UNIVERZITA KARLOVA

FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ

KATEDRA FARMACEUTICKEJ BOTANIKY A EKOLÓGIE

RIGORÓZNA PRÁCA

ALKALOIDY NARCISSUS PSEUDONARCISSUS L. cv.

DUTCH MASTER A ICH CHOLÍNESTERÁZOVÁ

A PROLYLOLIGOPEPTIDÁZOVÁ INHIBIČNÁ AKTIVITA

Vedúci rigoróznej práce: PharmDr. Jakub Chlebek, Ph.D.

Vedúci katedry: Doc. Ing. Lucie Cahlíková, Ph.D.

Hradec Králové Mgr. Marek Farkašovský

CHARLES UNIVERSITY

FACULTY OF PHARMACY IN HRADEC KRÁLOVÉ

DEPARTMENT OF PHARMACEUTICAL BOTANY AND ECOLOGY

RIGOROUS THESIS

ALKALOIDS FROM NARCISSUS PSEUDONARCISSUS L.

cv. DUTCH MASTER AND THEIR CHOLINESTERASE

AND PROLYL OLIGOPEPTIDASE INHIBITION ACTIVITY

Supervisor: PharmDr. Jakub Chlebek, Ph.D.

The Head of department: Doc. Ing. Lucia Cahlíková, Ph.D.

Hradec Králové Mgr. Marek Farkašovský

3

PREHLÁSENIE

Prehlasujem, že táto práca je mojím pôvodným autorským dielom. Literatúra a zdroje,

z ktorých som čerpal, sú v práci riadne citované a uvedené v zozname použitej literatúry.

Práca nebola využitá k získaniu rovnakého alebo iného titulu.

Táto práca bola spracovaná za podpory Špecifického vysokoškolského výskumu SVV 260 412.

V Hradci Králové Mgr. Marek Farkašovský

4

POĎAKOVANIE

Týmto ďakujem školiteľovi PharmDr. Jakubovi Chlebkovi, Ph.D. za odborné vedenie práce,

konzultácie a pomoc pri jej spracovávaní. Rád by som poďakoval aj doc. PharmDr. Jiřímu

Kunešovi, CSc. za zmeranie a interpretáciu NMR spektier, prof. RNDr. Lubomíru Opletalovi,

CSc. za zmeranie cholínesterázových aktivít, doc. PharmDr. Danielovi Junovi, Ph.D. a Mgr.

Martine Hrabinovej za stanovenie inhibičnej prolyloligopeptidázovej aktivity. V neposlednom

rade by som chcel poďakovať celému kolektívu Katedry farmaceutickej botaniky a ekológie

za vytvorenie príjemného pracovného prostredia, priateľský kolektív a pomoc pri riešení

problémov.

5

OBSAH

ZOZNAM OBRÁZKOV ........................................................................................................... 8

ZOZNAM TABULIEK ............................................................................................................. 8

ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK .......................................................................................... 9

1. ÚVOD .......................................................................................................................... 10

2. CIEĽ PRÁCE ................................................................................................................... 12

3. TEORETICKÁ ČASŤ ........................................................................................................ 14

3.1 Alzheimerova choroba .................................................................................................... 15

3.1.1 Demencia ................................................................................................................. 15

3.1.2 História ..................................................................................................................... 15

3.1.3 Patogenéza AD ......................................................................................................... 16

3.1.4 Klinický obraz ........................................................................................................... 17

3.1.5 Diagnostika ............................................................................................................... 18

3.1.6 Liečba ....................................................................................................................... 19

3.1.7 Rastliny a ich obsahové látky so schopnosťou inhibovať AChE a BuChE ................. 23

3.2 Rod Narcissus L. a jeho charakteristika .......................................................................... 26

3.2.1 Taxonómia a charakteristika rodu ........................................................................... 26

3.2.2 Obsahové látky rodu Narcissus L. ............................................................................ 28

3.2.3 Biologický účinok alkaloidov .................................................................................... 30

3.2.3.1 Alkaloidy galantamínového typu ...................................................................... 30

3.2.3.2 Alkaloidy homolykorínového typu ................................................................... 32

3.2.3.3 Alkaloidy hemantamínového a krinanového typu ........................................... 33

3.2.3.4 Alkaloidy lykorínového typu ............................................................................. 34

3.2.4 Potenciálne zdroje alkaloidov čeľade Amaryllidaceae ............................................ 37

4. EXPERIMENTÁLNA ČASŤ ............................................................................................... 38

4.1 Obecné postupy .............................................................................................................. 39

4.1.1 Príprava a čistenie rozpúšťadiel ............................................................................... 39

4.1.2 Sušenie a skladovanie izolovaných čistých látok ..................................................... 39

4.1.3 Tenkovrstvá chromatografia .................................................................................... 39

4.2 Materiál a vybavenie ...................................................................................................... 39

4.2.1 Chemikálie a rozpúšťadlá ......................................................................................... 39

6

4.2.2 Pomocné látky .......................................................................................................... 40

4.2.3 Chromatografické adsorbenty ................................................................................. 40

4.2.4 Detekčné činidlo ....................................................................................................... 40

4.2.5 Prístrojové vybavenie ............................................................................................... 40

4.2.6 Rastlinný materiál ................................................................................................... 40

4.3 Metódy použité pre štruktúrnu identifikáciu alkaloidov ................................................ 41

4.3.1 GC-MS analýza ......................................................................................................... 41

4.3.2 NMR analýza ............................................................................................................ 41

4.3.3 HRMS-Q-TOF MS (ESI) analýza ................................................................................. 41

4.3.4 MS (ESI) analýza ....................................................................................................... 42

4.3.5 Optická otáčavosť .................................................................................................... 42

4.4 Izolácia alkaloidov ........................................................................................................... 42

4.4.1 Extrakcia drogy a spracovanie extraktu ................................................................... 42

4.5 Izolácia alkaloidov z podfrakcie ND 3 – 5/2 .................................................................... 44

4.6 Stanovenie cholínesterázovej inhibičnej aktivity izolovaných alkaloidov ...................... 46

4.6.1 Chemikálie ................................................................................................................ 46

4.6.2 Pufry ......................................................................................................................... 46

4.6.2.1 5mM fosfátový pufr, pH 7,4 ............................................................................. 46

4.6.2.2 100mM fosfátový pufr, pH 7,4 ......................................................................... 46

4.6.2.3 5mM fosfátový pufr, pH 7,4, obsahujúci 150 mM chloridu sodného .............. 46

4.6.3 Prístrojové vybavenie ............................................................................................... 46

4.6.4 Podmienky merania ................................................................................................. 47

4.6.5 Biologický materiál ................................................................................................... 47

4.6.6 Stanovenie cholínesterázovej inhibičnej aktivity ..................................................... 47

4.7 Stanovenie prolyloligopeptidázovej inhibičnej aktivity .................................................. 48

4.7.1 Chemikálie a materiál .............................................................................................. 48

4.7.2 0,01M sodno-draselný fosfátový pufr, pH 7,4 ......................................................... 49

4.7.3 Prístrojové vybavenie ............................................................................................... 49

4.7.4 Podmienky merania ................................................................................................. 49

5. VÝSLEDKY .................................................................................................................... 50

5.1 Štruktúrna analýza O-acetylpluviinu (MF-1) ................................................................... 51

5.1.1 GC-MS analýza ......................................................................................................... 51

7

5.1.2 NMR analýza ............................................................................................................ 51

5.1.2.2 13C NMR analýza ............................................................................................... 52

5.1.3 Optická otáčavosť .................................................................................................... 53

5.2 Štruktúrna analýza alkaloidu MF-2 ................................................................................. 54

5.2.1 MS (ESI) analýza ....................................................................................................... 54

5.2.2 NMR analýza ............................................................................................................ 55

5.2.2.1 1H NMR analýza ................................................................................................ 55

5.2.2.2 13C NMR analýza ............................................................................................... 56

5.2.3 Optická otáčavosť .................................................................................................... 57

5.3 Inhibičná aktivita izolovaných alkaloidov voči AChE, BuChE a POP ............................... 57

6. DISKUSIA ..................................................................................................................... 58

7. ZÁVER .......................................................................................................................... 61

8. LITERATÚRA ................................................................................................................. 63

ABSTRAKT ....................................................................................................................... 71

ABSTRACT ........................................................................................................................ 72

8

ZOZNAM OBRÁZKOV

Obr. 1: Narcissus pseudonarcissus L. cv. Dutch Master ........................................................... 27

Obr. 2: Schéma syntézy alkaloidov čeľade Amaryllidaceae ..................................................... 29

Obr. 3: Alkaloidy galantamínového typu.................................................................................. 31

Obr. 4: Alkaloidy homolykorínového typu ............................................................................... 32

Obr. 5: Alkaloidy hemantamínového a krinanového typu ....................................................... 33

Obr. 6: Alkaloidy lykorínového typu ......................................................................................... 35

Obr. 7: Alkaloidy pankratistatínového typu ............................................................................. 36

Obr. 8: Alkaloidy tazettínového typu ....................................................................................... 37

Obr. 9: Chromatografia 1 ......................................................................................................... 43

Obr. 10: Chromatografia 2 ....................................................................................................... 44

Obr. 11: Kontrolné TLC podfrakcie ND 3 – 5/2 ......................................................................... 45

Obr. 12: O-acetylpluviin ........................................................................................................... 51

Obr. 13: EI-MS spektrum O-acetylpluviinu ............................................................................... 51

Obr. 14: 1H NMR spektrum O-acetylpluviinu ........................................................................... 52

Obr. 15: 13C NMR analýza O-acetylpluviinu ............................................................................. 53

Obr. 16: Alkaloid MF-2 ............................................................................................................. 54

Obr. 17: ESI-MS spektrum alkaloidu MF-2 ............................................................................... 54

Obr. 18: HRMS-Q-TOF MS (ESI) spektrum alkaloidu MF-2 ....................................................... 55

Obr. 19: 1H NMR spektrum alkaloidu MF-2 ............................................................................. 56

Obr. 20: 13C NMR spektrum alkaloidu MF-2 ............................................................................ 57

ZOZNAM TABULIEK

Tab. 1: Farmakoterapeutické postupy v liečbe AD nepodložené medicínou založenou na

dôkazoch .................................................................................................................................. 21

Tab. 2: Terapeutické postupy, ktoré sú súčasťou klinických štúdií .......................................... 22

Tab. 3: Extrakty rastlín s významnou inhibičnou aktivitou na AChE ........................................ 24

Tab. 4: Extrakty rastlín s významnou inhibičnou aktivitou na BuChE ...................................... 24

Tab. 5: Príklady obsahových látok rastlín s preukázanou inhibičnou aktivitou na AChE ........ 25

Tab. 6: Príklady obsahových látok rastlín s preukázanou inhibičnou aktivitou na BuChE ....... 25

Tab. 7: Systematické zaradenie rodu Narcissus L. ................................................................... 26

Tab. 8: Výsledky stĺpcovej chromatografie .............................................................................. 43

Tab. 9: Rozdelenie podfrakcie ND 3 – 5/2 do jednotlivých línií ............................................... 45

Tab. 10: Biologická aktivita štandardov ................................................................................... 48

Tab. 11: Výsledná inhibičná aktivita izolovaných alkaloidov voči AChE, BuChE a POP ............ 57

9

ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK

ACh acetylcholín

AChE acetylcholínesteráza

AD Alzheimerova choroba

Aβ β-amyloid

BL6 bunky myšieho melanómu

BuChE butyrylcholínesteráza

CEM bunky lymfoblastómu

cv. pestovaná odroda (kultivar)

DR4 receptor smrti

EGb 761 štandardizovaný extrakt z listov Ginkgo biloba L.

GSK-3β glykogénsyntáza kináza-3β

GC-MS plynová chromatografia spojená s hmotnostným spektrometrom

HEK 293T ľudské embryonálne bunky obličiek

HeLa bunky rakoviny krčku maternice

HEP G2 bunky pečeňového nádoru

IVIG intravenózne imunoglobulíny

K562 bunky myeloblastickej leukémie

LMTK bunky fibroblastov

L5178 MDR bunky myšieho lymfómu

MCF 7 bunky rakoviny prsníka

MOLT 4 leukemické bunky

NIST Národný inštitút štandardov a technológií

NMDA N-metyl-D-aspartát

NMR nukleárna magnetická rezonancia

POP prolyloligopeptidáza

PC-3 bunky karcinómu prostaty

SHSY-5Y bunky ľudského neuroblastómu

SSRI selektívne inhibítory spätného vychytávania serotonínu

U373 GBM bunky glioblastómu

5123tc bunky nádoru pečene potkana

10

1. ÚVOD

11

Rastliny a ich zmesi sú už niekoľko tisícročí využívané v medicíne pre svoje liečivé účinky. Sú

spracované do rôznych foriem. Najčastejšie ako čaje, odvary, ďalej sú súčasťou mastí,

krémov, doplnkov stravy, ale aj liečivých prípravkov. Používajú sa na liečbu rôznych

problémov, napr. na liečbu žalúdočných problémov, stresu a nervozity, posilnenie imunity,

choroby močových ciest a mnoho ďalších. Obsahové látky z niektorých rastlín sú súčasťou

registrovaných liečivých prípravkov napr. digoxín z rastliny Digitalis lanata Ehrh. (liek

Digoxin), silymarín z rastliny Silybum marianum (L.) Gaertner (liek Flavobion, Lagosa),

štandardizovaný extrakt z Ginkgo biloba L. (liek Gingio, Tanakan, Tebokan) alebo galantamín

z rodu Narcissus L. (liek Galantamin). Posledná menovaná látka – galantamín – je dnes

nezastupiteľnou súčasťou liečebnej terapie Alzheimerovej choroby. Pre túto chorobu je

typická strata pamäti, schopnosti učiť sa , uvažovať, orientovať sa v priestore a čase. Často sú

tieto príznaky chybne interpretované ako súčasť starnutia a pacient prichádza k lekárovi až

v rozvinutom štádiu choroby [1]. Všetky tieto príznaky predstavujú pre pacienta a jeho

rodinu veľkú psychickú, fyzickú a finančnú záťaž. AD je zatiaľ neliečiteľná, používané lieky

slúžia len na spomalenie rozvoja choroby. Práve kvôli týmto dôvodom, je úsilím mnohých

vedcov výskum a vývoj nových liečiv, ktoré by zabezpečili kvalitnejší a dôstojnejší život

s touto chorobou. Výskum sa stále zameriava aj na rastliny čeľade Amaryllidaceae, keďže

liečivá látka galantamín, bola izolovaná práve z rastlín patriacich do tejto čeľade. Izolácia

a štúdium biologickej aktivity týchto látok, je hlavným cieľom výskumnej pracovnej skupiny

ADINACO (Alzheimer Disease and Natural Compounds) na Katedre farmaceutickej botaniky

a ekológie Farmaceutickej fakulty Univerzity Karlovej v Hradci Králové. V rámci vypracovania

rigoróznej práce v tejto skupine, som dostal možnosť podieľať sa na izolácii a stanovení

biologickej aktivity alkaloidov rastliny Narcissus pseudonarcissus L. cv. Dutch Master s cieľom

nájsť látku s potenciálnym využitím v terapii Alzheimerovej choroby.

12

2. CIEĽ PRÁCE

13

1. Izolácia minimálne dvoch alkaloidov v čistom stave, s použitím chromatografických metód

z vybranej frakcie, získanej z chromatografickej separácie alkaloidného extraktu, získaného z

cibule rastliny Narcissus pseudonarcissus L. cv. Dutch Master,

2. Podiel na stanovení štruktúry alkaloidov pomocou metód hmotnostnej spektrometrie

(MS) a nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR),

3. Podiel na stanovení biologickej aktivity izolovaných alkaloidov na inhibíciu ľudských

cholínesteráz a prolyloligopeptidázy.

14

3. TEORETICKÁ ČASŤ

15

3.1 Alzheimerova choroba

3.1.1 Demencia

Demencia je heterogénnou skupinou ochorení, ktorých výskyt stúpa s narastajúcim vekom –

v kategórii nad 65 rokov postihuje až 20 % populácie. Vzniká najčastejšie ako dôsledok

chronického alebo progresívneho ochorenia mozgu. Medzi príčiny vzniku demencie patrí

Alzheimerova choroba (AD) (50 %), vaskulárna demencia (10 – 20 %), demencia s Lewyho

telieskami (10 – 15 %) [1]. Sekundárnou príčinou vzniku môže byť úraz, intoxikácia

alkoholom, nádor, zápal mozgových blán, infekcia (HIV, syfilis). Kombináciou

degeneratívneho poškodenia mozgu a nedostatočného prekrvenia vznikajú zmiešané

demencie [2]. V literatúre sa občas objavuje pojem pseudodemencia, ktorý označuje

choroby demenciu napodobňujúce, prípadne choroby, ktoré demenciu spôsobujú, ale sú

ovplyvniteľné terapiou. Pod tento termín môže byť zaradená aj depresia, prípadne demencia

ako dôsledok nežiadúcich účinkov liečiv [1].

3.1.2 História

AD je pomenovaná po nemeckom klinickom psychológovi Aloisovi Alzheimerovi (1864 –

1915). Popísal prípad Augusty D., ktorá bola prijatá na psychiatrickú kliniku kvôli poruchám

spánku a pamäti, zmätenosti a pretrvávajúcej paranoji. Pacientka zomrela po piatich rokov

a Alzheimer skúmal časť jej mozgu. Pri tejto pitve ako prvý objavil, popísal a definoval plaky

a neurofibrilárne klbká. Tento záver prezentoval malému okruhu výskumníkov ako

histopatologický nález, ktorý bol príčinou symptómov doteraz neznámej choroby. Následne

predstúpil so svojím objavom na kongrese Nemeckých psychiatrov, kde sa však uznania

nedočkal. To ho ale neodradilo od ďalšieho výskumu a v priebehu nasledujúceho roku

zaznamenal ďalšie tri prípady choroby. Jeho spolupracovník Kreapelin, ktorý v tom čase

pracoval na vydaní známej príručky Psychiatrie 8, si uvedomil dôležitosť Alzheimerovho

nálezu a popísal prípad Augusty D., s návrhom pomenovania tejto choroby po jej

objaviteľovi. Názov bol prijatý, ale vzhľadom na povahu choroby – demencia s nezvyčajnými

patologickými znakmi (plaky a klbká) – bolo diagnostikovaných prípadov veľmi málo. Na

meno Alois Alzheimer sa takmer na 50 rokov zabudlo, pričom ku zmene došlo až

v posledných desaťročiach [3].

16

3.1.3 Patogenéza AD

AD patrí medzi najčastejšie príčiny vzniku demencie, pričom jej prevalencia rastie s vekom.

Kým vo vekovej skupine od 65 do 74 rokov choroba postihuje len asi 3 % ľudí, tak vo veku

nad 85 rokov narastá desaťnásobne, t.j. na hodnotu 30 %. U žien je pravdepodobnosť vzniku

ochorenia dvakrát vyššia ako u mužov. AD patrí medzi degeneratívne ochorenia mozgu,

s výskytom charakteristických plakov a atrofiou v temporálnom, parietálnom a frontálnom

laloku [4]. Hlavnou príčinou je degenerácia určitých mozgových proteínov a následne vznik

patologických foriem proteínov. Zrejme základným neurodegeneratívnym prvkom je tvorba

β-amyloidu (Aβ). Je to prirodzene sa vyskytujúci transmembránový proteín, ktorý je za

normálnych podmienok štiepený α-sekretázou na krátke fragmenty nazývané β-peptid.

Tento peptid je dôležitý pre tvorbu nových synapsií. Pri AD sa však pri štiepení uplatňujú

enzýmy β-sekretáza a γ-sekretáza, ktorých aktivitou vznikajú fragmenty β-peptidu Aβ40

a Aβ42 [4,5]. Tieto enzýmy sú aktívne aj pri fyziologickom stave organizmu, pričom

patologické fragmenty vznikajú len vo veľmi malom množstve. Peptidy vznikajúce vyššou

aktivitou β- a γ-sekretázy oligomerujú a sú veľmi neurotoxické. Následne dochádza ku

koagulácii takto vznikutých oligomérov v extracelulárnom prostredí mozgovej kôry a

k vzniku patologického Aβ. Ten potom tvorí základ neurodegeneratívneho ložiska – plaku.

V mieste plaku dochádza k rôznym degeneratívnym dejom. Vzniká sterilný zápal, ktorý je

sprevádzaný uvoľnením cytokínov, interleukínov, excitačných aminokyselin a voľných

kyslíkových radikálov, ktoré zvyšujú aktivitu N-metyl-D-aspartát (NMDA) receptorov, čím

dochádza k nárastu koncentrácie Ca2+ iónov v bunke a následnej apoptóze [5,6]. Molekuly

peptidov Aβ40 a Aβ42 reagujú aj s receptormi na povrchu fagocytujúcich buniek a stimuláciou

týchto receptorov dochádza k uvoľnovaniu látok, ktoré stimulujú apoptózu neurónov [6].

V dôsledku toxicity Aβ dochádza k aktivácii proteinkinázy glykogénsyntázy kinázy-3β

(GSK-3β) a následnej degradácii intraneuronálneho τ-proteínu. Tým dochádza k tvorbe

neurofibrilárnych tangles (uzlíčkov, košíčkov) a apoptóze. Narastajúca apoptóza a znížená

tvorba rastových faktorov postupne vedie k atrofii mozgu [5]. Pokles počtu neurónov

spôsobuje aj poškodenie acetylcholinergného systému dôležitého pre mechanizmy pamäti.

Znižuje sa tvorba a uvoľnovanie acetylcholínu (ACh) z presynaptických zakončení a taktiež

dochádza k menšej tvorbe enzýmu syntetizujúceho ACh – cholínacetyltransferázy. Počet

muskarínových receptorov zostáva relatívne nezmenený, zatiaľ čo množstvo niektorých

17

podjednotiek nikotínových receptorov významne klesá. Po uvoľnení z receptorovej väzby je

ACh degradovaný enzýmom acetylcholínesterázou (AChE). V ľudskom mozgu boli zistené dva

typy AChE – G1 a G4. U zdravých ľudí prevláda forma G4, zatiaľ čo u pacientov s AD dochádza

k nárastu formy G1 a poklesu G4. Rovnako aj koncentrácia butyrylcholínesterázy (BuChE) –

ďalší enzým podieľajúci sa na rozklade ACh – je u postihnutých ľudí významne vyššia, čo

vedie k narastajúcemu nedostatku ACh [7]. Na rozvoji AD sa významne podieľajú aj poruchy

metabolizmu lipidov. Porucha transportu cholesterolu z astrocytov na synaptické

kompartmenty spôsobuje úbytok synapsií. Špecifická izoforma apolipoproteínu E apoE-ɛ4

môže ovplyvňovať transport cholesterolu z astrocytov k neurónom a ich hladinu na

synapsiách. Deficit cholesterolu v neurónoch má za následok hyperfosforyláciu τ-proteínu

a následný vznik neurofibrilárnych tangles [8]. U niektorých foriem je príčinou rozvoja AD

mutácia génov kódujúcich intracelulárne proteíny presenilín 1 a presenilín 2. Tieto gény sú

lokalizované na chromozómoch 1 a 14 a ich mutáciou dochádza k zvýšenej tvorbe Aβ [4].

Významnú úlohu v rozvoji AD a iných psychiatrických porúch zohráva zvýšená aktivita

prolyloligopeptidázy (POP). Tento enzým sa vyskytuje vo väčšine orgánov tela, vrátane

mozgu. Podieľa sa aj na procesoch učenia (formovanie a degradácia neuropeptidov),

bunkového delenia a diferenciácii buniek. POP štiepi peptidovú väzbu aminokyseliny prolínu

na jeho karboxylovom konci a zastáva kľúčovú úlohu v metabolizme inositol-1,4,5-P3, ktorý

je súčasťou signálnej kaskády neuropeptidov dôležitých pre procesy učenia a pamäti [9].

3.1.4 Klinický obraz

AD sa rozvíja pomaly a postupne, často je svojimi príznakmi mylne považovaná za súčasť

starnutia a pacientom a jeho okolím prehliadaná. Postihnutí spočiatku zabúdajú veci, ktoré

chceli urobiť, strácajú osobné veci apod. Postupne dochádza k poruchám myslenia, úsudku,

uvažovania, pamäti a schopnosti orientovať sa v priestore a čase. Poškodená je najmä

epizodická pamäť (zážitky, udalosti zo života), z časového hľadiska sa častejšie vyskytujú

výpadky pamäti na nedávne udalosti. Dlhodobé spomienky si pacient na začiatku ochorenia

väčšinou vybaví bez problémov. V priebehu ochorenia však poškodenie dlhodobej pamäte

progreduje. Medzi ďalšie príznaky patria aj poruchy aktivít denného života. Zo začiatku je to

zabúdanie zložitých úkonov ako je šoférovania auta, obsluha počítača, s postupom ochorenia

pacienti zabúdajú aj bežné úkony zahrňujúce obliekanie, umývanie, či schopnosť samostatne

sa najesť. Často dochádza aj k úniku moču a stolice a pacienti sú plne odkázaní na pomoc

18

rodiny, prípadne opatrovateľov [5]. Dochádza aj k zmene správania pacienta, častejšie sa

vyskytujú depresie, agresivita, halucinácie, apatia a bludy [1]. Konečným štádiom je strata

mentálnej kontroly a neschopnosť pacientov postarať sa o seba samých [6].

3.1.5 Diagnostika

Všetci pacienti s prejavmi demencie by mali podstúpiť základné neurologické a fyzikálne

vyšetrenia. V počiatočných štádiách AD sú výsledky fyzikálnych testov väčšinou v norme,

avšak u iných porúch, napr. vaskulárna demencia, demencia s Lewyho telieskami, sú tieto

testy kľúčovou časťou diagnostiky. Dôležitá je aj anamnéza, ktorej cieľom je zistiť, ktoré

kognitívne oblasti sú postihnuté, spôsob nástupu príznakov, choroby v mladosti a aktuálne

choroby. Anamnéza musí byť doplnená aj informáciami od tretej osoby, ktorou je

najčastejšie opatrovateľ alebo rodinný príslušník [10].

Vyšetrenie kognitívnych funkcií zahŕňa vyšetrenie celkovej miery kognitívneho

deficitu (Mini Mental State examination – krátky test kognitívnych funkcií, hodinový test),

pamäťových funkcií (postihnutie epizodickej pamäte – sedem minútový test), reči (test

slovnej plynulosti, test pomenovania obrázkov, rozlíšenie slov a obrazov) behaviorálnych

a psychiatrických symptómov (pri AD najčastejšie apatia, depresia a úzkosť) [10].

Laboratórna diagnostika zahŕňa vyšetrenie biomarkerov označovaných ako likvorový

triplet. Podstatou je stanovenie hodnôt Aβ42 (koncentrácia nižšia ako 500 pg/ml) celkového

τ-proteínu (koncentrácia vo veku 51 – 70 rokov vyššia ako 450 pg/ml, vo veku 71 – 93 vyššia

ako 500 pg/ml) a hyperfosforylovaného τ-proteínu (koncetrácia vyššia ako 60 pg/ml). Ani

tieto kritéria však nesmerujú k definitívnemu stanoveniu diagnózy AD [11].

Zobrazovacie metódy – počítačovú tomografiu alebo magnetickú rezonanciu – by mal

podstúpiť každý pacient. Slúžia k vylúčeniu liečiteľných typov demencie a k objaveniu

typických známok ochorenia. Pre AD je typická atrofia hippokampu, amygdaly a rozšírenie

komorového systému [5,12].

Diagnóza AD je stanovená až po prehodnotení výsledkov z týchto vyšetrovacích

metód a mala by byť oznámená pacientovi a jeho opatrovateľovi, prípadne rodinným

príslušníkom. Oznámenie diagnózy by malo prebehnúť s prihliadnutím na individuálny stav

pacienta s dostatkom informácií, podpory a poradenstva [12].

19

3.1.6 Liečba

Keďže AD je zatiaľ nevyliečiteľná, liečba je zameraná na spomalenie rozvoja choroby

a predĺženie schopnosti pacienta byť samostatným. Liečbu môžeme rozdeliť na dve hlavné

časti – nefarmakologickú a farmakologickú [1].

Nefarmakologická liečba je založená na neustálej aktivizácii a stimulácii pacienta

prostredníctvom reedukačných programov. Tieto programy môžu prebiehať aj pomocou

špeciálnych počítačových programov. Veľmi dôležitým prvkom je aj láskavý a trpezlivý

prístup ošetrovateľov, ktorý v pacientovi vyvolá pocit istoty a podpory [1].

Farmakologické postupy sú založené na ovplyvnení cholinergného systému –

zabránenie odbúravania ACh pomocou inhibítorov cholínesteráz a na blokáde NMDA

receptorov. Často prítomná depresia a úzkosť je liečená pomocou antidepresív zo skupiny

SSRI (selektívne inhibítory spätného vychytávania serotonínu) – citalopram, escitalopram,

sertralin. Najviac využívané sú inhibítory cholínesteráz, ktoré svojím účinkom zvyšujú

koncentráciu ACh v mozgu a ovplyvňujú aj tvorbu Aβ. Používajú sa k liečbe ľahkých a stredne

ťažkých štádií ochorenia. Kombinácia s memantínom sa uplatňuje v posledných štádiách

ochorenia. V súčasnosti sa k liečbe využívajú štyri látky zo skupiny inhibítorov cholínesteráz –

galantamín, donepezil, rivastigmín a huperzín A. Huperzín A sa používa k liečbe v Číne, v USA

je vo fáze klinického testovania [1,13]. Pred nasadením inhibítorov cholínesteráz je potrebná

opatrnosť u pacientov trpiacich astmou, zadržiavaním moču, aktívnymi žalúdočnými vredmi,

epilepsiou, poruchami srdcového rytmu, užívajúcich betablokátory a prípadne iné

bradykardizujúce lieky. Medzi najčastejšie nežiadúce účinky patria gastrointestinálne

problémy (nevoľnosť, zvracanie, strata chuti do jedla a s tým spojená strata hmotnosti),

menej často sa vyskytujú svalové kŕče a bolesti hlavy [14,15]. Medzi faktory, ktoré zlepšujú

akútnu znášanlivosť inhibítorov cholínesteráz, patrí napr. pomalé zvyšovanie dávky,

podávanie s jedlom alebo po jedle, vyššia telesná hmotnosť, mužské pohlavie, súčasné

podávanie antipsychotík a centrálnych antiemetík [14]. Liečba sa zahajuje najnižšími dávkami

inhibítorov cholínesteráz s dávkovaním raz až dvakrát denne v závislosti na látke a liekovej

forme. Dávka sa zvyšuje v mesačných intervaloch až na maximálnu dávku alebo zostáva na

dávke, ktorú pacient ešte toleruje. Rozhodujúci pre posúdenie účinku liečiv je prvý polrok

liečby. Ak nedôjde k zlepšeniu stavu pacienta, je potrebné zmeniť preparát [15]. Výber

20

vhodného liečiva závisí na jeho farmakologických vlastnostiach, jeho tolerancii pacientom,

ale aj na stupni poškodenia mozgu. Galantamín má okrem inhibície AChE schopnosť

allostericky modulovať nikotínové receptory [5]. Má krátky plazmatický polčas (4 – 6 hodín)

a je metabolizovaný cytochrómom P450, z čoho vyplýva vyššie riziko liekových interakcií pri

podávaní s inhibítormi, prípadne induktormi tohto cytochrómu. Dávkovanie je jedna

(retardované formy) alebo dve tablety denne. Donepezil má naopak veľmi dlhý biologický

polčas (70 hodín), čo umožňuje dávkovanie jedenkrát denne. Má najlepšiu gastrointestinálnu

znášanlivosť, nevýhodou je však jeho metabolizácia cytochrómom P450 a s tým spojené

vyššie riziko liekových interakcíí [14]. Rivastigmín inhibuje AChE aj BuChE, čo spôsobuje vyšší

výskyt prechodných nežiadúcich účinkov. Má krátky biologický polčas (2 – 3 hodiny) ale nie je

metabolizovaný v pečeni, čím dochádza k významnému zníženiu výskytu liekových interakcií.

Jediný je k dispozícii vo forme transdermálnej náplasti, čím sa zvyšuje kompliance pacienta

a ustupujú gastrointestinálne nežiadúce účinky. Náplasti sa menia každých 24 hodín a tablety

sa užívajú dvakrát denne [5, 14]. Memantín je liečivo patriace do skupiny

aminoadamantánov. Prvou používanou látkou z tejto skupiny bol amantadín, ktorý sa

používa v liečbe vírusových infekcií (chrípka). Pri liečbe amantadínom sa u niektorých

pacientov trpiacich Parkinsonovou chorobou zlepšili symptómy – hlavne tras. Následne bol

syntetizovaný memantín – pôvodne zamýšľaný ako antidiabetikum. Ukázalo sa, že memantín

podobne ako amantadín, pôsobí na nervový systém, pričom jeho terapeutický efekt spočíva

v blokovaní glutamátových NMDA receptorov. AD je charakteristická nadmerným

uvoľňovaním excitačnej aminokyseliny glutamátu, následnou stimuláciou NMDA receptorov

a s tým spojeným nadmerným influxom Ca2+ iónov do neurónu, čo má za následok apoptózu

bunky. Memantín blokádou týchto receptorov znižuje nadmerný vstup Ca2+ iónov do bunky

a tým pôsobí neuroprotektívne. Používa sa k liečbe stredne ťažkých až ťažkých foriem AD a

vaskulárnych demencií. U pacientov dlhodobo liečených inhibítormi cholínesteráz dochádza

po nasadení memantínu k výraznému zlepšeniu ich stavu [16].

Ako doplnok terapie inhibítorov cholínesteráz a memantínu sa používajú aj iné látky,

ktorých účinok však nie je založený na dôkazoch „evidence based medicine“ – najčastejšie

neboli prevedené veľké štúdie alebo ich výsledok nie je jednoznačný [7].

21

Tab. 1: Farmakoterapeutické postupy v liečbe AD nepodložené medicínou založenou na

dôkazoch [7]

Skupina látok Prípravky Dôvod

antioxidanty α-tokoferol, β-karotén,

retinoidy, kys. tioktová

eliminácia nadmerne

vytváraných oxidantov

nootropiká piracetam, pyritinol,

nicergolin

podpora zníženého

neuronálneho metabolizmu

prekurzory a stimulátory

neuronálnych rastových

hormónov

cerebrolyzín, substitúcia

estrogénmi u žien po

klimaktériu

znížená produkcia týchto

látok u AD

Egb 761 (štandardizovaný

extrakt z listov Ginkgo

biloba L.)

Tanakan, Tebokan, Gingio antioxidačný,

antitrombotický efekt,

zlepšenie metabolizmu

vitamíny a iné doplnky vitamín B12, kys. listová,

koenzým Q10, omega-3

nenasýtené kyseliny

zlepšenie metabolizmu,

ochrana neuronálnej

membrány

Časť z vyššie uvedených látok však aj napriek ich teoretickému prínosu v liečbe

nedosahuje v prebiehajúcich štúdiách očakávané výsledky. Je možné, že ich podávanie bude

označené ako zbytočné a bez pozitívneho efektu na liečbu. Medzi takéto látky/postupy sa

možno zaradí podávanie vitamínov, estrogénov a nootropík [7].

Účinnosť niektorých perspektívnych farmakoterapeutickych postupov je v súčasnej

dobe overovaná formou klinických štúdií. Jedná sa hlavne o látky, ktoré ovplyvňujú tvorbu

Aβ. Skúmajú sa inhibítory β- a γ-sekretázy, inhibítory oligomerizácie β-peptidu,

monoklonálne protilátky proti Aβ [7]. Protilátky proti Aβ (IgG) sú podávané intravenózne

a ich účinok je vyšší na začiatku ochorenia. Ďalšou formou pasívnej imunizácie je podávanie

intravenóznych imunoglobulínov (IVIG). Tieto imunoglobulíny sú zmesou ľudských

imunoglobulínov a protilátok proti Aβ. Ich účinok je založený na potlačení tvorby Aβ,

podpore jeho vylučovania z mozgu a ochrane neurónov pred jeho toxicitou [17]. Pozitívne

výsledky prináša aj liečba antidiabetikami zo skupiny aktivátorov jadrových receptorov

22

PPARγ – zvýšenie citlivosti mozgového tkaniva na inzulín a zlepšenie metabolizmu [7].

Klinickým štúdiami neprešla vakcína proti Aβ. Aj napriek jej pozitívnym účinkom – potlačenie

tvorby plakov a zlepšenie kognitívnej dysfunkcie – sa až u 6 % pacientov vyskytli nežiadúce

účinky vo forme postvakcinačnej encefalitídy. Ďalším neúspechom skončila myšlienka

redukcie amyloidového prekurzorováho proteínu, ktorého chybným štiepením Aβ vzniká.

Z tejto skupiny liečiv boli testované látky fenserín a deferoxamín [17]. Súhrn týchto

potenciálne nových liečiv je uvedený v tabuľke 2.

Tab. 2: Terapeutické postupy, ktoré sú súčasťou klinických štúdií [7,18]

Terapeutický postup Prípravky Dôvod

stimulátory α-sekretázy,

blokátory β-sekretázy

cerebrosterol potlačenie tvorby ďalších

fragmentov β-peptidu

blokátory oligomerizácie

a polymerizácie Aβ

tramiprostat, colostrinin zabránenie tvorby dlhších

fragmentov β-peptidu

protilátky proti Aβ bapineuzumab zabránenie tvorby

a ukladania Aβ

IVIG protilátky proti Aβ

blokáda enzýmu GSK-3β lítium, memantín zabránenie, zníženie

degradácie τ-proteínu

zlepšenie neuronálneho

metabolizmu

dimebon zlepšenie metabolizmu

aktivátory jadrových

receptorov PPARγ

glitazónové antidiabetika

(rosiglitazón)

zlepšenie citlivosti moz -

gového tkaniva na inzulín

aplikácia kmeňových buniek stimulácia tvorby nových

neurónov

inhibítory POP zabránenie degradácie

neuronálnych peptidov,

hormónov

23

3.1.7 Rastliny a ich obsahové látky so schopnosťou inhibovať AChE a BuChE

Obsahové látky, hlavne sekundárne metabolity, z mnohých rastlín vykazujú určitú inhibičnú

aktivitu na AChE a BuChE. Najznámejšou rastlinou je v tomto prípade Galanthus woronovii

Losinsk, z ktorej bol izolovaný galantamín. Štandardizované extrakty rastlín Bacopa monniera

L. a Ginkgo biloba L. vykazujú na dávke závislý inhibičný efekt. Z rastlín, využívaných

v tradičnej korejskej medicíne na zlepšenie pamäti, preukázali významnú aktivitu látky

izolované z Acorus calamus L. a Epimedium koreanum L.. Z rastlín, využívaných v thajskej

medicíne, prinieslo pozitívne výsledky testovanie koreňových extraktov zo Stephania

tuberosa Lour. a Tabernaemontana divaricata RBr. ex Roem. & Schult.. Physostigma

venenosum Balf. je zdrojom alkaloidu fyzostigmínu, ktorý je inhibítorom AChE s krátkym

biologickým polčasom. Jeho molekula sa stala predlohou k molekule rivastigmínu. V Afrike

ho niektoré domorodé kmene využívajú ako rituálny jed, ktorý sa používa k určeniu viny

alebo neviny pri spáchaní zločinu [19]. Plavúň Huperzia serrata Thunb. je zdrojom

chinolizidínového alkaloidu huperzínu A, ktorý je silným reverzibilným inhibítorom AChE.

V tradičnej čínskej medicíne sa táto rastlina používa pre svoj protizápalový a antipyretický

efekt. U izolovaného huperzinu A však tieto vlastnosti chýbajú. Jeho výhodou v liečbe AD je,

že má dlhšie pôsobenie ako donepezil a rivastigmín. Niektoré štúdie ho dokonca hodnotia

ako účinnejšiu látku. Ďalšími výhodami sú rýchlejší prestup cez hematoencefalickú bariéru,

lepšia dostupnosť po perorálnom podaní, menej periférnych nežiadúcich účinkov a nízke

dávkovanie (stotiny miligramu denne). V súčasnosti prebiehajú klinické hodnotenia a aj

pokusy o modifikáciu molekuly s cieľom dosiahnuť vyššiu účinnosť a menej nežiadúcich

účinkov. Ďalšou prírodnou látkou s možným účinkom na AD je rutekarpin –

chinazolinokarbolínový alkaloid izolovaný z Evodia ruteacarpa A. Juss.. Okrem toho, že

vykazuje silnú inhibičnú aktivitu a vysokú selektivitu k AChE, pôsobí aj protizápalovo, aj ako

vazodilatans a trombolytikum. V súčasnej dobe slúži ako predlohová štruktúra k syntéze

derivátov so zvýraznením inhibičným účinkom na AChE. V rastline Senna spectabilis Irwin &

Barneby, sa nachádzajú dva alkaloidy piperidínového typu 3-O-acetylspektalin a spektalin,

ktoré sa stali predlohou nových selektívnych AChE inhibítorov. Tieto deriváty sú vysoko CNS

selektívne, čo znamená, že majú minimum periférnych nežiadúcich účinkov [13]. Ďalšie

príklady rastlín, ktorých extrakty vykazujú inhibičnú aktivitu na AChE a BuChE, sú uvedené

v tabuľkách 3 a 4.

24

Tab. 3: Extrakty rastlín s významnou inhibičnou aktivitou na AChE [19]

Rastlina Čeľaď Inhibičná aktivita

extraktu (%)

Koncentrácia

extraktu

Corydalis solida L. Papaveraceae 87,56 ± 1,24 1 mg/ml

Fumaria capreolata L. Fumariaceae 96,89 ± 0,18 1 mg/ml

Fumaria densiflora DC. Fumariaceae 93,42 ± 0,42 1 mg/ml

Fumaria vaillantii Lois. Fumariaceae 94,23 ± 0,47 1 mg/ml

Fumaria judaica Boiss. Fumariaceae 96,47 ± 0,63 1 mg/ml

Glaucium corniculatum L. Papaveraceae 86,55 ± 0,67 1 mg/ml

Rhododendron luteum Sweet Ericaceae 76,32 ± 0,58 1 mg/ml

Rhododendron ponticum L. Ericaceae 93,03 ± 1,12 1 mg/ml

Salvia officinalis L. Lamiaceae 68,2 ± 15,6 2,5 mg/ml

Stephania suberosa Forman. Menispermaceae 91,93 ± 10,8 0,1 mg/ml

Tabernaemontana divericata

R.Br. Ex

Apocyanaceae 93,50 ± 0,37 0,1 mg/ml

Tab. 4: Extrakty rastlín s významnou inhibičnou aktivitou na BuChE (koncentrácia extraktov

bola 42 µg/ml) [20]

Rastlina Čeľaď Inhibičná aktivita extraktu (%)

Antiaris africana Lesch. Moraceae 78,55 ± 3,97

Bombax bromoposenze P. Beauv. Bombaceae 89,31 ± 9,22

Combretum molle R. Br. ex G. Don. Combretaceae 90,42 ± 5,35

Crinum jagus L. Amaryllidaceae 91,34 ± 6,35

Dioscorea dumentorum (Kunth) Pax Dioscoreaceae 87,55 ± 7,24

Markhamia tomentosa Seem. Bignoniaceae 78,45 ± 5,67

Spondias mombin L. Anacardiaceae 83,94 ± 6,31

Pycnanthus angolensis (Welw.) Warb. Myristicaceae 86,05 ± 8,32

Tetrapleura tetraptera Benth. Leguminosae 81,87 ± 3,54

25

Tab. 5: Príklady obsahových látok rastlín s preukázanou inhibičnou aktivitou na AChE [19]

Názov Rastlinný zdroj, čeľaď IC50 AChE (µM)

assoanín

oxoassoanín

Narcissus assoanus

Dufour ex Schult & Schult.f.

Amaryllidaceae

3,87 ± 0,24

47,21 ± 1,13

buxamín B

N, N-dimetylbuxapapín

Buxus papillosa C. K. Schneid

Buxaceae

7,56 ± 0,008

7,28 ± 0,06

galantamín Galanthus nivalis L.

Amaryllidaceae

1,07 ± 0,18

huperzín A Huperzia serrata Thunb.

Lycopodiaceae

0,033 ± 0,001

11-hydroxygalantamín Narcissus poeticus L.

Amaryllidaceae

1,61 ± 0,21

sangvinín Eucharis grandifolia

Planch. & Linden

Amaryllidaceae

0,1 ± 0,01

sarsolignón

vaganín

Sarcococca saligna D. Don

Buxaceae

7,028 ± 0,007

8,59 ± 0,155

Tab. 6: Príklady obsahových látok rastlín s preukázanou inhibičnou aktivitou na BuChE

[21, 22]

Názov Rastlinný zdroj, čeľaď IC50 BuChE (µM)

fyzostigmín Physostigma venenosum Balf.

Fabaceae

0,130 ± 0,004

gnetol Ficus foveolata Lam.

Moraceae

1,31 ± 0,22

harmol

nigelastrín II

vasicín

Peganum nigellastrum Bunge

Nitrariaceae

8,21 ± 3,65

9,26 ± 1,47

2,60 ± 1,47

26

3.2 Rod Narcissus L. a jeho charakteristika

3.2.1 Taxonómia a charakteristika rodu

Tab. 7: Systematické zaradenie rodu Narcissus L. [23]

Ríša Plantae Rastliny

Oddelenie Magnoliophyta Krytosemenné

Trieda Liliopsida Jednoklíčnolistové

Rad Asparagales Ľaliotvaré

Čeľad Amaryllidaceae Amarylkovité

Rod Narcissus L. Narcis

Rastliny rodu Narcissus L. sa vyskytujú v rôznych nadmorských výškach – na úpätiach hôr,

lúkach, brehoch riek a lesoch. Narcisy kvitnú na jar, následne dochádza k opadnutiu listov

a prechodu do letnej, podzemnej fázy. Rastlinná cibuľa je v podzemí chránená pred

zvieratami (produkuje alkaloidy, ktoré k tejto ochrane prispievajú) a zachytáva vlhkosť.

V tejto fáze nedochádza k žiadnemu významnému externému rastu a preto sa táto fáza

môže označovať aj ako obdobie pokoja – dormancie. Zimné obdobie je pre rastlinu dôležité,

pretože dochádza k rapídnemu zväčšeniu stonky, čo umožní následne kvitnutie. Po prečkaní

zimy dochádza na jar, v závislosti na vonkajšej teplote, k opätovnému klíčeniu rastliny [24].

Cibuľa v období dormancie pozostáva z viac alebo menej diskovitých plátov

(extrémne krátka podzemná stonka) nesúcich na spodnej strane vedľajšie korene. Na vrchnej

strane sú uložené zásobné orgány (cibuľové pláty – suknice) chrániace zárodok. Cibuľa je

krytá tenkou ochrannou šupinou okrovej a hnedej farby [24, 25].

Nadzemné časti zahrňujú listy, kvetnú stopku a kvet. Listy sú zložené z bazálnej pošvy

a čepele. Cibuľa vytvára polopriehľadný obal, ktorý vyčnieva nad zem. Jeho úloha je

obklopovať a podopierať zelené čiarkovité listy. Až 70 % narcisov má dva až štyri listy,

niektoré ich však môžu mať aj sedem alebo osem. Kvetná stopka je bez listov a na vrchole

nesie kvet. Poupata sú chránené zeleným toulcem, ktorý po zakvitnutí vysychá. Kvety majú

šesť okvetných lístkov usporiadaných v dvoch radoch, ktoré na spodnej strane zrastajú

v trubku s pakorunkou v ústi trubky. Sú pravidelné, obojpohlavné a slabo súmerné.

27

Pakorunka je veľmi rozmanitá, trubkovitá alebo plochá, rôzne veľká a jej usporiadanie je

rozlišujúcim znakom druhov a hlavne kultivarov v záhradníckom členení. Vnútri pakorunky je

šesť tyčiniek a piestik, plodom je trojpuzdrá tobolka. Pre kvety narcisov je typická biela a žltá

farba, pakorunky sú často zafarbené intenzívnejšie ako okvetné lístky a môžu byť žlté, žlté

s červeným lemom, oranžové, ružové až červené [24, 25, 26].

Narcissus pseudonarcissus L. cv. Dutch Master (Obr. 1) patrí do skupiny trubkovitých

narcisov, ktorých znakom je, že trubka je vždy dlhšia ako okvetné lístky. Kvet je žltej farby

[25].

Obr. 1: Narcissus pseudonarcissus L. cv. Dutch Master [27]

28

3.2.2 Obsahové látky rodu Narcissus L.

Pre rod Narcissus L. a aj pre čeľaď Amaryllidaceae, do ktorej patrí, je typický obsah

alkaloidov. Od prvej izolácie alkaloidu lykorínu z rastliny Narcissus pseudonacissus L. na konci

19. storočia, bolo na prítomnosť alkaloidov otestovaných asi 200 druhov tohto rodu. Doteraz

sa v rámci čeľade Amaryllidaceae podarilo izolovať už viac ako 500 rôznych druhov

alkaloidov. Ich základná chemická štruktúra pozostáva z:

- základného kruhového uhlíkového systému C1 – C6 odvodeného od fenylalanínu

a bázického dusíkatého systému N – C2 – C6 syntetizovaného z tyrozínu

- sú slabo bázické, hodnota pKa je v rozmedzí 6 – 9

- väčšina alkaloidov obsahuje len jeden dusíkatý atóm, ktorý môže byť sekundárny,

terciárny až kvartérny a počet atómov uhlíka je väčšinou 16 – 20 [24, 28]

Alkaloidy sú na základe podobnosti ich chemických štruktúr roztriedené do skupín,

pomenovaných podľa ich reprezentatívneho zástupcu. Medzi týchto zástupcov patrí –

norbelladín, lykorín, homolykorín, hemantamín, narciklasín, tazettín, montanín a galantamín

[23]. V súčasnosti však neexistuje žiadna presná dohoda o názve skupín alebo ich počte.

Alkaloidy sú v rastlinách prítomné hlavne v cibuliach a ich biosyntéza vychádza zo

spoločného prekurzoru norbelladínu [28]. Spočiatku boli alkaloidy izolované a detekované

pomocou základných fytochemických a spektrometrických metód, bez možnosti určenia ich

percentuálneho podielu v celkovej zmesi. Odhadovaný počet bol 5 – 10 typov alkaloidov na

rastlinu. So zavedením GC-MS analýzy sa zistilo, že rastliny obsahujú 5 – 30 rôznych druhov

alkaloidov, pričom niektoré boli dominantné, iné minoritné a niektoré sa vyskytovali len

v stopových množstvách [29]. Alkaloidy však nie sú jediné sekundárne metabolity

vyskytujúce sa v tejto čeľadi. Okrem nich sa v rastlinách vyskytujú v menšej či väčšej miere aj

flavonoidy, chalkóny, chromóny, terpény, steroly, glukany, polysacharidy, mastné kyseliny

(k. myristová, k. olejová, k. steárová) a ich estery. Využitie týchto látok v praxi však

nedosahuje významu alkaloidov [30]. Základná schéma biosyntézy alkaloidov je zobrazená na

obrázku 2.

29

Obr. 2: Schéma syntézy alkaloidov čeľade Amaryllidaceae [29]

30

3.2.3 Biologický účinok alkaloidov

Rastliny z rodu Narcissus L. sa už v minulosti využívali ako prostriedky na vyvolávanie tranzu,

halucinácie, prípadne boli používané k samovraždám. Už dávno bolo známe, že požitie cibúľ

narcisov je životu nebezpečné a spôsobuje tieto príznaky – salivácia, abdominálne bolesti,

kŕče, nauzeu, zvracanie, prípadne arytmie. V prípade otravy, ktorých je vďaka chuti cibule

veľmi málo, je ako antidotum podávaný atropín [24]. Na druhú stranu, môžeme tieto látky

využiť aj v náš prospech. Mnoho izolovaných alkaloidov má výrazné účinky na aktivity celej

rady fyziologicky významných enzýmov, hlavne inhibícia AChE a BuChE. V čeľadi sa vyskytuje

aj mnoho zástupcov s antibakteriálnou a antivírusovou aktivitou. U niektorých je prítomná

cytotoxicita k eukaryotickým bunkám, pričom nejde len o zdravé bunky ale predovšetkým

o nádorovo premenené. Niektoré pôsobia protizápalovo, dokážu indukovať apoptózu buniek

a majú aj významnú antimalarickú aktivitu [31, 32].

3.2.3.1 Alkaloidy galantamínového typu

Alkaloidy patriace do tejto skupiny sú chemicky odvodené od dibenzofuránu, pričom medzi

najvýznamnejších zástupcov patria – galantamín, epinorgalantamín a lykoramín (Obr. 3) [32].

Prirodzene sa druhy s obsahom galantamínu vyskytujú v oblasti východnej Európy, Turecka

a Kaukazu. Obsah galantamínu v jednotlivých druhoch narcisov je rôzny a môže dosahovať až

0,5 % hmotnosti sušenej cibule, pričom u niektorých rastlín tvorí až 50% podiel z celkovej

frakcie alkaloidov. Práve z oblastí východnej Európy pochádzajú prvé nepotvrdené správy

o využívaní odvarov z cibúľ pri liečbe poliomyelitídy v rámci ľudovej medicíny. Počiatočný

výskum galantamínu bol kvôli obdobiu studenej vojny obmedzený len na krajiny ZSSR. Prvý

dôkaz o schopnosti galantamínu inhibovať AChE priniesli v roku 1951 Mashkovsky a Kruglika-

Lvova (potlačil efekt jedu kurare na svalových vláknach in vitro). Rok 1952 sa zapísal do

histórie prvou izoláciou galantamínu z Galanthus woronowii Losinsk. [33]. Od tejto doby sa

experimentálne využíval pri liečbe neurologických porúch ako sú myastenia gravis, rôzne

demencie, detská mozgová obrna a poliomyelitída [32]. Dôvodom k nasadzovaniu

galantamínu na liečbu týchto chôrob bolo aj zistenie, že dobre prechádza cez

hematoencefalickú bariéru. Na konci 50. rokov 20. storočia bol registrovaný pod obchodným

názvom NIVALIN (pod týmto názvom užívaný v Bulharsku). V roku 1997 získala spoločnosť

Sanochemia Pharmazeutika patent na jeho syntetickú prípravu. Následne prišiel na trh

31

prípravok REMINYL, ktorý bol postupne zaregistrovaný v mnohých štátoch sveta [33].

V Českej republike je v súčasnosti zaregistrovaný a obchodovaný jediný prípravok s obsahom

galantamínu – GALANTAMIN MYLAN ( 8, 16, 24 mg kapsle s predĺženým uvoľňovaním) [34].

N-alkylované deriváty galantamínu získane z Leucojum aestivum L. vykazujú výrazne

vyššiu inhibičnú schopnosť ako samotný galantamín. Prítomnosť metoxylovej skupiny na C-9

a alkylovej skupiny na dusíku je predpokladom ich vyššej penetrácie cez hematoencefalickú

bariéru. Nanešťastie sa tieto deriváty vyskytujú v rastlinách len v stopových množstvách,

takže momentálne sú len súčasťou výskumu. Alkaloid sangvinín je asi desaťkrát účinnejším

inhibítorom ako galantamín, no kvôli hydroxylovej skupine neprestupuje cez

hematoencefalickú bariéru [35]. Lykoramín sa kvôli svojmu odlišnému priestorovému

usporiadaniu neviaže na AChE a nevykazuje tak žiadny inhibičný efekt [29].

galantamín

sangvinín

epinorgalantamín

lykoramín

Obr. 3: Alkaloidy galantamínového typu

32

3.2.3.2 Alkaloidy homolykorínového typu

Do tejto skupiny patrí množstvo látok, avšak len pár z nich má preukázateľný biologický

efekt. Tieto alkaloidy sú odvodené od 2-benzopyrano-[3,4-g]indolu a patrí sem napr.

homolykorín, lykorenín, hippeastrín (Obr. 4). Medzi pozitívne vlastnosti týchto látok patrí

schopnosť inhibovať rast niektorých nádorových buniek napr. HepG2 buniek ľudského

karcinómu pečene a MOLT-4 leukemických buniek. Negatívom je, že vykazujú aj cytostatický

efekt k nenádorovým LMTK bunkám myších fibroblastov [32]. Ďalším pozitívnym účinkom je

potlačenie replikácie vírusu chrípky v infikovaných bunkách. Alkaloidy síce nezabránia

replikácii RNA ale bránia vytvoreniu kompletnej vírusovej častice a sú účinnejšie v

počiatočných štádiách infekcie. Lykorín je účinný aj proti ľudským enterovírusom, vírusu

SARS a niektoré jeho deriváty majú významný antimalarický účinok na Plasmodium

falciparum (homolykorín nemá žiadny antimalarický efekt) [36, 37]. K ďalším biologickým

účinkom patrí aktivita hippeastrínu proti vírusu Herpes simplex a jeho antimykotický účinok

na Candida albicans [32].

Obr. 4: Alkaloidy homolykorínového typu

lykorenín

homolykorín hippeastrín

33

3.2.3.3 Alkaloidy hemantamínového a krinanového typu

Do tejto skupiny alkaloidov môžeme zaradiť hemantamín, hemantidín, krinamín, maritidín

a papyramín (Obr. 5). Látky sú odvodené od etanofenantridínu a vykazujú určitú schopnosť

inhibovať rast rozličných typov nádorových buniek, pričom medzi najúčinnejšie alkaloidy

patrí hemantidín a krinamín [32]. Tieto dve látky dokázali po 48 hodinách v koncentrácii

25 µM navodiť apoptózu u 85 – 90 % nádorových buniek 5123tc (bunky pečeňového nádoru

potkana). Ďalším pozitívnym účinkom bolo, že v testoch na nenádorových ľudských bunkách

HEK 293T nenavodzovali v podobných koncentráciách apoptózu. Počas štúdia závislosti

štruktúry a účinku sa zistilo, že deriváty, ktoré nemajú voľnú hydroxylovú skupinu v polohe

C-11 nemajú cytotoxické vlastnosti – hlavne schopnosť indukovať apoptózu. Voľná

hydroxylová skupina je tak pre tento účinok nenahraditeľná [38]. Podobne ako alkaloidy

homolykorínového typu, vykazujú aj niektoré látky z tejto skupiny antivirotický efekt na vírus

chrípky [33]. Hemantidín má taktiež antiparazitické, protizápalové a analgetické účinky,

ktorých efekt je porovnateľný s kyselinou acetylsalicylovou [32]. Krinamín je účinný voči

Entamoeba hystolitica [30]. Veľmi perspektívnym alkaloidom tejto skupiny je undulatín,

ktorý významne inhibuje aktivitu AChE a POP a prechádza hematoencefalickou bariérou [39].

hemantamín

hemantidín

krinamín

Obr. 5: Alkaloidy hemantamínového a krinanového typu

34

3.2.3.4 Alkaloidy lykorínového typu

Alkaloidy tejto skupiny patria medzi najznámejšie a z pohľadu cytotoxicity medzi

najúčinnejšie. Hlavným zástupcom je pyrolfenantridínový cyklický alkaloid lykorín – prvý

izolovaný alkaloid čeľade Amaryllidaceae (Obr. 6). K ďalším zástupcom patrí napr.

pseudolykorín, amarbellisín, galantín a anhydrolykorín. Lykorín má rozmanité biologické

vlastnosti. U rastlín je známa jeho schopnosť inhibovať syntézu kyseliny askorbovej

prostredníctvom potlačenia aktivity enzýmu galaktodehydrogenázy [32]. Zaujímavou

vlastnosťou je aj inhibícia rastu rastlín. V pokusoch, kde boli sušené listy rastliny Lycoris

radiata Herb. zmiešané s pôdou obsahujúcou semená rôznych rastlín, došlo v porovnaní

s kontrolnou skupinou (pôda bez listov Lycoris radiata Herb.) k výraznému spomaleniu rastu.

Ako hlavná účinná látka v listoch Lycoris radiata Herb. bol identifikovaný lykorín. Okrem

listov sa lykorín vyskytuje hlavne v cibuli a do pôdy môže byť uvoľnený pri poškodení cibule

alebo pri prípadnom odumieraní rastliny. Tento efekt by sa mohol v budúcnosti využiť pri

vytváraní nových typov herbicídov [40]. Okrem rastlín pôsobí lykorín aj na kvasinky

Saccharomyces cerevisie (antimykotický efekt) a má fatálny vplyv na prvoka Trypanosoma

brucei. Najdôležitejšou vlastnosťou lykorínu je jeho protinádorová aktivita, ktorá bola

preukázaná v mnohých výskumoch, napr. in vivo na bunkách myšieho melanómu BL6,

Lewisovho pľúcneho karcinómu a in vitro na bunkách HeLa, CEM, K562. Na molekulárnej

úrovni môžeme popísať jeho proapoptické účinky vďaka pôsobeniu na vnútornú

mitochondriálnu cestu prostredníctvom „down“ regulácie proteínu Mcl-1. Tento proteín

patrí do skupiny Bcl-2 proteínov, ktoré majú významný vplyv na reguláciu apoptózy. Zvýšená

expresia Mcl-1 je typická pre niektoré nádorové bunky a zaručuje ich odolnosť voči apoptóze

vyvolanej liečbou bežnými chemoterapeutikami. Práve u týchto typov buniek môžeme

očakávať ich zvýšenu citlivosť k lykorínu [32]. Lykorín je známy aj analgetickým,

hepatoprotektívnym a protizápalovým účinkom. Taktiež je silný antioxidant, čo prispieva

k jeho hepatoprotektívnym a protizápalovým vlastnostiam [41]. Medzi účinné protinádorové

látky patria tiež pseudolykorín a amarbellisín (Obr. 6). Cytotoxický účinok pseudolykorínu je

založený na vyvolaní apoptózy prostredníctvom inhibície proteosyntézy v štádiu formovania

peptidovej väzby. Podrobný efekt účinku amarbellisínu zatiaľ nie je známy [32].

35

lykorín

pseudolykorín

amarbellisín

Obr. 6: Alkaloidy lykorínového typu

3.2.3.5 Alkaloidy pankratistatínového typu

Alkaloidy tejto skupiny sú odvodené od molekuly fenantridínu a medzi najvýznamnejších

zástupcov patria narciklasín a pankratistatín (Obr. 7). Účinok narciklasínu spočíva v jeho

väzbe na 60S ribozomálnu podjednotku, kde inhibuje účinok peptidyltransferázy a následne

zabraňuje vzniku nových proteínov. Podobne ako niektoré známe cytostatika, narciklasín

pravdepodobne interaguje alebo tvorí komplexy s molekulou DNA živočíšnych buniek. Štúdie

taktiež preukázali proapoptický efekt narciklasínu na bunky MCF-7 (adenokarcinóm pŕs)

a PC-3 (karcinóm prostaty) sprostredkovaný aktiváciou kaspáz, prípadne väzbou alkaloidu na

receptor smrti – death receptor (DR4) [32, 42]. V 50nM koncentrácii zastavil mitózu

v bunkách karcinómov a gliómov. Naopak, v 1µM koncentrácii nedokázal navodiť smrť

v apoptóze rezistentných bunkách U373 GBM (bunky glioblastómu) [42]. Medzi ďalšie

významné biologické účinky patrí jeho baktericídna aktivita na Corynebacterium fascians,

antifungálna voči Candida albicans a protivírusová aktivita proti RNA vírusom spôsobujúcim

hemoragickú horúčku (flaviviry, bunyaviry) [32]. Na rozdiel od pankratistatínu, narciklasín je

36

významným inhibítorom cytochrómového systému CYP3A4, čo môže byť v terapii rakoviny

a iných pridružených chorôb zásadný problém [43]. Pankratistatín, prvýkrát izolovaný z ľalie

Hymenocallis littoralis (Jacq.) Salisb., taktiež vykazuje významný protinádorový efekt. In vitro

pokusy na bunkách SHSY-5Y (bunky ľudského neuroblastómu) v 1µM koncentrácii ukázali, že

po 24 hodinách inkubácie preukazovalo až 90 % buniek známky apoptózy. Taktiež došlo

k zvýšeniu koncentrácie aktívnych kyslíkových radikálov už po troch hodinách inkubácie.

Tento efekt mal za následok pokles tvorby ATP. Pozitívnou správou je aj to, že pankratistatín

neovplyvňoval rast, proliferáciu, apoptózu a zvýšenie koncentrácie kyslíkových radikálov

u nenádorových buniek ľudských fibroblastov. Napriek svojím pozitívnym účinkom je

pankratistatín stále nedostupný kvôli jeho nízkemu výskytu v rastlinách a náročnej syntéze

v laboratórnych podmienkach [44].

pankratistatín

narciklasín

Obr. 7: Alkaloidy pankratistatínového typu

3.3.3.6 Alkaloidy tazettínového typu

Pre tieto alkaloidy je typická štruktúra 2-benzopyrano-[3,4c]indolu, pričom medzi

najznámejších zástupcov môžeme zahrnúť tazettín a pretazettín (Obr. 8). Pretazettín patrí

medzi najaktívnejšie alkaloidy účinné proti T-lymfoidným bunkám MOLT-4. Je účinný aj na

bunky Lewisovho karcinómu pľúc, bunky Rauscher leukémie a HeLa bunky. Patrí medzi

silných inhibítorov P-glykoproteínu a má schopnosť viazať na seba enzým RNA-dependentnú

DNA polymerázu u rozdielnych typov onkogénnych vírusov. Účinkuje aj proti vírusu Herpes

simplex a flavivírusom [32]. Jeho cytotoxicita je porovnateľná s cisplatinou (v porovnaní

protinádorovej schopnosti s homolykorínom, ismínom, trisferidínom a 2-O-acetyllykorínom

37

dosiahol najlepšie výsledky). Významnou vlastnosťou, ktorá sa preukázala v testoch

s bunkami L5178 MDR (bunky myšieho lymfómu), je aj schopnosť potencovať

antiproliferatívny účinok doxorubicínu [45]. Tazettín, ktorý vzniká premenou pretazettínu,

nemá významnejšie protinádorové účinky. V rámci štúdií týkajúcich sa jeho biologickej

aktivity boli preukázané slabé hypotenzívne a antimalarické vlastnosti [46].

pretazettín

tazettín

Obr. 8: Alkaloidy tazettínového typu

3.2.4 Potenciálne zdroje alkaloidov čeľade Amaryllidaceae

Látky s významným biologickým efektom sa často vyskytujú v rastlinách len v obmedzenom

množstve, len v určitých tkanivách, prípadne je kultivácia rastliny náročná. Práve kvôli týmto

dôvodom je cieľom mnohých výskumov objaviť inú formu syntézy alkaloidov. Medzi tieto

procesy patrí čiastočná alebo úplná chemická syntéza, produkcia pomocou bunkových alebo

tkanivových kultúr, vyšľachtenie kultivarov nenáročných na pestovanie s čo najvyšším

obsahom požadovaných alkaloidov, prípadne zavedenie génov potrebných pre syntézu

alkaloidu do inej rastliny alebo mikroorganizmu. Alkaloidy tejto čeľade majú zložitú chemickú

štruktúru a priestorové usporiadanie, čo spomaľuje a ekonomicky predražuje proces ich

získavania inou cestou. V súčasnosti je jediným komerčne vyrábaným alkaloidom galantamín,

ktorý aj napriek tomu, že je známa jeho chemická syntéza, je z ekonomických dôvodov stále

izolovaný z rastlín [28].

38

4. EXPERIMENTÁLNA ČASŤ

39

4.1 Obecné postupy

4.1.1 Príprava a čistenie rozpúšťadiel

Všetky komerčné rozpúšťadlá použité v práci boli pred použitím prečistené destiláciou. Podľa

tabuľkových hodnôt teploty varu daného rozpúšťadla bola zachytená hlavná frakcia s tým, že

bolo predestilovaných maximálne 95 % objemu rozpúšťadla. Rozpúšťadla boli uchovávané

v tmavých nádobách.

4.1.2 Sušenie a skladovanie izolovaných čistých látok

Získané izolované čisté látky boli po odparení vo vákuovej odparke umiestnené na 24 hodín

do exsikátoru a následne skladované pri teplotách 2 – 8 oC .

4.1.3 Tenkovrstvá chromatografia

Vzostupná tenkovrstvá chromatografia bola vykonávaná v uzavretých komorách nasýtených

parami mobilnej fáze. Prítomnosť alkaloidov bola následne preukázaná pozorovaním pod UV

lampou v rozmedzí vlnových dĺžok 254 nm a 366 nm. Po nastriekaní Dragendorffového

činidla sa škvrny alkaloidov zafarbili červeno-oranžovo.

4.2 Materiál a vybavenie

4.2.1 Chemikálie a rozpúšťadlá

Acetón č. (Penta a.s., Ing. Petr Švec) (Ac)

Amoniak vodný roztok 25% – 29% č. (Penta a.s., Ing. Petr Švec) (NH3)

Chloroform č. (Penta a.s., Ing. Petr Švec) (CHCl3)

Cyklohexán p.a. (Penta a.s., Ing. Petr Švec) (CHx)

Dietylamín p.a. (Penta a.s., Ing. Petr Švec) (Et2NH)

Dietyléter (Penta a.s., Ing. Petr Švec) (Et2O)

Destilovaná voda (Millipore, Milford, MA, USA) (H2O)

Etanol 95% (lihovar Chrudim) (EtOH2)

Etyl-acetát (Penta a.s., Ing. Petr Švec) (EtOAc)

Lekársky benzín liekopisnej kvality (ČL2009) (Penta a.s., Ing. Petr Švec) (B)

n-Hexán p.a. (Penta a.s., Ing. Petr Švec) (C6H14)

Toluén p.a. (Penta a.s., Ing. Petr Švec) (C6H5CH3)

40

4.2.2 Pomocné látky

Křemelina Celite C 535 John´s Manville (Sigma-Aldrich)

4.2.3 Chromatografické adsorbenty

Kieselgel 60 GF254 (Merck)

Kieselgel 60 GF254 (Merck), 20x20 cm, hliníková doska s vrstvou silikagelu na TLC (0,2 mm)

4.2.4 Detekčné činidlo

Dragendorffovo činidlo – roztok tvorený 1,7 g dusičnanu bizmutitého zásaditého a 20 g

kyseliny vínnej v 80 ml destilovanej vody a roztok tvorený 16 g jodidu draselného v 40 ml

destilovanej vody zmiešaných v pomere 1:1.

4.2.5 Prístrojové vybavenie

Vákuová odparka Büchi Rotavapor R-114 (Büchi, Flawil, Švajčiarsko)

NMR Varian Inovia 500 (Varian, USA)

Plynový chromatograf s hmotnostným detektorom Agilent Technologies 7890A (Agilent

Technologies 7890A, Santa Clara, CA, USA)

Polarimeter P3000 (A. Krüss Optronic, Nemecko)

UHPLC systém Acquity UPLC I-class (Waters, Milford, USA) spojený s vysoko rozlišujúcim

hybridným hmotnostným spektrometrom (HRMS) Synapt G2Si (Waters, Manchaster, UK)

s kvadrupólovým a preletovým analyzátorom (Q-TOF)

Spektrometer ESI-MS Thermo Finnigan LCQDuo (GenTech Scientific, Arcade, New York, USA)

4.2.6 Rastlinný materiál

Čerstvé cibule Narcissus pseudonarcissus L. cv. Dutch Master boli objednané u firmy Lukon

Glads (Sadská, Česká republika). Verifikáciu vykonal prof. RNDr. Lubomír Opletal, Csc.,

dokladová vzorka rastliny je uložená v herbári Farmaceutickej fakulty Univerzity Karlovej

v Hradci Králové.

41

4.3 Metódy použité pre štruktúrnu identifikáciu alkaloidov

4.3.1 GC-MS analýza

K identifikácii alkaloidov bol použitý plynový chromatograf Agilent Technologies 7890A

s Triple-Axis hmotnostným detektorom Agilent Technologies 5975C. Nástrek vzorku

prebehol pri teplote 280 oC v objeme 1 µl a split pomerom 15:1. Delenie zmesi prebehlo na

kolóne Agilent Technologies HP-5MS pri teplotnom programe 15 oC/min z teploty 100 oC na

180 oC. Po minúte udržovania teploty na hodnote 180 oC pokračovalo zvyšovanie teploty

v gradiente 5 oC/min z teploty 180 oC na 300 oC. Teplota 300 oC bola udržiavaná po dobu 40

minút. Nosným plynom bolo He pri prietoku 0,8 ml/min. Ionizácia prebehla pri 230 oC

elektrónmi (70 eV) a detekované boli fragmenty v rozmedzí 40 – 600 m/z. Alkaloidy boli

identifikované pomocou porovnávania ich spektier so spektrami dostupnými v komerčnej

knižnici spektier NIST, v odbornej literatúre a s ostatnými spektrami látok, ktoré boli

izolované na Katedre farmaceutickej botaniky a ekológie.

4.3.2 NMR analýza

Štruktúra alkaloidov sa zisťovala pomocou NMR spektier na prístroji Varian Inova 500.

Pracovná frekvencia bola pre 1H 499,9 MHz a pre 13C 125,7 MHz. Spektrá 1H boli merané

v inverznej 5mm ID PGF sonde s využitím štandardných pulzných frekvencií. Pre meranie 13C

spektier bola použitá 5mm SW širokopásmová sonda. Meranie bolo prevedené

v deuterochloforme pri teplote 25 oC.

4.3.3 HRMS-Q-TOF MS (ESI) analýza

Presná molekulová hmotnosť bola stanovená pomocou HRMS-Q-TOF MS (ESI) (hmotnostná

spektrometria s ionizáciou elektrosprejom s vysokým rozlíšením). Hmotnostné spektrá boli

namerané UHPLC systémom UPLC I-class (Waters, Milford, USA) spojeným s vysoko

rozlišujúcim hybridným hmotnostným spektrometrom (HRMS) Synapt G2Si (Waters,

Manchaster, UK) s kvadrupólovým a preletovým analyzátorom (Q-TOF). Chromatografia bola

prevedená pomocou kolóny Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 µm). Využitá bola

gradientová elúcia acetonitrilom a 0,1% kyselinou mravčou, s prietokom 0,4 ml/min.

Ionizácia elektrosprejom prebehla v pozitívnom móde. Spektrá boli zaznamenávané

42

v rozsahu 200 – 1200 m/z za použitia leucín-enkefalínu ako hmotnostného štandardu

a sodnej soli kyseliny mravčej ako kalibrátoru.

4.3.4 MS (ESI) analýza

MS (ESI) spektrá boli namerané na spektrometri LC-MS Thermo Finnigan LCQDuo

s ionizáciou elektrosprejom v kladnom móde a iontovou pascou ako analyzátorom. MSn bola

prevedená pri kolíznej energii 40 eV. Alkaloidy boli rozpustené v metanole (0,5 mg/ml) a

zavedené priamo na sondu.

4.3.5 Optická otáčavosť

Optická otáčavosť bola stanovená polarimetrom P3000 v prostredí chloroformu pri 25 oC.

4.4 Izolácia alkaloidov

4.4.1 Extrakcia drogy a spracovanie extraktu

Cieľom práce bolo izolovať aspoň dva alkaloidy v čistej forme zo spojenej podfrakcie

ND 3 – 5/2. Podfrakcia ND 3 – 5/2 bola získaná stĺpcovou chromatografiou alkaloidného

sumárneho extraktu, ktorý bol separovaný na 11 frakcií (Tab. 8, Obr. 9). Príprava

alkaloidného extraktu a jeho následná separácia pomocou stĺpcovej chromatografie bola

prevedená Mgr. Danielou Hulcovou v rámci jej dizertačnej práce. Presný popis prípravy

a jeho stĺpcovej chromatografie je uvedený v diplomovej práci Mgr. Zdeňky Dvořákovej [47].

Priebeh chromatografickej separácie popisuje tabuľka 8. Jednotlivé spojené frakcie sú

znázornené na obrázku 9.

43

Tab. 8: Výsledky stĺpcovej chromatografie [47]

Označenie Frakcia Mobilná fáza Hmotnosť

(g)

ND1 46 – 51 B : CHCl3 (3:2) 0,4

ND2 51 – 57 B : CHCl3 (1:1) 1,11

ND3 58 – 82 B : CHCl3 (1:1) 9,38

ND4 83 – 94 B : CHCl3 (1:1) 2,49

ND5 95 – 138 B : CHCl3 (9:11) 7,85

ND6 139 – 165 B : CHCl3 (9:11) 3,21

ND7 166 – 194 B : CHCl3 (9:11) 4,83

ND8 195 – 206 B : CHCl3 (9:11) 1,11

ND9 207 – 289 B : CHCl3 (1:3, 1:4, 3:17, 1:9) CHCl3 14,93

ND10 290 – 292 CHCl3 : EtOH (1:1) 7,24

ND11 293 – 301 CHCl3 : EtOH (1:1) 1,68

Celkovo 54,22

Obr. 9: Chromatografia 1 – kontrolné TLC spojených frakcií z alkaloidného výtrepku (SiO2 60 GF254), detekcia UV + Dragendorffovo činidlo, sústava To : Et2NH 9:1, dráha 8,5 cm, počet vyvíjaní 1x [47]

44

Po vyhodnotení kontrolného TLC boli frakcie ND 3 – ND 5 veľmi podobné a preto boli

spojené (cca 18g), pre stĺpcovú chromatografiu, ktorá bola prevedená Mgr. Danielou

Hulcovou (chromatografia č. 2). Rozter bol pripravený rozpustením spojených frakcií v CHCl3,

zmiešaním s adsorbentom (1420 g deaktivovaného silikagelu) a odparený na vodnom kúpeli.

Kolóna s priemerom 5,8 cm a dĺžkou 100 cm mala mŕtvy objem 2,18 l. Ako mobilné fázy boli

použité zmesi CHCl3 : B (1:1, 3:2, 75:40), CHCl3, zmes CHCl3 : EtOH (17:3, 3:1) a EtOH.

Výsledných 13 frakcií bolo zachytávaných po 500 ml (Obr. 10).

4.5 Izolácia alkaloidov z podfrakcie ND 3 – 5/2

V rámci tejto rigoróznej práce bola prevedená separácia alkaloidov z podfrakcie ND 3 – 5/2

(892mg) (Obr. 10). K primárnemu deleniu alkaloidov bola použitá preparatívna TLC na 32

naliatých doskách 15x15 cm (dráha 12,5 cm) so silikagelom 60 GF254 a sústavou

B : CHCl3 : Et2NH v pomere 85:15:5. Na každú dosku bolo nanesených približne 30 mg

extraktu, pričom vyvíjanie prebehlo celkovo štyrikrát. Prítomné boli štyri hlavné línie

alkaloidov (L1, L2, L3, L4) (Obr. 11).

Obr. 10: Chromatografia 2 – kontrolné TLC spojených frakcií ND 3 – ND 5 (SiO2 60 GF254), detekcia UV + Dragendorffovo činidlo, sústava To : Et2NH 9:1, dráha 8,5 cm, vyvíjané 1x

45

Následne boli jednotlivé línie vyškrabané, eluované zmesou CHCl3 : EtOH v pomere 1:1

a vysušené v jednotlivých bankách. Celkový prehľad hmotností jednotlivých získaných línií

sumarizuje tabuľka 9.

Tab. 9: Rozdelenie podfrakcie ND 3 – 5/2 do jednotlivých línií

Línia Rf m (mg)

L1 0,52 35,3

L2 0,44 113,0

L3 0,38 75,0

L4 0,30 297,1

Následné prečistenie alkaloidov prebiehalo pomocou preparatívnej TLC na 24 ks komerčne

dostupných doskách (Kieselgel 60 GF254 Merck, veľkosť 10x20 cm, dráha 8 cm) za použitia

mobilnej fáze B : CHCl3 : Et2NH v pomere 85:15:5. Vyvíjanie prebehlo celkovo štyrikrát.

Následne boli línie vyškrabané, rozpustené a vysušené rovnako ako v prípade primárneho

delenia. Z línie L1 bol izolovaný žltkastý amorfný alkaloid MF-1 (18mg) a podobne z línie L2

žltkastý amorfný alkaloid MF-2 (20mg), ktoré boli podrobené štruktúrnej analýze – MS (EI,

ESI), NMR a optickej otáčavosti. Naopak, línie L3 a L4 obsahovali väčšie množstvo látok, ktoré

sa však aj napriek mnohonásobným pokusom nepodarilo oddeliť. Následne bola separácia

týchto línií ukončená.

Obr. 11: Kontrolné TLC podfrakcie ND 3 – 5/2, sústava B : CHCl3 : Et2NH v pomere 85:15:5, detekcia UV + Dragendorffovo činidlo, dráha 8 cm, vyvíjané 4x

46

4.6 Stanovenie cholínesterázovej inhibičnej aktivity izolovaných alkaloidov

4.6.1 Chemikálie

Acetyltiocholín jodid (Sigma-Aldrich) (použitý 10mM roztok)

Butyryltiocholín jodid (Sigma-Aldrich) (použitý 10mM roztok)

5,5´-ditiobis-2-nitrobenzoová kyselina ≥ 98% (DTNB) (Sigma-Aldrich) (použitý 5mM roztok)

Dihydrogénfosforečnan sodný dihydrát, p.a. (NaH2PO4.2H20) (Lachema)

Hydrogénfosforečnan disodný dodekahydrát, p.a. (Na2HP04.12H20), (Lachema)

Huperzín A (Tazhonghui Co., Ltd., China)

Fyzostigmín 98% (Sigma-Aldrich)

Dimetylsulfoxid ˃99,5% (DMSO) (Sigma-Aldrich)

Galantamín hydrobromid (Changsha Organic Herb Inc., China)

4.6.2 Pufry

4.6.2.1 5mM fosfátový pufr, pH 7,4

Zásobný roztok A – 10mM roztok NaH2P04 (1 liter roztoku obsahuje 1,2 g NaH2P04)

Zásobný roztok B – 10mM roztok Na2HP04 (1 liter roztoku obsahuje 1,42 g Na2HP04)

Zmieša sa 57 ml roztoku A s 283 ml roztoku B a 300 ml vody.

4.6.2.2 100mM fosfátový pufr, pH 7,4

Zásobný roztok A – 200mM roztok NaH2P04 (1 liter roztoku obsahuje 24,0 g NaH2P04)

Zásobný roztok B – 200mM roztok Na2HP04 (1 liter roztoku obsahuje 28,4 g Na2HP04)

Zmieša sa 57 ml roztoku A s 243 ml roztoku B a 300 ml vody.

4.6.2.3 5mM fosfátový pufr, pH 7,4, obsahujúci 150 mM chloridu sodného (NaCl)

8,766 g NaCl p.a. sa rozpustí v 5mM fosfátovom pufri pH 7,4 a doplní sa ním na 1000 ml

4.6.3 Prístrojové vybavenie

Reader SynergyTM HT Multi-Detection Microplate Reader (BioTek, USA)

Odstredivka Boeco U-32R (Boeco, Hamburg, Germany) s rotorom Hettich 1611 (Hettlich,

Tuttlingen, Germany)

47

4.6.4 Podmienky merania

Meranie prebiehalo pri teplote 37 oC v prostredí fosfátového pufru. Vznikajúce farebné

produkty boli stanovené spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke 436 nm (AChE) a 412 nm

(BuChE) v prípade cholínesterázovej aktivity.

4.6.5 Biologický materiál

Zdrojom AChE bol hemolyzát ľudských erytrocytov, zdrojom BuChE bola ľudská plazma.

Erytrocyty sa získali z čerstvo odobranej citrátovanej krvi zdravých dobrovoľníkov.

Bezprostredne po odbere sa krv rozdelila rovnomerne po 5 ml do uzatváracích skúmaviek

a centrifugovala sa pri rýchlosti 4000 rpm pri teplote 4 oC po dobu 10 minút. Po tejto

centrifugácii sa plazma odobrala tak aby v nej neboli erytrocyty a uchovávala sa v chladničke

pri teplote 4 oC do doby stanovenia aktivity BuChE, ktorá bola prevedená do 6 hodín.

Zbytok plazmy z erytrocytárneho sedimentu sa opatrne odsal bezpopolovým

filtračným papierom s hladeným povrchom a odčítal sa objem erytrocytárnej masy. Tento

objem sa zriedil rovnakým objemom 5mM fosfátového pufru pH 7,4, ktorý obsahoval

150 mM chloridu sodného a suspenzia sa rozdelila do skúmaviek s objemom 13 ml. Následne

sa dobre premiešala a previedla sa centrifugácia rovnakým spôsobom ako je uvedené vyššie

pri oddeľovaní plazmy. Premytie týmto spôsobom sa previedlo trikrát a premývacia

kvapalina sa dokonale odstránila. Potom sa pridalo také množstvo 5mM fosfátového pufru

pH 7,4 bez obsahu chloridu sodného aby bol objemový pomer erytrocyty : pufr 1:9. Zmes sa

opäť zhomogenizovala, preliala sa do Erlenmayerovej banky a erytrocyty sa nechali

spontánne hemolyzovať pri miešaní teflónovým miešadlom s otáčkami 300 rpm. Hneď po

skončení tejto riadenej hemolýzy sa stanovila aktivita, prípadne sa 5mM fosfátovým pufrom

upravila absorbancia (hodnota absorbancie musela byť 0,08 – 0,15) a nariedený hemolyzát

sa uchovával do doby použitia pri teplote -22 oC.

4.6.6 Stanovenie cholínesterázovej inhibičnej aktivity

Pre stanovenie hodnoty IC50 sa použila Ellmanova spektrofotometrická metóda s použitím

DTNB. Ako substráty sa používali estery tiocholínu. Pri reakcii vznikal žlto sfarbený produkt,

ktorý sa stanovil spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke λ=436 nm alebo λ=412 nm. Sledoval

sa nárast absorbancie za 1 minútu. Hodnoty IC50 boli vypočítané z nameraných hodnôt

48

poklesu aktivity AChE alebo BuChE nelineárnou regresiou v programe GraphPaD Prism.

Percentá inhibície (% I) boli počítané podľa vzorca I = 100-(ΔABL/ΔASA)*100, kde ΔABL bol

nárast absorbancie slepého vzorku a ΔASA bol nárast absorbancie meraného vzorku. Do

jamiek mirkotitračných doštičiek sa v prípade slepého vzorku napipetovalo 8,3 µl plazmy

alebo hemolyzátu, pridalo sa 283 µl 5mM DTNB, 8,3 µl DMSO a po 2 minútovom premiešaní

sa zmes inkubovala v komore readera pri teplote 37 oC, po dobu 5 minút. Potom sa pridalo

33,3 µl roztoku substrátu (acetyltiocholín jodidu alebo butyryltiocholín jodidu) a zistila sa pri

príslušnej vlnovej dĺžke hodnota absorbancie. U meraných látok sa použili rovnaké objemy

činidiel a roztoku substrátu. Namiesto DMSO (ten sa použil len do jamiek s porovnávacím

roztokom) sa pridali roztoky meranej látky s rôznou koncentráciou (40,0; 10,0; 4,0; 1,0; 0,4;

0,1; 0,04; 0,01; 0,004; a 0,001mM v DMSO). Meranie sa vykonávalo pri teplote 37 oC, vlnovej

dĺžke 436 nm v kinetickom móde po dobu 1 minúty (7 meraní). Pre výpočet IC50 sa použil

program GraphPaD Prism – určila sa 50% inhibičná koncentrácia tak ako je uvedené vyššie.

Cholínesterázová aktivita sa porovnávala s referenčními látkami (galantamínom,

fyzostigmínom a huperzínom A) (Tab. 10).

Tab. 10: Biologická aktivita štandardov

Štandard AChE IC50 (µM) BuChE IC50 (µM)

galantamín 1,71 ± 0,07 42,30 ± 1,30

fyzostigmín 0,063 ± 0,001 0,130 ± 0,004

huperzín A 0,033 ± 0,001 ˃1000

4.7 Stanovenie prolyloligopeptidázovej inhibičnej aktivity

4.7.1 Chemikálie a materiál

Z-gly-pro-p-nitroanilid ≥ 99% (Sigma-Aldrich)

Z-pro-prolinal ≥ 98% (Sigma-Aldrich)

1,4-dioxan p.a. (Sigma-Aldrich)

Dimetylsulfoxid ≥ 95% (Sigma-Aldrich) (DMSO)

Chlorid draselný p.a. (Penta a.s., Ing. Petr Švec) (KCl)

Chlorid sodný p.a. (Lachema, Brno) (NaCl)

49

Dihydrogénfosforečnan draselný bezvodý p.a. (Lach-Ner, Neratovice) (KH2PO4)

Dihydrogén fosforečnan sodný dihydrát (Penta a.s., Ing. Petr Švec) (NaH2PO4.2H2O)

Destilovaná vody (Millipore, Milford, MA, USA) (H2O)

Rekombinantná prolyloligopeptidáza ≥ 90% (Sigma-Aldrich) (rPOP)

Polystyrénové 96 jamkové doštičky s plochým dnom

4.7.2 0,01M sodno-draselný fosfátový pufr, pH 7,4

0,01M sodno-draselný fosfátový pufr, pH 7,4, obsahujúci 137 mM NaCl a 2,7 mM KCl

Zloženie: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4.2H2O a 0,24 g KH2PO4 bolo rozpustených

v 950 ml H2O, pH bolo upravené na hodnotu 7,4 a roztok bol doplnený H2O na 1 l.

4.7.3 Prístrojové vybavenie

Mikrodoštičkový ELISA reader (Multi-mode microplate reader Synergy 2, BioTek Instruments

Inc., Vermont, USA)

4.7.4 Podmienky merania

Meranie prebiehalo pri teplote 37 oC v prostredí fosfátového pufru. Vznikajúci farebný

produkt (p-nitroanilid) sa stanovil spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke 405 nm.

POP bola rozpustená v 0,01M sodno-draselnom fosfátovom pufri. Špecifická aktivita

enzýmu bola 0,2 U/ml. Meranie bolo prevedené na štandardných 96 jamkových

polystyrénových doštičkách s rovným dnom. Zásobné roztoky testovaných látok boli

pripravené pomocou 10 mM DMSO. Z týchto roztokov boli deionizovanou vodou nariedené

testovacie vzorky s koncentráciou 10-3 – 10-7 M. Kontrola prebiehala pomocou rovnakých

koncentrácii DMSO. Z-Gly-Pro-p-nitroanilid, substrát rPOP, bol rozpustený v 50% 1,4-dioxane

(5 mM). V každej reakcii bola 30 minút pri teplote 37 oC inkubovaná zmes rPOP (5 µl),

testovaného vzorku (5 µl) a sodno-draselného fosfátového pufru (170 µl). Po inkubácii bolo

pridaných 20 µl substrátu a nasledovala inkubácia pri teplote 37 oC v dĺžke 30 min. Množstvo

vznikajúceho p-nitroanilidu (merané spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke 405 nm) bolo

priamo závislé na aktivite rPOP. Inhibičná schopnosť bola vyjadrená ako IC50 (koncentrácia

inhibítora, ktorá zníži aktivitu rPOP na 50 %).

50

5. VÝSLEDKY

51

5.1 Štruktúrna analýza O-acetylpluviinu (MF-1)

Sumárny vzorec: C19H23NO4

Molekulárna hmotnosť: 329,40

5.1.1 GC-MS analýza

EI-MS m/z (%): 329(85), 328(11), 270(17), 269(21), 268(86), 254(16), 252(12), 243(41),

242(100)

5.1.2 NMR analýza

5.1.2.1 1H NMR analýza

1H NMR (500 MHz, CDCl3) 6.78 (1H, s, H13), 6.61 (1H, s, H10), 6.02 (1H, d, J=4.0 Hz, H1),

5.44-5.40 (1H, m, H3), 4.19 (1H, d, J=13.6 Hz, H8), 3.86 (3H, s, OCH3), 3.85 (3H, s, OCH3), 3.58

(1H, d, J=13.6 Hz, H8), 3.40-3.34 (1H, m, H6), 2.86-2.79 (1H, m, H16), 2.76-2.60 (4H, m, H2,

H5, H15), 2.46-2.40 (1H, m, H6), 2.40-2.33 (1H, m, H2), 1.91 (3H, s, CH3)

Obr. 12: O-acetylpluviin

Obr. 13: EI-MS spektrum O-acetylpluviinu

52

5.1.2.2 13C NMR analýza

13C NMR (125 MHz, CDCl3i) 170.9 (CO), 147.5 (C11), 147-3 (C12), 139.4 (C4), 128.1 (C9),

126.4 (C14), 114.2 (C3), 110.1 (C10), 107.9 (C13), 66.1 (C1), 61.2 (C16), 56.4 (C8), 55.9

(OCH3), 55.8 (OCH3), 53.8 (C6), 43.4 (C15), 33.4 (C2), 28.6 (C5), 21.3 (CH3)

Obr. 14: 1H NMR spektrum O-acetylpluviinu

53

5.1.3 Optická otáčavosť

[α]25D

= – 82,7° (c = 0,08; CHCl3)

Obr. 15: 13C NMR analýza O-acetylpluviinu

54

5.2 Štruktúrna analýza alkaloidu MF-2

Sumárny vzorec: C33H34N2O5

Molekulárna hmotnosť: 538,64

5.2.1 MS (ESI) analýza

ESI-MS m/z (%): [M+H]+ 539(100), 266(23)

Obr. 16: Alkaloid MF-2

Obr. 17: ESI-MS spektrum alkaloidu MF-2

55

HRMS-Q-TOF MS (ESI): m/z [M+H]+ 539,2543 (experimentálne zistená) a teoreticky

odpovedá sumárnemu vzorcu C33H34N2O5 s molekulárnou hmotnosťou 539,2541. V prípade

tejto zlúčeniny sa jedná o novú, doposiaľ nepopísanú štruktúru. Systematický názov tohto

alkaloidu je 10-metoxy-2-((6-(1-metylindolín-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)metyl)-

4a,5,7,8,9,10,11,12-oktahydro-6H-benzo[2,3]benzofuro[4,3-cd]azepín-7-ón.

5.2.2 NMR analýza

5.2.2.1 1H NMR analýza

Zmes diastereoizomérov v pomere cca 1:1,2

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.05 s a 7.00 s (1H, H3´), 7.04-7.01 m (1H, H12´), 6.81 d (J=7.4

Hz) a 6.69 d (J=7.4 Hz) (1H, H10´), 6.76 s a 6.73 s (1H, H7´), 6.66 t (J=7.2 Hz) a 6.61 t (J=7.2 Hz)

(1H, H11´), 6.63-6.59 m (1H, H7), 6.55 d (J=8.1 Hz) a 6.43 d (J=8.1 Hz) (1H, H8), 5.99-5.96 m

(2H, H5´), 4.67 t (J=3.1 Hz) a 4.54 t (J=3.1 Hz) (1H, H4a), 3.97 d (J=15.2 Hz) a 3.86 d (J=15.2

Hz) a 3.65 d (J=15.2 Hz) a 3.50 d (J=15.2 Hz) (2H, H9), 3.84 s a 3.84 s (3H, OCH3), 3.44 d

(J=14.5 Hz) a 3.36-3.24 m (2H, H1´), 3.30-3.23 m a 3.17 dd (J=18.2 Hz, J=9.2 Hz) a 3.07 dd

(J=18.2 Hz, J=9.2 Hz) (2H, H14´), 3.04-2.73 m (2H, H11), 3.03-2.74 m (2H, H13´), 3.04-2.73 m

a 2.57 td (J=18.9 Hz, J=2.6 Hz) (2H, H4), 2.24 s a 2.19 s (3H, NCH3), 2.38-2.23 m a 1.82-1.63 m

(2H, H1), 2.38-2.23 m a 2.12-1.97 m (2H, H2), 2.12-1.97 m a 1.55-1.49 m a 1.82-1.63 m a

1.37-1.28 m(2H, H12).

Obr. 18: HRMS-Q-TOF MS (ESI) spektrum alkaloidu MF-2

56

5.2.2.2 13C NMR analýza

Zmes diastereoizomérov v pomere cca 1:1,2

13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 209.2 (C3), 150.5 a 150.4 (C15´a), 146.9 (C3´a), 146.7 (C5a),

146.0 a 145.8 (C6´a), 143.6 (C6), 133.6 a 133.4 (C8´), 132.0 (C8b), 131.8 a 131.5 (C9´), 131.0 a

131.0 (C12´a), 130.4 a 130.2 (C10´), 129.9 (C8a), 123.2 a 123.2 (C12´), 122.8 (C2´), 122.2 a

122.2 (C8), 117.9 (C11´), 111.0 a 110.9 (C7), 110.5 a 110.3 (C7´), 108.7 a 108.4 (C3´), 101.0 a

100.9 (C5´), 88.3 a 88.2 (C4a), 57.9 a 57.6 (C9), 57.1 a 56.9 (C14´), 56.0 a 55.9 (OCH3), 54.9 a

53.7 (C1´), 52.3 a 51.1 (C11), 47.5 a 47.4 (C13), 40.0 a 40.0 (C4), 38.8 a 38.7 (NCH3), 37.4 a

36.4 (C12), 35.7 a 35.6 (C2), 29.7 a 29.6 (C1), 28.7 a 28.5 (C13´).

Obr. 19: 1H NMR spektrum alkaloidu MF-2

57

5.2.3 Optická otáčavosť

[]25D

= + 118,4° (c = 0,78; CHCl3)

5.3 Inhibičná aktivita izolovaných alkaloidov voči AChE, BuChE a POP

Tab. 11: Výsledná inhibičná aktivita izolovaných alkaloidov voči AChE, BuChE a POP

Testované zlúčeniny AChE IC50 (µM) BuChE IC50 (µM) POP IC50 (µM)

O-acetylpluviin 648 ± 54 603 ± 49 ˃1000

MF-2 489 ± 60 5,89 ± 0,21 29,2 ± 0,9

galantamín* 1,71 ± 0,07 42,30 ± 1,30 -

fyzostigmín* 0,063 ± 0,001 0,130 ± 0,004 -

huperzín A* 0,033 ± 0,001 ˃1000 -

berberín* - - 142 ± 21

Z-pro-prolinal* - - 3,27 ± 0,02 × 10-3

* pozitívne štandardy

Obr. 20: 13C NMR spektrum alkaloidu MF-2

58

6. DISKUSIA

59

Frakcia ND 3 – 5/2 bola získaná stĺpcovou chromatografiou alkaloidného sumárneho extraktu

v rámci dizertačnej práce Mgr. Daniely Hulcovej. Následná separácia alkaloidov bola

prevedená pomocou preparatívnej TLC a z vybranej podfrakcie ND 3 – 5/2 boli izolované dva

alkaloidy MF-1 (O-acetylpluviin) a MF-2 (nová, zatiaľ nepopísaná zlúčenina). Identifikácia

izolovaných zlúčenín bola prevedená na základe optickej otáčavosti, MS (EI, ESI), 1H NMR

a 13C NMR analýz. Izolované čisté alkaloidy boli testované in vitro na inhibíciu AChE, BuChE

a POP – enzýmov zahrnutých v patofyziológii AD a predstavujúcich terapeutické ciele tejto

choroby.

O-acetypluviin, ktorý patrí medzi alkaloidy lykorínového typu, bol predtým nájdený

v Narcissus pseudonarcissus L. cv. Dutch Master, ale aj v rastline Galanthus rizehenis Stern

[48, 49]. Jeho deriváty pluviin, norpluviin boli identifikované v rastlinách Narcsissus

cyclamineus Redouté, Narcissus ´Flower Record´ [50, 51]. Inhibičná aktivita na AChE, BuChE

a POP bola v porovnaní so štandardmi nevýznamná. Tento alkaloid sa teda z pohľadu

inhibície vyššie uvedených enzýmov javí ako neperspektívny a pre ďalšie štúdium

potenciálnych látok v liečbe AD nevýznamný. Alkaloidy lykorínového typu sú známe hlavne

pre svoju cytotoxickú aktivitu – lykorín, pseudolykorín, amarbellisín [29]. Významnú

schopnosť inhibovať AChE však vykazuje derivát lykorínu 1-O-Acetyllykorín izolovaný

z rastliny Crinum moorei Hook.f.. V biologických testoch na AChE z elektrického úhora

vykazoval približne dvakrát vyššiu účinnosť ako galantamín. IC50 1-O-acetyllykorínu bola

0,96 ± 0,04 µM, IC50 galantamínu 1,9 ± 0,16 µM [52]. Bohužiaľ, pri použití ľudskej AChE sa

tento alkaloid javil ako neaktívny IC50 ˃ 1000 µM [53].

Druhým izolovaným alkaloidom (MF-2) bola nová látka s názvom 10-metoxy-2-((6-

(1-metylindolín-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)metyl)-4a,5,7,8,9,10,11,12-oktahydro-6H-

benzo[2,3]benzofuro[4,3-cd]azepín-7-ón. Alkaloid štruktúrne predstavuje spojenie

galantamínového a galantindolového typu alkaloidov čeľade Amaryllidaceae. Alkaloid má

významnú inhibičnú aktivitu na BuChE (IC50: 5,89 ± 0,21 µM) a POP (IC50: 29,2 ± 0,9 µM). Táto

duálna inhibičná schopnosť je výhodná, pretože AD patrí medzi multifaktoriálne choroby.

Zvýšená aktivita BuChE a POP je totiž typická pre osoby trpiace AD, prípadne inými

psychiatrickými ochoreniami. BuChE sa podobne ako AChE podieľa na odbúravaní Ach, POP

zastáva dôležitú úlohu v delení a diferenciácii buniek, učení a pamäti. Taktiež zastáva

dôležitú úlohu v metabolizme inositol-1,4,5-P3, ktorý je súčasťou signálnej kaskády

60

neuropetidov, podieľajúcich sa na procesoch pamäti a učenia [7,9]. Ovplyvnenie viacerých

patologických mechanizmov jednou látkou („multitarget drugs”) je preto veľmi žiadané.

Schopnosť tohto nového alkaloidu inhibovať AChE je však v porovnaní s BuChE a POP

nevýznamná, jeho IC50 AChE dosahuje hodnôt 489 ± 60 µM. Látky galantamínového

a galaindolového štruktúrneho typu sa predtým podarilo izolovať v rámci dizertačnej práce

Mgr. Marcely Šafratovej. Konkrétne sa jedná o narcipavlin a narcikachnin izolované z rastliny

Narcissus poeticus L. cv. Pink Parasol. V rámci tejto práce sa podarilo stanoviť IC50 BuChE

narcipavlinu, ktorého hodnota je 24,4 ± 1,2 µM. Ostatné hodnoty sa z dôvodu

nedostatočného množstva alkaloidov nepodarilo zistiť [54]. Táto hodnota (IC50 BuChE

narcipavlinu) je síce v porovnaní s novým alkaloidom vyššia, avšak z pohľadu výskumu

inhibítorov BuChE stále zaujímavá. Alkaloidy tohto štruktúrneho typu by na základe týchto

výsledkov mohli viesť k potenciálne novým liečivám na AD.

61

7. ZÁVER

62

Z vybranej frakcie sa v rámci tejto práce podarilo izolovať dva alkaloidy (O-acetylpluviin

a alkaloid MF-2), ktoré boli testované na inhibíciu cholínesteráz (AChE a BuChE)

a prolyloligopeptidázy. Po zhodnotení výsledkov inhibičnej aktivity, sa v tomto smere javí

O-acetylpluvin ako neperspektívny. Alkaloid MF-2 (10-metoxy-2-((6-(1-methylindolín-7-

yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)metyl)-4a,5,7,8,9,10,11,12-oktahydro-6H-benzo[2,3]benzofuro-

[4,3-cd]azepín-7-ón však významne inhiboval BuChE (IC50: 5,89 ± 0,21 µM) aj POP (IC50: 29,2

± 0,9 µM) a preto sa v oblasti tohto výskumu radí medzi veľmi perspektívne látky, ktoré by

určite mali byť súčasťou ďalšieho štúdia.

63

8. LITERATÚRA

64

[1] RESSNER, P.: Alzheimerova choroba – diagnostika a léčba. Neurologie pro praxi 2004, 5,

(1), 11–16.

[2] HOLMEROVÁ, I.; MÁTLOVÁ, M.; VAŇKOVÁ, H.; JURÁŠKOVÁ, B.: Demence. Medicína pro

praxi 2010, 7, (3), 139–144.

[3] HIPPIUS, H.; NEUNDÖRFER, G.: The discovery of Alzheimer's disease. Dialogues in Clinical

Neuroscience 2003, 5, (1), 101–108.

[4] NEČAS, E.; ŠULC, K.; VOKURKA, M.: Patologická fyziologie orgánových systémů: Část II.

Praha: Karolinum, 2009. ISBN 978-80-246-1712-1.

[5] JIRÁK, R.: Diagnostika a terapie Alzheimerovy choroby. Neurologie pro praxi 2008, 9, (4),

240–244.

[6] SILBERNAGL, S.; LANG, F.: Atlas patofyziologie člověka. Praha: Grada, 2001. ISBN 80-7169-

968-3.

[7] JIRÁK, R.: Terapie Alzheimerovy choroby a příbuzných neurodegenerativních

demencí. Neurologie pro praxi 2009, 10, (6), 384–389.

[8] VLACHOVÁ, I.: Neurologické projevy poruch metabolizmu lipidů. Neurologie pro praxi

2005, 6, (1), 12–16.

[9] CAHLÍKOVÁ, L.; HULOVÁ, L.; HRABINOVÁ, M.; CHLEBEK, J.; HOŠŤÁLKOVÁ, A.; ADAMCOVÁ,

M.; ŠAFRATOVÁ, M.; JUN, D.; OPLETAL, L.; LOČÁREK, M.; MACÁKOVÁ, K.: Isoquinoline

alkaloids as prolyl oligopeptidase inhibitors. Fitoterapia 2015, 103, 192–196.

[10] RESSNER, P.; HORT, J.; REKTOROVÁ, I.; BARTOŠ, A.; RUSINA, R.; LÍNEK, V.;

SHEARDOVÁ, K.: Doporučené postupy pro diagnostiku Alzheimerovy nemoci a ostatních

demencí. Neurologie pro praxi 2009, 10, (4), 237–241.

65

[11] KOUDELKOVÁ, M.: Praktické zkušenosti s laboratorní diagnostikou Alzheimerovy nemoci

pomocí tau proteinu, fosfo-tau proteinu a beta amyloidu v likvoru. Neurologie pro

praxi 2009, 10, (5), 290–293.

[12] HORT, J.: Nová guidelines pro diagnostiku a léčbu Alzheimerovy choroby. Neurologie

pro praxi 2011, 12, (4), 277–281.

[13] MARTIN, J.; KRŠKOVÁ, Z.; DUŠEK, J.: Huperzin A a jiné přírodní látky v léčbě

Alzheimerovy choroby. Praktické lékárenství 2011, 7, (1), 39–41.

[14] BRUNOVSKÝ, M.: Inhibitory cholinesteráz v léčbě Alzheimerovy nemoci. Neurologie pro

praxi 2007, 8, (2), 112–117.

[15] FRANKOVÁ, V.: Optimalizace léčby Alzheimerovy choroby. Praktické lékarenství 2016,

12, (2), 79–82.

[16] PETROVIČ, M.; SEDLÁČEK, M.; HORÁK, M.; VYKLICKÝ JR. L.: Neurofarmakologická

podstata působení memantinu v léčbě Alzheimerovy demence. Klinická farmakologie

a farmacie 2004, 18, (8), 81–89.

[17] VALIŠ, M.; KALNICKÁ, D.: Novinky ve farmakoterapii demencí. Neurologie pro praxi

2011, 12, (1), 33–36.

[18] MÄNNISTO, P.T.; VENÄLÄINEN, J.; JALKANEN, A.; GARSIA-HORSMAN, J.: Prolyl

oligopeptidase: a potential target for the treatment of cognitive disorders. Drug News &

Perspection 2007, 20, (5), 293–305.

[19] MUKHERJEE, P. K.; KUMAR, V.; MAL, M.; HOUGHTON, P.J.: Acetylcholinesterase

inhibitors from plants. Phytomedicine 2007, 14, (4), 289–300.

66

[20] ELUFIOYE, T. O.; OBUOTOR, E. M.; SENNUGA, A. T.; AGBEDAHUNSI, J. M.; ADESANYA,

S. A.: Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitory activity of some selected

Nigerian medicinal plants. Brazilian Journal of Pharmacognosy 2010, 20, (4), 472–477.

[21] ZHAO, T.; DING, K.; ZHANG, L.; CHENG, X.; WANG, CH.; WANG, Z.: Acetylcholinesterase

and butyrylcholinesterase inhibitory activities of 𝛽-Carboline and quinoline alkaloids

derivatives from the plants of genus Peganum. Journal of Chemistry 2013, 1–6.

[22] SERMBOONPAISAM, T.; SAWASDEE, P.: Potent and selective butyrylcholinesterase

inhibitors from Ficus foveolata. Fitoterapia 2012, 83, (4), 780–784.

[23] https://en.wikipedia.org/wiki/Taxonomy_of_Narcissus, citované 24.10.2016.

[24] HANKS, G.: Narcissus and Daffodil: The genus Narcissus. New Fatter Lane, London EC4P

4EE: Taylor and Francis, 2002. ISBN 0-415-27344-7.

[25] PETROVÁ, E.: Pěstujeme okrasné cibuloviny. Praha: Brázda, 2005. ISBN 80-209-0335-6.

[26] JAHODÁŘ, L.: Farmakobotanika: semenné rastliny. Karolinum, Praha 2006. ISBN 978-80-

246-2015-2.

[27] https://www.rhs.org.uk/plants/details?plantid=5221. Citované 2.11.2016.

[28] TAKOS, A. M.; ROOK, F.: Towards a molecular understanding of the biosynthesis of

Amaryllidaceae alkaloids in support of their expanding medical use. International Journal of

Molecular Sciences 2013, 14, (6), 11713–11741.

[29] BERKOV, S.; MARTIÉZ-FRANCÉS, V.; BASTIDA, J.; CODINA, C.; RIOS, S.: Evolution of

alkaloid biosynthesis in the genus Narcissus. Phytochemistry 2014, 99, 95–106.

[30] TRAM, N.; TITORENKOVA, T. V.; BANKOVA, V. ST.; HANDIJIEVA, N. V.; POPOV, S. S.:

Crinum L. (Amaryllidaceae). Fitoterapia 2002, 73, (3), 183–208.

67

[31] ŞENER, B.; ORHAN, I.; SATAYAVIVAD, J.: Antimalarial activity screening of some alkaloids

and the plant extracts from Amaryllidaceae. Phytotherapy research 2003, 17, (10),

1220–1223.

[32] DALECKÁ, M.; HAVELEK, R.; KRÁLOVEC, K.; BRŮČKOVÁ, L.; CAHLÍKOVÁ, L.: Alkaloidy

rostlin čeledi Amaryllidaceae jako potenciální léčiva v terapii nádorových onemocnění.

Chemické listy 2013, 107, (9), 701–708.

[33] HEINRICH, M.; TEOH, H. L.: Galanthamine from snowdrop—the development of a

modern drug against Alzheimer’s disease from local Caucasian knowledge. Journal of

Ethnopharmacology 2004, 92, (2), 147–162.

[34] http://www.sukl.cz/modules/medication/search.php, citované 7.11.2016.

[35] BERKOV, S.; CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.: N-Alkylated galanthamine

derivatives: Potent acetylcholinesterase inhibitors from Leucojum aestivum. Bioorganic &

Medicinal Chemistry Letters 2008, 18, (7), 2263–2266.

[36] HE, J.; QI, W.; WANG, L.; TIAN, J.; JIAO, P.; LIU, G.; YE, W.; LIAO, M.: Amaryllidaceae

alkaloids inhibit nuclear-to-cytoplasmic export of ribonucleoprotein (RNP) complex of highly

pathogenic avian influenza virus H5N1. Influenza and other respiratory viruses 2013, 7, (6),

922–931.

[37] HAO, B.; SHEN, S.; ZHAO, J.: Cytotoxic and antimalarial Amaryllidaceae alkaloids from

the bulbs of Lycoris radiata. Molecules 2013, 18, (3), 2458–2468.

[38] MCNULTY, J.; NAIR, J. J.; CODINA, C.; BASTIDA, J.; PANDEY, S.; GERASIMOFF, J.;

GRIFFIN. C.: Selective apoptosis-inducing activity of crinum-type Amaryllidaceae

alkaloids. Phytochemistry 2007, 68, (7), 1068–1074.

68

[39] CAHLÍKOVÁ, L.; PERÉZ, D. I.; CHLEBEK, J.; ŠAFRATOVÁ, M.; JUN, D.; OPLETAL, L.;

HOŠŤÁLKOVÁ, A.: In vitro inhibitory effects of 8-o-demethylmaritidine and undulatine on

acetylcholinesterase and their predicted penetration across the blood−brain barrier. Journal

of Natural products 2015, 78, 1189–1192.

[40] ZAHIDA, I.; HABIB, N.; SYUNTARO, H.; YOSHIHARU, F.: Plant growth inhibitory activity of

Lycoris radiata Herb. and the possible involvement of lycorine as an allelochemical. Weed

Biology and Management 2006, 6, (4), 221–227.

[41] SALTAN ÇITOĞLU, G., ACIKARA, Ö B.; YILMAZ, B. S.; ÖZBEK, H.: Evaluation of analgesic,

anti-inflammatory and hepatoprotective effects of lycorine from Sternbergia fisheriana

(Herbert) Rupr. Fitoterapia 2012, 83, (1), 81–87.

[42] GOIETSENOVEN, G. V.; MATHIEU, V.; LEFRANC, F.; KORNIERKO, A.; EVIDENTE, A.;

KISS, R.: Narciclasine as well as other Amaryllidaceae isocarbostyrils are promising gtp-ase

targeting agents against brain cancers. Medicinal Research Reviews 2013, 33, (2), 439–455.

[43] MCNULTY, J.; NAIR, J. J.; SING, M.; CRANKSHAW, D. J.; HOLLOWAY, A. C.; BASTIDA, J.:

Selective cytochrome P450 3A4 inhibitory activity of Amaryllidaceae alkaloids. Bioorganic &

Medicinal Chemistry Letters 2009, 19, (12), 3233–3237.

[44] MCLACHLAN, A.; KEKRE, N.; MCNULTY, J.; PANDEY, S.: Pancratistatin: a natural anti-

cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce

apoptosis. Apoptosis 2005, 10, (3), 619–630.

[45] ZUPKÓ, I.; RÉTHY, B.; HOHMANN, J.; MOLNÁR, J.; OCSOVSZKI, I.; FALKAY, G.: Antitumor

activity of alkaloids derived from Amaryllidaceae species. In vivo 2009, 23, (1), 41–48.

[46] SALEHI SOURMAGHI, M.H.; AZADI, B.; AMIN, G.; AMINI, M.; SHARIFZADEH, M.: The first

phytochemical report of Galanthus transcaucasicus Fomin. DARU Journal of pharmaceutical

sciences 2010, 18, (2), 124–127.

69

[47] DVOŘÁKOVÁ, Z.: Alkaloidy Narcissus 'Dutch master' (Amaryllidaceae) a jejich biologická

aktivita. II. Katedra farmaceutickej botaniky a ekológie Farmaceutickej fakulty Univerzity

Karlovej v Prahe v Hradci Králové, 2016. Diplomová práca.

[48] VACKOVÁ, L.: Alkaloidy Narcissus 'Dutch master' (Amaryllidaceae) a jejich biologická

aktivita. I. Katedra farmaceutickej botaniky a ekológie Farmaceutickej fakulty Univerzity

Karlovej v Prahe v Hradci Králové, 2016. Diplomová práca.

[49] BOZKURT, B.; ONÜR, M. A.; BASTIDA, J.; BERKOV, S.: GC-MS Investigation and

acetylcholinesterase inhibitory activity of Galanthus rizehensis. Zeitschrift fur

Naturforschung 2013, 68, 118–124.

[50] HRSTKA, V.: Neurotropní a antioxidační aktivita vybraných druhů jednoděložných

alkaloidních rostlin. IV. Katedra farmaceutickej botaniky a ekológie Farmaceutickej fakulty

Univerzity Karlovej v Prahe v Hradci Králové, 2013. Diplomová práca.

[51] JANURA, M.: Biologická aktivita obsahových látek rostlin XXVIII. Alkaloidy vybraných

odrůd taxonu Narcissus cyclamineus REDOUTÉ a jejich účinek na acetylcholinesterasu a

butyrylcholinesterasu. Katedra farmaceutickej botaniky a ekológie Farmaceutickej fakulty

Univerzity Karlovej v Prahe v Hradci Králové, 2015. Diplomová práca.

[52] ELGORASHI, E. E.; STAFFORD, G. I.; STADEN, J. V.;. Acetylcholinesterase enzyme

inhibitory effects of Amaryllidaceae alkaloids. Planta Medica 2004, 70, (3), 260–262.

[53] VANĚČKOVÁ, N.; HOŠŤÁLKOVÁ, A.; ŠAFRATOVÁ, M.; KUNEŠ, J.; HULCOVÁ, D.;

HRABINOVÁ, M.; DOSKOČIL, I.; ŠTĚPÁNKOVÁ, Š.; OPLETAL, L.; NOVÁKOVÁ, L; JUN, D.;

CHLEBEK, J.; CAHLÍKOVÁ, L.: Isolation of Amaryllidaceae alkaloids from Nerine bowdeni W.

Watson and their biological activities. RSC Advances 2016, 6, 80114–80120.

70

[54] ŠAFRÁTOVÁ, M.: Studium inhibičního (toxického) vlivu alkaloidů vybraných druhů rostlin

z čeledi Amaryllidaceae na některé lidské enzymové systémy (in vitro studie) III. Katedra

farmaceutickej botaniky a ekológie Farmaceutickej fakulty Univerzity Karlovej v Prahe

v Hradci Králové, 2016. Doktorská dizertačná práca.

71

ABSTRAKT

Farkašovský Marek: Alkaloidy Narcissus pseudonarcissus L. cv. Dutch Master a ich

cholínesterázová a prolyloligopeptidázová inhibičná aktivita. Rigorózna práca 2017,

Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutickej botaniky

a ekológie.

Náplňou tejto práce bola izolácia obsahových látok z frakcie ND 3 – 5/2, získanej

stĺpcovou chromatografiou alkaloidného extraktu z Narcissus pseudonarcissus L. cv. Dutch

Master. Príprava extraktu a následná stĺpcová chromatografia bola prevedená Mgr. Danielou

Hulcovou v rámci jej doktorského štúdia. Pomocou preparatívnej TLC sa z tejto podfrakcie

podarilo izolovať dva alkaloidy, ktorých štruktúra bola určená na základe optickej otáčavosti,

MS (EI, ESI), 1H NMR a 13C NMR analýz. Výsledky boli porovnané s dostupnou literatúrou.

Prvým izolovaným alkaloidom bol O-acetylpluviin, ktorý patrí do skupiny lykorínových

alkaloidov. Inhibičná schopnosť vyjadrená v IC50 bola v porovnaní so štandardmi (galantamín,

huperzín A, fyzostigmín, berberín a Z-pro-prolinal) nevýznamná. IC50 AChE: 684 ± 54 µM, IC50

BuChE: 603 ± 49 µM, IC50 POP ˃1000 µM. Na základe výsledkov môžeme tvrdiť, že z hľadiska

inhibície cholínesteráz a POP sa jedná o neperspektívnu látku.

Druhým izolovaným alkaloidom bola zatiaľ nepopísaná látka so systematickým

názvom 10-metoxy-2-((6-(1-metylindolín-7-yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)metyl)-4a,5,7,8,9,10,

11,12-oktahydro-6H-benzo[2,3]benzofuro[4,3-cd]azepín-7-ón. Inhibičná schopnosť na AChE

bola nevýrazná IC50 AChE: 489 ± 60 µM. Naopak hodnoty IC50 BuChE: 5,89 ± 0,21 µM a IC50

POP: 29,2 ± 0,9 µM boli veľmi významné. Na základe výsledkov môžeme usudzovať, že sa

jedná látku s duálnym inhibičným účinkom (inhibícia BuChE a POP), ktorá by určite mala byť

súčasťou ďalších výskumov zaoberajúcich sa hľadaním nových látok v terapii AD.

Kľúčové slová: Narcissus pseudonarcissus L. cv. Dutch Master, Amaryllidaceae,

acetylcholínesteráza, butyrylcholínesteráza, prolyloligopeptidáza, Alzheimerova choroba

72

ABSTRACT

Farkašovský Marek: Alkaloids from Narcissus pseudonarcissus L. cv. Dutch Master and their

cholinesterase and prolyl oligopeptidase inhibition activity. Rigorous thesis 2017, Charles

university, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of Pharmaceutical Botany

and Ecology.

The content of this work was isolation of minimum two compound from alkaloid

fraction ND 3 – 5/2, obtained by column chromatography of Narcissus pseudonarcissus L. cv.

Dutch Master alkaloid extract. Preparation of extract and its column chromatography was

performed by Mgr. Daniela Hulcová as a part of her doctoral studies. Two different alkaloids

were isolated with preparative TLC method. Their structure was determined with optical

rotation, MS (EI, ESI), 1H NMR and 13C NMR analysis. Obtained data were compared with

facts with those in literature.

The first isolated compound was lycorine type alkaloid O-acetylpluvine. Its inhibition

activity compared to positive standards (galanthamine, huperzine A, physostigmine,

berberine and Z-pro-prolinal) was mild - IC50 AChE: 684 ± 54 µM, IC50 BuChE: 603 ± 49 µM,

IC50 POP ˃1000 µM. From the point of its cholinesterase and POP inhibition, this results

make O-acetylpluvine unusable compound in treatment of AD.

The second isolated compound was a new alkaloid, which has not been described in

any literature yet. Its systematic nomenclature is 10-methoxy-2-((6-(1-methylindolin-7-

yl)benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)methyl)-4a,5,7,8,9,10,11,12-octahydro-6H-benzo[2,3]benzofuro

[4,3-cd]azepin-7-on. Its AChE inhibition was not significant IC50 AChE: 489 ± 60 µM, but

inhibion of BuChE and POP was very potent IC50: BuChE 5,89 ± 0,21 µM and IC50 POP: 29,2 ±

0,9 µM. On the basis of this results, we can evaluate this alkaloid as a compound with a dual

effect (inhibition of BuChE and POP). This alkaloid should be a promising for further research

focused on potentional natural compounds in AD therapy.

Key words: Narcissus pseudonarcissus L. cv. Dutch Master, Amaryllidaceae,

acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, prolyl oligopeptidase, Alzheimer disease