Diferenciální diagnostika leukocytóz v morfologické laboratoři

- maligní leukocytózy

D. MikulenkováMorfologicko - cytochemická laboratoř, ÚHKT, Praha,

Definice leukocytózy

• Zvýšená hodnotu počtu leukocytů nad normu: dospělí WBC: 4 – 10 . 109 /l

Hematopoeza

Neutrofílie

Bakteriální infekceChronické virové infekceRůstové faktoryMyeloproliferativní onemocněníMDS/CMPD

myelocyt

myelocyt

promyelocyt

tyčtyč

tyč

blast

bazofil

tyč

promyelocyt

promyelocyt

promyelocyt

promyelocyt

myelocyt

myelocyt

myelocyt

myelocyt

metamyelocyt

metamyelocyt

metamyelocyt

metamyelocyt

metamyelocyt

metamyelocyt

metamyelocyt

metamyelocyt metamyelocyt

Lymfocytóza

Virové infekceReaktivní stavyPatologické lymfocytózy

Monocytóza

Chronické infekcePoruchy imunityHemolytické anémieMDS, MDS/CMPDAML

Eozinofílie

Reaktivní (alergie, polékové, parazitární infekce, GIT, nádorové…)HESNeoplazmatické – CEL, AML, CML

Mladší eozinofily

monocyt

Bazofílie

Neoplastické (chronické myeloproliferativní onemocnění, MDS, AML…)Alergie, hypotyreóza, ulcerózní kolitida

Absolutní počet Relativní počet

Neutrofily 2,00 – 7,00 . 109/l 45 – 70 %

Lymfocyty 0,80 – 4,00 . 109/l 20 – 45 %

Monocyty 0,08 – 1,20 . 109/l 2 – 12 %

Eozinofily 0,00 – 0,50 . 109/l 0 – 5 %

Bazofily 0,00 – 0,20 . 109/l 0 – 2 %

Rozpočet leukocytůDoporučení ČHS – www.hematology.cz/doporuceni-chs-meze.php

• 5- populační diferenciál (6- populační)• WBC + bazo• DIF• Perox• (IMI, WNR, WDF, WPC)

Hodnoty DIF z analyzátoru

Fluorescenční průtoková cytometrie (DIFF) - měření velikosti a analýza vnitřní struktury leukocytů na základě vyhodnocení změn parametrů procházejícího laserového paprsku buňkou specificky obarvenou na přítomnost nukleových kyselin DNA a RNA:- velikost buňky (Forward Scatter)- hustota vnitřní struktury buňky

(Side Scatter Light)- intenzita fluorescenčního úměrná aktivitě buňky a nepřímo úměrná stupni vyzrálosti buňky (Side Fluorescence Light)

Hodnoty DIF z analyzátoru

???

myeloperoxidáza

Akutní myeloidní leukemie bez známek vyzrávání (AML M1)

Optická metoda + myeloperoxidázová aktivita leukocytů:- DIF- peroxidázový kanál- velikost buňky na ose y

1 Noise2 NRBC3 Shluky destiček4 Lymfocyty a bazofily5 „Large Unstained Cells“ (velké MPO negativní

buňky)6 Monocyty7 Neutrofily8 Eozinofily

Hodnoty DIF z analyzátoru

DIFF – PEROX – průtoková cytometrie

PEROX DIF se velmi podobá tomu, co vidíte v mikroskopu

Cytochemická klasifikace dle myeloperoxidázové aktivity:

Buněčný typ MyeloperoxidázaMyeloblasty -, ½+ Promyelocyty 3+Myelocyty 3+Metamyelocyty 3+Tyče 2-3+Neutrofily 2-3+Eozinofily 4+Bazofily -Lymfoblasty - Prolymfocyty -Lymfocyty -Atypické lymfocyty -Monoblasty -Promonocyty -Monocyty 1+Plasmatické buňky -NRBC -

Akutní myeloidní leukemie bez známek vyzrávání (AML M1)

92% blastů

89% blastů MPO+

Burkittova leukemie/lymfom (dle FAB ALL L3)

50% lymfoblastů

MPO negativní

I. Podezření na maligní leukocytózy

Z analyzátorového DIF: Neutrofílie s posunem doleva (CML, MDS/CMPD…) Lymfo-monocytóza + anémie + trombocytopenie

(akutní leukemie) Lymfocytóza (leukemizované lymfoproliferativní

onemocnění) (LUC – peroxidáza negativní blasty, velké lymfocyty)

Jen pomocné hodnocení!!!

+

=

=

+

hruška x jablko ???

II. Podezření na maligní leukocytózu

Z mikroskopického hodnocení nátěruperiferní krve: přítomnost blastických elementů (myeloblasty,

monoblasty, leukemické promyelocyty, lymfoblasty…) přítomnost patologických lymfocytů posun doleva až k blastům, leukoerytroblastický obraz atypie erytrocytů, fragmentocyty snížený počet a atypie trombocytů

MYELOBLAST – agranulární (I. typu)

MYELOBLAST – granulární (II. a III.typ)

LYMFOBLAST

LYMFOBLASTY

MYELOBLAST

LYMFOBLAST (L3)

MONOBLAST

ALFA-NAFTYLBUTYRÁTESTERÁZA

LEUKEMICKÝ PROMYELOCYT

III. Podezření na maligní leukocytózu

Diagnóza potvrzena: z cytomorfologického hodnocení aspirátu KD

vč. cytochemického hodnoceníFCM vyšetřenísubcelulární vyšetřovací metodyhistopatologický rozbor kostní dřeně vč.

imunohistochemie

III. LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA NA MORFOLOGICKO-CYTOCHEMICKÉ LABORATOŘI

• Hodnoty KO• Nátěr PK: hodnocení 200 jaderných buněk,

zhodnocení červené řady a destiček• Nátěr aspirátu KD: zhodnocení celularity, 500

jaderných buněk, trilineární hematopoeza• Cytochemické vyšetření: myeloperoxidáza

(MPO), esterázy (ANBE, ANAE, NACE), Perlsova reakce na železo, PAS reakce, MPO- eoz, toluidinová modř

Maligní leukocytózy

• Akutní leukemie• Chronické leukemie• Leukemizované lymfomy

IV. KLASIFIKACE AKUTNÍCH LEUKEMIÍ WHO KLASIFIKACE TUMORŮ HEMATOPOETICKÉ A LYMFOIDNÍ TKÁNĚ z r. 2008

• Akutní myeloidní leukemie• Malignity z prekurzorových B - a T- buněk• Akutní leukemie obtížně klasifikovatelné

IV.A. AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKEMIE

1. AML s rekurentními translokacemi2. AML s myelodysplastickými změnami (z MDS, MDS/MPN,

MDS s cytogenetickými změnami, či bez předchozí anamnézy)

3. Therapy- related myeloidní neoplazma (alkylační cytostatika, inhibitory topoizomerázy, jiné)

4. AML jinak nekategorizované (MO-M7, akutní bazofilní leukemie, akutní panmyelóza s fibrózou)

5. Myeloidní sarkom (histologie)6. Myeloidní proliferace u Downowa syndromu7. Neoplazma z blastických plazmocytoidních dendritických

buněk

IV.A. AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKEMIE

1. AML s rekurentními translokacemi t(8,21)(q22,q22) - RUNX1-RUNX1T1 inv(16)(p13q22) nebo t(16,16) - CBFbeta- MYH11 t(15,17)(q22,q21) - PML-RARA, varianty t(9,11)(p22,q23) - MLLT3-MLL t(6,9)(p23,q34) - DEK-NUP214 inv(3)(q21,q26.2) nebo t(3,3)(q21,q26.2) RPN- EVI1 t(1,22)(p13,q13) – RBM-MKL1 AML s mutací NPM1 AML s mutací CEBPA

IV.B. PREKURZOROVÉ LYMFOIDNÍ LEUKEMIE

• Prekurzorová B lymfoblastická leukemie/ lymfom, nezařazená• Prekurzorová B lymfoblastická leukemie/ lymfom s rekurentními

genetickými abnormalitami t(9,22(, (q34,q11.2) BCR-ABL1 t(v,11q23) MLL přestavba t(12,21((p13,q22) TEL-AML1 (ETV6-RUNX1) s hyper- či hypodiploidií t(5,14)(q31,q32) IL3-IGH t(1,19)(q23,p13.3) E2A-PBX1(TCF3-PBX1)• Prekurzorová T lymfoblastická leukemie/ lymfoblastický lymfom

Obtížně klasifikovatelné akutní leukémie

Akutní nediferencovaná leukémie

Akutní leukémie se smíšeným fenotypem

Akutní leukémi

e se smíšen

ým fenotyp

em BCR-ABL1

Akutní leukémi

e se smíšený

m fenotype

m MLL

přestavba

Akutní leukémi

e se smíšen

ým fenotyp

em B/myeloidní

Akutní leukémi

e se smíšen

ým fenotyp

em T/myeloidní

Akutní leukémi

e se smíšený

m fenotype

m jinak

nespecifikované

Ostatní obtížn

ě klasifikovateln

é leukem

ie

IV. C. AKUTNÍ LEUKEMIE OBTÍŽNĚ KLASIFIKOVATELNÉ

Co musíme umět !

• PML/RARA pozitivní akutní myeloidní leukemie - (AML M3) (PK, KD, MPO či NACE)

• AML s dysplastickými změnami (kompletní cytochemické vyšetření)

Akutní promyelocytární leukemie s t(15,17)(q22,q21)

• Blasty tvoří obvykle méně než 20%• Přítomnost leukemických promyelocytů i v nátěru

periferní krve• Specifické cytogenetické a molekulárně genetické

abnormality• Prognostický faktor - počet leukocytů, DIC• Hypergranulární (typická) a mikrogranulární forma• APL s variantními translokacemi t(11,17)

PLZF/RARA, t(5,17) NPM/RARA

AML M3 – hypergranulární forma

AML M3 – mikrogranulární forma

Reparace po útlumu

AML s myelodysplastickými změnami

• Většinou pancytopenie• Dysplastické změny ve 2 a více řadách u více než 50% buněk• Dyserytropoeza - multinuklearita, pulverizace, karyorexe, N/C

asynchronie, megaloidní změny, makroerytroblasty, ringsideroblasty

• Dysgranulopoeza- patologická granularita, pseudopelgeroidie, abnormality tvaru jádra

• Dysmegakaryopeza- 3 a více či 50% mikromegakaryocytů, separace jader, hypo- či monolobularita

dyserytropoeza

dysmegakaryopoeza

V. Chronické leukemie

1. Chronická myeloidní leukemie2. Chronická eozinofilní leukemie3. Chronická lymfatická leukemie4. Prolymfocytární leukemie…

CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKEMIE• Ph+, bcr/abl pozitivita• NAP snížený u 95% (v chronické fázi)• Spleno- (hepato)megalie, infiltrace uzlin, měkkých tkání• 3 vývojové fáze• PK: leukocytóza s posunem doleva, méně než 10% blastů, normochromní a normo-

nebo makrocytární anémie, trombocytóza, bazofílie, eozinofílie, monocytóza (u p190)

• KD: hypercelulární, s hyperplazií granulo- a často i megakaryopoezy, zvýšeně bazofilní a eozinofilní prekurzory, megakaryocyty menší s hypolobací jádra (trpasličí), megaloidní změny

• Fáze akcelerace - progrese leukocytozy a splenomegalie, perzistující trombocytopenie či trombocytóza, v KD dysplastické změny, bazofílie

• Blastický zvrat - nejčastěji myeloidní, lymfoblastový, biklonální

CML periferní krev

CML chronická fáze - kostní dřeň

CML chronická fáze – kostní dřeň

CML megakaryocyty

CML pseudoGaucherovy buňky

CML sea- blue makrofágy

CML fáze akcelerace

• Blasty 10-19% jaderných buněk v PK či KD• Periferní bazofílie více než 20%• Perzistující trombocytopénie či trombocytóza• Progrese splenomegalie a leukocytózy• Cytogenetický průkaz klonální evoluce• Dysplázie granulo- a megakaryopoezy

CML fáze akcelerace – periferní krev

CML fáze akcelerace – kostní dřeň

CML blastický zvrat

• Blasty více než 20% v PK či KD• Proliferace blastů v extramedulární lokalizaci• Agregáty blastů v trepanobiopsii• 70% myeloidní - neutrofilní (eozinofilní,

bazofilní, monocytární, megakaryocytární, erytroidní)

• Lymfoblastový, bilineární, bifenotypový

CML myeloidní zvrat

CML lymfoblastový zvrat

CML megakaryoblastický zvrat

Charcotovy- Leydenovy krystaly

VI. Podezření na patologickou lymfocytózu

Dle hodnot KO:Leukocytóza s lymfocytózouNormální HGB (anémie) Normální počty trombocytů

(trombocytopenie)

VI. Podezření na patologickou lymfocytózu

Dle mikroskopického hodnocení nátěru periferní krve:

Přítomny patologické lymfocyty, lymfoblasty

1. ALL2. CLL, PLL, leukemizované lymfomy,

(myelom)

Morfologické dělení atypických lymfocytů

1. Reaktivní (aktivované) lymfocyty – lymfocyty reagující na infekční agens

2. Atypické (patologické) lymfocyty – lymfocyty atypické velikostí, tvarem a konturou jádra, charakterem chromatinu, atypickou barvitelností, prostorností, či konturou cytoplazmy (ALL, B - a T - lymfoproliferativní onemocnění, např. CLL, PLL, jiné leukemizované lymfomy)

3. Lymfoblasty

A. Reaktivní lymfocytózy (EBV, CMV…)

• 10 – 25 µm• jádro kulaté, oválné, členité• chromatin „rozvolněný“• početnější jadérka• cytoplazma bohatá, sytěji

homogenně bazofilní, více v okrajích, často nepravidelná kontura

• ojediněle jemná azurofilní granula a/nebo vakuoly

Plazmatická buňka

Reaktivní lymfocyt

B. Maligní lymfocytózy

Klonální leukemizovaná onemocnění z B- či T – lymfocytů, z NK buněk

1. Akutní lymfoblastové leukemie2. Chronické lymfocytární leukemie3. Leukemizované lymfomy

III. M. Hodgkin

II. CLL/SCL, B -PLL, lymfoplazmocytární lymfom/Waldenströmova makroglobulinémie, splenický lymfom z marginální zóny, vlasatobuněčná leukemie, malignity z plazmatických buněk, folikulární lymfom, lymfom z plášťových buněk, DLBCL, Burkittův lymfom/leukemie, extranodální lymfom z B – buněk, nodálním lymfom z B – buněk marginální zóny, mediastinální velkobuněčný lymfom, intravaskulární velkobuněčný lymfom, lymfomatoidní granulomatóza

IV. T- PLL, T- LGL, agresivní leukemie z NK buněk, leukemie/lymfom z T- buněk u dospělých (HTLV-1), extranodální lymfom z NK/T- buněk nazálního typu, intestinální lymfom z T- buněk, hepatosplenický T-lymfom, panikulitický podkožní T-lymfom, blastický NK lymfom, Mycosis fungoides a Sezaryho syndrom, angioimunoblastický T- lymfom, primární kožní CD30 pozitivní T- lymfoproliferativní onemocnění, periferní T-lymfom nespecifikovaný, anaplastický velkobuněčný T-lymfom

I. Neoplazma z lymfoidních B- a T- prekursorů

WHO klasifikace 2008

Chronická lymfocytární leukemie nejčastější leukemické onemocnění dospělých v západním

světě věk nad 50let, převaha mužského pohlaví nebolestivá generalizovaná lymfadenopatie s lymfocytózou z B

lymfocytů (splenomegalie, anémie, trombocytopenie, opakované infekty)

Folikulární lymfom (FCL)

Neoplazma z centrocytů a centroblastů zárodečného centra lymfatických folikulů

LU, slezina, kostní dřeň, periferní krev, Waldayerův okruh

Lymfom z plášťové zóny (MCL)

Neoplazma z malých až středně velkých B-lymfocytů plášťové zóny lymfatických folikulů

Lymfadenopatie, hepato-splenomegalie, GIT, Waldayerův okruh

Splenický lymfom z marginální zony (SMZL)

Neoplazma z malých B-lymfocytů

Slezina (marginální zona bílé pulpy), (kostní dřeň), periferní krev

V PK: vilózní lymfocyty (SLVL), plazmocytoidní lymfocyty

Závěr – I.

• Morfologické zhodnocení buněk v nátěru PK v některých případech pomůže stanovit diagnózu (u lymfocytóz jsou morfologické změny patologických lymfocytů v nátěru PK výraznější – velikost buněk, uniformita populace, atypie jádra a cytoplazmy)

Závěr – II.

• Definitivní diagnóza je stanovena z morfologicko-cytochemického hodnocení aspirátu kostní dřeně s podporou FCM vyšetření

• u pacienta s patologickou lymfocytózou je definitivní stanovena dg. z FCM a histopatologického vyšetření (KD, uzliny…)

• Subcelulární vyšetřovací metody (cytogentika a molgen) upřesní diagnózu a určí prognózu

Závěr – III.

• Ne každá lymfo-monocytóza v hodnotách KO je pravá lymfo-monocytóza!!!

• Ne každá lymfocytóza v hodnotách KO je pravá lymfocytóza!!!

• Nutné je pečlivé morfologické zhodnocení nátěru PK, které ukáže směr

Děkuji za pozornost