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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016
Memorias
Diversidad morfológica y filogenética de diatomeas planctónicas
marinas del Pacífico tropical mexicano, en condiciones de cultivo
Diana Marbely Balbuena Chavez.
Facultad de Ecología Marina de la UAGro
Programa AMC: Academia Mexicana de Ciencias.
Área II: Biología y Química.
Dr. David U. Hernandez Becerrril (Asesor – Investigador)
Instituto de Ciencias del Mar y Limnologia UNAM.
Resumen
La identificación de las diatomeas se inicia desde su tamaño y los detalles morfológicos
de algunos de estos, es el caso de estructuras biológicas rígidas que forman exoesqueletos
extremadamente complejos, generalmente simétricos y específicos de cada especie. Esta variedad
de ornamentaciones genera errores en la tipificación de las especies, por lo que se ha utilizado la
microscopía electrónica de barrido (MEB), y otro patrón para las estructuras de gran complejidad,
que resultan en características de las paredes apicales de las tecas, o valvas .Utilizan técnicas de
microscopia electrónica de transmisión (MET). Estas herramientas son utilizadas para la
identificación de las diatomeas Skeletonema pseudocostatum, Chaetoceros pseudocrinitus y
Coscinodiscus sp. donde se realizo. Lo cultivos fueron muy favorables , las imágenes de
microoscopia se observan detalladamente. la mayoría de los caracteres morfológicos utilizan para
distinguir que requieren de observación al microscopio electrónico: forma de valvas terminales y
su forma fultoportulae, y las bandas de ultraestructura cingular.
Palabras Clave: ADN, Diatomeas, morfología, MEB, MET.
Introducción:
La región del Pacífico Mexicano presenta una riqueza fitoplanctónica importante,
habiéndose registrado como mínimo 875 taxa de diatomeas (Hernández-Becerril & Díaz-Almeyda,
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2006; Hernández-Becerril et al., 2010; Meave, 1999, 2002, 2006, 2009; Meave et al., 2001, 2003b,
2008; Moreno et al., 1996; Moreno-Gutiérrez, 2008; Sterrenburg et al., 2003)
Son un grupo taxonómico de eucariotas unicelulares pertenecientes a la clase Bacillariophyceae,
las cuales se encuentran ampliamente distribuidas en hábitats acuáticos tanto marinos como
continentales, son de gran importancia biogeoquímica en el mar y representan el 40% de todo el
fitoplancton marino.
La producción de diatomeas está generalmente relacionado con la disponibilidad de luz y
nutrientes, mientras que la composición de la comunidad y la sucesión también se ven influidas
por la temperatura y la salinidad (Smayda, 1980). Su distintiva característica es una pared celular
(frustule) compuesto de dióxido de silicio hidratado y una pequeña cantidad de materia orgánica
organizada ya que dos de tamaño desigual, la superposición válvulas (tecas) similar a una placa de
Petri. (Smayda, 2011).
Se clasifican generalmente en dos grupos principales, dependiendo de la simetría de sus frústulos:
diatomeas céntricas son radialmente simétrica, mientras que diatomeas pennadas son alargados y
de simetría bilateral. Presentan inconvenientes para la identificación debido al tamaño y los detalles
morfológicos de algunos de estos, es el caso de estructuras biológicas rígidas que forman
exoesqueletos extremadamente complejos, generalmente simétricos y específicos de cada especie.
Esta variedad de ornamentaciones genera errores en la tipificación de las especies, por lo que se ha
utilizado la microscopía electrónica de barrido (MEB), y otro patrón para las estructuras de gran
complejidad, que resultan en características de las paredes apicales de las tecas, o valvas .Utilizan
técnicas de microscopia electrónica de transmisión (MET). Estas herramientas han sido
fundamentales para la identificación de diatomeas. (Moreno, 2001.)
Al dar cifras de la diversidad ficológica en México, hay que especificar qué para la identificación
de los grupos, denominados taxones, incluyendo especies, variedades y formas, ha prevalecido el
criterio morfológico.
En este estudio los objetivos será Realizar aislamiento y cultivos de diferentes especies de
diatomeas. Estudiar la morfología de las diatomeas con métodos de microscopia de barrido
(MEB) y microscopía electrónica de transmisión (MET). Y Tener conocimiento de la extracción
del ADN de las diatomeas para la realización del PCR.
Materiales y Metodos.
El área de muestreo es localizada en la bahía de Acapulco Guerrero, México con las
coordenadas: 1 Morro San Lorenzo (Latitud 16°51'14.113"N, longitud 99°53'07.381"O), y 2
terminal marítima (Latitud 16°50'54.975"N, longitud 99°53'57.891"O)
La bahía Tiene una forma semicircular, una longitud aproximada de 7 km y una anchura promedio
de 10 km. Sus profundidades oscila entre lós 10 y 30 m..
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La recolección de agua para cultivo se realizó con una botella de 1 litro en la orilla de la bahía de
Acapulco, donde ese mismo día fue traslada al Instituto de Ciencias del Mar y Limnologia de la
Universidad Nacional Autónoma de México (ICMYL-UNAM).
La muestra fue filtrada con filtro millipore de 1.2 μm, White rowp. La filtración fue
manualmente donde se evito que se secara, obteniendo las muestras en las cajas de Petri, el
aislamiento mediante una pipeta que se estiro usando mechero de alcohol alcanzado un tamaños
adecuado para la pesca de diatomeas y porta objetos de 25.4 x 76.2mm para realizar lavadas
continuas utilizando el medio f/2 rico en nutrientes para el cultivo, para su previa observación
utilizando el microscopio invertido ZEISS en objetivos de 10 x y 20 x .(Gonzalez, 1995)
Los cultivos de las diatomeas se mantuvieron varias semanas en cajas de cultivo celular: placas
celulares de 96 pocillos y posteriormente en placas de 24 pocillos, en iluminación con fotoperiodo
de 12:12 h con luz fría, y temperatura a 22ºC, hasta obtener una mayor densidad, para los siguientes
procesos.
Microscopia electrónica de barrido (MEB)
Las muestras destinadas ala observación con MEB requieren de una previa deshidratación
completa donde el agua de las células del cultivo es remplazado por otro solvente, en este
método, el primer paso fue pasar célula por célula aun filtro de membrana de 5,0 μm, dando
baños sucesivos de 5 min con alcohol etílico en cantidades de 30%, 50% 70%,90% y 100% Cada
uno evitando que se seque. (WIEBE , 2010)
Después el filtro fue trasladado al aparato de secado donde se realizó el punto crítico de un
sistema líquido/gas (agua/vapor, CO2líquido/CO2gas) en su temperatura crítica 31º-40ºc. Y la
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presión 1075 libras asociada con esta temperatura, Durante 25 min, obteniendo el filtro seco,
metalizándolo con oro (Boltovsky, 1995) posteriormente se colocó dentro del MEB para su
observación y análisis de imagen.
Limpieza de diatomeas para la observación en el microscopio de transmisión:
Obtenidas las muestras del cultivo de diatomeas en tubos Pyrex de 15 ml, se realizaron 5 lavados
continuos con agua destiladas a 3000 rpm por 10 min, eliminando el sobrenadante después de cada
lavada y agregando nuevamente agua destilada, en el último lavado se eliminó el sobrenadante y
se le agrego la misma cantidad que se obtuvo de muestra , permanganato de potasio (KMnO4) en
solución saturada dejándolo reposar 24horas, al siguiente día se le agrego ácido clorhídrico (HCl)
concentrado de modo que se resbale por las paredes, calentándose en ebullición usando mechero y
se agito levemente formando círculos hasta que tomo un color transparente, realizando el paso
siguiente de cinco lavadas continuas con agua destilada a 3500 rpm por 5 min, eliminando el
sobrenadante, (Ferrario, 1995) dejando solo la muestra limpia de materia orgánica, donde se toman
varias gotas y se transfieren a celdas de 100 para la observación en el microscopio electrónico de
transmisión.
Extracción de DNA.
Se colocó una submuestra de cultivo en tubo eppendorf, se centrifuga para remover agua salada,
y nuevamente se centrifuga dos veces con agua des ionizada para enjuagar a 8 mil rpm, se quita el
sobrenadante. Se agregó 300 ml de buffer de extracción (vortex), proteinasa K 60 μl , CTAB 50
μl ( vortex) pasa a incubarse 2 horas entre 60ºC en multiblok, agitándose cada 15 min al terminar
este proceso se le agrego 350 μl de solución fenol ;cloroformo: isoamil , cerrando bien (vortex),
centrifugación 1 min a 12,000 rpm posteriormente se extrae la fase acuosa con pipeta. (Aguirre,
2011)
Se Precipita con 300 μl de isopropanol frio y 30 μl de acetato de sodio después se mantiene en el
-20ºc. Al día siguiente se centrifuga 20 min a 14.000 rpm y se seca 10 min a 50 ºc en el
termoblock, para después rehidratarse con 25 μl de agua molecular, centrifugando 3 min a 7500
rp y se guardó en el -20ºc (Edvardsen, (2003)
Preparación de PCR
Ya obtenidas los 4 pellets de extracción de ADN (1D, 104,103 y 3E) Se realizan las siguientes
disoluciones con los primer 1F y 1528R, se descongelan, se toman 0.2 μl, 91μl de agua y 8.7 μl
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del primer 1F, 4.5 μl a 1528R. Agua miliQ 91.5 μl (1F) y 95.5 μl (1528R), de 1 μl para obtener
las siguientes diluidos 1F 2 y 1528R 2 agregándoles 9.0 μl de agua miliQ, para la preparación
de mix de reacción se realizo uso de los pellets de ADN, se agregó 13.5 μl de agua miliQ, 2.5 μl
de Dntp mix, 2.5 μl de PCR buffer ,1 μl de ADN y 1.5 μl de Taq. Las mezclas se homogenizan
con micro pipeta.
Las reacciones se llevaron a cado con un termociclador bajo los siguientes parámetros SSU:
95ºC-5min (desnaturalización inicial), 35 ciclos 94ºC-2 min, 37º-2min, 3 min- 72ºc, 72ºC- 6min y
72ºC – 9 min (extensión). (Biase, 2002)
Electroforesis
Preparación del gel de Agarosa al 8% en TBE 1X, (50 ml de TBE y 4.0 gramos de agarosa
calentándose cada 10 seg. En microondas, y se dejó enfriar el gel en refrigerador. Se utilizó 2 µL
de lader, 5 µL de la muestra de ADN y 1 μl de buffer de carga. El gel de Agarosa se dejó correr a
100 voltios durante 37 min. ( Zárate Segura, 2009)
Resultados:
Los cultivos fueron muy exitosos en su crecimiento, fueron identificados mediante los
varios métodos de identificación de microscopia las imágenes son muy detalladas en la formas de
diatomeas que existen, las imágenes de estas muestras diferentes características morfológicas.
Skeletonema pseudocostatum Medlin emend. Zingone et Sarno
Descripción: Cadenas relativamente largas y rectas, se encontraron con 5-18 células de
forma rectangular de 2,8 11 μm, por cadena de longitud de 50-70 μm, por lo general hay una o dos
cloroplastos por célula. Las valvas son planas a convexa de 2 -9 μm, areolas densidad de 35-40
en 10 μm.
Externo, los procesos de la FP se abren la valvas intercalares, Cerrado, en sus bases en las
válvas terminales de la colonia, distal termina truncado o de garra. 3 poros satelitales.
La parte basal de la TFPPs es tubular y oblicua al eje de células, formando un ángulo con
el resto del proceso, que está abierto a lo largo de su longitud y en paralelo al eje pervalvar de la
célula. Los TFPPs tienen una punta estrecha que puede ser truncado, espinoso, o de garra.
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Fig. 1. Skeletonema pseudocostatum. ML: A y B. MEB: C, D, E y F. (A Y B) muestras
del cultivo vivo de las células. (C) una cadena de la célula de 140 μm. (D y E) valvas intercalares
conectados con fultoportula se observa un proceso (F) valva terminal con extremos espinosos.
(Hernández-becerril, 2013, 34 )
Chaetoceros pseudocrinitus Ostenfeld 1901.
Descripción: Cadenas rectas o ligeramente torcidas, generalmente largas. En vista cingular,
células rectangulares, con esquinas angulosas. Cara valvar plana o convexa; aberturas muy
estrechas. Cerdas intercalares muy delgadas, emergiendo al azar de las esquinas de la valva; cerdas
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terminales esencialmente similares, pero más largas y orientadas al eje de la cadena. Un cloroplasto
por célula
Dimensiones: Eje apical: 8-29 µm (Hustedt 1930a). Eje apical: 10-30 µm; eje pervalvar:
18-50 µm (Hendey, 1964). Eje apical: 10-12 µm; eje pervalvar: 9-12 µm; abertura: 1-2 µm.
Fig.2 Chaetoceros pseudocrinitus . ML: A . MEB: B,C,D,E,F. (A) vista del una cadena del cultivo se observa como se divide, ( B) cadena larga de 200 um. (C) forma de unión de las setas .(D y E) detalles de sus valvas terminales con un proceso. (F) celula se observa que las setas muy largas.
(kooistra, 2010) (Lee, 2011)
Fig.3 Coscinodiscus asteromphalus Ehrenberg. ML: D . MET:A. (A) En el centro el número de
areolas es de 5/10 µm, mientras que en el margen es de 6/10 µm. Se presenta una roseta central,
formada por 9 areolas de mayor tamaño .
Coscinodiscus centralis Ehrenberg ML: E . MET:B. (B) Valvas circulares y ligera o fuertemente
cóncavas, deprimidas en el centro, existe una roseta central formada por 8 areolas de mayor
tamaño .
Coscinodiscus granii Gough . ML: F. MET:C. (C) : Hay un anillo de microrrimopórtulas marginales,
separadas por 5-8 areolas.
D.U. Hernández-Becerril 1999.
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En biología molecular los cultivos fueron más selectivos por la extracción de ADN, estos
si crecieron lo adecuado, pero los primer que se usaron ya no funcionaron , y se necesitó de más
tiempo para volver a realizar el proceso, no obtuvimos resultados en la realización del PCR, por
lo que se pospuso que se volvería a realizar nuevamente.
Discusion y conclusiones
El género Skeletonema y el género Chaetoceros en aguas del Pacífico mexicano se ha
considerado estar constituida varias especies incluyendo estas especies,
Sin embargo, después de las recientes revisiones del género utilizando tanto molecular y
caracteres morfológicos. La especie Skeletonema pseudocostatum
la mayoría de los caracteres morfológicos utilizan para distinguir que requieren de
observación al microscopio electrónico: forma de valvas terminales y su forma fultoportulae, y las
bandas de ultraestructura Cingular
Las consecuencias en los estudios ecológicos y fisiológicos son enormes,
como los conceptos y protocolos de estudio nuevos se debe considerar si las diferentes
especies de género Skeletonema en aguas del Pacífico mexicano se ha considerado estar constituida
por sólo dos especies: S. costatum y S. tropicum
(Smayda, 2011). Especies de Skeletonema podrían ser identificados por la combinación de
métodos, incluyendo herramientas moleculares (Godhe et al, 2006)
Chaetoceros pseudocrinitus (Hernández-Becerril. 1996). Son difíciles de identificar las
especies , por poco conocimiento que se tienen de ellas. Existe una estrecha relación entre C.
crinitus, C. ingolfianus. Es necesario una investigación más detallada de la morfología y el ciclo
de vida de estas especies para resolver el problema (Hernández-Becerril, 1996).
Agradecimientos:
Al instituto de Ciencias del Mar y Limnologia UNAM por darme la oportunidad de participar un verano
de investigación científica de muchas experiencias y nuevos conocimientos.
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