Discusin de Western Blot La electroforesis incluye las tcnicas de separacin que implican la separacin en un campo elctrico de partculas cargadas. En el caso de la electroforesis de protenas, el proceso se diferencia en funcin de los electrodos, el tampn de electroforesis y el soporte que utiliza. Tampn de electroforesis. El tampn de electroforesis (electrolito) debe cumplir los siguientes requisitos: Mantener el pH constante: ha de tener una alta capacidad de tamponacin, ya que las partculas que se separan (en nuestro caso, las protenas) ven afectadas sus cargas en funcin del pH y las reacciones en los electro- dos ocasionan cambios en el pH. Mantener la corriente elctrica. No debe haber interacciones con las partculas que se desea separar. El rango de pH debe estar entre 4 y 9. La fuerza inica del tampn de electroforesis (elec- trolito) debe estar controlada; si la fuerza es muy alta, el proceso es lento, la movilidad disminuye, puede aumentar la temperatura y puede producirse la desnaturalizacin de las macromolculas

Los cuatro componentes fundamentales para la polimerizacin de un gel de acrilamida con estructura tridimensional porosa son: Acrilamida. Bisacrilamida. TEMED (tetraetilenmetilendiamina) APS (persulfato amnico).

La molcula de APS es la iniciadora de la reaccin y en disolucin se encuentra en forma de radical libre, es muy activa y acta sobre una molcula de acrilamida. As transmite su capacidad de radical libre a esta molcula, que a su vez acta sobre otras molculas de acrilamida y da lugar a un polmero lineal. Estas reacciones de polimerizacin las cataliza el TEMED. La bisacrilamida acta como agente enlazante. El poro tiene un tamao medio que se controla por el porcentaje de acrilamida que utilizamos al preparar el gel. Este porcentaje ira desde el 4 hasta el 30%. Por en- cima o por debajo de este rango los geles no son utilizables, puesto que se vuelven demasiado consistentes y frgiles o demasiado lquidos, respectivamente. Cuanto mayor es el porcentaje de acrilamida menor es el tamao del poro. En nuestra prctica utilizamos todos los componentes que necesitamos para la realizacin de una transferencia de protenas y seguimos los pasos segn lo marca la tcnica, se acomodaron los componentes del sadwich a manera que las protenas puedan migrar hacia

el polo positivo ya que el SDS les confiri una carga negativa de manera uniforme para porder darles orientacin, de esta manera, las protenas que se encuentran inmersas en el gel de poliacrilamida, podrn migrar a la membrana y revelarse para su observacin.

Fig 1.- Componentes de la tcnica en el orden adecuado

Al cargar lo pocillos, vimos que las protenas migran con mas velocidad ( Fig. 2) en la primer fase de acrilamida, debido a que esta, tiene un poro de mayor tamao, lo cual les imprime velocidad, junto con la posicin vertical en la cual se orienta el gel, pero al llegar a la segunda fase, en donde la concentracin de acrilamida es mayor, las protena comienzan a viajar mas lentamente, debido a que los poros se han reducido, esto ayuda a poder separar a las protenas de acuerdo a su peso y volumen.

Fig.- 2 Pocillos llenos en un gel de poliacrilamida, se logra ver la diferencia de concentracin en las 2 fases.

Al finalizar la prctica, se pudo observar la transferencia de las protenas de diferentes

pesos como se revela en la Fig 3.

Fig.-3 Transferencia de protenas a la membrana

Conclusin Aprendimos la tcnica para realizar un Western Blot, La tcnica de inmunotransferencia (immunoblotting o Western blot) es un sistema rpido y muy sensible para la deteccin y caracterizacin de protenas que se basa en la especificidad de reconocimiento entre antgeno y anticuerpo.

Bibliografa http://www.elsevier.es/sites/default/files/elsevier/pdf/21/21v22n05a13102083pdf001.pdf