85

Die Stille der Transkription

Mating-type switching in der Bäckerhefe

Heterochromatin in Drosophila (Entdeckung der Histon-Methyltransferasen)

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Kondensation größerer Chromatinbereiche zB. am Telomer

87

Silencing und Mating type switching in der Hefe:

MATa

haploid: MATa oder MATα

diploid: MATa / MATα

Fragen: Wie wird der Paarungstyp determiniert? Was ist die Ursache für das mating-type switching

MATa

homothallische Hefe: HO+ heterothallische Hefe: ho-

nur die Mutterzelle wechselt den Paarungstyp

MATα

MATa

MATα MATα

heterothallische Mutanten wechseln den Paarungstyp nicht:

Tochterzelle

Der Paarungstyp wird durch den Mating typ locus (MAT) determiniert: MAT a MAT α

mat a1 mat α1 mat α2

MATa /MATα Diploide Zellen:

MAT a haploide Zelle MAT α haploide Zelle

mat a1

MAT α

mat α1 mat α2

89 Quelle: Watson ed6

Kombinatorische Kontrolle durch Kombination verschiedener Tx- Faktoren

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MAT a HMRa

Was ist die Ursache für das mating-type switching? Es gibt drei Mating type Kassetten (HML und HMR werden aber nicht exprimiert)

HO-Endonuklease schneidet eine spezifische Sequenz im MAT-Locus: dieseser Doppelstrangbruch führt zur Genkonversion

HMLα

HO

Degradation der MATa Information und Reparatur mit HMLα als Matrize

MATa switching zu MATα

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Warum werden die stillen MAT-loci nicht exprimiert?

MAT a HMRa

mat a1 mat a1

HMLα

mat α1 mat α2

Sequenzen in den stillen MAT -loci führen zur Ausbildung von Heterochromatin in HML und HMR: Silencer

Die Entdeckung von Silencern*

wie wirken Silencer?

Isolierung von Mutanten, die kein Silencing machen SIR1, SIR 2 (Histondeacetylase) , SIR3, SIR4,...(solche Mutanten werden steril)

nur mata1 wird exprimiert

Silencer*: nicht zu verwechseln mit gene silencing durch siRNAs

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Die Wirkung von Sir Proteinen:

Die Sir-Proteine waren der Ausgangspunkt zur Molekularen Analyse von Heterochromatin

1.DNA bindende Proteine (Rap1, Abf1, ORC) erkennen Sequenzen in HML-loci

2.Rekrutierung von Sir1, Sir2, Sir3, Sir4 2.Sir3 /Sir 4 wechselwiken mit Histonen H3 und H4 (deacetyliert) 3. Sir2 ist eine Histondeacetylase, Ermöglicht mehr Bindung von Sir3/Sir4 4. Ausdehnung des heterochromatischen Bereichs durch Polymerisation von Sir3/Sir4

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Andere heterochromatische Bereiche in der Hefe Telomere ribosomale DNA Repeats (rDNA) Centromere

SIR2 ist die zentrale Histondeacetylase in Heterochromatin Sir2 deacetyliert Histon H4K16.

Sir3 und Sir4/Sir2 Komplex binden an deacetyliertes H4K16 So breitet sich das Hetrerochromatin aus.

Sir2 im Kopmlex mit Sir3 und Sir4 –zusätzliche Substrate in H3 und H4 werden erkannt.

In angrenzenden euchromatischen Bereichen ist die Sas Acetyltransferase aktiv (something about silencing) Histon wird an der selben Stelle acetyliert (H4K16)

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Silencing ist nicht immer stabil

Erklärung: Die Ausdehnung heterochromatischer Bereiche kann variieren

Ein Reporter-System zur Analyse des Silencing in der Hefe

Die Ausdehnung heterochromatischer Bereiche variiert PEV: (Position effect variegation)

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Position Effect variegation in Drosophila und Silencing in der Spalthefe S. pombe: Identifizierung von Histon-Methyltransferasen als wichtige Regulatoren von Heterochromatin

Genetik: Su(var)3-9: Suppressor of variegation Dann lange nichts Dann die Entdeckung, dass Su(var)3-9 und homologe Proteine Ähnlichkeit zu Methyltransferasen haben (Die SET-Domäne)

Histon H3-Lys9

H3-Lys9-Met Su(var)3-9

Heterochromatin Protein HP1 (Chromodomain Protein)

Repression

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S. pombe Silencing: Ähnlich zum Mechanismus in Drosophila

K9 Methylierung verhindert die für Euchromatin typische K14 Acetylierung

S. pombe Swi6 ist das Ortholog des Drosophila Heterochromatinproteins HP1

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Auswirkungen von Heterochromatin

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Ein klassisches Beispiel von Heterochromatin: Das inaktive X- Chromosom (Der Barr Körper)

Heterochromatin: typische Eigenschaften von Heterochromatin: Hypermethylierte DNA, wenig acetylierte Core Histone H3/H4 späte Replikation während der S-Phase

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Die Inaktivierung eines der X- Chromosomen bei Frauen

Warum? Dosis Kompensation i.e die Expression X-chromosmaler Gene muss in männlichen Zellen und in weiblichen Zellen gleich sein

Welches Chromosom?

Mensch et al. : zufällig im 32-64 Zellstadium

Ein spezieller Locus auf dem X-Chromosom ist für die Inaktivierung verantwortlich: X-inactivation center

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XIC: "X-inactivation center" auf dem X-Chromosom

17 kb RNA Xist: X-inactive transcript

Xist

Tsix Xce Xce: X-controlling element

Tsix: anti-sense transcript zu Xist

Xist : Expression vom inaktiven X (Xi) als einziges Gen keine Expression vom aktiven X

Xist RNA bindet entlang des gesamten inaktiven X-Chromosom

Dsxpas34-Marker

Tsix wirk antagonistisch zu Xist: Modell: Ausbildung eines Tsix/Xist Duplexes am aktiven X

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Die Xist RNA dekoriert das gesamte inaktive X-Chromosom

Nachweis der Xist RNA durch Hybridisierung in Metaphasezellen

Das inaktive X hat weniger Acetylierte Histone (hier Nachweis von Acetyliertem H4)

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Aufrechterhaltung der Inaktivierung

Xist RNA rekrutiert spezifische Heterochromatinproteine: Polycomp repressor complex1 und 2 (PRC1 und PRC2) Histon H2A K119 Ubiquitinierung PRC2: Histon H3 K27 Trimethylierung. Histon H4 K20 Methylierung

später akkumulieren Histonvarianten macroHsA und man findet deacetyliertes Histon H4

noch später wird auch die DNA an Cytosin methyliert

Das gängige Model:

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Andere Funktionen von Histonen bzw. Chromatinstruktur:

Reparatur und Rekombination

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MAT a HMRa

Wie erfolgt eigentlich die Verarbeitung der Dopplestrangbrüche beim Mating type Switching?

HMLα

HO

Degradation der MATa Information und Reparatur mit HMLα als Matrize

homologe Rekombination (Genkonversion) wird eingeleitet. Der Begriff Genkonversion stammt aus der Beobachtung, dass dabei ein Allel in ein anderes konvertiert wird. In der klassischen Pilzgenetik beobachtete man seltene 1:3 Segregation von Allelen (R. Holliday 1964).

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Das Switching ist mechanistisch identisch mit der Reparatur von Doppestrangbrüchen nach oder während der S-Phase wenn Schwesterchromatide zur Verfügung stehen:

A) Bei der Meisoe erfolgt der Doppelstrangbruch (DSB) programmiert durch Ezyme wie Spo11 (Hefe).

B) Beim switching durch die HO Endonuklease C) In somatischen Zelle durch DNA Schäden

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Mre11 – Nuklease Rad 50 Xrs2

BRCA2 (Defekt führt zu Prädisposition für Krebs, („breast cancer“)

Mre11 Nuklease Komplex MRX:

DER DOPPELSTRANGBRUCH rekrutiert MRX Komplex

Strangaustausch mit recA – homologen Rad51 Dcm1

In diesen Komplexen findet man in Vertebraten auch BCRCA2

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Das passiert nach Bestrahlung sehr schnell:

Eine Kultur von Fibroblasten wurde in Streifen mit Röntgenstrahlen bestrahlt.

nach 30 Minuten findet man neu synthetisierte DNA (hellgrün (Einbau von Brom-desoxyUridin (BrdU); Nachweis mit Fluoreszierendem Antikörper gegen BrdU)

Bereiche neusynthetisierter DNA enthalten Mre11 Protein.

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Auch hierbei ist die Struktur der Nukleosomen wichtig:

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Bestrahlung von Blutzellen führt zur H2AX Phosphorylieung (gamma γ-H2AX) und Akkumulation dieser Histonvariante am Doppelstrangbruch

Proteinkinasen werden aktiv (Stopp des Zellzyklus) Mec1/Tel1 (ATM) DNA-PK

Histon H2AX Variante wird phosphoryliert. Akkumulation von Reparaturenzymen in sehr kurzer Zeit direkt am Doppelstrangbruch.

detaillierte Analyse in Hefe: Cohesinproteine, Mre11 und Histon H2AX akkumulieren – alle bekannte der letzten Stunden

grün: γ-H2AX Foci nach Bestrahlung

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MAT a HMRa HMLα

HO MAT a HMRa HMLα

Dieser Prozess heißt nonhomologous end joining oder : NHEJ Dieser Weg ist in Tieren sehr aktv und wir auch für die Rekombination von Antikörgergenen eingesetzt.

Was passiert wenn kein homologer Partner da ist? Wenn der DSB nach der Replikation stattfindet, ist das Schwesterchromatid da und es wird über homologe Rekombination repariert Und wenn es vor der Repliation stattfindet? (HO wird kurz vor der Replikation aktiv)? Dann kann der Doppelstrangbruch wieder auf gut Glück ligiert werden

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Man nehme: Hefezellen, die keine Möglichkeit haben durch homologe Rekombination den HO Doppelstrangbruch zu reparieren.

Man induziere die Expression von HO Nuklease

Analysiere die Überlebenden

Solche Testsysteme wurden verwendet, um diese Prozesse genetisch zu studieren.

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Hier entstehen Fehler durch den Verlust bzw. Addition von Nukleotiden (Mutationen)

Schätzungen: 2000 Veränderungen/ somatische Zelle am Ende unseres Lebens

Ku70/89 bilden einen Ring um die DNA

Die Enzyme des NHEJ

114 (Alberts Kapitel 5)

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Die Take home lesson:

kovalente Modifikationen von Chromatinproteinen hat funktionelle Bedeutung für alle Prozesse der Genexpression und DNA Modifikationen (Rekombination).

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Zusammenfassung Stunde 5/6

Histondeacetylasen modifizieren Chromatin am Telomer Silencing von mating type Genen in der Hefe

Die Bedeutung der Chromatinstruktur für die Ausbildung von Heterochromatin

Histonmethylierung am inatktiven X-Chromosom.

Einige Gene deren Produkte für die Ausbildung von Heterochromatin in Drosophila kodieren für Histon-Methyltransferasen. Chromatin Protein HP1 erkennt und bindet Methylierte Histone.

Reparatur und Rekombination Rekrutierung von Repataturenzymen und Histonvarianten am Doppelstrangbruch Die Enzyme des NHEJ, nonhomologous end joining

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Übungsfragen und notwendiges zur Klausur.

Fragen kommen aus den Zusammenfassungen und aus dem Folgenden:

Wie sieht ein Nukleosom aus? Welche Biochemischen Reaktionen führen zu: Acetylierung, Methylierung, Ubiquitinierung?