol Dr. Komárek). Kultivované kmene boli zo zásobnej

kultúry (agarové BBM) prenesené do tekutého BBM3N média a jemným miešaním na

magnetickej miešačke homogenizované. Homogenizované suspenzie (celková hustota 106

– 108 buniek v 1 ml média) boli prenesené do jamiek sérologických mikrodoštičiek na

povrch agarového BBM3N média v ôsmich opakovaniach. Každá jamka obsahovala 100

µl média s 5 µl bunkovej suspenzie ako inokulum. Na kultivačnom stole bolo

rozostavených 28 mikrodoštičiek v 4 radoch po 7 (Obr. 9) a ich poloha zodpovedala

použitým úrovniam radiácie 20, 40, 60 a 80 µmol.m-2.s-1 a teplôt 0, 5, 10, 14, 18, 24 a 28

°C (integrované hodnoty pre jednotlivé doštičky). Pre zamedzenie vyschnutiu

a kontaminácii kultúr boli jamky mikrodoštičiek prekryté priľnavou priesvitnou fóliou

z polyetylénu.


49

Obr. 8. Nákres zariadenia pre kultiváciu v skrížených gradientoch teploty svetla. (1) zdroje svetla (neónové

trubice), (2) listy pauzovacieho papiera, (3) transparentný kryt, (4) buničitá vata nasiaknutá vodou, (5) sérologické mikrodoštičky, (6) vyhrievaný a (7) chladený oddiel masívnej hlíníkovej platne, (8) bočné tienidlo.

Obr. 9. Usporiadanie kultivácie rias v skrížených gradientoch teploty a svetla. (s odkrytým osvetľovacím

zariadením).


50

3.3.2. Meranie parametrov produkcie a rastu kultúr

Pre charakterizovanie optimálnych podmienok a limitov produkcie a rastu

testovaných kultúr sme použili neinvazívne metódy merania: fotogrammetrické meranie

rastu kultúr s využitím analýzy obrazu, stanovenie parametrov indukovanej fluorescencie

chlorofylu a in vivo stanovenie koncentrácie chlorofylu.

Jednotlivé série meraní boli uskutočené v postupne narastajúcom časovom rozpätí

medzi nimi, v 2., 5., 9., 15., 20., 27. a 35 deň od založenia kultivácie.

Na začiatku a na konci kultivácie bola u všetkých vzoriek stanovená O.D. pri

750 nm ako spektrofotometrický parameter množstva narastenej biomasy. Na toto meranie

bol využitý pristroj Multiscan Bichromatic (Labsystem, Helsinki, Fínsko).

Rast kultúr rias v podmienkach skrížených gradientov teploty a svetla

Pre zhodnotenie nárastu biomasy sme využili fotogrammetrické meranie rastu

kultúr s využitím analýzy obrazu. Fotogrammetrické snímky sme získavali pomocou

digitálneho fotoaparátu Olympus 5050 zo vzdialenosti 20 cm od sérologickej

mikrodoštičky. Snímky boli prenesené do počítača vo formáte JPG a analyzované

s využitím softvéru pre analýzu obrazu LUCIA 4.6 (Lucia, s.r.o., Praha, Česká Republika).

Kultúry fotobiontov pre každú jamku a sérologickú mikrodoštičku charakterizovali

hodnoty plochy narastenej kultúry a intenzity zeleného zafarbenia.

Stanovenie parametrov fotosyntetickej aktivity na úrovni primárnych fotochemických

procesov

Pre charakterizovanie fotosyntetickej aktivity fotobiontov na úrovni primárnych

fotochemických procesov vo fotosystéme II sme použili metódu zobrazenia plošnej

distribúcie indukovanej fluorescencie chlorofylu (CFI – Chlorophyll fluorescence

imaging). S využitím kinetickej fluorometrickej CCD kamery FluorCam 700MF (Photon

Systems Instruments, Brno, Česká Republika) bola zaznamenávaná pomalá (Kautského)

indukčná kinetika fluorescenčného signálu chlorofylu na celej ploche sérologickej

mikrodoštičky.

Najpr boli kultúry fotobiontov v sérologickej mikrodoštičke zatemnené počas 10

minút (táto doba bola vopred testovaná sériou meraní FV/FM). Meranie začalo vystavením

zatemnených kultúr v mikrodoštičke slabému meraciemu žiareniu (5 µmol.m-2.s-1) pre


51

určenie základnej fluorescencie chlorofylu (F0), potom boli kultúry vystavené silnému

pulzu žiarenia (950 µmol.m-2.s-1) pre stanovenie maximálneho výťažku fotochemických

procesov PS II (FV/FM). Potom boli kultúry počas 5 minút vystavené aktinickému žiareniu

(85 µmol.m-2.s-1), tak aby bol dosiahnutý rovnovážny stav fluorescencie chlorofylu (FS)

(viď Obr. ). Následne bol znovu aplikovaný saturačný pulz, ktorý umožnil stanoviť

kvantový výťažok fotochemických reakcií PS II (ΦII), koeficienty fotochemického (qP)

a nefotochemického (qN) zhášania fluorescencie chlorofylu. Ihneď po vypnutí aktinického

žiarenia bol zmeraný minimálny výťažok fluorescencie chlorofylu na ožiarenie

aklimovaných kultúrach (F0'). Následne, po 90 sekundách bol pred aplikovaním ďalšieho

saturačného pulzu zistený minimálny výťažok fluorescencie chlorofylu v priebehu

temnotnej relaxácie (F0'') a v priebehu pulzu maximálny výťažok fluorescencie chlorofylu

v priebehu temnotnej relaxácie kultúr fotobiontov (FM'') (Obr. 10).

Stanovovanie parametrov fotosyntetickej aktivity na základe meraní indukovanej

fluorescencie chlorofylu u vybraných druhov fotobiontov prebiehalo vždy za tých istých

teplotných podmienok ako kultivácia kmeňov v rámci danej sérélogickej mikrodoštičky.

Zaznamenané plošné distribúcie fluorescenčného signálu v priebehu indukovanej

kinetiky fluorescencie chlorofylu v rámci sérologických mikrodoštičiek s kultivovanými

kultúrami pre jednotlivé varianty s definovanými podmienkami teploty a PPFD boli

analyzované pomocou softvéru FluorCam 5.1 (Photon Systems Instruments, Brno, CZ).

Analýzou boli zistené jednotlivé parametre indukovanej fluorescencie chlorofylu uvedené

v Tab 1.

Štatistické spracovanie výsledkov

Zistené parametre indukovanej fluorescencie chlorofylu vo vzťahu k použitým

kultivačným podmienkam (teplota a PPFD) a dobe kultivácie boli štatisticky spracované

s využitím štatistického softvéru STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, USA)

a prezentované v podobe sérií 3D grafov.


52

Tab. 1. Parametre indukovanej fluorescencie chlorofylu využívanév experimentoch. Popísané parametre sú zhrnuté z prác GENTY et al. (1989), VAN KOOTEN & SNELL (1990), ROHÁČEK & BARTÁK (1999), SCHREIBER et al. (1995a).

Parameter Definícia Vzorec

F0 základná fluorescencia chlorofylu vyvolaná meracím pulzom na zatemenej vzorke

FM maximálna fluorescencia chlorofylu vyvolaná saturačným pulzom na predzatemnenej vzorke

FV maximálna variabilná fluorescencia chlorofylu meraná na predzatemnenej vzorke

FM – F0

FV/FM maximálny výťažok prímárnych fotochemických procesov v PS II (FM – F0)/FM

F0/FM relatívna základná fluorescencia chlorofylu vyvolaná meracím pulzom na zatemenej vzorke

F0/FM

FS fluorescencia v ustálenom stave na vzorke vystavenej aktinickému žiareniu

FM' maximálna fluorescencia chlorofylu vyvolaná saturačným pulzom na vzorke aklimovanej k aktinickému žiareniu

FV' maximálna variabilná fluorescencia chlorofylu meraná na vzorke aklimovanej k aktinickému žiareniu

FM' - FS

ΦΙΙ kvantový výťažok fotochemických reakcií v PS II (FM' - FS)/ FM'

F0' základná fluorescencia chlorofylu vyvolaná meracím pulzom na vzorke aklimovanej k aktinickému žiareniu (zmeraná tesne po jeho vypnutí)

FM'' maximálna fluorescencia chlorofylu vyvolaná saturačným pulzom na vzorke aklimovanej k aktinickému žiareniu (zmeraná po jeho vypnutí)

NPQ koeficient nefotochemického zhášania fluorescencie chlorofylu (FM - FS)/ FM'

qT+I koeficient zhášania fluorescencie chlorofylu závislý na stavových prechodoch a fotoinhibícii

(FM – FM'')/ (FM-F0)

qE koeficient energeticky závislého zhášania fluorescencie chlorofylu [1 - (FM' - F0')/(FM-F0)] – qT+I

Obr. 10. Príklad pomalej indukčnej kinetiky fluorescencie chlorofylu nameranej prístrojom FluorCam

700MF. V tabuľku uprostred sú uvedené časy, v ktorých boli determinované jednotlivé parametre indukovanej fluorescencie chlorofylu.


53

3.4. VPLYV OŽIARENOSTI A OSMOTICKÉHO STRESU NA LIŠAJNÍKOVÚ

SYMBIOTICKÚ RIASU TREBOUXIA ERICI

3.4.1. Kultivácia fotobionta

Zásobné kultúry lišajníkového fotobionta Trebouxia erici Ahmadjian boli

udržiavané ako axenická kultúra (UTEX 911) na Boldovom Bazálnom Médiu (BBM -

agar) na Petriho miskách pri 20 °C a fotoperióde 16/8 h. Médium bolo pripravené podľa

AHMADJIAN (1993). Po 2 mesiacoch kultivácie na agarovom BBM médiu boli kultúry rias

prevedené do tekutého BBM3N média (AHMADJIAN 1993) a suspendované jemným

miešaním na magnetickej miešačke počas 1 h.

3.4.2. Navodenie osmotického stresu

Kvôli aklimácii boli zásobné kultúry pred použitím na ďalšie experimenty

inkubované v tekutom prostredí počas 5 dní. Suspenzie kultúr fotobionta bola potom

prenesené do Erlenmeyerových baniek (100 ml) a hustota kultúr bola upravená pridaním

sterilného média na konštantnú hodnotu (A750nm= 0,8). Pre experimenty bola použitá

suspenzie kultúr fotobionta v kontrolnej osmoticky stresovanej variante. Pre navodenie

podmienok osmotického stresu bol použitý prídavok sacharózy do výslednej koncentrácie

2 M (osmotický potenciál Ψ=-11,35 MPa). Dosiahnutý rovnovážny stav fotosyntetických

procesov u osmoticky ovplyvnenej bunkovej suspenzie bol determinovaný opakovaným

meraním ΦII až po zistenie konštantných hodnôt (po 60 h). Pre toto meranie doby

inkubácie bol použitý modulovaný fluorometer OS-FL1 (OptiScience, Tyngsboro, USA).

3.4.3. Súbežné meranie ΦΦΦΦII a OER

Pre účely súbežného stanovovania ΦII a OER v suspenziách fotobionta (rias) bola

špeciálne navrhnutá a zostavená aparatúra (Obr. 11, 12). Pre meranie ΦII u suspenzií T.

erici bol použitý dvojmodulovaný fluorometer FL-200 (Photon Systems Instruments, Brno,

ČR) uspôsobený pre meranie tekutých vzoriek v kyvete. Expozičná kyveta (3 ml)

v meracom oddieli fluorometra bola doplnená zabudovanou kyslíkovou elektródou OC

223-B (THETA ’90, Praha, ČR) pripojenou ku počítačom ovládanému O2-metru

(Oxycorder 401, Photon Systems Instruments, Brno, ČR). Konštantná teplota suspenzie


54

fotobionta v priebehu meraní v expozičnej kyvete (24 °C) bola udržiavaná

termoregulátorom TR2000 (Photon Systems Instruments, Brno, ČR). Teplota v kyvete bola

zároveň kontrolovaná teplotnými senzormi (meď-konštantánové termočlánky, Ø =

0,45 mm) a zaznamenávaná ústredňou MiniCube (EMSI, Brno, ČR). Suspenzia fotobionta

v expozičnej kyvete bola kontinuálne miešaná pomocou magnetickej miešačky. V rámci

protokolu merania bola suspenzia fotobionta vystavovaná postupne rastúcej intenzite

ožiarenia aplikovanej pomocou poľa červených LED diód (λmax= 615 nm). Postupne boli

aplikované nasledovné intenzity radiácie (PPFD – photosynthetic photon flux density): 37,

66, 135, 270 a 500 µmol.m-2.s-1. Na konci každej 10-minútovej periódy jednotlivých

použitých PPFD bol na svetlo adaptované suspenzie fotobionta aplikovaný saturačný pulz,

s využitím poľa oranžových LED diód (λmax= 626 nm). Zo zaznamenanej fluorescencie

chlorofylu (Chl) pred saturačným pulzom bola stanovená rovnovážna hodnota výťažku

fluorescencie Chl (FS) a po aplikácii saturačného pulzu hodnota takto indukovanej

maximálnej Chl fluorescencie (FM’). Kvantový výťažok fotochemických procesov vo

fotosystéme II (ΦII) bol vypočítaný z hodnôt FM’ a FS pre všetky použité PPFD. Súbežne

s meraním indukovanej fluorescencie chlorofylu v priebehu expozícii jednotlivým PPFD

boli pre suspenzie fotobionta merané a zaznamenávané koncentrácie O2. Rýchlosť vývinu

kyslíka (OER) bola stanovená ako smernica priemerného rovnovážneho rastu koncentrácie

O2 pre každú úroveň PPFD. Potom bol vyjadrený vzájomný vzťah ΦII a OER ako aj ich

závilosť na PPFD. Uvedená procedúra bola aplikovaná na neovplyvnené (kontrolné)

a osmoticky stresované suspenzie fotobionta.

Pre charakterizovanie fotosyntetickej odpovedi suspenzií T. erici na PPFD boli

získané graficky znázornené dáta OER v závislosti na ožiarenosti preložené exponencielou

(POTVIN et al. 1990). Temnotná respirácia bola vyjadrená ako negatívna OER odvodená z

rovnice preloženej krivky, keď bola PPFD „0“. Maximum OER bolo vyjadrené ako

asymptotická hodnota k preloženej krivke za vysokej ožiarenosti.


55

Obr. 11. Schéma zapojenia aparatúry pre súbežné meranie parametrov indukovanej fluorescencie

chlorofylu a rýchlosti vývinu kyslíku

Obr. 12. Aparatúra pre súbežné meranie parametrov indukovanej fluorescencie chlorofylu a rýchlosti

vývinu kyslíku. (A) merací oddiel, uprostred expozičná kyveta s odklopeným termoregulátorom, na bočných stranách s napojeným zdrojom osvetlenia, PIN detektrom, O2 elektródou a teplotnými senzormi, zo spodu je magnetická miešačka. (B) Zostava celej aparatúry.

A

B


56

3.4.4. Parametre fluorescencie Chl vo vzťahu k osmotickému stresu

Sada parametrov Chl fluorescencie bola meraná na kontrolných a osmoticky

ovplyvnených vzorkách po 60 h inkubácie. Základné parametre (FV/FM, F0/FM, ΦII, NPQ,

pre podrobnosti viď Tab. 1) boli zistené z analýzy zaznamenaných kinetík Chl

fluorescencie podľa nasledujúceho meracieho protokolu. Na tmu adaptované (postačujúci

čas 10 min bol stanovený predtestom) vzorky boli vystavené meraciemu (slabému)

žiareniu pre stanovenie základnej fluorescencie Chl (F0). Nasledná aplikácia saturačného

pulzu umožnila vyjadriť maximálnu fotosyntetickú kapacitu PS II (FV/FM). Rovnovážna

hodnota výťažku Chl fluorescencie (FS) a maximálna fluorescencia Chl na vzorkách

adaptovaných na PPFD boli zistené (vyššie spomínaným spôsobom) pre všetky použité

PPFD. Po vypnutí aktinického žiarenia bol po 10 min. adaptácie na tmu aplikovaný

posledný saturačný pulz (maximum Chl fluorescencie predstavuje FM´´). Osobitne boli

vypočítané komponenty zhášania fluorescencie Chl, napr. energeticky závislé zhášanie

(qE), stavové prechody a fotoinhibičné zhášanie (qT+I) pre najvyššiu použitú úroveň PPFD

(500 µmol.m-2.s-1).


57

4. VÝSLEDKY

4.1. SÚHRN ZMIEN V METODIKE IZOLÁCIE A KULTIVÁCIE


Ako základ sme pri izolácii fotobiontov použili metódu diferenciálnej centrifugácie.

Metódu bolo nutné optimalizovať na podmienky použitých lišajníkov a ich fotobiontov..

Optimalizované boli rýchlosti a doby centrifugácie s cieľom získať čo najväčšie množstvo

fotobionta v čo najvyššej čistote. Postup centrifugácie bol kontrolovaný pomocou svetelnej

mikroskopie.

Diferenciálnou centrifugáciou získaná suspenzia buniek fotobionta však stále

obsahovala i keď v značne zriedenom množstve možné kontaminujúce elementy

(kvasinky, baktérie). Kvôli oddeleniu suspenzie fotobionta od týchto jednobunkových

organizmov sme zaradili prefiltrovanie izolovanej kultúry cez filter s veľkosťou pórov 11

µm, na ktorom sa zachytili väčšie bunkové štádiá vývinového cyklu riasy (zrelé materské

bunky, príp. skupiny autospór) a premývaním sterilným médiom kvôli odplaveniu

maximálneho množstva zbytkových kontaminantov. Výsledný postup izolácie je popísaný

v kapitole 3.1. Izolácia a kultivácia fotobiontov rodu Trebouxia.

Pre kultiváciu izolovaných fotobiontov bolo použité Boldovo bazálne médium

v modifikácii so zvýšeným obsahom dusíka (3N) podľa AHMADJIAN (1993).

V experimentoch s izoláciou buniek fotobionta lišajníkovej stielky sa nám podarilo

získať kultúry riasových fotobiontov z rodu Trebouxia z folióznych druhov lišajníkov

Lasallia pustulata, Umbilicaria hirsuta, Umbilicaria antarctica a kríčkovitého druhu

Usnea antarctica.


58

Obr. 13. Kultivácia lišajníkových fotobiontov na agarovom BBM médiu v Petriho miskách (A). Nárast rozteru kolónií Trebouxia erici na agarovom BBM médiu v Petriho miske po 10 týždňoch kultivácie pri 20 °C a 30 µmol.m-2.s-1 (B). Suspenzia buniek lišajníkovej symbiotickej riasy T. erici (C).


59



4.2.1. Porovnanie rastu kultúr

Rozdiely v rastovej odpovedi oboch kmeňov Trebouxia erici na vysoké

koncentrácie medi boli zjavné vo všetkých použitých testoch. Medzi divokým

a tolerantným kmeňom pri porovnaní rastu na médiu s nutričnou koncetráciou medi neboli

zjavné žiadne významné rozdiely a u oboch bol kategorizovaný ako výborný (analyzované

po 28 dňoch). Po prídavku medi (výsledná koncentrácia 4 mM.l-1) sme zaznamenali

výrazné rozdiely v raste medzi oboma použitými kmeňmi T. erici už po 8-10 dňoch

kultivácie. Rast tolerantného kmeňa bol mierne znížený v porovnaní s kontrolou a bol

zhodnotený ako výborný až dobrý. Naproti tomu, rast divokého kmeňa bol výrazne

znížený a bol hodnotený ako pomalý až zanedbateľný. Po 21 dňoch bol efekt prídavku

medi do média ešte výraznejší a rast divokého kmeňa bol výrazne obmedzený.

Na presnú kvantifikáciu rozdielov v raste medzi oboma kmeňmi bola použitá

kultivácia na celulózo-acetátových diskoch umiestnených na povrchu agarového Trebouxia

média. Rastová dynamika oboch kmeňov na agarových médiách s nutričným obsahom

medi bola porovnateľná a nevykazovala štatisticky významné rozdiely (Graf 1a). Na

médiách s prídavkom medi (výsledná koncentrácia 4 mM.l -1) boli rozdiely v raste medzi

divokým a tolerantným kmeňom viditeľné už po dvoch týždňoch kultivovania (cca. 5,1-

krát viac biomasy rias u tolerantného kmeňa, ANOVA P<0,01). Tieto rozdiely boli ešte

významnejšie po troch týždňoch, kedy bol nárast biomasy u tolerantného kmeňa až 9,9-

krát vyšší (ANOVA P<0,01, Graf 1b). Rast tolerantného kmeňa bol znížený cca. 6,1-krát

oproti kontrole, avšak rast divokého kmeňa na tom istom médiu bol redukovaný až 70-

násobne.

Hodnota PCV (packed cell volume) bol využitý ako spoľahlivý parameter pre

porovnanie vplyvu zvýšenej koncentrácie medi na rast dvoch kmeňov T. erici v tekutom

Trebouxia médiu (Graf 2). Aj keď sme v tomto prípade nesledovali rastovú dynamiku,

bolo evidentné, že po troch týždňoch kultivácie sú výrazné rozdiely v odpovedi medzi

oboma sledovanými kmeňmi vystavenými medi s koncentráciou 0,5 mM.l-1 (50 ml

celkového objemu média). Pri sledovaní rastu jak tolerantného, tak i divokého kmeňa na

médiu s nutričnou koncentráciou medi sme nezaznamenali významný rozdiel. Je


60

zaujímavé, že prídavok medi v médiu nespôsobil významnú redukciu biomasy

u tolerantného kmeňa, i keď rast divokého kmeňa na tom istom médiu bol významne

znížený (ANOVA P<0,01) cca. 4-násobne.

Tolerancia k medi u „tolerantného“ kmeňa bola zachovaná i po kultivácii na médiu

s nutričnou hladinou medi po niekoľko generácií (testované v priebehu 3 mesiacov, 3

inokulácie na čerstvé médium). Po reinokulácii na agarové médium s celkovou

koncentráciou medi 4 mM.l-1 bol rast kolónií fotobionta zhodnotený ako výborný až dobrý.


61

Graf 1. Rast divokého (p) a tolerantného (y) kmeňa fotobionta Trebouxia erici po 7, 14 a 21 dňoch kultivácie na agarovom médiu s nutričnou koncetráciou medi (6,3 µM, kontrola, A) a na médiu so zvýšenou koncentráciou medi (+4 mM, B). Hodnoty predstavujú priemer z 5 opakovaní. Chybové úsečky vyjadrujú smerodajné odchýlky. Odlišné písmená nad nimi označujú štatisticky významný rozdiel pri P<0,05 analyzovaný Turkey-ho provým testom (kritická hodnota = 4,05).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

control +0.5 mM Cu

PA

CK

ED

CE

LL V

OLU

ME

[l]

a

a

b

a

Graf 2. Hodnoty Packed cell volume (PCV) 21-dňových kultúr divokého (p) a tolerantného (y) kmeňa

Trebouxia erici kultivovaných v tekutom Trebouxia médiu (celkový objem = 50 ml) s nutričnou (6,3 µM, kontrola – control) a zvýšenou koncentráciou medi (+0,5 mM). Hodnoty predstavujú priemer z 5 opakovaní. Chybové úsečky vyjadrujú smerodajné odchýlky. Odlišné písmená nad nimi označujú štatisticky významný rozdiel pri P<0,05 analyzovaný Turkey-ho provým testom (kritická hodnota = 4,05).

0

50

100

150

200

250

300

7 14 21

TIME [days]

SA

MP

LE F

RE

SH

WE

IGH

T [m

g]

a a

aa

aa

A

0

10

20

30

40

50

7 14 21

TIME [days]S

AM

PLE

FR

ES

H W

EIG

HT

[mg]

bb c

b

c

b

B


62

4.2.2. Svetelná mikroskopia

Dôkaz pre toleranciu k medi u „tolerantného“ kmeňa T. erici pochádza

z predbežnej štúdie pomocou svetelnej mikroskopie. Neboli zistené významné rozdiely v

priemere buniek medzi divokým kmeňom (9,43 ± 1,17 µm, n=50) a tolerantným kmeňom

(9,66 ± 1,21 µm, n=50) rastúcim na agarovom médiu s nutričnou koncentráciou medi.

Prídavok medi do mmédia nespôsobil u tolerantného kmeňa významné rozdiely v priemere

buniek (10,12 ± 1,15 µm, n=50). Zistenia u divokého kmeňa boli však odlišné a štatisticky

významný (ANOVA P<0,01) nárast priemeru buniek bol zaznamenaný už po dvoch

týždňoch kultivácie (12,53 ± 1,26 µm, n=50).

Okrem toho, po dvojtýždňovej kultivácii na meďou obohatenom médiu boli

u divokého kmeňa pozorovateľné niektoré abnormálne cytologické charakteristiky.

Najvýraznejším z nich bola plazmolýza; u tolerantného kmeňa bol počet

plazmolyzovaných buniek nižší ako jedno percento (n=200), zatiaľ čo u divokého kmeňa

bol tento počet veľmi vysoký – až 56% (n=200) a niektoré z bunie navyše stratili sfarbenie.

4.2.3. Obsah chlorofylu

Analýzy obsahu chlorofylov u 21-dňových populácií výrazne podporovali našu

hypotézu o možnosti indukcie tolerancie k medi u kultúr T. erici (Graf 3). Bol analyzovaný

obsah chlorofylu a, chlorofylu b, chlorofyl a+b, pomer chlorofylov a/b, feofytinizačný

kvocient (O.D. 435 / O.D. 415) ako aj pomer O.D. 665 a O.D. 665 po acidifikácii

(špecifická feofytinizácia chlorofylu a). Neboli zistené žiadne signifikantné rozdiely

v obsahu chlorofylu a medzi tolerantným a divokým kmeňom za nutričnej koncentrácie

medi v médiu (Graf 3a). Pridanie medi do média malo za následok pokles obsahu

chlorofylu a (na 61% oproti kontrole) u tolerantných kultúr. V prípade divokého kmeňa bol

pokles obsahu chlorofylu a oveľa jasnejší (na 37,6% oproti kontrole). Rozdiely medzi

týmito dvoma kmeňmi boli vysoko signifikantné (ANOVA P<0,01). Naproti tomu,

signifikantné zmeny v obsahu chlorofylu b sme nepozorovali (Graf 3b) a výsledky pre

chlorofyl a+b boli podobné ako pre chlorofyl a (Graf 3c). V prípade kultivácie na meďou

obohatených médiách sme zistili u oboch kmeňov zmeny v pomere chlorofylov a/b (Graf

3d). V prípade tolerantného kmeňa bol tento pomer signifikantne vyšší. Pre divoký kmeň

bol tento pomer menj ako 1. Feofytinizácia chlorofylu a bola stanovená dvoma

nezávislými parametrami: O.D. 435 nm / O.D. 415 nm (Graf 3e) a O.D. 665 nm /

O.D. 665 nm po acidifikácii (Graf 3f). Pridanie medi do média malo za následok pokles


63

oboch parametrov (zvýšenú feofytinizáciu) u oboch sledovaných kmeňov. Divoký kmeň

bol štatisticky významne citlivejší k feofytinizácii chlorofylu a.

4.2.4. Ko-tolerančné testy toxicity kovov

Nepozorovali sme žiadne signifikantné rozdiely v raste medzi oboma testovanými

kultúrami T. erici po aplikácii kobaltu do média. Rast oboch kmeňov bol výrazne

obmedzený, kolónie boli malé a vykazovali stratu zelenej farby. Podobne sme

nezaznamenali signifikantné rozdiely medzi oboma kmeňmi v raste pri ko-tolerančných

testoch na médiách s prídavkom zinku, kadmia a ortuti (Graf 4).


64

0

5

10

15

20

control +4 mM Cu

CH

LOR

OP

HY

LL a [m

g.g-1

dry

wei

ght]

aa

c

b

0

2

4

6

8

control +4 mM Cu

CH

LOR

OP

HY

LL b [m

g.g-1

dry

wei

ght]

a aa

a

0

5

10

15

20

25

control +4 mM Cu

CH

LOR

OP

HY

LL a+

b [m

g.g-1

dry

wei

ght]

a

a

c

b

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

control +4 mM Cu

CH

LOR

OP

HY

LL a/b

[rel

ativ

e]

ba

d

c

0

0.5

1

1.5

control +4 mM Cu

O.D

. 435

nm

/ O

.D. 4

15 n

m [

rela

tive] a a

c

b

0

0.5

1

1.5

2

control +4 mM Cu

O.D

. 665

nm

/ O

.D. 6

65 n

m*

[rel

ativ

e]

a a

c

b

A B

C D

E F

Graf 3. Analýzy chlorofylov (A - chlorofyl a, B – chlorofyl b, C – chlorofyl a+b, D – chlorofyl a/b, E –

pomer optickej hustoty pri 435 nm / O.D.415 nm a O.D. 665 nm / O.D. 665* po okyslení 1N HCl) 21 dňových kultúr divokého (p) a tolerantného (y) kmeňa fotobionta Trebouxia erici kultivovaných na agarovom médiu s nutričnou koncetráciou medi (6,3 µM, kontrola - control) a na médiu so zvýšenou koncentráciou medi (+4 mM). Hodnoty predstavujú priemer z 5 opakovaní. Chybové úsečky vyjadrujú smerodajné odchýlky. Odlišné písmená nad nimi označujú štatisticky významný rozdiel pri P<0,05 analyzovaný Turkey-ho provým testom (kritická hodnota = 4,05).

] ]

0

10

20

30

40

control +1 mM Cu +3 mM Cu +1 mM Zn +3 mM Zn +1 mM Co +3 mM Co +1 mM Cd +3 mM Cd +1 mM Hg +3 mM Hg

DR

Y W

EIG

HT

[mg]

aa

b

a

b

ab

b c

d e

c d

d e d ddde ee e

Graf 4. Suchá biomasa 14-dňových kultúr divokého (p) a tolerantného (y) kmeňa fotobionta Trebouxia erici kultivovaného na agarovom médiu s nutričnou koncetráciou medi (6,3 µM, kontrola - control) a na médiách s prídavkom kovu v koncentráciách 1 a 3 mM. Hodnoty predstavujú priemer z 5 opakovaní. Chybové úsečky vyjadrujú smerodajné odchýlky. Odlišné písmená nad nimi označujú štatisticky významný rozdiel pri P<0,05 analyzovaný Turkey-ho párovým testom (kritická hodnota = 4,80).


66



4.3.1. Rast kultúr rias v podmienkach skrížených gradientov teploty a svetla

Pre porovnanie rastu kultúr sme využili predbežné výsledky obrazovej analýzy

fotogrammetrického stanovenia biomasy v 35. deň rastu kultúr. V skrížených gradientoch

teploty a svetla sme kultivovali tri kmene lišajníkových fotobiontov z rodu Trebouxia (T.

erici, T. irregularis, Trebouxia sp. izolovaný z lišajníka Umbilicaria antarctica), dva druhy

rias, možných lišajníkových fotobiontov (Coccomyxa sp., Trentepohlia umbrina) a dva

druhy aerofytických rias netvoriacich lišajníkovú symbiózu (Clepsormidium sp.,

Desmococcus vulgaris).

Pre druh lišajníkového fotobionta Trebouxia erici sme zistili najväčší nárast

biomasy v teplotách kultivácie od 10 do 24 °C a v ožiarenostiach pod 50 µmol.m-2.s-1

s maximom v 16 °C a 20 µmol.m-2.s-1. Výrazne obmedzený až žiadny rast sme zistili pri

teplotách pod 5 °C nezávisle na použitých intenzitách ožiarenia. Za intenzity ožiarenia nad

50 µmol.m-2.s-1 sme zhodnotili rast ako pomalý. Výsledky fotogrammetrickej analýzy rastu

kultúr podporili porovnateľné výsledky zo stanovenia O.D. pri 750 nm.

Druh T. irregularis vykazoval približne 3-násobne nižšie hodnoty nárastu biomasy

ako druh T. erici. Významnejší nárast tohto druhu sme zaznamenali v teplotách od 10 do

20 °C a ožiarenosti od 20 do 60 µmol.m-2.s-1 s maximom v okolí 18 °C a 40 µmol.m-2.s-1.

V prípade ďalšieho druhu z rodu Trebouxia izolovaného z lišajníka Umbilicaria

antarctica sme zistili najintenzívnejší rast v teplotách 5 až 20 °C a ožiarenosti pod 60

µmol.m-2.s-1. Avšak kvôli zistenej kontaminácii v závere experimentu kultúrou s optimom

rastu v okolí 24 °C a ožiarenosti nad 70 µmol.m-2.s-1 bude nutné výsledky pre tento druh

overiť. Výsledky analýzy rastu druhu z rodu Coccomyxa ukazujú na optimálne teploty

rastu 18 až 28 °C pri ožiarenosti nad 60 µmol.m-2.s-1 s maximom v 24 °C a ožiarenosti nad

70 µmol.m-2.s-1. Z toho by sa dalo vyvodiť (a podporila to i mikroskopická analýza), že

došlo ku kontaminácii kultúry Trebouxia sp. izolovanej z lišajníka práve kultúrou

Coccomyxa sp.

Výsledky pre druh Clepsormidium sp. ukazujú na teplotné optimum v okolí 28 °C

a ožiarenosti nad 80 µmol.m-2.s-1, s významneším nárastom v teplotách 5 až 28 °C naprieč

všetkými použitými ožiarenosťami.


67

Druh Desmococcus vulgaris vykázal intenzívny rast v teplotách od 22 °C

a ožiarenosti nad 60 µmol.m-2.s-1 s maximom nad použitými kultivačnými teplotami

a ožiarenosťami. V teplotách pod 18 °C a ožiarenostiach pod 40 µmol.m-2.s-1 bolo možné

rast hodnotiť ako nevýrazný až žiadny.

U druhu Trentepohlia umbrina sme zaznamenali len nízke intenzity rastu (približne

1/3) v porovnaní s ostatnými sledovanými druhmi. Z predbežných výsledkov vyplýva, že

optimum rastu tohto druhu je v rozmedzí teplôt od 10 do 20 °C a ožiarenosti nad 50

µmol.m-2.s-1 s maximom nárastu v 16 °C a ožiarenosti nad 80 µmol.m-2.s-1.

Popísované predbežné výsledky zo záveru experimentu v 35. deň kultivácie bude,

však nutné overiť na základe porovnania s ostatnými čiastkovými výsledkami v priebehu

experimentu.

4.3.2. Závislosť parametrov fluorescencie chlorofylu na teplotných a svetelných

podmienkach kultivácie

V podmienkach nízkej teploty a nízkej úrovne radiácie (PPFD) v priebehu

kultivácie sme zistili najnižšie hodnoty základného fluorescenčného pomeru (FV/FM)

u kultúr T. erici. V teplotách od 10 do 28 °C nezávisle na ožiarenosti a ožiarenosti od 60 do

80 µmol.m-2.s-1 nezávisle na teplote bola v prvých fázach experimentu zrejmá pomerne

vyrovnaná hladina FV/FM (0,13). S pribúdajúcou dobou kultivácie (po cca. 2 týždňoch) sme

zaznamenali zvýšenie FV/FM v teplotách od 13 do 24 °C a oveľa miernejšie zvýšenie

hodnôt parametru v nižších úrovniach PPFD s maximom (0,38) v okolí 16 °C a 20 µmol.m-

2.s-1 z použitých podmienok kultivácie. Po dosiahnutí tohoto stavu (po týždni kultivácie),

sa tento ďalším kultivovaním už výraznejšie nemenil.

V podmienkach teploty 14 až 26 °C a ožiarenosti pod 50 µmol.m-2.s-1 sme

zaznamenali vyrovnanú úroveň i u hodnôt kvantového výťažku fotochemických procesov

vo PS II (ΦII; 0,12; Graf. 6a). V priebehu experimentu sa tento parameter mierne menil

a v 20. deň kultivácie (Graf. 6c) dosahoval maximálnych hodnôt (0,15) pri teplote 18 °C

ožiarenosti do 50 µmol.m-2.s-1. V teplotách pod 10 °C dosahovalo ΦII extrémne nízkych

hodnôt (<0.01).

Absolútne hodnoty základnej (F0) a maximálnej (FM) indukovanej fluorescencie

chlorofylu sa s použitou úrovňou PPFD na začiatku kultivácie (Graf. 7a, 8a) pri

jednotlivých teplotách líšili len minimálne. Výraznejšie sa spomínané hodnoty menili


68

s teplotou. V rozsahu teplôt 0 až 22 °C sa hodnoty oboch parametrov zvyšovali

s následným poklesom pri teplotách nad 24 C.

Zistené hodnoty koeficientu nefotochemického zhášania fluorescencie chlorofylu

(NPQ) boli v prvých dňoch kultivácie za teplotných a svetelných podmienkach kultivácie

kultúr T. erici (Graf. 9a) pomerne nestále. Náznak závislosti na teplote je zreteľný pri

PPFD pod 40 µmol.m-2.s-1, s maximom NPQ (0,25) v okolí 18 °C za týchto ožiareností.

S postupom kultivácie bol viditeľný nárast hodnôt NPQ v teplotách od 12 do 24 °C

a ožiarenostiach pod 60 µmol.m-2.s-1 s maximom (0,59) v 18 °C a najnižšej použitej

ožiarenosti, 20 µmol.m-2.s-1 (Graf. 9c). Podobne ako u parametrov FV/FM, ΦII a FM

indukovanej fluorescencie chlorofylu bolo i NPQ za nižších úrovní PPFD (pod 50 µmol.m-

2.s-1) výraznejšie závislé na teplote.


69

Graf 5. Závislosť maximálneho výťažku primárnych fotochemických procesov v PS II (FV/FM) na teplote

a hustote toku fotosynteticky aktívneho žiarenia (PPFD) u kultúr lišajníkového fotobionta Trebouxia erici kultivovaných v skrížených gradientoch teploty a svetla. Priemerné zistené hodnoty (n ≥ 5) v druhý (A), piaty (B) a dvadsiaty deň (C) kultivácie boli s využitím metódy najmenších štvorcov preložené plošnou funkciou.

A

B

C


70

Graf 6. Závislosť kvantového výťažku fotochemických procesov v PS II (ΦΙΙ) na teplote a hustote toku

fotosynteticky aktívneho žiarenia (PPFD) u kultúr lišajníkového fotobionta Trebouxia erici kultivovaných v skrížených gradientoch teploty a svetla. Priemerné zistené hodnoty (n ≥ 5) v druhý (A), piaty (B) a dvadsiaty deň (C) kultivácie boli s využitím metódy najmenších štvorcov preložené plošnou funkciou.

B

C

A


71

Graf 7. Závislosť minimálneho výťažku fluorescencie chlorofylu zmeraného u predzatemnených vzoriek

(F0) na teplote a hustote toku fotosynteticky aktívneho žiarenia (PPFD) u kultúr lišajníkového fotobionta Trebouxia erici kultivovaných v skrížených gradientoch teploty a svetla. Priemerné zistené hodnoty (n ≥ 5) v druhý (A), piaty (B) a dvadsiaty siedmy deň (C) kultivácie boli s využitím metódy najmenších štvorcov preložené plošnou funkciou.

A

B

C


72

Graf 8. Závislosť maximálneho výťažku fluorescencie chlorofylu meraného u predzatemnených vzoriek

(FM) na teplote a hustote toku fotosynteticky aktívneho žiarenia (PPFD) u kultúr lišajníkového fotobionta Trebouxia erici kultivovaných v skrížených gradientoch teploty a svetla. Priemerné zistené hodnoty (n ≥ 5) v druhý (A), piaty (B) a dvadsiaty siedmy deň (C) kultivácie boli s využitím metódy najmenších štvorcov preložené plošnou funkciou.

C

B

A


73

Graf 9. Závislosť koeficientu nefotochemického zhášania fluorescencie chlorofylu (NPQ) na teplote

a hustote toku fotosynteticky aktívneho žiarenia (PPFD) u kultúr lišajníkového fotobionta Trebouxia erici kultivovaných v skrížených gradientoch teploty a svetla. Priemerné zistené hodnoty (n ≥ 5) v druhý (A), piaty (B) a dvadsiaty siedmy deň (C) kultivácie boli s využitím metódy najmenších štvorcov preložené plošnou funkciou.

C

B

A


74



4.4.1. Fotosyntéza vo vzťatu k radiácii

U kontrolnej suspenzie kultúry Trebouxia erici kvantový výťažok fotochemických

procesov v PS II klesal so stúpajúcou intenzitou žiarenia z 0,38 zaznamenaných v tme po

0,15 zaznamenaných pri 500 µmol.m-2.s-1(Graf 10). OER vykázala za stúpajúcej intenzity

žiarenia krivkový rast s maximom 5,06 pg(O2).(1000 buniek)-1.s-1 pri 500 µmol.m-2.s-1

(Graf 10-kontrola). U osmoticky stresovanej suspenzie boli OER a ΦII výrazne redukované

(Graf 10-2M sacharóza). ΦII so stúpajúcou radiáciou exponenciálne klesalo s plató pri

PPFD nad 300 µmol.m-2.s-1. V porovnaní s kontrolou, u osmoticky stresovaných buniek

OER dosiahla maximum [2,8 pg(O2).(1000 buniek)-1.s-1] pri 130 µmol.m-2.s-1 a pri vyšších

úrovniach PPFD vykázala OER pokles spôsobený fotoinhibíciou až po dosiahnutie

konštantnej hodnoty [0,04 pg(O2).(1000 buniek)-1.s-1] nad 300 µmol.m-2.s-1.

4.4.2. Vzájomný vzťah ΦΦΦΦII a OER

Simultánne študovaný vzájomný vzťah ΦII a OER za postupne stúpajúcej ožiarenosti

(Graf 11) bol u kontroly lineárny, naznačujúc typický klesajúci trend OER so stúpajúcim

ΦII. Maximálna zaznamenaná OER bola 5,6 pg(O2).(1000 buniek)-1.s-1 pri 500 µmol.m-2.s-

1. ΦII za tých istých radiačných podmienok dosiahol najnižšiu hodnotu (0,17). Prevaha

respiračných procesov v bunkovej suspenzii T. erici za tmy mala za následok negatívnu

OER [-3,6 pg(O2).(1000 buniek)-1.s-1]. Maximálny ΦII dosahoval v tme hodnoty 0,32.

U osmoticky stresovanej varianty boli hodnoty OER pre daný ΦII vždy nižšie ako

u kontroly. (Graf 11). Pokles OER bol zjavný v celom rozsahu ΦII. Oproti kontrole

vykázali osmoticky stresované bunkové suspenzie nelineárny vzťah medzi OER a ΦII.

Maximálna odchýlka od linearity tohto vzťahu bola zistená v podmienkach typických pre

vysoké a nízke hodnoty ΦII, t.j. za vysokej radiácie a v tme. Za tmy bola OER záporná

a vyjadrovala intenzitu temnotnej respirácie [-6,34 pg(O2).(1000 buniek)-1.s-1]. Za

rastúceho PPFD, s klesajúcim ΦII OER stúpala až po ΦII okolo 0,1 a potom OER mierne

klesala až po jej ďalšie zistené minimum (Graf 11). Pri vysokých hodnotách PPFD, OER

dosiahla nulové hodnoty, kým ΦII bolo stále detekovateľné (ΦII = 0,05).


75

4.4.3. Vplyv osmotika na parametre fluorescencie Chl

Šesťdesiat hodinová expozícia bunkovej suspenzie T.erici 2 M roztoku sacharózy

viedla k zmenám parametrov Chl fluorescencie (Tab. 2). Hodnoty FV/FM boli redukované

na 35% a redukcia kvantového výťažku fotochemických procesov v PS II dosiahla 72%

pre-expozičných hodnôt. Následkom expozície v 2 M roztoku sacharózy sa zvýšil podiel

zužitkovania absorbovanej energie svetelného kvanta v nefotochemických procesoch,

predovšetkým v energeticky závislom zhášaní Chl fluorescencie (qE). Nefotochemické

zhášanie (NPQ) bolo približne 2,5-krát vyššie ako v kontrole, qE sa zvýšilo takmer 9-

násobne. Ďalšia komponenta NPQ, qT+I, ktoré je spojené s fotoinhibíciou a stavovými

prechodmi vo fotosyntetickom aparáte (PS II, PS I), ostalo nezmenené. Osmotický stres

indukoval 23%-ný nárast F0/FM, čo poukazuje na možné štruktúrne zmeny na periférii

svetlozberných komplexov (LHC), prípadne ich odpájanie od jadra PS II.

Tab. 2. Parametre indukovanej fluorescencie chlorofylu, hodnoty pre osmoticky neovplyvnenú (kontrolnú) suspenziu a pre osmoticky stresovanú suspenziu buniek Trebouxia erici po 60 h. inkubácii v 2M roztoku sacharózy a ich porovnanie s rýchlosťou vývinu kyslíku (OER). FV/FM - maximálny výťažok prímárnych fotochemických procesov v PS II; ΦII - kvantový výťažok fotochemických reakcií v PS II meraný za PPFD 500 µmol m-2 s-1; NPQ - koeficien nefotochemického zhášania fluorescencie chlorofylu; qT+I - koeficient zhášania fluorescencie chlorofylu závislý na stavových prechodoch a fotoinhibícii; qE - koeficient energeticky závislého zhášania fluorescencie chlorofylu; F0/FM - relatívna základná fluorescencia chlorofylu vyvolaná meracím pulzom na zatemenej vzorke. Hviezdička za hodnotami znamená štatisticky významný rozdiel testovaný Studentovým t-testom pri hladine P<0.001.

Parameter Kontrola 2M sacharóza

Priemer ±S.D. Priemer ±S.D.

Fv/FM 0.381 ±0.0192 0.257 ±0.0126 *

ΦII 0.151 ±0.0072 0.043 ±0.0059 * NPQ 0.227 ±0.0381 0.567 ±0.0462 * qT+I 0.350 ±0.0604 0.365 ±0.0354 qE 0.063 ±0.0508 0.550 ±0.0145 *

F0/FM 0.606 ±0.0052 0.743 ±0.0126 *

OERmax [pg (Ο2) (1000 cells)−1 s−1] 5.07 1.39 Temnotná respirácia [pg (Ο2) (1000 cells)−1 s−1] -3.76 -6.34


76

OX

YG

EN

EV

OLU

TIO

N R

AT

E [p

g (O

2) (

1000

cel

ls)-1

s-1

]

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

II[re

lativ

e]0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 100 200 300 400 5000.0

0.1

0.2

0.3

PPFD [µmol m-2 s-1]

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

control

2 M sucrose

Graf. 10. Závislosť kvantového výťažku fotochemických reakcií vo fotosystéme II [ΦII - ■] a rýchlosti vývinu kyslíku [OER - �] na PPFD (photosynthetic photon flux density) u kontrolnej a osmoticky ovplyvnenej (2M roztok sacharózy - sucrose) suspenzie buniek Trebouxia erici. Body sú priemermi z najmenej 5 opakovaní. Smerodajná odchýlka (±) je vyjadrená chybovými úsečkami.

ΦII [relative]

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

OX

YG

EN

EV

OLU

TIO

N R

AT

E [p

g (O

2) (

1000

cel

ls)-1

s-1

]

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

Graf. 11. Rýchlosť vývinu kyslíku (OER) vo vzťahu ku kvantovému výťažku fotochemických reakcií vo fotosystéme II (ΦII) za postupne sa zvyšujúceho hustoty toku fotosynteticky aktívnej radiácie (PPFD) u bunkovej suspenzie Trebouxia erici v kontrolnej (osmoticky neovplyvnenej) variante [●] a za osmotického stresu [○]. Chybové úsečky označujú ± smerodajnú odchýlku OER (vertikálne úsečky) a ΦII (horizontálne úsečky). Body sú priemermi z najmenej 5 opakovaní.

Φ


77

5. DISKUSIA



Zmeny v rýchlosti rastu sú všeobecne považované za kľúčový bod štandardných

testov toxicity. Tento parameter je pomerne jednoduché merať a indikovať tak stres pre

mnohé chemikálie. Rôzna senzitivita voči ťažkým kovom v prostredí naprieč druhmi vedie

k rozdielom v rýchlosti rastu a je možné očakávať zmeny v druhovom zložení v rámci

komunít rastúcich v takýchto lokalitách (RAI et al. 1981, GENTER 1996).

Relatívna toxicita ťažkých kovov bola sumarizovaná v niekoľkých prehľadných

štúdiách (napr. RAI et al. 1981, REED & GADD 1989). Najbežnejšie udávané poradie

všeobecnej toxicity kovov je Hg>Cu>Cd>Ag>Pb>Zn. Relatívne pozície Cu a Cd môžu

byť navzájom zamieňané, čo bolo tiež demonštrované pre lišajníkového fotobionta

Trebouxia irregularis (BAČKOR et al. 1998). Ťažké kovy môžu vystupovať ako hlavný

činiteľ usmernenej selekcie vedúcej k vzniku ku kovom tolerantných ekotypov. Deficit

medi bol popísaný u Chlorella vulgaris a Oocystis marssonii pri koncentrácii Cu2+ < 10-16

mol.l-1. Toxické účinky medi sú všeobecne popisované pre Cu2+ v rozsahu 10-10 až 10-9

mol.l-1. U nekoľkých senzitívnych kmeňov rias bola zistená extrémna citlivosť na Cu2+

katióny v koncentráciách okolo 10-11 mol.l-1, ktoré mali na kmene reštriktíny účinok

(BATES et al. 1985).

Subjektívne porovnanie, založené výlučne na vizuálnom pozorovaní rozdielov

v raste lišajníkových fotobiontov je predovšetkým pre svoju jednoduchosť využívané

pomerne rutinne (ARCHIBALD 1977). Celulózo-acetátové disky sú ideálne pre krátkodobé

experimenty, pretože biomasu fotobionta je možné stanoviť jednoducho a pórovitosť

diskov umožňuje dostatočný prístup k živinám na celej ploche disku (GOLDSMITH et al.

1997). Hodnota PCV (packed cell volume) je všeobecne využívaný parameter

v laboratóriách rastlinných tkanivových kultúr (HÜSEMANN 1995), i keď jeho stanovenie

vyžaduje viac času i krokov postupu než stanovenie váhy celulózo-acetátových diskov.

EDTA a ďalšie organické látky môžu viazať kovy a znižovať tým ich toxicitu

(GENTER 1996). Toxicita medi je často viac závislá na aktivite voľných hydratovaných

iónov Cu 2+ v roztoku, ako na celkovej koncentrácii medi. Toxicita medi je znižovaná


78

zvýšeným pH alebo vápenatými a horečnatými soľami (RAI et al. 1981). Koncentrácia

živín (napr. fosfor vo forme fosfátov) znižuje toxicitu ťažkých kovov v širokom spektre

mikroskopických rias. Naše výledky poukazujú na rozdiely v toxicite medi medzi

kultúrami pestovanými na pevnom a v tekutom médiu, i keď množstvo v komplexoch

viazanej (detoxifikovanej) medi v rôznych médiách nedokážeme spočítať, signifikantné

rozdiely v raste medzi divokým a tolerantným kmeňom sú evidentné. Model GEOCHEM-

PC využíva rovnovážne termodynamické dáta pre predikciu iónových interakcií, ale

neberie do úvahy výmenu CO2 alebo možné spomalenia v dosahovaní chemickej

rovnováhy v biologických štruktúrach (MACFIE & WELBOURN 2000). Exponenciálne

rastúce bunky akumulujú kovy oveľa rýchlejšie ako bunky v stacionárnej fáze rastu (DE

FILIPPIS & PALLAGHY 1976) a citlivosť fytoplanktónu na kovy sa tiež znižuje so

stúpajúcim vekom kultúry (GIBSON 1972). Všetky tieto faktory, ktoré ovplyvňujú toxicitu

kovov sme v našej štúdii eliminovali paralelnou kultiváciou oboch kmeňov rovnakého

veku na chemicky totožne definovaných médiách.

Testy potvrdili, že vlastnosť tolerancie k medi sa zachováva i po kultivácii počas

niekoľkých generácií na nutričnej koncentrácii medi (testované po troch mesiacoch).

STOKES & DREIER (1981) vyselektovali na meď tolerantný kmeň Scenedesmus acutus

a TWISS et al. (1993) zistil, že tolerancia k medi sa u tohto kmeňa udržala i po 9 rokoch.

Výsledky nepodporujú hypotézu o ko-tolerancii ku kobaltu a ďalším kovom.

BAČKOR et al. (1998) zistil viacnásobnú toleranciu k medi ako i ortuti a kadmiu

u lišajníkového fotobionta T. irregularis. To je pravdepodobne dôsledok chemickej povahy

prirodzeného substrátu (polymetalické banské haldy), na ktorom populácia Cladina mitis,

zdroj fotobionta, rástla. Tolerancia k medi u T. erici bola vyselektovaná in vitro a ako

anorganický stresor bol použitý len jeden kov - meď. TWISS et al. (1993) zistil, že napriek

chemickej podobnosti kobaltu s meďou, Cu-tolerantný kmeň S. acutus nebol ko-tolerantný

ku kobaltu. MACFIE et al. (1994) publikovala hodnoty EC30 pre Chlamydomonas rinhardtii

rastúci na médiách s obsahom medi a kobaltu (EC30= koncentrácia dvojmocných iónov

kovov, ktorá znižuje hustotu riasovej suspenzie na 30% zodpovedajúcej kontrolnej riasovej

suspenzie). Je zjavné, že kobalt spôsobil rovnaký inhibičný efekt ako meď pri 18,5-

násobne vyššej koncentrácii (pri pH=5) alebo až pri 47,5-násobne vyššej koncentrácii

v médiu (pri pH=6,8). Naše výsledky poukazujú na vysokú toxicitu kobaltu u oboch

kmeňov lišajníkového fotobionta T. erici.

Zväčšenie priemeru vegetatívnych buniek divokého kmeňa po vystavení medi je

zaujímavý fenomén. Je to pravdepodobne spojené s na metabolizme nezávislou fázou


79

akumulácie medi jednotlivými časťami bunkovej steny, kde väčšia plocha povrchu dokáže

zvýšiť absorpčnú kapacitu pre viazanie medi. Tento mechanizmus pravdepodobne nieje

veľmi efektívny, ako je zrejmé z abnormlnych cytologických charakteristík

zaznamenaných u divokého kmeňa. Plazmolýza buniek fotobionta a odfarbenie chlorofylu

zistené v tejto štúdii bolo podobné efektom pozorovaným po vystavení SO2 (RAO &

LEBLANC 1966), aj keď neboli pozorované autormi spomínané hnedé bodky na

chloroplastoch. TWISS et al. (1993) zistil, že priemer buniek u na meď tolerantnáho kmeňa

S. acutus bol signifikantne menší než jeho hodnota v parentálnej populácii (UTEX 72).

Pokles obsahu chlorofylu a u rastlín po vystavení medi a ďalším kovom je pomerne

bežným fenoménom a bol pozorovaný i u lišajníkov (CONWAY 1978, CHETTRI et al. 1998).

Práve inhibícii ťažkými kovmi je možné prisudzovať redukčné účinky v priebehu

biosyntézy týchto pigmentov (DE FILIPPIS et al. 1981).

Výsledky ukazujú, že pokles obsahu chlorofylu a u tolerantného kmeňa bol

signifikantne menší ako u divokého. Meď mala významný dopad na obsah chlorofylu

indikujúc jej príjem do buniek fotobionta. To naznačuje možný mechanizmus detoxifikácie

medi v bunkách tolerantného kmeňa. Pomer chlorofylu a/b je oveľa citlivejší na zmeny ako

chlorofyl a+b (CHETRI et al. 1998) a u lišajníkov všeobecne varíruje hodnota tohto pomeru

od 2 po viac ako 4 (BELTMAN et al. 1980, CHETRI et al. 1998, BARNES et al. 1992). To je

v súlade s výsledkami získanými pre oba kmene kultivované na agaroch s nutričnou

koncentráciou medi. Po expozícii médiu s prídavko medi tento pomer u oboch kmeňov

dramaticky poklesol, i keď boli významné rozdiely v odpovedi medzi sledovanými

kmeňmi. Pomer chlorofylu a/b bol menej narušený u telerantného kmeňa. V niekoľkých

štúdiách (napr. CHETRI et al. 1998) bolo demonštrované, že pomer chlorofylu a/b je veľmi

užitočný ekofyziologický parameter pre determináciu fyziologických podmienok rastlín,

vrátane lišajníkov a ich fotobiontov. Degradácia chlorofylu (feofytinizácia) je často

využívaná ako spoľahlivý parameter v rôznych ekologických štúdiách zameraných na

vplyv znečistenia ovzdušia a ťažkých kovov na lišajníky (napr.: GARTY et al. 1993, CHETRI

et al. 1998). V tejto štúdii bol tento parameter s výhodou využitý na kvantifikáciu vplyvu

medi na dva sledované kmene T. erici.

Toxický vplyv ťažkých kovov na riasy môže zahŕňať viac ako len ireverzibilné

zvýšenie priepustnosti plazmalemy (plazmolýza) a zmeny v objeme buniek, či degradácii

fotosyntetických pigmentov spojenej s obmedzením rastu. Narušenie fotosyntetického

elektónového transportu a fotosyntetickej fixácie uhlíka, inhibícia respiračnej spotreby

kyslíka, narušenie procesov príjmu živín, inhibícia enzýmov v dôsledku vytesňovania


80

esenciálnych iónov kovov, inhibícia syntézy proteínov, abnormálny morfologický vývin

a ultraštruktúrne zmeny sú ďalšími tu nesledovanými dôsledkami vplyvu ťažkých kovov.

Je možné konštatovať, že citlivosť lišajníkov na znečistenie môže byť v priamom vzťahu

k energetickej závislosti mykobionta na fotobionte (BELTMAN et al. 1980). Resyntézne

experimenty s metal-tolerantným kmeňom fotobionta by naznačili nové aspekty

lišajníkovej tolerancie k ťažkým kovom.


81



Rast kultúr rias v podmienkach skrížených gradientov teploty a svetla

Predbežné zistenia optimálnej teploty a ožiarenosti z fotogrammmetrickej analýzy

rastu sledovaných kultúr rias z rodu Trebouxia (16-18 °C a 20-40 µmol.m-2.s-1)

korešpondujú s výsledkami získanými analýzou fluorescencie chlorofylu, pretože väčšina

parametrov fluorescencie chlorofylu charakterizujúcich fotochemické procesy fotosyntézy

dosahovala najvyšších hodnôt práve v tomto rozmedzí teploty a PPFD.

Zistené predbežné výsledky optimálnych teplotných a svetelných podmienok

kultivácie pre druhy Desmococcus vulgaris a Trentepohlia umbrina sú i napriek nutnosti

ďalšieho spresnenia hodnotné, pretože presné dáta o optimálnej teplote a ožiarenosti pri

kultivácii v laboratórnych podmienkach kultivácie týchto druhov a osobitne o rode

Trentepohlia neexistujú.

Závislosť parametrov fluorescencie chlorofylu na teplotných a svetelných podmienkach

kultivácie

Analýzu rastu kultúr pomocou fotogrammetrických metód (analýza obrazu)

výborne dopĺňa analýza parametrov indukovanej fluorescencie chlorofylu. Vyrovnaná

úroveň maximálnej kapacity fotochemických procesov v PS II v úvodnej perióde

experimentu svedčí o spoločných podmienkach zásobnej kultivácie (a aklimácii na ne)

jednotlivých vzoriek kultúr. S časom kultivácie mala na hodnoty FV/FM podstatne

výraznejší vplyv teplota kultivácie než použité PPFD.

Negatívny vplyv nízkej teploty a nízkej PPFD na efektivitu fotochemických

procesov v PS II, vyjadrenej pomocou ΦΙΙ, sa vzhľadom k narastajúcej biomase

v optimálnejších podmienkach, relatívne zvýrazňoval s postupom kultivácie.

Z analýzy nefotochemického zhášania flourescencie chlorofylu (NPQ) je zjavná

jeho pomerne vyrovnaná hladina naprieč použitými teplotami a ožiarenosťami kultivácie.

V záverečných fázach experimentu je vidieť mierny nárast hodnôt NPQ v teplotách okolo

18 °C a PPFD pod 50 µmol.m-2.s-1. Z pomerne vysokých hodnôt NPQ i v najnižšej použitej

ožiarenosti (20 µmol.m-2.s-1) je zrejmé, že sú pomerne dobre adaptované na takéto nízke


82

úrovne okolitej žiarenia. To korešponduje s doporučením AHMADJIAN (1993), ktorý pre

kultiváciu fotobiontov rodu Trebouxia udáva ožiarenosti okolo 30 µmol.m-2.s-1. KRANNER

et al. udávajú pre druh Trebouxia excentrica (izolovaný z lišajníka Cladonia vulcani)

optimálnu kultivačnú ožiarenosť 12 µmol.m-2.s-1, pričom ožiarenosti nad 15 µmol.m-2.s-1

spôsobovali zastavenie rastu a oxidatívny stres, čo sa v našom prípade nepotvrdilo.

YOSHIMURA et al. (2002) odporúča ako minimum pre dlhodobé uchovávanie kmeňov

fotobiontov rodu Trebouxia iba 5 µmol.m-2.s-1.

Relatívne stabilná úroveň qE (výsledky tu neuvedené) naznačuje, že pool pigmentov

xantofylového cyklu (ako jeden z hlavných faktorov energetického zhášania) je zrejme

dostatočne veľký a konverzia violaxanínu na zeaxantín bola podobná vo všetkých

kultivačných podmienkach, a to i za vysokých teplôt. Po dlhodobej kultivácii však

pravdepodobne dochádza k jeho vyčerpaniu predovšetkým v extrémnych podmienkach

(vyššia teplota, nízka ožiarenosť), kde má už výraznejšiu úlohu qT+I (zvýšené hodnoty

parametru v tepltách nad 24 °C za PPFD pod 30 µmol.m-2.s-1).

Nárast absolútnych hodnôt indukovanej fluorescencie chlorofylu (F0, FM) je

v priebehu kultivácie daný predovšetkým prírastkami biomasy zistenými fotogrammetricky

(analýzou obrazu) a zároveň za podmienok inhibície teplotou a svetlom je zjavný pokles

týchto parametrov.


83



Pokles ΦII, zistený u osmoticky ovplyvnenej bunkovej suspenzie Trebouxia erici je

všeobecnou odpoveďou fotosyntézy rias na osmotický stres. U rias bola podobná odpoveď

popísaná pre širokú škálu stresorov, napríklad vysoké ožiarenie (RITZ et al 1999), vysoká

teplota (SAYED & SHAHED 2000), limitovaná dostupnosť dusíka (SAYED 1998) a ťažké

kovy (KÜPPER et al. 2003), atď. Vystavenie osmotiku viedlo u T. erici k zvýšeniu F0/FM.

To je možné považovať za ukazovateľ všeobcného stresu na úrovni LHC II, ktorý môže

byť navodený rôznymi druhmi stresu, napr. teplotný stres (LOVELOCK et al. 1995),

osmotický stres (HÁJEK et al. 2004) vysoké ožiarenie (BERTAMINI & NEDUNCHEZHIAN

2004). V experimente osmoticky indukovaný pokles ΦII u T. erici poukazoval na pokles

rýchlosti fotosyntetického elektrónového transportu na membránach tylakoidov a zvýšenie

pomeru nefotochemických ciest odvodu (disipácie) absorbovanej energie žiarenia.

Z poklesu ΦII u všetkých použitých úrovní ožiarenia v tejto štúdii bolo zjavné, že

osmotický stres môže viesť k inhibícii fotochemických procesov v PS II u T. erici pri

všetkých úrovniach ožiarenia. V porovnaní s výsledkami podobného experimentu (HÁJEK

et al. 2005), dosiahnutými na úrovni stielky so symbiontom Trebouxia sp., naše výsledky

poukazujú na výraznejší pokles ΦII než boli dosiahnuté v rovnakej koncentrácii osmotika

na úrovni stielky. Dalo by sa to vysvetliť pufrovacím efektom hýfových vlákien

mykobionta, predovšetkým v rámci kôrovej vrstvy lišajníkovej stielky. Takto je možné

predpokladať nižšiu koncentráciu osmoticky aktívnych látok v riasovej vrstve lišajníkovej

stielky než u bunkovej suspenzie rias vystavenej rovnakej koncentrácii osmotika priamo.

Možno preto očakávať menej výrazný vplyv osmoticky aktívnych látok na riasy

v lišajníkovej stielke ako v bunkovej suspenzii. Trebouxia je pomerne odolná voči

osmotickému stresu. Pri prepočítaní na vodný potenciál (Ψ), použitá koncentrácia

sacharózy navodila úroveň Ψ -11,35 MPa. Čo predstavuje len mierny vodný stres

u poikilohydrických lišajníkov. BARTÁK & GLOSER (2004) domonštrovali, že lišajníkové

stielky vystavené atmosférickej dehydrácii vykázali len malý pokles pod maximálne

hodnoty ΦII pri Ψ okolo -10 MPa, kým pokles Ψ pod -10 MPa spôsobil výrazný pokles

ΦII. Podobne, CHAKIR & JENSEN (1999) zistili, že až pri Ψ pod -8 MPa nastáva zníženie

ΦII u lišajníka Lobaria pulmonaria ovplyvneného osmotikom (sacharóza, NaCl). Ďalší

príklad, že až v podmienkach nízkeho Ψ nastáva redukcia ΦII podali KAWAMITSU et al.


84

(2000), ktorý považovali vodný potenciál pod -10 MPa za kritický pre fotosyntézu

vyjadrenú ako OER.

Z výsledkov nášho experimentu vyplýva, že u nestresovanej riasovej suspenzie, je

vzťah medzi OER a ΦII lineárny. V podmienkach osmotického stresu je sledovaný vzťah

OER a ΦII nelineárny (krivkový) a bola zistená výrazne nižšia OER (v porovnaní s

kontrolou), čo by mohlo byť pripisované zníženej fotosyntetickej fixácii CO2 u stresovanej

suspenzie T. erici kvôli zvýšenej fotorespirácii. Zvlášť pri vysokých PPFD (500 µmol.m-

2.s-1) za osmotického stresu dochádzalo u T. erici k vážnemu zníženiu OER [0,04

pg(O2).(1000 buniek)-1.s-1]. Kombinovaný negatívny vplyv osmotika a intenzívneho

radiačného stresu na fotosyntézu je bežný u rias, dokonca i u osmoticky-tolerantných

druhov chalúh (RALPH 1999). Redukcia fotosyntézy je bežným fenoménom

u poikilohydrických lišajníkov, v rámci nich sú to predovšetkým symbiotické riasy, ktoré

trpia dehydráciou za suboptimálneho obsahu vody v stielke (napr. LANGE 1988, 2002,

SUNDBERG et al. 1997).

Negatívne účinky atmosferickej dehydrácie a osmotického stresu na fyziologické

a fotosyntetické procesy v stielke lišajníkov sú veľmi podobné (CHAKIR & JENSEN 1999).

Osmoticky indukovaná inhibícia PN môže byť interpretovaná ako následok poklesu

rýchlosti fotochemických a biochemických procesov vplyvom osmotického stresu (JENSEN

et al. 1999). Ak u lišajníkov poklesne obsah vody v stielke pod asimilačné optimum,

fotosyntetická aktivita je inhibovaná kvôli dopadu dehydratačných (desikačných) efektov

na metabolické procesy fotobionta. Vplyvom dehydrácie je štruktúra bunky fotobionta

(riasy alebo sinice) silne narušená hlavne kvôli kontrakcii protoplastu následkom straty

vody a zmeny v tvare chloroplastu. V dehydrovanom stave je menej absorbovanej energie

transportovanej cez PS II a nadbytok energie by mohol spôsobiť zničenie štruktúry

a funkcie PS II. Tieto zmeny vedú predovšetkým k redukcii ΦII a PN. V bunkách

poikilohydrických rastlín sa kvôli zabráneniu poškodenia PS II v priebehu

desikácie/dehydrácie aktivujú ochranné mechanizmy, ktoré zvyšujú nefotochemickú

utilizáciu prebytočnej energie, čo sa prejaví vo zvýšení parametru NPQ Chl fluorescencie

(DELTORO et al. 1998). Paralelne so zvyšovaním NPQ, rastie i kapacita karotenoidov

a antioxidantov odvádzať excitačnú energiu z energetizovaných molekúl Chl (KRANNER

2002). Aktiváciou týchto ochranných mechanizmov sa znižuje ΦII a efektivita využitia

absorbovanej energie žiarenia v Calvinovom cykle. K ďalším mechanizmom, ktoré

negatívne ovplyvňujú fotosyntézu za osmotického stresu možno zaradiť i rozsah internej


85

hotovosti (poolu) rozpusteného uhlíku (CO2 + HCO3- ), ktorá je v bunkách fotobionta

dostupná pre fotosyntetické procesy (PALMQVIST 1997). Zmenšenie tohto poolu sa môže

prejaviť v znížení intenzity fotosyntézy. Bolo zistené, že množstvo rozpusteného uhlíku je

u Trebouxia sp. pomerne malé v porovnaní s jeho množstvom u niektorých rias, napr.

Chalamydomonas reinhardtii (PALMQVIST 1997). Samozrejme, aktuálne množstvo

rozpusteného uhlíku v bunkách Trebouxia sp. závisí na rýchlosti transportu a akumulácii

CO2. Schopnosť a využitie mechanizmu koncentrrácie uhlíka (CCM) bunkami Trebouxia

sp. v dehydratovaných alebo osmoticky ovplyvnených stielkach môže byť dôležitým

faktorom ovplyvňujúcim fotosyntetickú odpoveď lišajníkov (PALMQVIST & SUNBERG

2000). Okrem toho, pokles ΦII za osmotickej dehydrácie môže byť ešte výraznejší

v prípade spolupôsobenia ďalších stresových faktorov. Dostupnosť živín pre lišajníky

a predovšetkým ich fotobionty môže mať významný vplyv na PN a produkciu biomasy, čo

bolo zistené napríklad pre dusík (DAHLMAN et al. 2003) a fosfor (LITCHMAN et al. 2003).

Pri štúdiu zmien fotosyntézy za postupne sa zvyšujúcej PPFD sme u nestresovanej

bunkovej suspenzie T. erici bola zistená lineárna závislosť vo vzťahu medzi parametrami

ΦII a OER. To svedčí o výraznej efektivite prenosu absorbovanej energie fotónu v rámci

fotochemických a biochemických procesov fotosyntézy. Linearita vzťahu medzi ΦII

a biochemickými procesmi fotosyntézy (kvantový výťažok CO2 fixácie, ΦCO2) za

zvyšujúcej sa PPFD je dobre dokumentovaná u vyšších rastlín (OBERHUBER et al. 1993).

Tento vzťah je výrazne lineárny v širokom rozsahu PPFD s malou odchýlkou od linearity

za PPFD blízko nuly, kedy predstavuje respirácia podstatnú časť celkovej výmeny CO2 (vo

vzťahu k hrubej fotosyntéze). Preto sú hodnoty ΦCO2 za nízkej PPFD u vyšších rastlín

o niečo nižšie ako tie, očakávané z lineárneho vzťahu ΦII a ΦCO2. Naproti tomu, za vysokej

úrovne PPFD podiel respirácie na hrubej fotosyntéze klesá.

U rias bola popísaná slabo krivková závislosť medzi ΦII a biochemickými procesmi

fotosyntézy. FIGUEROA et al. (2003) zistili slabo nelineárnu závislosť medzi ΦII a ΦO2

zelených makrorias Ulva rotundata a U. olivascens a u červenej riasy Porphyra leucosticta

vystavených širokému rozsahu PPFD. Slabá nelinearita mohla byť spôsobená

heterogenitou PS II vo fotosyntetickom aparáte, napríklad SCHREIBER et al. (1995b) zistil

u eukaryotickej riasy dve populácie PS II vykazujúce odlišnú efektivitu elektrónového

transportu. Nami zistené výsledky pre nestresovanú T.erici sú porovnantelné so zisteniami

FIGUEROA et al. (2003), pretože po vyjadrení našich výsledkov ako vzťah ΦII/ΦO2, bol

tento mierne nelineárny.


86

Za osmotického stresu bol analyzovaný vzťah ΦII/OER krivkový a pre jednotlivé

hodnoty ΦII sme zistili mierne nižšie hodnoty OER ako u kontroly. Nelinearita tohto

vzťahu spôsobená zníženými hodnotami OER za vysokej/nízkej PPFD, t.j. za

vysokého/nízkeho ΦII, môže byť interpretovaná ako dôsledok osmoticky indukovaného

poklesu PN. Okrem toho, negatívny efekt osmotickej aktivity sacharózy vo vysokej

koncentrácii vedie k negatívnym štruktúrnym zmenám v chloroplastoch a ich obsahu,

podobne ako popísali STOYNOVA-BAKALOVA a TONCHEVA-PANOVA (2003/4). Procesy v

osmoticky ovplyvnených chloroplastoch boli inhibované, čo sa odrazilo v zreteľnej

nelinearite vzťahu ΦII a OER.

U lišajníkov analyzovaných na úrovni stielky bola nelinearita vzťahu ΦII a ΦCO2

prezentovaná GREEN et al. (1998). Keďže optimálna hydrácia stielky je dôležitým

faktorom fotosyntézy, môžeme považovať heterogenitu v hydrácii rôznych častí stielky za

možný dôvod pre nelinearitu vzťahu ΦII/ΦCO2 u lišajníkových stielok. Ďalším dôvodom pre

nelinearitu môže byť heterogenita PS II, resp. rôzny pomer aktívnych/neaktívnych PS II

v rôznych častiach stielky. Väčšina lišajníkových druhov začína znižovať PN za

suboptimánych hodnôt vodného sýtostného deficitu (WSD), vyšších než 60% (LANGE

2002, HÁJEK et al. 2001). Pôsobenie intenzívnejšieho dehydračného stresu u lišajníkových

stielok má za následok silnú inhibíciu fotosyntetických procesov. Naproti tomu, niektorý

autori (napr. LANGE 2003b) popísali u vodou presýtených lišajníkov inhibíciu

fotosyntetických procesov, ktorú spôsobil pokles dostupnosti CO2 v dôsledku nárastu

difúzneho odporu pre CO2 vnútri stielky. Preto WSD v rozmedzí 0 – 20% môže mať

u niektorých lišajníkov inhibičný efekt na fotosyntézu.

Zistili sme, že osmotický stres inicioval nárast nefotochemického zhášania,

predovšetkým komponenty qE. Za týchto podmienok je teda menšia časť absorbovanej

energie fotónov využitá v biochemických procesoch fotosyntézy a vyšší podiel energie je

odvádzaný nefotochemickými cestami, napríklad cyklickým elektrónovým transportom

okolo PS II, Mehlerovou reakciou, vytváraním Chl – Chl dimérov, premenou violaxantínu

na zeaxantín, agregáciou LHC II a inaktiváciou OEC, ako zhrnul POSPÍŠIL (1997).

Z dosiahnutých výsledkov vyplýva, že u osmoticky dehydratovaných buniek riasového

symbionta (T. erici) je qE hlavnou zložkou NPQ.


87

6. SÚHRN A ZÁVERY

Dizertačná práca bola zameraná na štúdium fyziologických vlastností lišajníkových

symbiotických rias rodu Trebouxia. Práca si kládla za cieľ prispieť k prehĺbeniu poznatkov

o vplyve teploty, svetla, ťažkých kovov a osmotického stresu na rast a procesy primárnej

fotosyntetickej produkcie u lišajníkových fotobiontov. Za týmto účelom bolo na

pracovisku zavedených niekoľko nových metodických prístupov a náslene uskutočnená

séria experimentov,.

Po testovaní metodiky izolácie riasových fotobiontov z lišajníkov, bola na

pracovisku zavedená metóda izolácie fotobiontných rias z lišajníkov. Vo fáze selekcie

buniek rias bola využitá metóda diferenciálnej centrifugácie, doplnená o filtráciu

centrifugáciou získanej suspenzie buniek fotobionta cez mikrobiologické filtre (veľkosť

pórov 11 µm). Metodika bola optimalizovaná pre fotobionty z lišajníkov, jak s lupeňovitou

(folióznou stielkou), tak i kríčkovitou (frutikóznou) stielkou. V experimentoch s izoláciou

buniek fotobionta zo stielok lišajníkov sa nám podarilo získať kultúry riasových

fotobiontov z rodu Trebouxia z folióznych druhov lišajníkov Lasallia pustulata,

Umbilicaria hirsuta, Umbilicaria antarctica a kríčkovitého druhu Usnea antarctica.

V spojení s izoláciou lišajníkových symbiotických rias boli na pracovišti zavedené

i techniky kultivácie fotobiontných rias, jak na agarovom (pevnom), tak i v tekutom

Boldovom bazálnom médiu (BBM) a jeho modifikáciách (v rátane organického Trebouxia

média s prídavkom glukózy). Získané kultúry lišajníkových fotobiontov sú kultivované

v rôznom stupni čistoty na minerálnom BBM médiu až po získanie čistej kultúry schopnej

nekontaminovaného rastu na organickom Trebouxia médiu.

V zbierke riasových kultúr sú kultivované i kmene lišajníkových fotobiontov

Trebouxia erici a T. irregularis s vysokým stupňom čistoty získaných zo zbierky (Dr.

Bačkor).

V experimentoch s toleranciou fotobiontov voči medi boli v sérii testov

porovnávané odpovede postupnou selekciou (postupne sa zvyšujúcim selekčným tlakom

obsahu iónov Cu2+ v médiu) získaného „tolerantného“ kmeňa a „divokého“ kmeňa

lišajníkovej symbiotickej riasy Trebouxia erici. Analýzou rastu oboch kultúr i analýzou

obsahu chlorofylov boli medzi kmeňmi dokázané signifikantné rozdiely a tolerantný kmeň


88

vykazoval niekoľkonásobne lepšie charakteristiky rastu (pestovanie na celulózo-

acetátových diskoch) a produkcie (analýzy obsahu chlorofylov) i na médiách s obsahom

medi až 4 mmol.l-1 ako kmeň divoký. Výledky poukázali na rozdiely v toxicite medi medzi

kultúrami pestovanými na pevnom (obsah Cu2+ 4 mmol.l-1) a v tekutom médiu (obsah Cu2+

0,5 mmol.l-1). Testy potvrdili, že vlastnosť tolerancie k medi sa zachováva i po kultivácii

počas niekoľkých generácií na nutričnej koncentrácii medi. Výsledky nepodporujú

hypotézu o ko-tolerancii ku kobaltu a ďalším kovom zistenú BAČKOR et al. (1998)

u lišajníkového fotobionta T. irregularis. Je možné konštatovať, že citlivosť lišajníkov na

znečistenie môže byť v priamom vzťahu k energetickej závislosti mykobionta na

fotobionte (BELTMAN et al. 1980). Resyntézne experimenty s metal-tolerantným kmeňom

fotobionta by naznačili nové aspekty lišajníkovej tolerancie k ťažkým kovom.

Pre charakterizáciu rastových/produkčných nárokov lišajníkových fotobiontov bola

na pracovisku zavedená metodika kultivácie rias v podmienkach skrížených gadientov

teploty a svetla. Riasy boli kultivované v sérologických mikrodoštičkách, ktoré umožňujú

súčasné porovnanie až 8 druhov rias. Rast a primárna produkcia na úrovni PS II boli

analyzované využitím fotogrammetrie doplenenej o analýzu obrazu, metódou analýzy

indukovanej plošnej distribúcie fluorescencie chlorofylu (Chlorophyll fluorescence

imaging) v priebehu kultivácie a analýzou obsahu chlorofylu a in-vivo.

Predbežné zistenia optimálnej teploty a ožiarenosti z fotogrammmetrickej analýzy

rastu sledovaných kultúr rias z rodu Trebouxia (16-18 °C a 20-40 µmol.m-2.s-1)

korešpondovali s výsledkami získanými analýzou fluorescencie chlorofylu, pretože väčšina

parametrov fluorescencie chlorofylu charakterizujúcich fotochemické procesy fotosyntézy

dosahovala najvyšších hodnôt práve v tomto rozmedzí teploty a ožiarenosti.

Boli zistené predbežné výsledky optimálnych teplotných a svetelných podmienok

kultivácie pre druhy Desmococcus vulgaris a Trentepohlia umbrina, ktoré sú i napriek

nutnosti ďalšieho spresnenia hodnotné, pretože presné dáta o optimálnej teplote

a ožiarenosti pri kultivácii v laboratórnych podmienkach kultivácie týchto druhov

a osobitne o rode Trentepohlia neexistujú.

V najbližšom období bude prikročené k podrobnej analýze dát získaných analýzou

indukovanej fluorescencie chlorofylu a analýzou obrazu fotogrammetrických snímkov

zaznamenaných v priebehu experimentu. Bude prevedená podrobná štatistická analýza

(vrátane faktorovej analýzy) a porovnanie získných dát. V neposlednom rade budú overené

a spresnené zistenia o optimálnych teplotných a ožiarenostných podmienkach rastu a


89

primárnej produkcie na úrovni PS II, predovšetkým u druhov Desmococcus vulgaris

a Trentepohlia umbrina.

V ďalšom experimente bol analyzovaný vplyv ožiarenosti a osmotického stresu na

vzťah primárnych fotochemckých dejov na úrovni PS II a biochemických parametrov

fotosyntetickej produkcie u lišajníkového fotobionta Trebouxia erici. Bola overovaná

hypotéza o nelinearite vzťahu fotochemických a biochemických procesov fotosyntézy

u lišajníkových rias prezentovaná na úrovni stielky GREEN et al. (1998) Pre analýzu týchto

dejov u suspenzií lišajníkových symbiotických rias bol kvôli eliminácii vplyvu ďalších

faktorov (napr. kolísanie teploty) a čo najpresnejšie porovnanie fotochemických

a biochemických parametrov fotosyntézy navrhnutý a zostavený systém umožňujúci

súbežné stanovovanie parametrov indukovanej fluorescencie (prezentovaných kvantovým

výťažkom fotochemických procesov v PS II - ΦII) chlorofylu a rýchlosti vývinu kyslíku

(OER) za kontrolovaných podmienok teploty a ožiarenosti.

Z výsledkov experimentu vyplýnulo, že u nestresovanej riasovej suspenzie, je

vzťah medzi OER a ΦII lineárny. To svedčí o výraznej efektivite prenosu absorbovanej

energie fotónu v rámci fotochemických a biochemických procesov fotosyntézy.

V podmienkach osmotického stresu bol sledovaný vzťah OER a ΦII nelineárny (krivkový)

a bola zistená výrazne nižšia OER (v porovnaní s kontrolou), čo by mohlo byť pripisované

zníženej fotosyntetickej fixácii CO2 u stresovanej suspenzie T. erici kvôli zvýšenej

fotorespirácii. Zvlášť pri vysokých PPFD (500 µmol.m-2.s-1) za osmotického stresu

dochádzalo u T. erici k vážnemu zníženiu OER [0,04 pg(O2).(1000 buniek)-1.s-1]. Bolo

zistené, že osmotický stres inicioval nárast nefotochemického zhášania (NPQ),

predovšetkým komponenty qE. Z dosiahnutých výsledkov vyplynulo, že u osmoticky

dehydratovaných buniek riasového symbionta (T. erici) je práve qE hlavnou zložkou NPQ.

Je možné zhrnúť, že v protiklade s kontrolou, osmoticky stresovaná T. erici

vykazuje nelineárny vzťah ΦII a OER. Zistenú nelinearitu je dobré mať na zreteli v

terénnych ekofyziologických štúdiách lišajníkov využívajúcich výhradne techniky Chl

fluorescencie. V niektorých prípadoch, predovšetkým pri čiastočnej dehydrácii, nemôže

byť teda PN priamo odvodená od ΦII v dôsledku nepredvídateľného vzťahu medzi ΦII a PN.

Preto, pre presné zhodnotenie fotosyntetických procesov u čiastočne dehydrovaných

lišajníkov je použitie paralelného fluorometrického (ΦII) a gazometrického (PN) merania

nevyhnutnosťou.


90

7. ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY

AHMADJIAN V. (1967a) – The lichen symbiosis. Waltham, Mass. Blaisdell Publishing. 152p. AHMADJIAN V. (1967b) – A guide to the algae occurring as lichen symbionts: Isolation, culture, cultural

physiology, and identification. Phycologia. 6: 127-160. AHMADJIAN V. (1977) – Quantitative requirements and utilization of nutrients: Lichens. In: Rechcigl, J. M.

(ed.): CRC Handbook Series in Nutrition and Food. Vol. I., Cleveland, CRC Press, pp.203-215. AHMADJIAN V. (1988) – The lichen alga Trebouxia: Does it occur free-living? Plant Systematics and

Evolution, 158: 243-247. AHMADJIAN V. (1990) – Trebouxia jamesii and the question of multinucleate cells in the lichen photobiont.

Trebouxia. Lichenologist, 22: 321-324. AHMADJIAN V. (1993) – The lichen symbiosis. New York, USA: John Wiley & sons, 250p. AHMADJIAN V. & J ACOBS J.B. (1983) – Algal-fungal relationships in lichens: Recognition, synthesis and

development. In: Goff, L. J. (ed.): Algal Symbiosis. Cambridge, Cambridge University Press. 147-172. AHMADJIAN V. & JACOBS J.B. (1987) – Studies on the development of synthetic lichens. In: Peveling, E.

(ed.): Progress and Problems in Lichenology in the Eighties. Bibliotheca Lichenologica. Vol. 25. Berlin-Stuttgart, J. Cramer, pp.47-58.

ARCHIBALD P.A. (1975) – Trebouxia de Pulmaly (Chlorophyceae, Chlorococcales) and Pseudotrebouxia gen. nov. (Chlorophyceae, Chlorosarcinales). Phycologia, 14: 125-137.

ARCHIBALD P.A. (1977) – Physiological characteristics of Trebouxia (Chlorophyceae, Chlorococcales) and Pseudotrebouxia (Chlorophyceae, Chlorosarcinales). Phycologia 16: 295-300.

ARMSTRONG R.A. (1974) – A comparison of the growth-curves of the foliose lichen Parmelia conspersa determined by a cross-sectional study and by direct measurement. Environmental and Experimental Botany, 32: 221-227.

ARMSTRONG R.A. (1993) – Factors determining lobe growth in foliose lichen thalli. New Phytologist, 124: 675-679.

ASCASO C. (1980) – A rapid method for the quantitative isolation of green algae from lichens. - Annals of Botany 45: 483.

AVALOS A. & V ICENTE C. (1987) – The occurrence of lichen phenolics in the photobiont cells of Evernia prunastri. – Plant Cell Reports. 6: 74-76.

BAČKOR M. & D ZUBAJ A. (2004) – Short-term and chronic effects of copper, zinc and mercury on the chlorophyll content of four lichen photobionts and related alga. – J. Hattori bot. Lab. 95: 271-284.

BAČKOR M., HUDÁK J. & BAČKOROVÁ M. (1998) – Comparison between growth responses of autotrophic and heterotrophic populations of lichen photobiont Trebouxia irregularis (Chlorophyta) on Cu, Hg and Cd chlorides treatment. – Phyton (Horn) 38: 239-250.

BARNES J.D., BALAGUER L., MANRIQUE E., ELVIRA S., DAVISON A.W. (1992) – A reappraisal of the use of DMSO for the extraction and determination of chlorophylls a and b in lichens and higher plants. Environmental and Experimental Botany 32: 85-100.

BARTÁK , M. & G LOSER, J. (2004) – Activity of primary photosynthetic processes in some antarctic lichens and mosses at decreasing water potential of their thalli. In: Book of Abstr., SCAR, Bremen, Antarctica and the Southern Ocean in the Global System, Terra Nostra, pp.107-108.

BATES S.S., TESSIER A., CAMPBELL P.G.C. & LÉTOURNEAU M. (1985) – Zinc-phosphorus interactions and variation in zinc accumulation during growth of Chlamydomonas variabilis (Chlorophyceae) in batch culture. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 42: 86-94.

BECK A. (1999) – Photobiont inventory of a lichen community growing on heavy-metal-rich rock. Lichenologist 31: 501-510.

BELTMAN I.H., DE KOK L.J., KUIPER P.J.C. & VAN HASSELT P.R. (1980) – Fatty acid composition and chlorophyll content of epiphytic lichens and a possible relation to their sensitivity to air pollution. Oikos 35: 321-326.

BERTAMINI M. & N EDUNCHEZHIAN N. (2004) – Photosynthetic response for Vitis vinifera plants grown at different photon flux densities under field conditions. – Biol. Plant. 48: 149-152.

BOONPRAGOB K., NASH T.H. & F OX C.A. (1989) – Seasonal deposition patterns of acidic ions and ammonium to the lichen Ramalina menziesii Tayl. in Southern California. Environmental and Experimental Botany 29(2): 187-197.

BROWN D.H. & BECKETT R.P. (1984) – Uptake and effect of cations on lichen metabolism. Lichenologist 16: 173-188.


91

BROWN D.H., RAPSCH S., BECKETT A. & A SCASO C. (1987) – The effect of dessication on cell shape in the lichen Parmelia sulcata Taylor. New Phytologist. 105: 295-299.

BROWN R.M. & W ILSON R. (1968) – Electron microscopy of the lichen Physcia aipolia (Ehrh.) Nyl. Journal of Phycology. 4: 230-240.

BRYSON V. & SZYBALSKY W. (1952) – Microbial selection II. Science. 116: 45-51. BUBRICK P. & GALUN M. (1984) – Cyanobiont diversity in the Lichinaceae and Heppiaceae. Lichenologist,

16: 279-287. BUCK G.W. & BROWN D.H. (1979) – The effect of desiccation on cation location in lichens. Annals of

Botany 44: 265-277. BÜDEL B. & L ANGE O.L. (1991) – Water status of green and blue-green phycobionts in lichen thali after

hydration by water vapor uptake: Do they become turgid? Botanica Acta. 104: 345-404. CALATAYUD A., DELTORO V.I., BARRENO E. & DEL VALLE -TASCON, S. (1997) – Changes in in vivo

chlorophyll fluorescence quenching in lichen thalli as a function of water content and suggestion of zeaxanthin-associated photoprotection. – Physiologia Plantarum. 101: 93-102.

CALATAYUD A., GUERA A., FOS S. & BARRENO E. (2001) – A New Method to Isolate Lichen Algae by Using Percoll((R)) Gradient Centrifugation. Lichenologist 33: 361-366.

CHAKIR S. & JENSEN M. (1999) – How does Lobaria pulmonaria regulate photosystem 2 during progressive desiccation and osmotic water stress? A chlorophyll fluorescence study at room temperature and at 77 K. Physiologia Plantarum. 105: 257-265.

CHETTRI M.K., COOK C.M., VARDAKA E., SAWIDIS T. & L ANARAS T. (1998) – The effect of Cu, Zn and Pb on the chlorophyll content of the lichens Cladonia convoluta and Cladonia rangiformis. Environmental and Experimental Botany 39: 1-10.

CHIDA Y. & U EDA K. (1991) – Division of chloroplasts in a green alg, Trebouxia potteri. Annals of Botany. 67: 435-442.

COLLINS C.R. & FARRAR J.F. (1978) – Structural resistances to mass transfer in the lichen Xanthoria parietina. New Phytologist 81: 71-83.

CONWAY H.L. (1978) – Sorption of arsenic and cadmium and their effects on growth, micronutrient utilization, and photosynthetic pigment composition of Asterionella formosa. Journal of the Fisheries Board of Canada 35: 286-294.

CZEHURA S.J. (1977) – A lichen indicator of copper mineralization, Lights Creek district, PlumasCounty, Californian Economy and Geology 72: 796-803.

CZECZUGA B., CZECZUGA -SEMENIUK E., GALUN M. & M UKHTAR A. (2004) – Pigmentation changes in Xanthoria parietina (L.) Th. Fr. – J. Hattori bot. Lab. 95: 293-300.

DAHLMAN L., PERSSON J., NÄSHOLM T., PALMQVIST K. (2003) – Carbon and nitrogen distribution in the green algal lichens Hypogymnia physodes and Platismatia glauca in relation to nutrient supply. Planta 217: 41-48.

DELTORO V.I., CALATAYUD A., GIMENO C. & BARRENO E. (1998) – Water relations, chlorophyll fluorescence, and membrane permeability during desiccation in bryophytes from xeric, mesic, and hydric environments. – Can. J. Bot. 76: 1923-1929.

DE FILIPPIS L.F., HAMPP R. & Z IEGLER H. (1981) – The effects of sublethal concentrations of zinc, mercury and cadmium on Euglena. Growth and pigments. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie 101: 37-47.

DE FILIPPIS L.F. & PALLAGHY C.K. (1976) – The effect of sub-lethal concentrations of mercury and zinc on Chlorella. I. Growth characteristics and uptake of metals. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie 78: 197-207.

DREW E.A. & SMITH D.C. (1967) – Studies in the physiology of lichens. VIII. Movement of glucose from alga to fungus during photosynthesis in the thallus of Peltigera polydactyla. New Phytologist. 66: 389-400.

ETTL H. & G ÄRTNER G. (1984) – About the significance of cytology in the taxonomy of algae, demonstrated in Trebouxia (Chlorellales, Chlorophyceae). Plant Systematics and Evolution, 148: 135-147.

ETTL H. & G ÄRTNER G. (1995) – Syllabus der Boden-, Luft- und Flechtenalgen. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart., pp.721.

FIECHTER E. & H ONEGGER R. (1988) – Seasonal variation in the fine structure of Hypogymnia physodes (lichenized Ascomycetes) and its Trebouxia photobiont. Plant Systematics and Evolution. 158: 249-263.

FIGUEROA F.L., CONDE-ALVAREZ R. & GOMEZ I. (2003) – Relations between electron transport rates determined by pulse amplitude modulated chlorophyll fluorescence and oxygen evolution in macroalgae under different light conditions. – Photosynth. Res. 75: 259-275.

FISHER K.A. & L ANG N.J. (1971) – Comparative ultrastructure of cultured species of Trebouxia. Journal of Phycology. 7: 155-165.


92

FOX C.H. (1967) – Studies of the cultural physiology of the lichen alga Trebouxia. Physiologia Plantarum. 20: 251-262.

FRANCOLINI I., NORRIS P., PIOZZI A., DONELLI G. & STOODLEY P. (2004) – Usnic acid, a natural antimicrobial agent able to inhibit bacterial biofilm formation on polymer surfaces. Antimicrobial agents and chemotherapy 48(11): 4360-4365.

FRIEDL T. 1989a. – Comparative ultrastructure of pyrenoids in Trebouxia (Microthamniales, Chlorophyta). Plant Systematics and Evolution. 164: 145-159.

FRIEDL T. (1989b) – Systematic und Biologie von Trebouxia (Microthamniales, Chlorophyta) als Phycobiont der Parmeliaceae (lichenisierte Ascomyceten). Inaugural disertacion, Bayreuth, Universität Bayreuth.

FRIEDL T. & G ÄRTNER G. (1988) – Trebouxia (Pleurastrales, Chlorophyta) as a phycobiont in the lichen genus Diploschistes. Archiv Für Protistenkunde. 135: 147-158.

GADD G.M. (1988) – Accumulation of metals by microorganisms and algae, In: Rehm, H.J., (ed.): Biotechnology-A Comprehensive Treatise, Vol. 6b, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, pp.401-434.

GALLE L. (1968) – The xerothermic lichen species Cladonia magyarica Vain. A Mora Frenc Muzeum Evkonyve [Szeged]. 1968: 237-268.

GÄRTNER G. (1985) – Die Gattung Trebouxia Puymaly (Chlorellales, Chlorophyceae). Archiv für Hydrobiologie, Supplement. Algological Studies. 41: 495-548.

GARTY J., KARARY Y. & H AREL J. 1993. – The impact of air pollution on the integrity of cell membranes and chlorophyll in the lichen Ramalina duriaei (De Not.) Bagl. transplanted to industrial sites in Israel. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 24: 455-460.

GAUSLAA Y. (2005) – Lichen palatability depends on investments in herbivore defence. Oecologia 143:94-105.

GAUSLAA Y. & SOLHAUG K.A. (2004) – Photoinhibition in lichens depends on cortical characteristics and hydration. Lichenologist 36(2): 133-143

GENTER R.B. (1996) – Ecotoxicology of inorganic chemical stress to algae. In: Stevenson RJ, Bothwell ML, Lowe RL. eds. Algal ecology. San Diego, USA: Academic Press, pp.403- 468.

GENTY B., BRIANTAIS J.-M. BAKER N.R. (1989) – The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron-transport and quenching of chlorophyll fluorescence. – Biochim. biophys. Acta 990: 87-92.

GIBSON C.E. (1972) – The algicidal effect of copper on a green and blue-green alga and some ecological implications. Journal of Applied Ecology 9: 513-518.

GOLDSMITH S.J., THOMAS M.A. & G RIES C. (1997) – A new technique for photobiont culturing and manipulation. Lichenologist 29: 559-569.

GOYAL R. & SEAWARD M.R.D. (1981) – Metal uptake in terricolous lichens. 1. Metal localization within the thallus. New Phytologist 89: 631-645.

GOYAL R. & SEAWARD M.R.D. (1982) – Metal uptake in terricolous lichens. 3. Translocation in the thallus of Peltigera canina. New Phytologist 90: 85-98.

GREEN T.G.A., SCHROETER B., KAPPEN L., SEPPELT R.D. & M ASEYK K. (1998) – An assessment of the relationship between chlorophyll a fluorescence and CO2 gas exchange from field measurements on a moss and lichen. Planta 206: 611-618, 1998.

HÁJEK J. (2002) – Fotosyntetická odezva stélek lišejníků k dehydrataci a nízké teplotě detekovaná pomocí fluorescence chlorofylu. Disertační práce.

Hájek J., Barták M. & Gloser J. (2001) – Effects of thallus temperature and hydration on photosynthetic parameters of Cetraria islandica from contrasting habitats. Photosynthetica 39: 427-435, 2001.

HÁJEK J., BARTÁK M. & D UBOVÁ J. (2005) – Inhibition of photosynthetic processes in foliose lichens induced by temperature and water stress. Biologia Plantarum. – submitted.

HALE M.E. (1973) – Growth. In: Ahmadjian V., Hale M.E. (eds.): The Lichens. London: Academic Press, pp.473-492.

HALL J., HEALEY F.P. & ROBINSON G.G.C. (1989) – The interaction of chronic copper toxicity with nutrient limitation in two chlorophytes in batch culture. Aquatic Toxicology. 14: 1-14.

HEBER U., BILGER W., BLIGNY R. & L ANGE O.L. (2000) – Phototolerance of lichens, mosses and higher plants in an alpine environment: analysis of photoreactions. Planta 211: 770-780.

HICKMOTT M. (1980) – Lichens on lead. Lichenologist 12: 404-406. HILDRETH K.C. & A HMADJIAN V. (1981) – A study of Trebouxia and Pseudotrebouxia isolates from

different lichens. Lichenologist. 13: 65-86. HONEGGER R. (1991) – Functional aspects of lichen symbiosis. Annual Rewiew of Plant Physiology and

Plant Molecular Biology, 42: 553-578. HONEGGER R. (1993) – Developmental biology of lichens. Transley Review No. 60. New Phytologist, 125:

659-677.


93

HÜSEMANN W. (1995) – Establishment of photoautrophic cell cultures. In: Lindsey K, (ed.): Plant tissue culture manual, Supplement 5, Section H. Dordrecht, Netherlands: Kluwer Academic Publishers, pp.1-30.

HYVÄRINEN M. & C RITTENDEN P.D. (1998) – Growth of the cushion-forming lichen, Cladonia portentosa, at nitrogen-polluted and unpolluted heathland sites. Environmental and Experimental Botany, 40: 67-76.

JACOBS J.B. & AHMADJIAN V. (1971) – The ultrastructures of lichens. II. Cladonia cristella: The lichen and its isolated symbionts. Journal of Phycology. 7: 71-82.

JENSEN M., CHAKIR S. & FEIGE G.B. (1999) – Osmotic and atmospheric dehydration effects in the lichens Hypogymnia physodes, Lobaria pulmonaria, and Peltigera aphthosa: an in vivo study of the chlorophyll fluorescence induction. Photosynthetica. 37: 393-404.

KANTZ T.S., THERIOT E.C., ZIMMER E.A. & CHAPMAN R.L. (1990) – The Pleurastrophyceae and Micromonadophyceae: A cladistic analysis of nuclear ribosomal RNA sequence data. Journal of Phycology, 26: 711-721.

KAPPEN L. (1981) – Ecological significance of resistance to high temperature. In: Lange O.L., Nobel P.S., Osmond C.B., Ziegler H. (eds.): Physiological Plant Ecology, vol. I. Responses to the Physical Environment. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlang, pp.439-473.

KAPPEN L. (1983) – Ecology and physiology of the Antarctic fruticose lichen Usnea sulphurea (Koenig) Th. Fries. Polar Biology. 1: 249-255.

KAPPEN L. (1989) – Field measurements of carbon dioxide exchange of the Antarctic lichen Usnea sphacelata in the frozen state. Antarctic Science, 1: 31-34.

KAPPEN L. (1993a) – Lichens in the Antarctic region. In: Friedmann E.I. (ed.): Antarctic Microbiology. New York: Wiley-Liss, pp.433-490.

KAPPEN L. (1993b) – Plant activity under snow and ice, with particular reference to lichens. Arctic. 46: 297-302.

KAPPEN L., SOMMERKORN M. & SCHROETER B. (1995) – Carbon acquisition and water relations of lichens in polar regions – potentials and limitations. Lichenologist. 27: 531-545.

Kawamitsu Y., Driscoll T. & Boyer J.S. (2000) – Photosynthesis during desiccation in an intertidal alga and a land plant. Plant Cell Physiology. 41: 344-353.

K INRAIDE W.T.B. & A HMADJIAN V. (1970) – The effects of usnic acid on the physiology of two cultured species of the lichen alga Trebouxia Puym. Lichenologist, 4: 234-247.

KOMÁREK J. & RŮŽIČKA J. (1969) – Effect of temperature on the growth and variability of Scenedesmus quadricauda (Turp.) Bréb. In: Studies in Phycology. Academia, Prague, pp.262-292.

KÖNIG J. & PEVELING E. (1980) – Vorkommen von Sporopollenin in der Zellwand des Phycobionten Trebouxia. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 98: 459-464.

KÖNIG J. & PEVELING , E. (1984) – Cell walls of the phycobionts Trebouxia and Pseudotrebouxia: Constituents and their localozation. Lichenologist. 16: 129-144.

KRANNER I. (2002) – Glutathione status correlates with different degrees of desiccation tolerance in three lichens. New Phytol. 154: 451-460.

KÜPPER H., ŠETLÍK I., ŠETLÍKOVÁ E., FERIMAZOVÁ N., SPILLER M. & K ÜPPER F.C. (2003) – Copper-induced inhibition of photosynthesis: limiting steps of in vivo copper chlorophyll formation in Scenedesmus quadricauda. – Funct. Plant Biology. 30: 1187-1196.

KVÍDEROVÁ J. & L UKAVSKÝ J. (2001) – A new unit for crossed gradients of temperature and light. In: Elster, J., Seckbach, J., Vincent, W.F., Lhotský, O. (eds.). Algae and extreme environments: Ecology and physiology. Nova Hedvigia Beih. 123: 541-550.

LAMB I.M. (1970) – Antarctic terestrial plants and their ecology. In: Holdgate, M. W. (ed.): Antarctic Ecology. Vol. 2. New York, Academic Press. pp.733-751.

LAMBRIGHT D.D. & TUCKER S.C. (1980) – Observation on the ultrastructure of Trypethelium eluteriae Spreng. Bryologist. 83: 170-178.

LANGE O.L. (1988) – Ecophysiology of photosynthesis: Performance of poikilohydric lichens and homoiohydric mediterranean sclerophylls. – Journal of Ecology. 76: 915-937.

LANGE O.L. (2002) – Photosynthetic productivity of the epilithic lichen Lecanora muralis: Long-term field monitoring of CO2 exchange and its physiological interpretation - I. Dependence of photosynthesis on water content, light, temperature and CO2 concentration from laboratory measurements. – Flora 197: 233-249.

LANGE, O.L. (2003a) – Photosynthetic productivity of the epilithic lichen Lecanora muralis: Long-term field monitoring of CO2 exchange and its physiological interpretation - II. Diel and seasonal patterns of net photosynthesis and respiration. Flora 198: 55-70.

LANGE O.L. (2003b) – Photosynthetic productivity of the epilithic lichen Lecanora muralis: Long-term field monitoring of CO2 exchange and its physiological interpretation - III. Diel, seasonal, and annual carbon budgets. Flora 198: 277-292.


94

LANGE O.L., BILGER W., RIMKE S. & SCHREIBER U. (1989) – Chlorophyll fluorescence of lichens containing green and blue-gree algae during hydration by water vapour uptake and by addition of liquid water. Botanica acta. 102: 306-313.

LANGE O.L., BÜDEL B., ZELLNER H., ZOTZ G. & M EYER A. (1994) – Field measurements of water relations and CO2 exchange of tropical, cyanobacterial basidiolichen Dictyonema glabratum in a Panamian Rainforest. Botanica Acta. 107: 279-290.

LANGE O.L. & M ATTHES U. (1981) – Moisture-dependent CO2 exchange of lichens. Photosynthetica. 15: 555-574.

LANGE O.L. & Z IEGLER H. (1963) – Der Schwermetallgehalt von Flechten aus dem Acarosporetum sinopicae auf Erzschlackenhalden des Harzes. I. Eisen und Kupfer. Mitteil. Der Florist-soziologische. Arbeitsgemeinschaft, N.F. 10: 156-183.

LARSON D.W. (1987) – The absorption and release of water by lichens. Bibliotheca Lichenologica. 25: 351-360.

LAWREY J.D. (1986) – Biological role of lichen substances. The Bryologist. 89: 111-122. L ICHTENTHALER H.K. (1968) – Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27: 144-149. L IŠKA J. (2000) – Vázaný a nevázaný život lišejníků. Lichenizace jako příklad úspěšné strategie. Vesmír. 79:

623-631. L ITCHMAN E., STEINER D. & BOSSARD, P. (2003) – Photosynthetic and growth responses of three

freshwater algae to phosphorus limitation and daylength. Freswater Biology. 48: 2141-2148. LOVELOCK C.E., JACKSON A.E., MELICK D.R. & SEPPELT R.D. (1995) – Reversible photoinhibition in

antarctic moss during freezing and thawing. Plant Physiology. 109: 995-961. LUKAVSKÝ J. (1982) – Cultivation of chlorococcal algae in crossed gradients of temperature and light.

Algological studies. 29: 517-528. MACFIE S.M., TARMOHAMED Y. & W ELBOURN P.M. (1994) – Effects of cadmium, cobalt, copper, and

nickel on growth of the green alga Chlamydomonas reinhardtii: The influence of the cell wall and pH. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 27: 454-458.

MACFIE S.M. & WELBOURN P.M. (2000) – The cell wall as a barrier to uptake of metal ions in the unicellular green alga Chlamydomonas reindhardtii (Chlorophyceae). Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 39: 413-419.

MACKENZIE T.D.B. & CAMPBELL D.A. (2001) – Evidence for wavelength-dependent light screening of cyanobionts and phycobionts in Lobaria during dehydration. Symbiosis 30: 57-70.

MATTHEWS S.W., TUCKER S.C. & CHAPMAN R.L. (1989) – Ultrastructural features of mycobionts and trentepohliaceous phycobionts in selected subtropical crustose lichens. Botanical Gazette. 150: 417-438.

MATTOX K.R. & STEWART K. D. (1984) – Classification of green algae: A concept based on comparative cytology. In: Irvine D.E.G. (ed.): Systematics of the Green Algae. Systematics Associations Special, London, Academic Press, pp.29-72

McCoy G.A. (1978) – Nutritional, morphological, and physiological characteristics of Trentepohlia (I.U. 1227) in axenic culture on defined media. Oregon State University. University Microfilms International, Ann Arbor, Michigan, 1981.

MELKONIAN M. & P EVELING E. (1988) – Zoospore ultrastructure in species of Trebouxia and Pseudotrebouxia (Chlorophyta). Plant Systematics and Evolution. 158: 183-210.

MEIER J.L. & C HAPMAN R.L. (1983) – Ultrastructure of the lichen Coenogonium interplexum Nyl. American Journal of Botany. 70: 400-407.

MUIR P.S., SHIRAZI A.M. & P ATRIE J. (1997) – Seasonal growth dynamics in the lichen Lobaria pulmonaria. Bryologist. 100: 458-464.

NAKANO T. (1971a) – Some aerial and soil algae from the Ishizuchi mountains. Hikobia. 6: 139-152. NAKANO T. (1971b) – Subaerial algae of Patagonia, South America I. Bulletin Biological Society of

Hiroshima University. 38: 2-12. NASH T.H. (1975) – Influence of effluents from a zinc factory on lichens. Ecological Monography 45: 183-

198. NASH T.H. (1989) – Metal tolerance in lichens. In: Shaw AJ, (ed.) Heavy metal tolerance in plants:

Evolutionary aspects. Boca Raton, USA: CRC Press, pp.119-131. NASH T.H. (1996) – Photosynthesis, respiration, productivity and growth. In: Nash T.H. (ed.): Lichen

biology. Cambridge: Cambridge University Press, pp. 88-120. NIEBOER E., RICHARDSON D.H.S. & TOMASSINI F.D. (1978) – Mineral uptake and release by lichens: an

overview. The Bryologist. 81: 226-246. OCAMPO-FRIEDMAN R., MEYER M.A., CHEN M. & F RIEDMANN E.I. (1988) – Temperature response of

Antarctic cryptoendolithic photosynthetic microorganisms. Polarforschung. 58: 121-124. OBERHUBER W., DAI Z.-Y. & E DWARDS G. (1993) – Light dependence of quantum yields of photosystem 2

and CO2 fixation in C3 and C4 plants. Photosynthesis Research. 35: 265-274.


95

OPANOWICZ M. & G RUBE M. (2004) – Photobiont genetic variation in Flavocetraria nivalis from Poland (Parmeliaceae, Lichenized Ascomycota). Lichenologist. 36: 125-162.

ORUS M.I. & E STÉVEZ M.P. (1984) – Isolation of Evernia prunastri (L.) Ach. Phycobiont . Study of its response to climatic variables and ecological significance. Cryptogamic Bryology and Lichenology. 5: 373-387.

PALMQVIST K. (1993) – Photosynthetic CO2- use efficiency in lichens and their isolated photobionts: The possible role of a CO2- concentrating mechanism. Planta. 191: 48-56.

PALMQVIST K. (2001) – Carbon economy in lichens. New Phytologist. 148: 11-36. PALMQVIST K., DE LOS RIOS A., ASCASO C. & SAMUELSSON G. (1997) – Photosynthetic carbon acquisition

in the lichen photobionts Coccomyxa and Trebouxia (Chlorophyta). Physiologia Plantarum. 101: 67-76. PALMQVIST K., CAMPBELL D., EKBLAD A., JOHANSSON H. (1998) – Photosynthetic capacity in relation to

nitrogen content and its partitioning in lichens with different photobionts. Plant Cell and Environment. 21: 361-372.

PALMQVIST K. & SUNDBERG B. (2000) – Light use efficiency of dry matter gain in five macrolichens: Relative impact of microclimate conditions and species-specific traits. Plant Cell and Environment. 23: 1-14.

PETERSON H.G., HEALEY F.P. & WAGEMANN R. (1984) – Metal toxicity to algae: a highly pH dependent phenomenon. Canadian Journal of Fish. Aquatic Science 41: 974-979.

PEVELING E. & K ÖNIG J. (1985) – Differences in formation of vegetative cells and their walls in Trebouxia and Pseudotrebouxia as further evidence for the classification of these genera. Lichenologist. 17: 281-287.

PEVELING E. & ROBENEK H. (1980) – The plasmalemma structure in the phycobiont Trebouxia at different stages of humidity of a lichen thallus. New Phytologist. 84: 371-374.

POSPÍŠIL P. (1997) – Mechanisms of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching in higher plants. Photosynthetica. 34: 343-355.

POTVIN C., LECHOWICZ M.J. & T ARDIF S. (1990) – The statistical analysis of ecophysiological response curves obtained from experiments involving repeated measures. Ecology 71: 1389–1400.

Purvis O.W. (1984) – The occurrence of copper oxalate in lichens growing on copper sulphide-bearing rocks in Scandinavia. Lichenologist 16: 197-204.

PURVIS O.W. & H ALLS C. (1996) – A review of lichens in metal-enriched environments. Lichenologist 28: 571-601.

PURVIS O.W. & JAMES P.W. (1985) – Lichens of the Coniston copper mines. Lichenologist 17: 221-237. PURVIS O.W. & W EDIN M. (1999) – Le succès tout terrain des lichens. La Recherche. 317: 96-99. RAI L.C., GAUR J.P. & KUMAR H.D. (1981) – Phycology and heavy-metal pollution. Biological Review of

the Cambridge Philosophical Society 56: 99-151. RALPH P.J. (1999) – Photosynthetic response of Halophila ovalis (R. Br.) Hook. f. to combined

environmental stress. Aquatic Botany. 65: 83-96. REMMER S. B., AHMADJIAN V. & L IVDAHL T.P. (1986) – Effects of IAA (indole-3-acetic acid) and kinetin

(6-furfurylamino-purine) on the synthetic lichen Cladonia cristella and its isolated symbionts. Lichen Physiology and Biochemistry. 1: 1-25.

RAO D.N. & L EBLANC F. (1966) – Effects of sulfur dioxide on the lichen algae, with special reference to chlorophyll. The Bryologist. 69: 69-75.

RASCHER U., LAKATOS M., BÜDEL B. & L UTTGE U. (2003) – Photosynthetic field capacity of cyanobacteria of a tropical inselberg of the Guiana Highlands. European Journal of Phycology. 38: 247-.

RAVINSKAYA A.P. & VEINSTEIN E.A. (1976) – The influence of lichen extracts and lichen acids on algae. Botanicheskii Zhurnal [in Russian with English summary] . 61: 1410-1416.

REED R.H. & GADD G.M. (1989) – Metal tolerance in eukaryotic and prokaryotic algae. In: Shaw AJ, (ed.) Heavy metal tolerance in plants: Evolutionary aspects. Boca Raton, USA: CRC Press, 105-118.

RENHORN K.-E., ESSEEN P.-A., PALMQVIST K. & SUNDBERG B. (1997) – Growth and vitality of epiphytic lichens: I. Response to microclimate along a forest edge-interior gradient. Oecologia. 109: 1-9.

RHOADES F.M. (1977) – Growth rates of Lobaria oregana as determined from sequential photographs. Canadian Journal of Botany. 55: 2226-2233.

RICHARDSON D.H.S. & SMITH D.C. (1968) – Lichen physiology. X. The isolated algal and fungal symbionts of Xanthoria aureola. New Phytologist 67: 69-77.

RITZ M., NEVEROV K.V. & E TIENNE A.L. (1999) – Delta pH-dependent fluorescence quenching and its photoprotective role in the unicellular red alga Rhodella violacea. Photosynthetica 37: 267-280.

ROHÁČEK K. & B ARTÁK M. (1999) – Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: Basic concepts, useful parameters, and some applicatons. Photosynthetica 37: 339-363.


96

ROMAGNI J.G., MEAZZA G., NANAYAKKARA N.P.D. & DAYAN F.E. (2000) – The phytotoxic lichen metabolite, usnic acid, is a potent inhibitor of plant p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase. FEBS Letters 480 (2-3): 301-305.

ROMEIKE J., FRIEDL T., HELMS G. & OTT S. (2002) – Genetic diversity of algal and fungal partners in four species of Umbilicaria (lichenized Ascomycetes) along a transect of the Antarctic peninsula. Molecular Biology and Evolution. 19: 1209-1217.

SASS L., CSINTALAN Z., TUBA Z. & V ASS I. (1995) – Changes in photosystem II activity during desiccation and rehydration of the desication tolerant lichen Cladonia convoluta studiet by chlorophyll fluoroscence. In: Mathis, P. (ed.): Photosynthesis: from Light to Biosphere, Kluwer Academic Publishers. 4: 553-556.

SACKS L.E. (1956) – A pH gradient agar plate. Nature. 4527: 269-270. SAYED O.H. (1998) – Analysis of photosynthetic responses and adaptation to nitrogen starvation in chlorella

using in vivo chlorophyll fluorescence. Photosynthetica 35: 611-619. SAYED O.H. & EL-SHAHED A.M. (2000) – Growth, photosynthesis and circadian patterns in Chlorella

vulgaris (Chlorophyta) in response to growth temperature. Cryptogamie Algologie. 21: 283-290. SEAWARD M.R.D. & R ICHARDSON D.H.S. (1989) – Atmospheric sources of metal pollution and effectson

vegetation. In: Shaw AJ, (ed.): Heavy metal tolerance in plants: Evolutionary aspects.Boca Raton, USA: CRC Press, pp.75-92.

SHOWMAN R.E. (1972) – Photosynthetic response with respect to light in three strains of lichen algae. Ohio Journal of Science. 72: 114-117.

SCHOFIELD E. & A HMADJIAN V. (1972) – Field observation and laboratory studies of some Antarctic cold desert cryptogams. In: Llano, G. A. (ed.): Antarctic Terrestrial Biology. Vol. 20. American Geophysical Union, Washington, D. C. pp.97-142.

SCHROETER B., GREEN T.G.A., KAPPEN L. & SEPPELT R.D. (1994) – Carbon dioxide exchange at subzero temperatures. Field measurements on Umbilicaria aprina in Antarctica. Cryptogamic Botany. 4: 233-241.

SCHREIBER U., BILGER W. & N EUBAUER C. (1995a) – Chlorophyll fluorescence as a nonintrusive indicator for rapid assessment of in vivo photosynthesis. - In: Schulze, E.-D., Caldwell, M.M. (eds.): Ecophysiology of Photosynthesis. Springer-Verlag, Berlin – Heidelberg – New York, pp.49-70.

SCHREIBER U., HORMANN H., NEUBAUER C. & K LUGHAMMER C. (1995b) – Assessment of photosystem-II photochemical quantum yield by chlorophyll fluorescence quenching analysis. – Aust. J. Plant Physiol. 22: 209-220.

SMITH D.C. (1967) – The movement of carbohydrate from alga to fungus in lichens. Mémoire Société Botanique de France. Colloque sur les Lichens et la symbiose Lichénique Paris. 129-133.

STOKES P.M. & DREIER S.I. (1981) – Copper requirement of a copper-tolerant isolate of Scenedesmus and the effect of copper depletion on tolerance. Canadian Journal of Botany 59: 1817-1823.

STOYNOVA -BAKALOVA E. & T ONCHEVA -PANOVA T. (2003/4) – Subcellular adaptation to salinity and irradiance in Dunaliella salina. Biologia Plantarum. 47: 233-236.

SUNDBERG B., NÄSHOLM T. & PALMQVIST K. (1999) – The effect of nitrogen on growth and co-ordinated development of lichen photo- and mycobionts. In: Sundberg B.: Physiological ecology of lichen growth. Ph.D. Thesis, Department of Plant Physiology, Umeå University, Paper V.

SUNDBERG B., PALMQVIST K., ESSEEN P.A. & RENHORN K.E. (1997) – Growth and vitality of epiphytic lichens 2. Modelling of carbon gain using field and laboratory data. – Oecologia 109: 10-18.

SMITH E.C. & GRIFFITHS H. (1998) – Intraspecific variation in photosynthetic responses of Trebouxioid lichens with reference to the activity of a carbon-concentrating mechanism. Oecologia 113: 360-369.

TAPPER R. (1981) – Glucose uptake by Trebouxia and associated fungal symbiont in the lichen symbiosis. FEMS Microbiology Letters. 10: 103-106.

TAPPER R. (1983) – Uptake of methylamine by symbionts of the lichen Cladonia convoluta (Algal symbiont: Trebouxia). New Phytologist. 95: 61-67.

TSCHERMAK -WOESS E. (1978) – Myrmecia reticulata as a phycobiont and free-living Trebouxia: The problem of Stenocybe septata. Lichenologist. 10: 69-79.

TSCHERMAK -WOESS E. (1988) – The algal partner. In: Galun M. (ed.): CRC Handbook of lichenology. Boca Raton: CRC Press, pp.39-94.

TUBA Z., PROCTOR M.C.F. & C SINTALAN Z. (1998) – Ecophysiological responses of homoiochlorophyllous and poikilochlorophyllous desiccation tolerant plants: a comparison and an ecological perspective. Plant Growth Regulation. 26: 71-71.

TWISS M.R., WELBOURN P.M. & SCHWARTZEL E. (1993) – Laboratory selection for copper tolerance in Scenedesmus acutus (Chlorophyceae). Canadian Journal of Botany 71: 333-338.

VAINSTEIN E.A. (1985) – Lichen acids and permeability of alga Trebouxia erici cells. Fyziologiya Rastenii. 32: 1153-1158.


97

VAINSTEIN E.A. (1986) – Effect of lichen acids on photosynthesis of Trebouxia from the lichen Cetraria islandica (L.) Ach. Lichen Physiology and Biochemistry. 1: 70-76.

VAINSTEIN E.A. & T AKHTADZHYAN E.A. (1981) – Physiological changes in the lichen alga Trebouxia during cultivation. Soviet Plant Physiology. 28: 763-769.

VICENTE C. & L EGAZ M.E. (1987) – Development of urease activity in isolated photobionts of Cladonia polia. Endocytobiosis and Cell Research. 4: 69-78.

VAN KOOTEN O. & SNEL J.F.H. (1990) – The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynthesis Research. 25: 147-150.

WITHROW K. & A HMADJIAN V. (1983) – The ultrastructure of lichens. VII. Chiodecton sanguineum. Mycologia. 75: 337-339.

WOOD J.M. & W ANG H.F. (1985) – Strategies for microbial resistance to heavy metals. In: Stumm V, (ed.): Chemical Processes in Lakes. New York (USA), Wiley, pp.81-98.

WUJEK D.E. (1975) – Some ultrastructure aspects of the pyrenoid of the Chaetophoracean alga Pleurastrum. Transactions Kansas Academy of Sciences. 3-4: 133-137.

YARISH C., LEE K.U. & E DWARDS P. (1979) – An improved apparatus for the culture of algae under varying regimes of temperature and light intensity. Botanica Marina. 22: 395-397.

YAMAMOTO Y. (1987) – Tissue cultures of lichens. Proceedings of Symposium on Tissue Culture of Lichen and Bryophyte. Osaka, Japan: Nippon Paint Company, pp.14-25.

YAMAMOTO Y., M IURA Y., HIGUCHI M., K INOSHITA Y. & Y OSHIMURA I. (1993) – Using lichen tissue cultures in modern biology. The Bryologist 96(3): 384-393.

YOSHIMURA I., K UROKAWA T., NAKANO T. & Y AMAMOTO Y. (1987) – A preliminary report of cultures of Cladonia vulcani and the effects of the hydrogen ion concentration on them. Bulletin of Kochi Gakuen College 18: 335-343.

YOSHIMURA I., YAMAMOTO Y., NAKANO T. & F INNIE J. (2002) – Isolation and Culture of Lichen Photobionts and Mycobionts. In: Kranner I., Beckett R., & Varma A. (eds.): Protocols in Lichenology: Culturing, Biochemistry, Ecophysiology and Use in Biomonitoring. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-NewYork, pp.3-33.


98

8. PRÍLOHY

1) BAČKOR M. & V ÁCZI P. (2002) – Copper tolerance in the lichen photobiont

Trebouxia erici (Chlorophyta). Environmental and Experimental Botany. 48(1): 11-20

2) VÁCZI P. & BARTÁK M. (2005) – Lichen symbiotic alga Trebouxia erici affected

by irradiance and osmotic stress. Biologia Plantarum. – in press Podiel práce autora (P. Váczi) pri tvorbe publikácií priložených v prílohe: 1) Publikácia je výsledkom spoločnej práce so spoluautorom:

Podiel na kultivácii kmeňov lišajníkových fotobiontov, podiel na analýzach rastu a stanovovaní obsahov chlorofylov, podiel na tabelárnom a grafickom spracovaní výsledkov, podiel na tvorbe textu publikácie, prezentácia výsledkov na seminároch KFAR.

2) Publikácia je výsledkom samostatnej práce na KFAR MU v Brne pod vedením

konzultanta: Plánovanie a realizácia experimentov, zostavenie aparatúry pre súbežné meranie fotochemických a biochemických parametrov fotosyntézy, prípravné experimenty, meranie fotochemických a biochemických parametrov fotosyntézy, spracovanie výsledkov, tvorba grafov a tabuliek, štatistické vyhodnotenie, podiel na tvorbe textu publikácie, prezentácia výsledkov na konferencii a seminároch KFAR.

Zoznam ostatných publikácií je súčasťou životopisu autora V Brne, 17. marca 2005 ……………………………………… Mgr. Peter VÁCZI

I. BAČKOR M. & V ÁCZI P. (2002) – Copper tolerance in the lichen photobiont Trebouxia erici (Chlorophyta). Environmental and Experimental Botany. 48(1): 11-20

II. VÁCZI P. & BARTÁK M. (2005) – Lichen symbiotic alga Trebouxia erici affected by irradiance and osmotic stress. Biologia Plantarum. – in press

III. ŽIVOTOPIS A ZOZNAM PUBLIKÁCIÍ AUTORA

PETER VÁCZI (Curriculum vitae)

Osobné údaje: Narodený: 11.9.1977, Košice

Súčastné bydlisko: Herčíkova 18, 612 00 Brno

Mobil: 73 777 2592

E-mail: [email protected]

Webová stránka: http://www.sci.muni.cz/~vaczi/

Štúdium: 1992 - 1996 Gymnázium Košice

1996 - 2001 Mgr .: Univerzita Pavla Jozefa Šafárika v Košiciach, Prírodovedecká fakulta

Odbor: Genetika a fyziológia rastlín

Diplomová práca:

„Tolerancia vybraných kmeňov lišajníkových fotobiontov Trebouxia erici na meď.“

2001 - 2005 Ph.D.: Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta

Odbor: Anatomie a fyziologie rostlin

Dizertačná práca:

„Fyziologické vlastnosti lišajníkových fotobiontov rodu Trebouxia“

Ocenenia: 05 1995 07 2001

Strieborná medaila, The 5th International Environmental Project Olympiad,

Istanbul, Turecko

Pochvalné uznanie za vedecko-výskumnú činnosť, Univerzita P.J. Šafárika

Košice, Slovensko

Zamestnanie: 1.10.2002 Katedra fyziologie a anatomie rostlin, Přírodovědecká fakulta MU Brno

Kotlářská 2, 611 37 Brno

Tel: 54949 7862

Zahraničné stáže:

02 - 05 2001 Universidad Complutense de Madrid, Španielsko

Departamento de Biologia Vegetal II

Publikácie v medzinárodnom odbornom periodiku: VÁCZI P. & HAWKSWORTH D.L. (2001) – Polycoccum crespoae sp. nov., the first report

of a lichenicolous fungus on Chondropsis semiviridis (Parmeliaceae). Lichenologist 33(6): 513-517.

BAČKOR M. & V ÁCZI P. (2002) – Copper tolerance in the lichen photobiont Trebouxia

erici (Chlorophyta). Environmental and Experimental Botany. 48(1): 11-20 In press: VÁCZI P. & BARTÁK M. (2005) – Lichen symbiotic alga Trebouxia erici affected by

irradiance and osmotic stress. Biologia Plantarum.

Abstrakty: HÁJEK J., VÁCZI P. & BARTÁK M. (2003) – Photosynthesis in two foliose lichen species

in response to a changing temperature and dehydration. Book of Abstracts. Photosynthesis in a Changing World (PHOTOCHANGE), An European Union - A High Level Scientific Conference, May 27 - June 3, 2003, Kolymbari, Greece, 76p.

VÁCZI P., HÁJEK J., VRÁBLÍKOVÁ H. & B ARTÁK M. (2003) – Alterations in fast

chlorophyll fluorescence rise detect high light stress in photosystem II of Antarctic lichen species. Plant Physiology Conference of Ph.D. Students and Young Scientists , Brno, 2003, pp.11-12.

ILÍK P., KOTABOVÁ E., KAŇA R., HÁJEK J., VÁCZI P. & BARTÁK M. (2004) – Unusual

step(s) in the fast chlorophyll fluorescence induction in lichens. Book of Abstracts, 14th FESPB Congress, Krakow, Poland, Aug. 23-27, 2004. Acta Physiologiae Plantarum. 26 (suppl.): 174.

VÁCZI P. & BARTÁK M. (2004) – Relation of quantum yield of photosystem II to oxygen

evolution rate in a lichen photobiont Trebouxia erici. Book of Abstracts, 14th FESPB Congress, Krakow, Poland, Aug. 23-27, 2004. Acta Physiologiae Plantarum, 26 (suppl.): 176.

VÁCZI P. & BARTÁK M. (2004) – Photochemical processes of photosynthesis and oxygen

evolution rate in lichen photobiont Trebouxia erici. Book of Abstracts. Czecho-Slovak Student Scientific Conference, Brno, Czech Republic, May 1, 2004, 88p. (in Slovak)

VÁCZI P. & K OMÁREK O. (2004) – Isolation and cultivation of aerophytic green algae at limiting conditions of light and temperatures. Book of Abstracts, 10th Days of Plant Physiology, Bratislava, Slovakia, Sept. 5-9, 2004, 85p.

Prednášky na konferenciách (bez abstraktu): BARTÁK M., HÁJEK J., DUBOVÁ J. & V ÁCZI P. (2002) – Sources of heterogeneity in the

yield of PS II in lichen thalli. Kinetic Fluorescence Imaging of Plants, Nové Hrady(CZ) VÁCZI P. & CHMELÍK F. (2002) – Method of simultaneous measurement of fluorometric

and gasometric parameters of photosynthesis in lichens. Meeting of „photosynthetic“ PhD. students, Nové Hrady (CZ) (in slovak)

VÁCZI P. & BARTÁK M. (2004) – Effect of osmotic stress on photochemical and

biochemical processes of photosynthesis in photobionts isolated from different lichen species. Meeting of „photosynthetic“ PhD. students, Nové Hrady (CZ) (in slovak)

Editovanie zborníku konferencie: Plant Physiology Conference of Ph.D. Students and Young Scientists 2003, Book of

Abstracts ISBN: 80-7157-676-X

dizerta ČnÁ prÁca · 2005. 10. 18. · pŘÍrodov ĚdeckÁ fakulta masarykovy univerzity v brn...

Documents