diana marcela peÑarete vargas
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EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE LAS LÍNEAS CELULARES U937 Y KG-1a
DIANA MARCELA PEÑARETE VARGAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
CARRERA DE BACTERIOLOGIA
Santa fe de Bogotá, Octubre de 2000
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EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE LAS LÍNEAS CELULARES U937 Y KG-1a
DIANA MARCELA PEÑARETE VARGAS
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar el título de
BACTERIÓLOGA
DIRECTORA
MARTHA MESA VILLANUEVA. M.Sc.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
CARRERA DE BACTERIOLOGIA
Santa fe de Bogotá, Octubre de 2000
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EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE LAS LÍNEAS CELULARES U937 Y KG-1a
DIANA MARCELA PEÑARETE VARGAS
MARTHA MESA VILLANUEVA. M.Sc. DIRECTORA CLARA SPINEL. Ph.D. JURADO JHON MARIO GONZÁLEZ. Ph.D. JURADO CARLOS CORREDOR. Ph.D.
DECANO ACADÉMICO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS
AURA ROSA MANASCERO. M.Sc.
DIRECTORA DE LAS CARRERAS DE BACTERIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA
4
A mi Madre
Con todo mi amor
5
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a: Martha Mesa, M.Sc. directora de la investigación Laboratorio de Inmunobiología, Pontificia Universidad Javeriana Grupo de Inmunobiología, Pontificia Universidad Javeriana Diana Camargo, M.Sc. Univesidad Industrial de Santander Asesora estadistica Mauricio Rojas, Ph.D. Laboratorio Central de Investigaciones, Universidad de Antioquia Asesor de la investigación
6
ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N0 13 de Julio de 1946: “ La Universidad no se hace
responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado”
7
CONTENIDO
pág.
1.INTRODUCCIÓN 1
2.MARCO TEÓRICO 2
2.1.MELATONINA 2
2.1.1.Metabolismo 4
2.1.2.Mecanismos de acción 7
2.1.2.1.Receptores de membrana plasmática 9
2.1.2.2.Receptores nucleares 10
2.1.2.3.Actividad intracitoplasmática 11
2.1.3.Funciones 11
2.1.3.1.Remoción de radicales libres 11
2.1.3.2.Potenciación de la función inmune 13
2.1.3.3.Efecto oncostático 14
2.1.3.3.1.Efectos directos 15
2.1.3.3.1.1.Demora en la transición de la fase G1 a fase S 15
2.1.3.3.1.2.Factores de crecimiento 16
2.1.3.3.1.3.Interacción con calmodulina 16
2.1.3.3.1.4.Uniones intercelulares 16
2.1.3.3.2.Efectos indirectos 18
2.1.3.3.2.1.Efecto Antioxidante 18
8
2.1.3.3.2.2.Efecto Inmunoestimulador 18
2.1.3.3.2.3.Estudios clínicos en pacientes con cáncer 20
2.1.3.3.2.4.Estudios in vitro sobre líneas celulares tumorales 21
2.2.LÍNEA CELULAR KG1a 24
2.2.1.Carcterísticas 24
2.2.2.Modelos de estudio 26
2.3.LÍNEA CELULAR U937 27
2.3.1.Carcterísticas 27
2.3.2.Modelos de estudio 27
2.4. CICLO CELULAR 30
3.JUSTIFICACIÓN 35
4.OBJETIVOS 37
4.1.OBJETIVO GENERAL 37
4.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS 37
5.MATERIALES Y MÉTODOS 38
5.1.TIPO DE ESTUDIO 38
5.2.MUESTRA 38
5.2.1. Línea celular KG1a 38
5.2.2. Línea celular U937 38
5.3. REACTIVOS 39
5.4.MÉTODOS 41
5.4.1. Cultivo celular 41
5.4.2. Caracterización morfológica e inmunofenotípica 41
9
5.4.3. Tiempo de Generación 41
5.4.4. Ensayos de proliferación celular 42
5.4.5.Estudio de apoptosis por coloración con DIOC6 (3) y Bromuro
de etidio 43
5.4.6.Análisis del ciclo celular con yoduro de propidio 46
5.4.8.Análisis 49
6.RESULTADOS 50
6.1.CARACTERIZACION MORFOLÓGICA E INMUNOFENOTIPICA DE
LA LINEA CELULAR KG1a 50
6.2. TIEMPO DE GENERACIÓN DE LA LINEA CELULAR KG1a 52
6.3. EFECTO DE MELATONINA SOBRE PROLIFERACIÓN DE KG1a 52
6.4.EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE EL ∆∆ΨΨm DE KG1a 53
6.5.EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE EL CICLO CELULAR DE
KG1a 55
6.6. CARACTERIZACION MORFOLÓGICA E INMUNOFENOTIPICA
DE LA LINEA CELULAR U937 57
6.7.TIEMPO DE GENERACIÓN DE LA LINEA CELULAR U937 59
6.8.EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE
LA LINEA CELULAR U937 59
6.9.EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE EL ∆∆ΨΨm DE U937 60
6.10. EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE EL CICLO CELULAR DE
KG1a 61
7.DISCUSIÓN 64
10
8.CONCLUSIONES 69
9.RECOMENDACIONES 70
10.BIBLIOGRAFÍA 71
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 1. Efectos intracelulares putativos de la melatonina que
contribuyen a la oncostasis 17
Tabla 2. Efectos de la melatonina sobre el sistema inmune 19
Tabla 3. Efecto de la melatonina 1x10-3 M sobre el ∆∆ΨΨm de KG1a 54
Tabla 4. Efecto de la melatonina 1x10-3 M sobre el ciclo celular de
KG1a. 55
Tabla 5.Efecto de la melatonina 1x10-3 M sobre el ∆∆ ΨΨm de U937 60
Tabla 6. Efecto de la melatonina 1x10-3 M sobre el ciclo celular de
U937. 62
11
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Estructura química de la Melatonina 2
Figura 2. Producción de Melatonina en la glándula pineal 3
Figura 3. Metabolismo de la Melatonina 5
Figura 4. Regulación de la síntesis de melatonina en la pineal 6
Figura 5. Receptores de Melatonina 8
Figura 6. Efecto antioxidante de la melatonina 12
Figura 7. Maduración Hematopoyética 24
Figura 8. Determinación de ∆∆ΨΨ m y viabilidad (DiOC6 / BE) 46
Figura 9. Análisis del ciclo celular con yoduro de propidio. 48
Figura 10. Células KG1a teñidas con colorante de Wright 50
Figura 11. Inmunofenotipo de la línea celular KG1a 51
Figura 12. Efecto de la melatonina sobre la proliferación de la línea 52
celular KG1a
Figura 13. Efecto de la melatonina sobre el ∆∆ΨΨm de la línea celular 54
KG1a
Figura 14. Efecto de la melatonina sobre el ciclo celular de KG1a 56
12
Figura 15. Células U937 teñidas con colorante de Wright 57
Figura 16. Inmunofenotipo de la línea celular U937 58
Figura 17. Efecto de la melatonina sobre la proliferación de la línea
U937 59
Figura 18. Efecto de la melatonina sobre el ∆∆ΨΨm de la línea celular
U937 61
13
Figura 19. Efecto de la melatonina sobre el ciclo celular de U937 63
14
LISTA DE ABREVIATURAS
∆Ψm Potencial de membrana interna mitocondrial
ADCC Citotoxicidad dependiente de anticuerpos
AMPc Adenocin 5´, 3´ monofosfato ciclico
BE Bromuro de etidio
CamK Kinasas dependientes de calcio
CD Cluster determination
CRE Elemento de respuesta a AMPc
CREB Proteina de unión a CRE
DIOC6 3,3 dihexiloxacarbocianina
EGF Factor de crecimiento epidermal
EGFr Receptor del EGF
Gi Proteina G inhibitoria
ICER Represor temprano de la transcripción inducida por AMPc
IFNγ Intereferón gamma
IGF Factor de crecimiento insulinoide
IL Interleuquina
MAPKinasas Kinasas activadas por mitógenos
MCH Complejo mayor de histocompatibilidad
15
PKC Proteinkinasa C
TGFβ Factor transformador del crecimiento
TNFα Factor de necrosis tumoral alfa
16
RESUMEN
Recientemente se ha observado que la melatonina (N- acetil-5-metoxitriptamina),
principal hormona secretada por la glándula pineal de los mamíferos tiene funciones
oncostáticas. Los mecanismos a través de los cuales la melatonina ejerce esta acción
se pueden describir bajo influencia directa o indirecta de sus funciones celulares,
aunque no se conoce definitivamente la forma por la cual logra inhibir el crecimiento
tumoral.
El presente trabajo determinó el efecto de la melatonina sobre las líneas tumorales
hematopoyéticas KG1a y U937 in vitro por medio del análisis de la proliferación celular,
la apoptosis y cambios en el ciclo celular.
El cálculo de la proliferación por coloración con azul tripano mostró una reducción
significativa del crecimiento celular con dosis de melatonina de 1x 10-3 M, luego de 72
horas de cultivo para las líneas celulares U937 (p < 0.001) y KG1a, (p<0.001) el
posterior análisis del potencial de membrana interna mitocondrial (∆Ψm) con DiOC6
mostró alteraciones compatibles con la inducción de apoptosis a las 72 horas para la
línea celular U937 (p=0.00163), en estas células el estudio del ciclo celular con yoduro
de propidio mostró un aumento de la población hipopliode (apoptótica) luego del
17
tratamiento con melatonina( p=0.0495) y disminución de la fracción en fase S
(p=0.0495).
En las células KG1a no hubo diferencias significativas en los cambios de ∆Ψm; pero si
se observó disminución de las células en fase S del ciclo celular a las 48 horas de
cultivo (p=0.0495) posiblemente la inhibición de la proliferación en ésta línea celular se
deba a este fenómeno.
18
1.INTRODUCCIÓN
La melatonina es una indolamina producida en la glándula pineal que se secreta
siguiendo un ritmo circadiano, a la cual se le han atribuido importantes funciones
fisiológicas que afectan de manera directa o indirecta algunos procesos biológicos,
entre los cuales está la activación de la respuesta inmune por estimulo en la producción
de interleuquinas sobre linfocitos T ayudadores ; la protección del daño celular por su
acción antioxidante sobre células que han sufrido algún tipo de injuria y la acción
antiproliferativa y oncostática ejercida por medio de mecanismos como la regulación del
ciclo celular, bien sea por inhibición de la actividad de factores estimulantes de
crecimiento o regulación en la expresión génica. ( BRZEZINSKI, A. 1997).
Se ha planteado el estudio del efecto de la melatonina sobre líneas celulares de
progenitores hematopoyéticos tempranos, con base en evidencias clínicas y
moleculares que sugieren que la melatonina puede controlar el crecimiento tumoral de
manera indirecta, o directa. (PANZER, A. 1997; HILL, S. 1988; LISSONI, P. 1999); el
presente estudio muestra el efecto de la melatonina sobre dos líneas tumorales
hematopoyéticas; la línea celular monocítica U937, y la línea celular mieloide KG1a ,
19
teniendo en cuenta variables de dosis y tiempo sobre la proliferación celular, la
apoptosis y cambios en el ciclo celular.
2. MARCO TEÓRICO
2.1. MELATONINA
Filogenéticamente la melatonina es una molécula conservada a través de la evolución,
está presente en unicelulares, algas, invertebrados y vertebrados superiores, se ha
propuesto que a diferentes niveles cumple funciones reguladoras de ciclos periódicos
de adaptación a la luz y fertilidad, entre otras. (ARENDT, J. 1986). La melatonina es la
principal hormona secretada por la glándula pineal de mamíferos, químicamente es una
indolamina, N- acetil-5-metoxitriptamina, sintetizada a partir del triptófano (Figura 1.).
Figura 1. Estructura química de la Melatonina ( N-acetil-5-metoxitriptamina)
N
C H 2 C N
H
H
C C H 3 O C H 3
O
20
La glándula pineal en los mamíferos es un transductor neuroendocrino que responde
con la secreción de melatonina frente al estimulo que recibe en la oscuridad;
principalmente consta de pinealocitos, también se encuentran células gliales, astrocitos
y células intersticiales. (BRZEZINSKI, A. 1997); en el hombre la glándula pineal ocupa
la depresión existente entre los tubérculos cuadrigéminos superiores del cuerpo calloso
detrás del tercer ventrículo. (Figura 2).
21
Sin embargo, este no es el único lugar de síntesis de melatonina, se ha mostrado que
en la retina, el intestino y los leucocitos existe una significativa producción de esta
hormona, (CONTI, A. 2000) mostrando un gran espectro de funciones sobre diferentes
blancos. (HARDELAND, R. 1995); en general se ha considerado que cumple un papel
importante en la sincronización de ritmos circadianos, la estimulación del sistema
inmune y la reproducción. Existen receptores para melatonina en los núcleos
supraquiasmáticos hipotalámicos, la pars tuberalis de la hipófisis, en los vasos
sanguíneos, y otros sitios anatómicos en donde posiblemente cumpla diferentes
funciones. ( BRZEZINSKI, A. 1997).
2.1.1. Metabolismo. La melatonina fue aislada y caracterizada por Aaron Lerner, de
extractos pineales bovinos, su biosíntesis está dada a partir de triptófano, el cual por
medio de la triptófano hidroxilasa se convierte en 5-hidroxitriptófano, para luego ser
descarboxilado a serotonina, sobre esta última actúa primero una N-acetiltransferasa
llevándola a N-acetilserotonina y finalmente, la enzima hidroxiindol-O-metiltransferasa
cataliza su conversión en Melatonina. (BRZEZINSKI ,A.1997).( Figura 3)
La información fotónica de la retina se transmite a la glándula pineal a través de los
núcleos supraquiasmáticos y el sistema nervioso simpático, la síntesis y secreción de
melatonina es estimulada por la oscuridad e inhibida por la luz. Durante las horas de
luz del día, las células fotoreceptoras de la retina están hiperpolarizadas, lo cual inhibe
22
la secreción de norepinefrina; con la llegada de la oscuridad, los fotoreceptores
secretan norepinefrina, por consiguiente activan el sistema y el número de receptores
adrenérgicos en la glándula aumentan, activando la síntesis de N-acetiltransferasa y por
consiguiente de melatonina.
Figura 3. Metabolismo de la Melatonina . La melatonina se sintetiza a partir de Triptófano por acción de la triptófano hidroxilasa, luego el 5-hidroxitriptófano se descarboxila a serotonina, sobre ésta actúa una N-acetiltransferasa y finalmente la hidroxiindol-o-metiltransferasa convierte la N-acetilserotonina en melatonina. En el hígado la melatonina se hidroxila y conjuga para ser excretada. Alternativamente la hormona puede ser desacetilada en la retina.
.
serotonina
O H
N
C H 2
H
C H 2 N H 2
N
C H 2
H
C H 2 N C C H 3
H
O H
O
Acido 5-hidroxiindolacético
O H
N
C H 2
H
C O O H
N-acetilserotonina
Melatonina
O
C H 3 O
N
C H 2
H
C H 2 N C C H 3
HN
C H 2
H
C O O HC H 3 O
Acido 5-metoxiindolacético
N
C H 2
H
C H 2 N C C H 3
H
C H 3 O
O H
O
6-hidroximelatonina
ácido glucosidurónicosulfato
N
C H 2
H
C H N H 2
C O O -
H O
N
C H 2
H
C H N H 2
C O O -
triptofano
5- hidroxitriptofano
23
La producción rítmica de la melatonina se sabe que depende de la integridad en la
inervación simpática de la glándula pineal , los núcleos supraquiasmaticos y los
paraventriculares, además de la proyección retinohipotalámica y los ojos, ( KLEIN, D.
1979), se considera que en los núcleos supraquiasmaticos se genera un ritmo
endógeno que es sincronizado por el ciclo luz-oscuridad, ( MOORE, R. 1974).
La enzima reguladora de la síntesis de melatonina es la N-acetiltransferasa, la cual
muestra un ritmo de actividad circadiano, que al igual que el de la melatonina, está
regulado en los núcleos supraquiasmáticos por la luz. En la oscuridad, dependiendo de
la inervación adrenérgica de la glándula pineal, los niveles de AMP cíclico (AMPc)
aumentan y la proteincinasa dependiente de AMPc fosforila la proteína de unión al
elemento de respuesta CRE (CREB), la cual por lo tanto se Pune a CRE y activa los
sitios de transcripción determinados para la N-acetiltransferasa. (BORJIGIN, J. 1999.
(Figura 4)
Figura 4. Regulación de la síntesis de Melatonina en la pineal. En la oscuridad, la norepinefrina liberada por la retina activa el sistema neuronal que induce en el pinealocito un aumento del AMPc; éste activa la PKA que fosforila a CREB; CREB-P induce la transcripción de N-acetiltransferasa para la síntesis de melatonina; el represor ICER inhibe la transcripción de la enzima.
CREB P
↑↑ cAMP
Transcripción
PK
↑↑ Melatonina
N-acetiltransferasa
NÚCLEO
CRE
CREB P DNA
ICER
Norepinefrina Fotoreceptores de la retina
24
La inhibición de la transcripción de la N-acetiltransferasa ocurre a través del represor
temprano de la transcripción inducida por AMPc (ICER), el cual está sujeto a activación
transcripcional por CREB y a retroalimentación negativa por sí mismo. Al incrementarse
la síntesis de melatonina, la hormona entra en el flujo sanguíneo por difusión pasiva, de
modo que entre las 2 y las 4 a.m. se presenta un pico máximo de secreción que cae
gradualmente. Los niveles séricos de la hormona varían de acuerdo con la edad; en
adultos sanos los valores promedio en el día son: 10 pg / ml, ( 40 pmol / L), y en la
noche: 60 pg / ml, (260 pmol / L). (BRZEZINSKI, A. 1997).
Finalmente, la melatonina , es catabolizada en el hígado donde por hidroxilación y
posterior conjugación con sulfato o glucuronato es conducida al sistema renal y
excretada en la orina principalmente en forma de 6-sulfatomelatonina. Alternativamente,
la melatonina es desacetilada a 5-metoxitriptamina, la cual es desaminada a ácido 5-
metoxiindolacético y 5-metoxitriptfol, esta vía es de particular importancia en la retina;
en los plexos coroides y en la glándula pineal la melatonina es metabolizada a L-
kinurenina por acción de 2,3-indolamina dioxigenasa. ( VANECEK J, 1998).( Figura 3)
2.1.2.Mecanismos de acción. Algunos efectos de la melatonina están mediados por
receptores de membrana, otros son independientes de receptor ya que por ser una
molécula lipofílica cruza las membranas biológicas por difusión simple. Se han
caracterizado dos tipos de receptores para melatonina: los receptores Mel 1, son de alta
25
Dominio Extraceluilar
afinidad, responden a concentraciones de melatonina del orden picomolar; y los
receptores Mel 2, de baja afinidad, que actúan a concentraciones nanomolares. Los
receptores Mel 1 pertenecen a la familia de receptores acoplados a proteínas G, en
general, actúan inhibiendo la actividad de la adenilato ciclasa ( Gi ); Los receptores Mel
2 están acoplados a la estimulación de la hidrólisis de inositolfosfato, su distribución no
ha sido determinada. (BRZEZINSKI, A. 1997). (Figura 5)
26
2.1.2.1. Receptores. Se han caracterizado tres subtipos de receptores Mel1: 1a,
expresado en cerebro de mamíferos y pájaros, Mel 1b, presente en la retina de los
mamíferos y Mel 1c, que se encuentra en los melanóforos de anfibios, entre otros. En
general, estos receptores son proteínas de aproximadamente 420 aminoácidos con 7
segmentos hidrófobos aparentemente transmembranales, el peso molecular estimado
es de 47.424; basado en su análisis estructural pertenecen a un grupo distinto dentro de
la gran superfamilia de receptores acoplados a proteínas G. Los receptores Mel 1a
forman la mayoría de receptores del cerebro, hipófisis y núcleos supraquiasmáticos, se
cree que este subtipo puede mediar los efectos estacionales y circadianos atribuidos a
la melatonina así como la función reproductora en especies de cría estacionaria.
(BRZEZINSKI, A. 1997).
En los núcleos supraquiasmáticos la función del receptor está dada por la activación de
la fosfolipasa C, lo cual regula la hidrólisis de fosfatidilinositolbiifosfato; el diacilglicerol
resultante puede activar la proteincinasa C para inducir la activación (fosforilación) de
Fosfolipasa A2, con lo cual se incrementa la liberación de ácido araquidónico, (segundo
mensajero), esta liberación también puede estar provocada por la movilización de calcio
mediada por inositoltrifosfato. Además es probable que la melanina actúe vía terceros
mensajeros, por ejemplo mediante la proteína c-fos, (VANECEK, J. 1998).
27
Así mismo en la pars tuberalis la melatonina puede inhibir la producción de AMPc, de
manera que se evita la fosforilación de CREB, y por ende la transcripción génica, por
ejemplo de c-fos y c-jun. (VANECEK, J. 1998).
Los receptores Mel 1b de la retina al parecer regulan los efectos de la melatonina sobre
la sensibilidad a la fotopercepción. La dependencia del calcio para la liberación de
dopamina, sugiere que el incremento de calcio puede ser la señal que induce su
secreción; la melatonina probablemente actúa por medio del receptor Mel 1b acoplado a
proteína G que interviene en la regulación del calcio intracelular (VANECEK, J. 1998).
Es probable que la melatonina inhiba la liberación de dopamina al disminuir los niveles
de calcio, se ha mostrado recientemente que la melatonina no solo puede inhibir el
influjo de calcio sino además su movilización de los depósitos intracelulares.
2.1.2.2. Receptores nucleares. Adicionalmente se ha encontrado que la melatonina se
une a dos receptores huérfanos de la familia de los receptores nucleares de retinoides,
estos receptores son llamados RZR α y RZR β, este último tiene una afinidad de unión
nanomolar y se expresa principalmente en regiones cerebrales; existe una variante por
splicing del RZR α, llamado ROR α 1, el cual se une específicamente a la melatonina
en el rango nanomolar; RZR α y ROR α 1 se expresan en muchos tejidos y células por
ejemplo en leucocitos de sangre periférica, hígado y músculo liso. Estos receptores
posiblemente participan en la regulación transcripcional que ejerce la melatonina en
28
tejidos periféricos de manera diferente a las funciones que regula a nivel cerebral. Ya
que la melatonina se ha visto involucrada en algunos mecanismos de control del
crecimiento y diferenciación celular, estos efectos podrían estar controlados por
regulación génica mediada por los receptores nucleares de la melatonina.
(WIESENBERG, I. 1995). (Figura 5)
2.1.2.3. Actividad intracitoplasmática. La melatonina también puede actuar en sitios
intracelulares a través de su unión a la calmodulina citosólica, afectando directamente la
señalización por interacción con enzimas blanco tales como la adenilato ciclasa y la
fosfodiesterasa, así como con proteínas estructurales.(BRZEZINSKI, A. 1997). (Figura
5)
2.1.3.Funciones.
2.1.3.1.Remoción de radicales libres. Particularmente por su grupo 5-metoxi, la
melatonina tiene una gran capacidad de atrapar radicales libres, tales como hidroxilo y
anión superóxido, esto hace que sea un agente antioxidante potencialmente importante;
en algunos estudios se ha demostrado que tiene una efectividad mayor que otras
sustancias altamente antioxidantes como la vitamina E, el glutatión y el manitol; además
se ha reportado que la melatonina estimula la glutatión peroxidasa cerebral reduciendo
la formación de hidroxilo. (PANZER, A.1997). De esta forma, la melatonina puede
proteger macromoléculas como el DNA contra el daño degenerativo causado por
agentes oxidantes químicos o radiaciones ionizantes. Sin embargo, estos efectos se
29
presentan a concentraciones de melatonina que superan sus niveles fisiológicos.
(BRZEZINSKI, A. 1997) (Figura 6).
Figura 6. Efecto antioxidante de la melatonina. La melatonina atrapa radicales libres y termina las cadenas redox. La interacción con peróxido o hidroxilo origina un radical indolil catiónico que al unirse al anión superóxido origina la molécula N-acetil-N-formil-5-metoxiquinuramina. Fuente: Neuroscience and Biobehavioral reviews, 1993; 17:347-355
30
La melatonina adquiere mayor importancia debido a que por si misma termina la cadena
de reacciones necesarias para eliminar los productos oxidantes sin involucrarlos en
otras cadenas de reducción-oxidación adicional, por medio de dos pasos que incluyen
primero la formación del radical melatonil a partir de su interacción con los radicales
peróxido o hidroxilo, y luego su unión al anión superóxido, lo cual lleva a la formación de
la molécula: N-acetil-N-formil-5-metoxiquinuramina (AFMK) ( HARDELAND, R. 1995).
2.1.3.2.Potenciación de la función inmune. Se ha mostrado que la melatonina está
conectada con algunas funciones inmunes, en los linfocitos T CD4+ y neutrófilos
humanos se han identificado sitios de unión específica para la melatonina, se cree que
son receptores acoplados a proteínas G, por medio de los cuales se estimula la
producción de citoquinas y en algunos casos la respuesta primaria de anticuerpos.
(PANZER, A.1997). En linfocitos T, la melatonina, por medio de su unión a receptores
de alta afinidad regula la producción de AMPc, mientras que la unión a receptores de
baja afinidad aumenta la formación de GMPc. (HARDELAND, R. 1995)
La melatonina estimula la producción de interleuquina 4 (IL -4) en células T ayudadoras
y del factor estimulante de colonias granulocíticas-monociticas en células estromales de
médula ósea. ( BRZEZINSKI, A. 1997).
31
Otros efectos de la melatonina sobre el sistema inmune incluyen la activación de
monocitos vía proteincinasa C, induciéndolos a citotoxicidad, secreción de interleuquina
1 (IL-1) y producción de intermediarios reactivos de oxígeno. (MORREY,K. 1994).
Las indolaminas en general han mostrado modular la citotoxicidad natural de las células
NK, modificar la respuesta de anticuerpos, inhibir la proliferación de linfocitos activados
por mitógenos e inhibir la producción de Interferón gamma (IFNγ) por células T
humanas. Además el IFNγ y las indolaminas parecen ser parte de un circuito
inmunoregulador en los leucocitos mononucleares de sangre periférica debido a que
IFNγ incrementa la producción de serotonina y melatonina en linfocitos y macrófagos,
mientras que estas indolaminas inhiben la síntesis de IFNγ, los monocitos sintetizan
melatonina a partir de triptófano y el IFNγ disminuye la deaminación oxidativa de 5-
hidroxitriptamina. ( MORREY,K. 1994).
2.1.3.3.Efecto oncostático. Los mecanismos a través de los cuales la melatonina
ejerce su acción oncostática se pueden describir bajo influencia directa o indirecta de
sus funciones celulares, aunque no se conoce definitivamente la forma por la cual logra
inhibir el crecimiento tumoral, es probable que ejerza una acción antimitótica, o que
estimule la destrucción tumoral por inmunoregulación. (BRZEZINSKI, A. 1997).
32
Debido a los mecanismos de acción que involucran efectos sobre la producción de
moléculas reguladoras de función celular, estimulación de la respuesta inmune humoral
y celular, y a su actividad antioxidante; la melatonina se ha postulado como un factor
oncostático natural. Adicionalmente, la pinealectomía ha mostrado un aumento
consecuente en el desarrollo tumoral y la administración de melatonina ha revertido en
cierta medida esta progresión en animales de experimentación. (PANZER, A. 1997).
2.1.3.3.1.Efectos directos.
2.1.3.3.1.1. Demora en la transición de la fase G1 a fase S. El efecto directo de la
melatonina sobre el ciclo celular, se ha evidenciado por medio de ensayos en los cuales
la melatonina ha incrementado la fracción de células en fase G1, mientras reduce la
cantidad de células en fase S, el efecto antiproliferativo de la melatonina parece ser
específico del ciclo celular, causando una demora en la transición de la fase G1 a S,
esto se relaciona con los hallazgos de que la melatonina prolonga la duración del ciclo
celular e induce en algunos casos diferenciación de líneas celulares in vitro. Esto se ha
observado en particular en las línea celular MCF-7.
Los receptores de membrana para la melatonina posiblemente mediando mecanismos
de transducción de señales puede demorar el crecimiento celular por medio de efectos
sobre el ciclo celular. (JONES, MP: 2000). En células de coriocarcinoma humano la
melatonina inhibe la proliferación celular al parecer mediante su interacción con el
33
receptor Mel 1b, en éstas células se presenta una demora en la transición G1/S en
presencia de melatonina que se correlaciona con el efecto antiproliferativo observado.
(SHIU,SH. 1999).
2.1.3.3.1.2. Factores de crecimiento. La melatonina puede estimular la producción y/o
secreción de factores inhibitorios del crecimiento autocrinos o paracrinos. (PANZER, A.
1997), por ejemplo se ha encontrado que la melatonina ocasiona un incremento en el
factor transformador de crecimiento TGFβ, que inhibe el crecimiento celular y que la
melatonina inhibe la proliferación de la línea celular MCF-7 bloqueando la acción del
factor de crecimiento epidermal,
2.1.3.3.1.3. Interacción con calmodulina. Las funciones de la calmodulina pueden ser
antagonizadas por la melatonina, afectando la señalización de calcio, mediante la
interacción directa con enzimas como la fosfodiesterasa, o proteínas estructurales como
las de los microtúbulos; o bien, por acciones indirectas a través de proteincinasas
específicas; también la melatonina puede tener una acción antineoplásica por su efecto
antagonista de calmodulina a nivel de DNA, induciendo su fragmentación, ya que el
calcio y la calmodulina están involucrados en el proceso que le confiere estabilidad al
DNA en células neoplásicas.
2.1.3.3.1.4. Uniones intercelulares. A concentraciones fisiológicas la melatonina ha
mostrado incrementar las uniones intercelulales gap , de manera que se puede suprimir
34
la promoción del tumor y la metástasis, por medio de la transferencia de moléculas que
suprimen el crecimiento desde células normales a las células malignas. (PANZER, A.
1997).
Tabla 1. Efectos intracelulares putativos de la melatonina que contribuyen a la oncostasis.
Sitio de Acción Acción Mecanismo Efecto
Acción Antioxidativa
DIRECTA: remoción de radicales libres. INDIRECTA: Antioxidante
↓daño DNA Inhibe óxido nítrico sintasa, NO, OH- y H2O2
↓ carcinogénesis ↓ angiogénesis ↓daño DNA
Factores de crecimiento
Antiestrógeno Antagonista de prolactina Bloquea el EFG*
↓ transcripción receptor de estrógeno Antagoniza prolactina Bloquea EGFr
↓ proliferación dependiente de hormonas Mejora el grado histológico
Ciclo Celular Demora la transición G1/S
Degeneración de las células al diferenciarse
Mejora el grado histológico
Comunicación Intercelular
↑ uniones intercelulares gap
Permite transferencia de supresores de crecimiento a las células tumorales
↓metástasis
Citoesqueleto A niveles fisiológicos: se une a calmodulina A niveles farmacológicos: se une a tubulina
↑ tamaño de microtúbulos: ↑ fragmentación DNA de células tumorales Disrupción microtubular
Muerte de células tumorales Muerte de células tumorales
*EGF: Factor de Crecimiento Epidermal; ↓↓: disminución; ↑↑:aumento Fuente: Journal of pineal research. The validity of melatonin as an oncostatic agent. Vol. 22 (1997) ; p 184-202
35
2.1.3.3.2.Efectos indirectos
2.1.3.3.2.1. Efecto antioxidante. La melatonina puede prevenir el daño del DNA
inducido por radicales libres, además puede disminuir la carcinogénesis causada por
daño oxidativo sobre el DNA; un mecanismo alternativo está dado por su efecto sobre la
enzima oxido nítrico sintasa; se cree que el óxido nítrico formado por las células
tumorales puede promover la carcinogénesis. La inhibición de está enzima por parte de
la melatonina da una posibilidad de reducción de la malignidad y el crecimiento tumoral.
( PANZER, A. 1997).
2.1.3.3.2.2.Efecto inmunoestimulador. El principal componente en el control de la
proliferación maligna es el sistema inmune y se ha mostrado que la melatonina estimula
las funciones reguladoras celulares y humorales enfocadas hacia la eliminación de las
células tumorales.
Como ya se mencionó la melatonina tiene la capacidad de activar los monocitos para
atacar a los blancos tumorales por medio de citotoxicidad; además otros trabajos han
mostrado que la melatonina aumenta la presentación antigénica por parte de
macrófagos esplénicos y aumenta las moléculas de histocompatibilidad
de clase II en macrófagos; se ha visto que en respuesta a la melatonina las células T
citotóxicas aumentan la expresión de receptores y la actividad de citotoxicidad
dependiente de anticuerpos, así como la actividad de las células NK in vivo, todo ello
con el objetivo de llevar a la necrosis tumoral. ( PANZER, A. 1997).
36
En cuanto a la respuesta humoral, los monocitos estimulados con melatonina secretan
IL-1 e IL-2, con lo cual se activan los linfocitos T, las células NK y los linfocitos B para
que produzcan inmunoglobulinas. También se ha mostrado que las células T
ayudadoras son estimuladas por melatonina para producir IL-4 y factor de necrosis
tumoral α (TNFα), (MAESTRONI, G. 1999), Los linfocitos estimulados con melatonina
además secretan IFN γ, lo cual incrementa la producción de melatonina por monocitos.
Tabla 2. (MAESTRONI, G. 1994; PANZER, A. 1997).
Tabla 2. Efectos de la melatonina sobre el sistema inmune
Parámetro Efecto ↑ células anti tumorales Necrosis Tumoral ↑ respuesta primaria de anticuerpos ↑ la inmunidad humoral ↑ Interleucina 1 ↑ la respuesta de fase aguda ↑ Interleucina 2 Multiplicación y crecimiento de Linfocitos
T, estimulación de <NK y producción elevada de Ig por estímulo de Linfocitos B
↑ IL 2 y Número de células inmunes ↑ linfocitos CD 25+, linfocitos, NK y eosinófilos.
↑ Interleucina 4 ↑ hematopoyesis ↑ péptidos opioides inducidos por melatonina
Contrarresta la inmunodepresión causada por estrés o esteroides
↓ Factor de Necrosis tumoral α ↓ caquexia ↑ Factor de Necrosis tumoral α Toxicidad selectiva para células
tumorales ↑ interferón γ ↑ la producción de melatonina por
monocito/macrófago ↓ Factor de crecimiento insulinoide 1 ↓crecimiento tumoral (cáncer de seno) ↑ afinidad y densidad de receptores tímicos para esteroides adrenales
Modula la respuesta inmune
Fuente: Journal of pineal research. The validity of melatonin as an oncostatic agent. Vol. 22 (1997) ; p 184-202
37
2.1.3.3.3.Estudios clínicos en pacientes con cáncer. la melatonina ha probado
contrarrestar los efectos citotóxicos de la quimioterapia, actuando como un agente
antioxidante y además promoviendo apoptosis de las células tumorales.
Los primeros datos de administración intravenosa de melatonina en humanos reportan
una dosis de 200 mg diarios, lo cual representa un valor extremadamente alto si se
tienen en cuenta los bajos niveles séricos de esta hormona; sin embargo no hubo efecto
alguno de toxicidad en los pacientes, estudios posteriores mostraron que el único efecto
colateral a la administración de 250 mg de melatonina fue somnolencia. ( PANZER, A.
1997).
Desde 1969 se han reportado tratamientos con melatonina en pacientes con cáncer de
seno, estómago o pulmón entre otros, en los que se mostraba cierto grado de
efectividad en el tratamiento de tumores sólidos con melatonina; posteriormente, se
realizaron estudios en los que se demostró que la inmunoterapia con melatonina e IL -2
fue más efectiva y tuvo menos efectos secundarios comparada con la administración de
cisplatin y etopósido, en pacientes con cáncer de pulmón. Lissoni reportó en otros
ensayos clínicos beneficios adicionales de la terapia con melatonina como por ejemplo
la disminución en el desarrollo de trombocitopenia, disminución en la severidad del
síndrome mielodisplásico inducido por quimioterapia, disminución de los efectos
inmunosupresores de otras drogas citotóxicas y reducción en la severidad de la
38
hipotensión secundaria al tratamiento con IL - 2. (LISSONI, P 1998; PANZER, A. 1997).
En un estudio de pacientes con glioblastoma, aquellos tratados con melatonina y
radioterapia vivieron más tiempo que los pacientes tratados solo con radiación;
(BRZEZINSKI, A. 1997). Luego se reportó que pacientes con melanoma maligno
avanzado tratados con 700 mg al día de melatonina tuvieron disminución transitoria del
tamaño de masas tumorales (BRZEZINSKI, A. 1997).
Recientemente se evaluó la eficacia de varios tratamientos quimioterapéuticos
(cisplatin, etoposido, doxorubicina y mitoxantone) combinados con melatonina (20
mg/día oral) en pacientes con estados clínicos avanzados; se vio que la melatonina
puede aumentar la eficacia de la quimioterapia y reducir la citotoxicidad, al menos en
pacientes con estados clínicos avanzados. ( LISSONI, P. 1999).
2.1.3.3.4.Estudios in vitro con líneas celulares tumorales. Los estudios realizados
con la línea celular humana MCF-7 de cáncer de seno, positiva para receptor de
estrógenos, han revelado aspectos importantes del efecto antiproliferativo de la
melatonina; un estudio realizado en 1988 muestra que la melatonina a dosis fisiológicas
de 10-9 M y 10-11 M inhibe la proliferación celular (valor de p< 0.001). (HILL, S. 1988).
39
El crecimiento de células positivas para receptor de estrógenos como MCF-7, TA7D y
ZR75-1, se inhibió en presencia de melatonina, en contraste con las líneas celulares
negativas para este receptor: BT20 y MDA-MB-231; es entonces posible que la
melatonina pueda ejercer una acción oncostática por medio de su efecto sobre el
receptor de estrógenos. (PANZER, A. 1997; KANISHI, Y. 2000).
En las células MCF-7, se vio que la melatonina incrementa los niveles de p53 y
p21WAF1, de manera que la inhibición en la proliferación de estas células puede estar
dada por un arresto en el ciclo celular dependiente del incremento en la expresión de
p21WAF1 mediado por la vía que involucra p53. (MEDIAVILLA, S. 1999). Sin embargo
otros estudios realizados en MCF-7, en los cuales se indujo apoptosis con melatonina y
ácido retinoico, mostraron que las células disminuyen los niveles de Bcl-2 e
incrementan los niveles de Bax y Bak, pero no presentan cambios en los niveles de
p53. (ENRÍQUEZ, K. 2000)
Un estudio adicional investigó los efectos de la melatonina en la capacidad invasiva de
las células MCF-7. La hormona a dosis fisiológicas (10-9 M y 10-11 M ) redujo la
invasividad de estas células tumorales medida en cámara de invasión, (COS, S. 1998).
Estudios adicionales mostraron que la melatonina inhibe la proliferación de otras líneas
celulares, por ejemplo las células de cáncer de próstata humano DU 145 fueron
40
inhibidas con concentraciones de 10-6 M a 10-9 M , estas células son positivas para el
receptor nuclear de melatonina RZRα, pero negativas para los receptores de
membrana; en el mismo estudio se vio una eficiencia en el tratamiento oral con
melatonina en ratas transplantadas con las células MCF-7, (RZR/ROR positivas) de
manera dosis dependiente, en la disminución del crecimiento subcutáneo del tumor.
(KARASEK , M. 1999).
Se ha propuesto que la melatonina ejercer su efecto antiproliferativo in vivo bloqueando
el metabolismo de los ácidos grasos; en un sistema in vivo se vio que la melatonina
regula la incorporación y el metabolismo del ácido linoleico dependiendo de la
concentración sérica de la hormona, los periodos de máxima secreción de melatonina
se correlacionaron con los de menor incorporación de ácidos grasos; un metabolito del
ácido linoléico, el ácido 13-hidroxioctadecadienoico, es una importante molécula
mitogénica ya que estimula la mitogénesis dependiente del factor de crecimiento
epidermal; la melatonina inhibe su incorporación de manera que reduce la proliferación
celular. ( BLASK, D 1999).
Las líneas tumorales hematopoyéticas han sido estudiadas bajo diferentes
perspectivas, en particular se ha caracterizado su respuesta a diferentes agentes
inductores de diferenciación debido a que una de las anormalidades de estas células es
su incapacidad de diferenciarse hasta un estado funcional maduro; los agentes que
permiten a dichas células madurar bajo ciertas circunstancias ambientales tienen una
gran importancia terapéutica. ( KOEFFLER, P. 1983). En este estudio del efecto de la
41
melatonina sobre líneas celulares hematopoyéticas tempranas se analizan los efectos
de la melatonina sobre dos líneas celulares provenientes de tumores hematopoyéticos,
las células KG1a y las células U937. Dentro de la maduración hematopoyética, estas
líneas celulares son precursores inmaduros, que hacen parte del linaje granulocitico y
monocitico respectivamente. (Figura 7).
Figura 7. Maduración Hematopoyética. A partir de una célula pluripotencial (Stem cell) se diferencia una línea tronco linfoide que da origen a los linfocitos; igualmente, se origina un progenitor mieloide común para plaquetas, eritrocitos, granulocitos y monocitos. Dentro de la maduración del linaje granulo-monocitico se encuentran las líneas celulares KG1a y U937.
2.2. LINEA CELULAR KG1A
2.2.1.Características. La línea celular mieloide KG-1a se originó a partir de la línea
celular KG1, está última fue obtenida de un paciente con eritroleucemia que evolucionó
CFU-GM BFU- Meg
Stem CellCélula troncolinfoide
CélulaMultipotencial
GEMMM
PLAQUETAS
ERITROCITOSLINFOCITOS
PROMONOCITO
MONOCITOS
CFU-G
PROMIELOCITO
MIELOCITO
METAMIELOCITO
GRANULOCITOS
KG1a
LINFOCITOS
C F U -G
C F U -MMIELOBLASTO
PROMIELOCITO
MIELOCITO
METAMIELOCITO
GRANULOCITOSMONOCITOS
PROMONOCITO
MONOBLASTO
B F U -E B F U -Meg
ERITROCITOS
PLAQUETAS
U937
CFU-GMCFU-GM BFU- Meg
Stem CellCélula troncolinfoide
CélulaMultipotencial
GEMMM
PLAQUETAS
ERITROCITOSLINFOCITOS
PROMONOCITO
MONOCITOS
CFU-G
PROMIELOCITO
MIELOCITO
METAMIELOCITO
GRANULOCITOS
KG1a
LINFOCITOS
C F U -G
C F U -MMIELOBLASTO
PROMIELOCITO
MIELOCITO
METAMIELOCITO
GRANULOCITOSMONOCITOS
PROMONOCITO
MONOBLASTO
B F U -E B F U -Meg
ERITROCITOS
PLAQUETAS
U937
CFU-GM
42
a leucemia mieloide aguda, las características morfológicas de KG1 son compatibles
con mieloblastos y promielocitos; por su parte las células KG1a presentan un estado de
maduración más temprano. Fueron establecidas en 1980 por Koeffler y se reconocen
como mieloblastos inmaduros por sus características citoquímicas tales como la
inactividad de estearasas específicas, ASD diacetato estearasa y α-Naftil butirato
estearasa, tampoco presentan actividad de peroxidasa leucocitaria. (KOEFFLER, H.
1980).
KG1 y KG1a comparten algunas características por ejemplo el cariotipo, las isoenzimas
citoplasmáticas y la expresión de los antígenos HLA A 30, 33 y B 35, ninguna de las dos
líneas celulares expresa antígenos de linfocitos T ni antígenos de Leucemia Linfoide
Aguda, así como tampoco antígenos del virus Eipsten-Barr, o inmunoglobulinas de
membrana. ( KOEFFLER, H. 1980).
A diferencia de las células KG1 las KG1a no expresan antígenos HLA DR, tienen una
menor expresión de receptores para la fracción Fc de las inmunoglobulinas y son
negativas para la formación de colonias en agar como respuesta al factor estimulante
de colonias. ( FURLEY, A. 1986). KG1a no se diferencia bajo el estimulo con ésteres de
forbol o teleocidinas como lo hace KG1; la línea celular KG1a expresa los antígenos
CD34, CD13 ,CD7 y CD15.
43
Las células KG1a crecen en medio IMDM , suplementado con l-glutamina 4 mM,
bicarbonato de sodio1.5 g/L, y suero fetal bovino al 20%. Atmósfera húmeda con 5% de
CO2 y 37º C de temperatura; el tiempo de generación reportado es de 55 a 65 horas.
2.2.2.Modelos de estudio. La línea celular KG1a ha mostrado resistencia a la
apoptosis inducida por TNFα mediada por esfingomielinasa (BEZOMBES, C. 1998);
además otros tratamientos que generalmente inhiben el crecimiento de líneas tumorales
en cultivo han sido ineficientes en la inducción de apoptosis en esta línea celular, tal es
el caso de mitoxantrone, el cual induce apoptosis en las líneas celulares U937 y HL-60.(
BAILLY, JD. 1997).
Una característica importante de las células KG1a es la alta expresión de Bcl-2,
además, la presencia de la glicoproteina P, que al parecer le confiere resistencia a la
muerte inducida por TNFα y otros agentes,(BEZOMBES, C. 1998); otros investigadores
han reportado que esta línea celular es deficiente en p53; aunque también se ha
reportado que expresa la proteína mutada (CLAVE, E. 1997).
Sin embargo los efectos de la radiación ionizante en esta línea celular han mostrado
que se presenta muerte necrótica subsecuente al arresto del ciclo celular en fase G2/M.
(CLAVE, E. 1996). Luego se reportó que las células KG1a mueren por apoptosis en
tratamiento con rayos X, al parecer esta muerte está relacionada con la expresión de
IFN, (CLAVE, E. 1997).
44
2.3. LINEA CELULAR U937
2.3.1.Características. Las células U937, son células provenientes de un linfoma
histiocítico humano; pueden ser inducidas a diferenciación monocítica terminal con
sobrenadantes de cultivos mixtos linfocitarios, ésteres de forbol y vitamina D. La línea
celular fue establecida en 1974 por Sundström y Nilsson (SUNDSTRÖM, C.1976),
presenta rasgos morfológicos de monoblastos y tiene producción de lisozima y β2
microglobulina; no produce Inmunoglobulinas ni expresa antígenos HLA DR, tampoco
antígenos del virus Eipsten-Barr.
Presenta en su membrana los antígenos CD 13, CD 33, CD11, CD120 (receptor para
TNF), y receptores para la fracción Fc de las inmunoglobulinas y para C3r; tiene el
antígeno Fas.
El cultivo y propagación de las células de acuerdo a las indicaciones de la American
Type Culture Collection (ATCC) requiere medio RPMI 1640, bicarbonato de sodio 1.5
g/L, HEPES 10mM, piruvato de sodio 1.0 mM y glucosa1,5 g/L y suero fetal bovino al
10%. Las células tienen un tiempo de generación de 16 a 20 horas.
2.3.2.Modelos de estudio. Debido al grado de maduración y a las características
funcionales de estas células se ha mostrado que son sensibles de inducción a muerte
celular programada bajo efecto de moléculas como TNFα (YEUMG 1998), óxido nítrico
y etopósido VP-16 (MÚHL, H.1999). Algunos autores han propuesto que la apoptosis
45
mediada por TNFα, involucra la participación de p53, ya que se ha observado un
aumento en su expresión cuando las células son inducidas a diferenciación con TPA, y
presentan una muerte apoptotica subsecuente dependiente de TNFα (TAKADA,
Y.1999)
Las células U937 poseen receptores de membrana Mel 1 para la mela tonina, se ha
visto que al ser activadas con INFγ se induce la expresión de los receptores nucleares
RORα1 y RORα2, y se reprime la expresión del receptor citoplasmático. ( GUERRERO,
J. 2000); la expresión de estos receptores ha mostrado activar la producción de IL 6 en
las células U937 en presencia de melatonina. (GUERRERO, J. 2000).
Lizard y colaboradores indujeron a apoptosis las células U937 mediante 7-
ketocolesterol; en este trabajo se evaluó la capacidad de la melatonina para inhibir la
apoptosis inducida por 7-ketocolesterol debido a sus capacidades antioxidantes. Se
vio que la melatonina a pesar de inhibir la producción de radicales oxidantes, no
previene las disfunciones mitocondriales implicadas en la apoptosis. (LIZARD, G. 2000).
Sin embargo la melatonina previene el daño del DNA inducido por H2O2 en las células
U937. ( ROMERO, MP. 1999).
Se ha visto que la línea celular U937 es sensible de diferenciación monocítica bajo la
influencia de diversas sustancias, en un estudio las células U937 fueron activadas in
vitro con sobrenadantes de un cultivo mixto linfocitario, las células mostraron cambios
morfológicos compatibles con activación monocítica, ( KOREN, H. 1979). Resultados
46
similares se obtuvieron cuando las células U937 fueron expuestas a
dihidroxicolecalciferol (OLSON I 1983) ; se cree que los cambios relacionados con
maduración de las células U937 no requieren síntesis de DNA, pero si la síntesis de
algunas proteínas.
La línea celular U937 ha mostrado sensibilidad a la diferenciación y a muerte apoptótica
activada por agentes que efectan la viabilidad y las funciones celulares pues activan
mecanismos tales como la producción y/o liberación de citoquinas o proteínas
reguladoras del ciclo celular; estos modelos de estudio han permitido postular algunas
vías de señalización que se activan cuando una señal apoptótica llega a la célula, por
ejemplo la activación de la proteincinasa C o de las MAPcinasas. (TAKADA, Y.1999).
Sin embargo los mecanismos implicados en la activación del programa de muerte
celular para muchos modelos de estudio permanecen poco claros; con respecto a la
inhibición de la proliferación inducida por la melatonina in vitro se ha planteado la
intervención de cascadas de señalización que se activan de manera dependiente a los
receptores de membrana celular para la hormona, por ejemplo la disminución en los
niveles de AMPc intracelular; por otro lado la interacción directa de la melatonina con
los receptores nucleares de la familia del ácido retinóico plantea la posibilidad de la
activación de factores nucleares que regulan el ciclo celular de forma directa.
La melatonina ha mostrado afectar diversas funciones celulares como la secreción de
citoquinas y la intervención en mecanismos que posiblemente regulan directa o
47
indirectamente el ciclo celular, de manera que puede ejercer efectos importantes para el
destino de una célula como de hecho se ha reportado in vitro.
2.4. CICLO CELULAR.
Cuando el ambiente celular es favorable o una célula ha recibido alguna señal externa
que le indique que debe dividirse, se desencadenan los mecanismos de señalización
que determinan la síntesis de proteínas reguladoras como la ciclina D y su unión a una
proteincinasa (CDK4/6), los eventos posteriores de fosforilación permiten que el
contenido de DNA se duplique y que la célula progrese en el ciclo celular.(SHER, C.
1995)
En el ciclo celular, las células diploides pasan a través de cuatro fases distintas: G1, S,
G2 y M, las células que no se replican se encuentran en un estado de reposo o fase G0
del ciclo celular; el contenido del DNA se encuentra en cromosomas apareados y la
cantidad se denota como 2n. Cuando la reproducción celular se activa por algún
inductor de proliferación u otro estímulo externo, las células entran en la fase G1 del
ciclo, en la cual hay síntesis de RNA y proteínas pero el contenido de DNA permanece
constante y es igual al contenido de la fase G0, [fase (G0/G1)] . La fase S comienza con
la replicación del DNA y llega hasta que todo el DNA se ha replicado y el contenido es
entonces el doble, 4n, en ese momento la célula entra en la fase G2 , el contenido de
48
DNA no cambia hasta que la célula esta lista para la división o mitosis , fase M, en la
cual el DNA se divide dentro de dos célula hijas cada una con un contenido 2n.
Cuando la célula debe permanecer en G0 se mantiene un estricto control regulado por
proteínas inhibitorias como p21, p27, p57, p15, p16, p18 y p19, que actúan bloqueando
la acción de los complejos ciclina/CDK. (LEVINE, A. 1997)
La muerte celular programada es un proceso que garantiza la eliminación fisiológica de
células en determinados momentos convenientes para un organismo; este mecanismo
falla cuando se pierde el control del ciclo celular debido a mutaciones que llevan a la
célula a un estado de resistencia, dado por la sobre expresión de proteínas
antiapoptoticas como bcl-2 o por cambios en la función de proteínas supresoras del
crecimiento celular como p53 o pRb,
Los eventos intracelulares que determinan la vía que debe tomar una célula en un
momento determinado dentro del ciclo celular involucran una gran cantidad de
posibilidades que se relacionan con las circunstancias del ambiente celular; por ejemplo
los factores de crecimiento o la inhibición por contacto que recibe de las células
vecinas. Dentro del ciclo, la célula esta sujeta a puntos de control que en condiciones
normales son estrictos y no permiten la replicación de células defectuosas, estos
controles son evadidos por las células tumorales en las cuales puede haber
sobreexpresión de genes asociados con proliferación como c-myc, c-fos, c-jun o
también de ciclinas.
49
El estudio del ciclo celular representa una importante aproximación en modelos de
inducción a apoptosis o a diferenciación celular , de manera que permite evaluar los
efectos apoptóticos o citotostáticos de moléculas de interés biológico y clínico.
En algunos casos es muy importante determinar si los efectos antiproliferativos están
relacionados con la inducción a apoptosis, el arresto en alguna fase del ciclo celular o
citotoxicidad.
Cuando se desencadena el programa genético de muerte celular se presentan eventos
importantes que pueden distinguirse por rasgos característicos en la célula involucrada;
recientemente se ha planteado el estudio del potencial de membrana mitocondrial como
un marcador de iniciación de apoptosis debido a que la disrupción de este potencial
favorece la liberación el citocromo c al citoplasma con la consecuente activación de
caspasas que activan el programa de apoptosis. (MARCHETTI, P. 1995; SUSIN,S.
1996)
El potencial de la membrana interna mitocondrial (∆Ψm) puede estimarse a partir de la
distribución de colorantes lipofílicos dentro de las células de acuerdo a la ecuación de
Nernst, Cc/Co= e-nεF/RT (donde Cc y Co son las concentraciones del indicador citosólica y
extracelular, n es la carga del indicador, ε es el potencial de membrana, F es la
constante de Faraday, R la constante de los gases y T la temperatura).
50
En las células vivas existen diferencias en el potencial eléctrico de las membranas
celulares , debido en parte a los gradientes de concentración de Na+, K+ y Cl- y en parte
a la acción de las bombas electrogénicas. Las diferencias en potencial a través de las
membranas citoplasmáticas son del rango de 10 a 90 mV, con el interior celular
negativo con respecto al exterior. También existe una diferencia de potencial de ≥ 100
mV a través de las membranas de las mitocondrias energizadas, con el interior negativo
con respecto al citosol, este potencial depende del metabolismo energético. (SHAPIRO,
H. 1997)
Se ha aplicado la incorporación mitocondrial de 3,3 dihexiloxacarbocianina, (DiOC6(3))
para establecer la integridad de la membrana mitocondrial con base en el potencial
eléctrico transmembrana (∆Ψm); este es un indicador catiónico perteneciente a las
cianidas, para las que la distribución intracelular es baja a medida que disminuye el
potencial de membrana y es alta si la célula esta hiperpolarizada; si el colorante esta
cargado negativamente como los Oxonoles la respuesta se da en dirección contraria.
(RABINIVITCH, P. 1997; SHAPIRO, H. 1997) .
Estas sustancias lipofílicas pueden pasar fácilmente a través de la membrana hasta que
se alcanza un equilibrio dependiente de ∆Ψ; entonces la distribución intracelular
(intramitocondrial) y extracelular del colorante es medida por citometría de flujo y es
usada para estimar el potencial de membrana; (SHAPIRO, H. 1997; MARCHETTI, P.
1996); según diferentes evidencias el potencial estimado de esta forma es consistente
51
con los datos obtenidos por microelectrodos. (DARZYNKIEWICZ, Z. 1994; SHAPIRO,
H. 1997).
52
3. JUSTIFICACIÓN
Se ha propuesto que la melatonina puede jugar un papel importante como molécula
reguladora en el proceso de muerte celular programada en modelos experimentales
llevados a cabo sobre líneas celulares malignas, esto no sólo es interesante desde el
punto de vista biológico, sino que además proporciona una nueva expectativa clínica de
aplicación terapéutica, ya que se ha reportado en algunos ensayos clínicos reducción o
estabilización del crecimiento tumoral en pacientes con neoplasias avanzadas que han
tomado melatonina, además se ha visto una marcada protección a la toxicidad quimio y
radioterapéutica debido a la administración concomitante de melatonina en estos
pacientes.
Es de señalar que la terapia con melatonina en un momento dado pueda, por un lado
proteger los progenitores hematopoyéticos de efectos citotóxicos gracias a sus
propiedades antioxidantes, y, por otro inducir reducción de la masa tumoral por su
acción antiproliferativa sobre células malignas ; es evidente la necesidad de muchos
estudios básicos y clínicos para establecer con certeza el valor terapéutico de la
administración de melatonina en neoplasias hematológicas, por ello es importante
53
estudiar la relación directa que existe entre la exposición a melatonina y la inducción de
la apoptosis, como posible mecanismo oncostático en líneas celulares malignas.
El estudio de los cambios en la viabilidad y el ciclo celular inducidos por la melatonina
en líneas celulares, puede llevar a conocer los efectos que esta hormona ejerce sobre
las células tumorales in vivo.
Además el análisis de las alteraciones que podrían presentarse debido a la presencia
de melatonina en las células tumorales permite plantear los mecanismos de acción
intracelular de la melatonina.
54
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto de la melatonina sobre las líneas celulares U937 y KG-1a.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
4.2.1. Normalizar las condiciones de cultivo de las líneas celulares U937 y KG-1a.
4.2.2. Determinar cambios en la proliferación de las células U937 y KG-1a luego de su
exposición a melatonina, por medio de tinción con Azul Tripano
4.2.3. Determinar el efecto de la melatonina sobre el potencial de la membrana interna
mitocondrial (∆Ψ) de U937 y KG-1a, por medio la incorporación de DiOC6 y
análisis por citometría de flujo.
4.2.4. Analizar la variación en el ciclo celular de U937 y KG-1a debida a la exposición a
melatonina con Yoduro de Propidio y análisis por citometría de flujo.
55
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. TIPO DE ESTUDIO
Este trabajo es de tipo experimental; se considera que los efectos que la melatonina
puede tener sobre líneas celulares en cultivo, representa una aproximación adecuada
para conocer algunas de sus acciones potenciales sobre células tumorales in vivo.
5.2. MUESTRA
5.2.1. Línea Celular KG1a. (ATCC No CCL-246.1) Es una línea celular mieloide
humana variante de la línea celular de leucemia mieloide aguda KG1 proveniente de
médula ósea con morfología de mieloblasto y estado de ploidia 2n, depositada por D.
W. Golde en 1980
5.2.2. Línea Celular U937. (ATCC No CRL-1593.2) Es una línea celular monocítica
humana con morfología de macrófago o histiocito proveniente de un linfoma histiocitico
humano, depositada por H. Coren en 1976
56
5.3. REACTIVOS
5.3.1. Medio IMDM. (Sigma I2510), este medio fue suplementado con bicarbonato de
sodio (Sigma S7277) 1.5 g/L, glutamina (Sigma G-1517) 4mM y suero fetal bovino,
(Sigma F-2442), 20%.
5.3.2. Medio RPMI 1640. (Sigma R6504) se suplementó con HEPES (Sigma H3784)
10mM, piruvato de sodio (Gibco BRL 11360-070) 1 mM, glucosa (Sigma G5400) 2,5
g/L, bicarbonato de sodio (Sigma S7277) 1,5 g/L y suero fetal bovino, (Sigma F-2442)
10 %.
5.3.3. Melatonina. N- acetil-5-metoxitriptamina (Sigma M-5250), p m 232,3. Se
preparó un stock de 1 x 10 –1 M en etanol absoluto (Merck 100983) y se conservó en
oscuridad a –180 C. Las diferentes soluciones de melatonina de 1 x 10 –3 M a 1x 10 –10
M se prepararon con RPMI 1640 sin Suero fetal Bovino y etanol 1 absoluto.
5.3.4. Azul tripano. ( Sigma T-8154) 0.4 % (p/v) en PBS.
5.3.5. DiOC6(3). (Molecular Probes D-273) se preparó una Solución concentrada 1.74
mM en DMSO anhidro ( Sigma D-2650) que se mantuvo en oscuridad a –18 0 C. A
partir de esta se preparó una solución de trabajo de concentración 70 µM en etanol
absoluto.
57
5.3.6. Bromuro de etidio. ( Sigma E7637), solución de trabajo 1,3 mg / ml de agua
destilada. Se conservó temperatura ambiente en oscuridad.
5.3.7. Solución de yoduro de propidio RNAsa. La solución de trabajo contiene
Yoduro de propidio ( Sigma P-4170) 10 mg; triton X-100 ( Sigma T-1503) 0,1mg; EDTA
(Merck 8418) 3,7 mg; PBS 9 ml; RNAsa (sigma R-5503) 10U - 100U por 1x106 células.
Se conservó a 4 0 C en oscuridad.
5.3.8. Fitohemaglutinina (Sigma L 9017) 10 µg/ ml.
5.3.9. Ficoll Hypaque (Sigma H1077).
5.3.10. Albúmina bovina (Sigma A-2153)
5.3.11. Buffer fosfato salino, PBS (Sigma P3813)contiene NaH2PO4 anhidro 1.9 mM;
Na2HPO4 anhidro 8.1mM; NaCl 154 mM, pH:7.4
5.3.12. Anticuerpos monoclonales. anti-CD34-FITC (Pharmygen clon 581), anti-
CD33, PE -( Becton Dikinson clon P67.6), anti-CD13-PE(Becton Dikinson clonL138),
Anti-CD14-FITC(Becton Dikinson clon MφP9) y Anti-CD16-PE(Becton Dikinson clon
NKP15).
58
5.4. MÉTODOS
5.4.1.Cultivo celular. Las células KG1a fueron cultivadas en medio IMDM
suplementado a una temperatura de 37º C en atmósfera de 95 % de humedad y 5% de
CO2. Las células U937 se incubaron a de 37º C en medio RPMI 1640 suplementado en
atmósfera de 95 % de humedad y 5% de CO2.
5.4.2.Caracterización morfológica e inmunofenotípica. Las células fueron evaluadas
bajo los criterios morfológicos de la coloración de Wigth en láminas preparadas en
citocentrífuga e inmunofenotipicamente por medio del análisis de citometria de flujo de
algunos antígenos de membrana celular mediante anticuerpos monoclonales marcados.
Para esto, se utilizaron 100000 células por marcador; el botón celular se incubó durante
30 minutos con Anti-CD34/anti-CD33, anti-CD14/Anti-CD16 y anti-CD13. Luego de la
marcación, las células se lavaron 2 veces con PBS y se resuspendieron en 500 ul de
PBS con paraformaldehído al 0,5% para análisis en el citómetro Facscalibur (Becton-
Dickinson).
5.4.3.Tiempo de generación. El tiempo de generación para cada línea celular se calculó siguiendo
el siguiente procedimiento (Doyle A.; 1997). De un cultivo celular en crecimiento exponencial se
tomaron 400000 células que fueron subcultivadas en 5 ml de medio cada 4 días, se realizaron
recuentos de viabilidad y número de células con
59
azul tripano y se inocularon nuevos frascos de cultivo con 400000 células. El procedimiento se
repitió tres veces mas. El cálculo se realizó de la siguiente forma:
TG = ln 2/ u
Donde u = Tasa específica de crecimiento=[ln (X/Xo)] / t
Donde X = Densidad celular final
Xo = Densidad celular inicial
t = tiempo (72 horas)
Finalmente se calcula un promedio de todos los subcultivos para obtener el Tiempo de
Generación.
5.4.4. Ensayos de proliferación celular. En placas de cultivo celular de 24 pozos
(Becton Dikinson falcon 3047) se incubaron 100.000 células / ml en cada uno de los
pozos.
Las células se expusieron a concentraciones de melatonina 1x 10-11 M a 1x 10-3 M;
como controles de la prueba se incubaron 100.000 células / ml de medio de cultivo con
la solución diluyente de la melatonina. Para cada concentración se prepararon tres
réplicas y el ensayo se realizó dos veces.
60
Luego de 72 horas de cultivo se realizó el recuento celular de cada uno de los pozos de
la placa en cámara de Neubauer. Las células se diluyeron en colorante Azul tripano.
Este colorante permite evaluar la integridad de la membrana plasmática; se sabe que
uno de los rasgos más distintivos que discriminan entre células vivas y muertas es la
pérdida de la función de transporte y de la integridad física de la membrana, este
ensayo se basa en éste fenómeno, (PHELAN, M. 1997); debido a que la membrana
intacta de las células vivas excluye una variedad de colorantes cargados tales como el
azul de tripano; la incubación con estos colorantes resulta en el marcaje selectivo de
células muertas, mientras que las células vivas no muestran adquisición del colorante
(CORDER, D. 1997).
El número de células/ ml se obtuvo utilizando la siguiente fórmula:
No. De células /ml = [No. Células x factor de dilución / 4 mm2 x 0.1 mm
El cálculo para determinar el porcentaje de viabilidad se realizó con la siguiente fórmula:
% de Viabilidad = No. De células vivas/ No. Total de Células x 100
5.4.5. Estudio de apoptosis por coloración con DiOC6(3) y bromuro de etidio. En
tubos de citometría de flujo (Becton Dikinson falcon 3054) se incubaron 100.000 células
/ ml de medio de cultivo con melatonina 1 x 10-3 M durante 24, 48 y 72 horas, al cabo de
61
las cuales las células fueron coloreadas con DiOC6 (3) y Bromuro de etidio con el fin de
establecer las poblaciones apoptóticas y necróticas del cultivo respectivamente luego
de la exposición a la hormona; como control se incubaron 100.000 células / ml de medio
de cultivo con la solución diluyente de la melatonina.
Para la coloración con DiOC6 (3) y Bromuro de etidio se realizó el siguiente protocolo:
Las células se centrifugan 10 minutos a 3000 r.p.m. y se retiran 500 µl del
sobrenadante; se adiciona la misma cantidad de Albúmina bovina al 2 % en PBS, 5 µl
de DiOC6(3) (70µM) y 12.5 µl de Bromuro de etidio (1,3µg/ml); la suspensión se agita y
se incuba en oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego se realiza un
lavado con PBS por centrifugación a 3000 r.p.m. finalmente se elimina el sobrenadante
y se suspende el botón celular en 400 µl de PBS para la lectura en el citómetro
FACScalibur (Becton Dickinson).
Esta técnica se ha implementado para conocer la integridad de la membrana
mitocondrial con base en el potencial eléctrico transmembrana (∆Ψm); la incorporación
mitocondrial de 3,3 dihexiloxacarbocianina, (DiOC6(3)), tiene relevancia en los estudios
de apoptosis debido a que la disrupción en el potencial de membrana mitocondrial
62
parece favorecer la liberación el citocromo c al citoplasma con la consecuente
activación de caspasas que activan el programa de muerte celular programada. (
KROEMER, G. 1995; SUSIN,S. 1996).
La discriminación entre células apoptóticas y necróticas se consigue con la adición de
Bromuro de etidio; este colorante fluorescente tiene una longitud de onda de excitación
de 493 nm y una longitud de onda de emisión de 637 nm, lo cual permite su uso
simultáneo con el colorante DiOC6 (3) y su análisis por citometría de flujo.
El bromuro de etidio es un colorante que penetra en las células que han perdido la
integridad de la membrana citoplasmática y se intercala en los pares de bases del
DNA, de modo que la población que incorpora Bromuro de etidio corresponde a células
con muerte necrótica, mientras que las células negativas para este colorante y
débilmente positivas para DiOC6 (3) muestran rasgos de muerte apoptótica.
(DARZYNKIEWICZ, Z. 1994)
La adquisición de los datos se realizó en el citómetro de flujo FACSCalibur (Becton
Dickinson), utilizando las longitudes de onda de emisión y excitación indicadas para
cada colorante.
Se utilizó el canal FL1 para la adquisición de la fluorescencia de DiOC6 (verde) y el
canal FL2 para la fluorescencia de bromuro de etidio (roja). En la Figura 8 se presentan
gráficas de puntos de Bromuro de etidio contra DiOC6 e histogramas de intensidad de
63
fluorescencia de DiOC6. Los datos arrojados por la adquisición en el citómetro de flujo
fueron analizados con el programa WinMDI 2.8 estableciendo tres regiones de
intensidad de fluorescencia para FL1: M1, M2 y M3.
Figura 8. Determinación de ∆∆ΨΨm y viabilidad (DiOC6/BE). Células KG1a en cultivo teñidas con Dioc6/BE. Izquierda: Análisis bivariado de integridad de membrana celular vs ∆Ψm: Las células en la región de mayor intensidad de fluorescencia con DiOC6 tienen ∆Ψm alto (vivas); las células a la izquierda tienen menor ∆Ψm (pre-apoptóticas). Derecha: Histograma de fluorescencia de Dioc6: Los marcadores M1, M2, M3 corresponden a células con bajo, medio y alto ∆Ψm respectivamente.
5.4.6. Análisis del ciclo celular con yoduro de propidio. En tubos de citometría de
flujo se incubaron 350.000 células / 2 ml de medio de cultivo con melatonina 1 x 10-3 M
durante 1, 24, 48 y 72 horas al cabo de las cuales las células fueron fijadas y luego
coloreadas con Yoduro de propidio para establecer las poblaciones del cultivo en las
Dioc 6
Dioc 6
BE
Células vivas
Células con membrana despolarizada
64
diferentes fases del ciclo celular; como control se incubaron 350.000 células / 2 ml de
medio de cultivo con la solución diluyente de melatonina.
Simultáneamente se realizó la tinción de mononucleares de sangre periférica obtenidos
por gradiente de densidad con Ficoll hypaque y estimulados con fitohemaglutinina
durante 48 horas.
Para la coloración con Yoduro de propidio se realizó el siguiente protocolo:
Luego de incubación, las células se lavan una vez con PBS frío a 3000 r.p.m. durante
10 minutos, se adicionan 3 gotas de PBS frío y se fijan con seis gotas de etanol
absoluto frío en agitación constante; de esta forma las células pueden ser almacenadas
a 40 C; el objetivo de la fijación es preservar las células de lisis y degradación autolitica
y permeabilizarlas para hacer accesible el DNA al colorante.
Al momento de la coloración las células se centrifugan tres veces con PBS frío durante
10 minutos a 3000 r.p.m. para retirar todo el etanol, luego al pellet se le adicionan 400
µl de solución de Yoduro de propidio-RNAsa, se mezcla y se incuba en oscuridad
durante 30 minutos a temperatura ambiente; luego se realiza un lavado con PBS frío
por centrifugación a 3000 r.p.m., se elimina el sobrenadante y se suspende el pellet en
400 µl de PBS.
El Yoduro de propidio es un colorante fluorescente con una longitud de onda de
excitación de 488 nm y >600 nm de emisión, que se une estequiométricamente a las
65
cadenas de DNA y RNA, por esto para el análisis del contenido de DNA debe usarse
RNAsa. (DARZYNKIEWICZ, Z. 1997)
Con la coloración de yoduro de propidio se puede obtener una distribución del
contenido de DNA dentro de las fases del ciclo celular como la observada en la Figura
9.
Figura 9. Análisis del ciclo celular. Fluorescencia de células U937 en cultivo teñidas con yoduro de propidio. El cont enido de DNA (FL2-A) se relaciona con cada fase del ciclo celular: M2=G0/G1, M3=S, M4=G2/M. Además la región M1=Sub G0/G1 corresponde a las células apoptóticas.
66
La adquisición de los datos se realizó en el citometro de flujo FACSCalibur de Becton
Dickinson, utilizando las longitudes de onda de emisión y excitación indicadas para
yoduro de propidio.
Se utilizó el canal FL2 para la adquisición de la fluorescencia roja del yoduro de
propidio. El análisis posterior a la adquisición se realizó utilizando el programa WinMDI
2.8 determinando los marcadores para las regiones con el contenido de DNA de cada
fase del ciclo celular.
5.4.8. Análisis. El efecto de la melatonina sobre la proliferación celular se determinó
mediante un análisis de varianza, Kruskall-Wallis (α = 0,05).
El efecto de la hormona sobre el ∆Ψm y sobre el ciclo celular de células tratadas con
melatonina comparadas con el control a las 24, 48 y 72 horas se determinó con la
prueba de Wilcoxon (α = 0,05). Se compararon los porcentajes de células presentes
en cada marcador con y sin melatonina, luego de 24, 48 y 72 horas.
67
6.RESULTADOS
6.1. CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA E INMUNOFENOTIPICA DE LA LÍNEA
CELULAR KG1A.
El estudio microscópico de la coloración de Wrigth mostró los siguientes rasgos:
citoplasma azul oscuro vacuolado sin granulaciones, núcleo con cromatina fina
uniformemente teñida, presencia de abundantes nucleolos y un área clara en la periferia
del núcleo, el tamaño celular es variado y la forma redonda u oval, estas células se
reportan por lo general como mieloblastos inmaduros aunque algunos autores indican
que se trata de promielocitos (KOEFFLER, H. 1980). Figura 10.
Figura 10. Células KG1a teñidas con colorante de Wrigth. Preparación en citocentrífuga de las células
KG1a teñidas con colorante de Wright. (100x)
68
La inmunotipificación de la línea celular KG1a con los anticuerpos monoclonales utilizados mostró que la línea es CD13+,CD33+, CD34+, CD14-, CD16-. Figura 11.
Figura 11. Inmunofenotipo KG1a. A. Control de isotipo IgG1 (Ac murino-PE). B. Control de isotipo IgG1 (Ac murino-FITC). C. CD33-PE vs CD34-FITC D.CD16-PE vs CD14-FITC. E. CD13-PE. Las células KG1a fueron CD33+/CD34+, CD16-/CD14- y CD13+ .
A B
C D
E
69
6.2. TIEMPO DE GENERACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR KG1a.
La línea celular KG1a tuvo un tiempo de generación de 70 horas para las condiciones
de cultivo empleadas.
6.3. EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE LA LÍNEA
CELULAR KG1a.
La melatonina a una concentración de 1 x 10-3 M inhibió de manera significativa la
proliferación de las células KG1a (p<0,001) con recuentos menores a las 72 horas de
cultivo con respecto al control (Figura 12).
Figura 12.Efecto de la melatonina sobre la proliferación de la línea celular KG1a. Las células fueron cultivadas en IMDM con diferentes dosis de Melatonina durante 72 horas, teñidas con azul tripano y contadas en cámara de Neubauer. Se observó una disminución del crecimiento celular con Melatonina 1x10-3M. (n=6) (Kruskall–wallis p<0,001).
MELATONINA (M)
Cél
ulas
/ml
0 1.E-11 1,E-9 1,E-7 1,E-6 1,E-5 1,E-4 1,E-30
2
4
6
8(X 100000)
70
Debido a que la inhibición de la proliferación celular fue significativa y constante con
melatonina 1 x 10-3 M , las células KG1a se trataron de nuevo con esta dosis para
analizar posteriormente los cambios en el potencial de membrana mitocondrial y
establecer si la disminución en la proliferación se debía a apoptosis.
De igual forma se realizaron ensayos para analizar el ciclo celular con yoduro de
propidio en las células expuestas a melatonina 1 x 10-3 M.
6.4. EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE EL ∆∆ΨΨm DE LA LÍNEA CELULAR KG1a.
Al comparar el porcentaje de células KG1a en cada región de ∆Ψm (alto, medio, bajo)
en presencia y ausencia de melatonina 1 x 10-3 M, no se observaron diferencias
significativas (Tabla 3.; figura 13); sin embargo, sí se evidenció disminución progresiva
de la población celular con ∆Ψm alto y aumento concomitante de la población con ∆Ψm
medio.
71
Tabla 3. Efecto de melatonina 1 x 10-3 M sobre el ∆∆ΨΨm de KG1a
Tiempo (h)
Melatonina (M)
Marcador Porcentaje (Mediana)
Rango (Min-Máx)
p (Wilcoxon)
24 0 1x10-3
1 1
1.22 1.86
0.27 – 7.2 0.96 – 6.26
0.8273
48 0 1x10-3
1 1
0.77 0.75
0.43 – 1.59 0.66 – 1.68
0.8273
72 0 1x10-3
1 1
0.62 0.63
0.44 – 1.41 0.61 – 1.16
0.8273
24 0 1x10-3
2 2
19.26 35.89
6.04 – 69.18 24.77 – 73.85
0.2752
48 0 1x10-3
2 2
53.64 41.59
36.29 – 59.51 38.25 –67.63
0.8273
72 0 1x10-3
2 2
61.51 75.56
47.17 – 67.13 48.87 – 82.99
0.2752
24 0 1x10-3
3 3
78.18 60.21
25.09 – 96.35 20.96 – 73.74
0.2752
48 0 1x10-3
3 3
46.22 58.27
39.95 – 61.4 31.89 – 58.99
0.8273
72 0 1x10-3
3 3
38.1 24.12
32.69 – 51.19 16.62 – 49.76
0.2752
Porcentajes de células KG1a en cada marcador de intensidad de fluorescencia de DiOC 6 luego de 24, 48 y 72 horas de cultivo con (1x10-3 ) y sin melatonina (0). M1= ∆Ψm bajo; M2= ∆Ψm medio; M3: ∆Ψm alto. (n=3)
Figura 13.Efecto de la melatonina sobre el ∆∆ΨΨm de KG1a. Las células KG1a fueron cultivadas en ausencia (gris) y presencia de melatonina 1x 10-3 M (verde). A las 24, 48 y 72 horas se realizó tinción doble con Dioc6/BE. A las 72 horas se observó disminución leve de la población con mayor ∆Ψm en el cultivo expuesto a melatonina. M1= ∆Ψm bajo; M2= ∆Ψm medio; M3: ∆Ψm alto.
DiOC 6 DiOC 6 DiOC 6
24h 48h 72h
72
6.5. EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE EL CICLO CELULAR DE KG1a.
A las 48 horas de cultivo se observó menor fracción de células en fase S en los
cultivos tratados con melatonina 1 x 10-3 M (p=0,0495) comparado con el control; no
hubo diferencias para las otras fases del ciclo celular (Tabla 4, Figura 14)
Tabla 4. Efecto de melatonina 1 x 10-3 M sobre el ciclo celular de KG1a . Tiempo
(h) Melatonina
(M) Marcador Porcentaje
(Mediana) Rango
(Min-Máx) p
(Wilcoxon)
1hora
0 1x10-3
1 1
44.4 37.6
35-67 27.54-87.8
0.8273
24 horas
0 1x10-3
1 1
26.5 24.68
17.8-37-9 22.7-40.4
0.8273
48 horas 0 1x10-3
1 1
26.6 36.8
24.35-40.3 32.9-54.91
0.2752
72 horas 0 1x10-3
1 1
42.69 72.88
21.1-74.8 72.21-92.2
0.2752
1 hora
0 1x10-3
2 2
24.9 30.7
15.1-27.88 5.9-31.15
0.5127
24 horas
0 1x10-3
2 2
31.3 41.8
25.94-50.2 22.4-45.2
0.8273
48 horas 0 1x10-3
2 2
43.8 35.1
23.28-46.3 18.87-40.5
0.2752
72 horas 0 1x10-3
2 2
24.73 10.74
14.01-49.4 4.7-16.8
0.1266
1 hora
0 1x10-3
3 3
15.88 12.66
13-16.9 3.28-15.65
0.1266
24 horas 0 1x10-3
3 3
15.7 14.5
12.7-20.33 11.9-17.6
0.5127
48 horas 0 1x10-3
3 3
15.9 12.4
14.16-16.1 10.8-12.9
0.0495
72 horas 0 1x10-3
3 3
9.94 5.53
5.81-16.6 1.7-6.01
0.1266
1 hora
0 1x10-3
4 4
6.8 13.2
5.6-12.6 2.17-16.87
0.5127
24 horas 0 1x10-3
4 4
10.91 14.1
9.9-11.4 9.13-14.3
0.5127
48 horas 0 1x10-3
4 4
7.4 9.8
6.83-9.2 6.31-12.4
0.5427
72 horas 0 1x10-3
4 4
7.89 3.7
3.16-9.9 0.9-5.27
0.2752
Porcentajes de células KG1a en cada fase del ciclo celular luego de 1, 24, 48 y 72 horas de cultivo con (1x10-3
) y sin melatonina (0). M1=Sub G0/G1, M2= G0/G1, M3= S, M4= G2/M.(n=3)
Control
73
Figura 14. Efecto de melatonina sobre el ciclo celular de KG1a . Células KG1a fueron cultivadas en ausencia (panel superior) y presencia de melatonina 1x10-3 M (panel inferior) . A las 24, 48 y 72 horas se realizó tinción con Yoduro de Propidio. A las 48 horas, se observó disminución de la fracción celular en fase S en el cultivo expuesto a melatonina (p=0,0495). M1=Sub G0/G1, M2= G0/G1, M3= S, M4= G2/M.(n=3)
24 h 48 h 72 h
*
p=0,0495
57
6.6. CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA E INMUNOFENOTIPICA DE LA LÍNEA
CELULAR U937.
Las células U937 teñidas con colorante de Wrigth presentaron las siguientes características: abundante citoplasma azul grisáceo, núcleo con cromatina fina y presencia de nucleolos, la morfología es compatible con blastos; su identificación como promonocitos se establece por medio de coloraciones citoquímicas. Figura 15.
Figura 15. Células U937 teñidas con colorante de Wrigth. Preparación en citocentrífuga de las células U937 teñidas con colorante de Wright. (100x).
58
La marcación con anticuerpos monoclonales mostró el siguiente inmunofenotipo para las células U937: CD13+; CD33+, CD34-, CD14- y CD16-. Figura 16.
A B
C D
E
59
Figura 16. Inmunofenotipo de U937. A. Control de isotipo IgG1 (Ac murino-FITC). B. CD33-PE vs CD34-FITC C. CD16-PE vs CD14-FITC. D. CD13-PE. Las células U937 fueron CD33+/CD34-, CD16-/CD14- y CD13+ .
6.7. TIEMPO DE GENERACIÓN DE LA LÍNEA CELULAR U937.
La línea celular U937 tuvo un tiempo de generación calculado de 20 horas en las
condiciones de cultivo expuestas.
6.8. EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE LA LÍNEA
CELULAR U937.
El análisis de proliferación mostró una disminución significativa del recuento celular a
las 72 horas de cultivo con melatonina 1x10-3 M (p<0,001) (Figura 17).
MELATONINA (M)
Cél
ulas
/ml
0 1 . E - 1 1 1 ,E-9 1 ,E-7 1 ,E-5 1 ,E-4 1 ,E-37,5
9,5
1 1 , 5
1 3 , 5
1 5 , 5
1 7 , 5( X 1 0 0 0 0 0 )
60
Figura 17.Efecto de la melatonina sobre la proliferación de la línea celular U937. Las células fueron cultivadas en RPMI 1640 con diferentes dosis de Melatonina durante 72 horas, teñidas con azul tripano y contadas en cámara de Neubauer. Se observó una disminución del crecimiento celular con Melatonina 1x10-3M. (n=6) (Kruskall–wallis p<0,001).
Para determinar si el efecto inhibitorio de la melatonina sobre la proliferación celular se
debía a apoptosis, se estudiaron los cambios en el ∆Ψm de U937 expuestas a
melatonina 1x10-3 M, y se analizaron las poblaciones en cada fase del ciclo celular con
yoduro de propidio.
6.9. EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE EL ∆∆ΨΨm DE LA LÍNEA U937.
A diferencia del control, las células cultivadas con melatonina 1x10-3 M mostraron una
disminución significativa en el porcentaje de células de ∆Ψm alto a las 72 horas de
cultivo (p = 0,0163). (Tabla 5, figura 18).
Tabla 5. Efecto de la melatonina 1x10-3 M sobre el ∆∆ΨΨm de U937 Tiempo
(h) Melatonina
(M) Marcador Porcentaje
(Mediana) Rango
(Min-Máx) p
(Wilcoxon)
24 horas
0 1x10-3
1 1
1.72 0.61
0.39-3.69 0.59-0.64
0.5127
48 horas 0 1x10-3
1 1
1.18 1.5
0.49-1.63 0.54-1.26
0.4647
61
72 horas 0 1x10-3
1 1
0.64 0.63
0.4-1.46 0.41-22.01
0.9168
24 horas
0 1x10-3
2 2
11.18 12.11
7.68-32.82 4.98-33.34
0.8273
48 horas 0 1x10-3
2 2
11.01 18.78
5.67-24.54 5.49-35.05
0.6015
72 horas 0 1x10-3
2 2
10.28 25.03
7.45-23.43 9.58-45.82
0.1172
24 horas 0 1x10-3
3 3
88.1 87
65.3-88.55 66.24-94.34
0.8273
48 horas 0 1x10-3
3 3
88.3 79.01
74.66-92.5 64.5-1.26
0.6015
72 horas 0 1x10-3
3 3
89.1 62.38
76.45-90.15 9.51.79.87
0.0163
Porcentajes de células U937 en cada marcador de intensidad de fluorescencia de DiOC 6 luego de 24, 48 y 72 horas de cultivo con (1x10-3 ) y sin melatonina (0). M1= ∆Ψm bajo; M2= ∆Ψm medio; M3: ∆Ψm alto. (n=3)
Figura 18.Efecto de la melatonina sobre el ∆∆ΨΨm de U937. Las células U937 fueron cultivadas en ausencia (gris) y presencia de melatonina 1x 10-3 M (verde). A las 24, 48 y 72 horas se realizó tinción doble con Dioc6/BE. A las 72 horas se observó disminución de la población con mayor ∆Ψm en el cultivo expuesto a melatonina (Wilcoxon, p=0,0163). M1= ∆Ψm bajo; M2= ∆Ψm medio; M3: ∆Ψm alto.
6.10. EFECTO DE LA MELATONINA SOBRE EL CICLO CELULAR DE U937.
La melatonina 1x10-3 M indujo en las células U937 cambios en la distribución de las
poblaciones en las fases del ciclo celular; específicamente incrementó el porcentaje de
DiOC 6 DiOC 6 DiOC 6
p = 0,0163 *
62
células apoptóticas (P=0,0495) y disminuyó la fracción celular en fase S (p=0,0495) a
las 72 horas de tratamiento (Tabla 6, Figura 19).
Tabla 6. Efecto de melatonina sobre el ciclo celular de U937 . Tiempo
(h) Melatonina
(M) Marcador Porcentaje
(Mediana) Rango
(Min-Máx) p
(Wilcoxon) 1 0
1 1 1
26.625 13.715
7.7-45.57 7.9-19.53
1
24 0 1
1 1
24.59 31.43
20.65-29.2 7.86-43.01
0.5127
48 0 1
1 1
29.17 32.45
13.55-32.32 30.27-47.4
0.1266
72 0 1
1 1
31.18 49.36
12.29-39.84 48-68.52
0.0495
1 0 1
2 2
33.745 37.3
30.015-6.54 32.87-41.73
0.4386
24 0 1
2 2
32.17 33.69
29.72-40.48 28.33-43.98
0.8273
48 0 1
2 2
30.14 32.56
30.1-43.08 31.38-34.76
0.5127
72 0 1
2 2
35.45 21.62
24.9-47.22 14.91-29.31
0.1266
1 0 1
3 3
23.35 29.52
12.39-34.31 28.49-30.55
1
24 0 1
3 3
26.39 22.34
20.2-26.9 14.45-26.09
0.2752
48 0 1
3 3
26.34 17.41
20.75-27.73 9.27-26.87
0.2752
72 0 1
3 3
24.6 13
21.76-33.62 8.89-17.49
0.0495
1 0 4 12.27 6.67-16.87 0.4386
63
1 4 14.665 10.39-18.94 24 1
0 4 4
8.2 8.35
7.73-11.63 7.35-12.17
0.8273
48 0 1
4 4
7.79 8.21
17.78-14.1 7.08-11.64
0.8273
72 0 1
4 4
8.44 6.35
7.29-12.86 3.76-7.16
0.0495
Porcentajes de células U937 en cada fase del ciclo celular luego de 1, 24, 48 y 72 horas de cultivo con (1x10-3 ) y sin melatonina (0).M1=Sub G0/G1, M2= G0/G1, M3= S, M4= G2/M.(n=3)
64
Figura 19. Efecto de melatonina sobre el ciclo celular de U937 . Células U937 fueron cultivadas en ausencia (panel superior) y presencia de melatonina 1x10-3 M (panel inferior) . A las 24, 48 y 72 horas se realizó tinción con Yoduro de Propidio. A las 72 horas, se observó disminución de las fracciones celulares en las fases S (p=0,0495) y G2/M (p=0,0495) y aumento de la población hipoploide (p=0,0495) en las células expuestas a melatonina. M1=Sub G0/G1, M2= G0/G1, M3= S, M4= G2/M (n=3).
Control
Control
1x10-3M
DNA-PI DNA-PI DNA-PI
DNA-PI DNA-PI DNA-PI
* * *
p=0,0495
24 h 48 h 72 h
65
7. DISCUSION
La melatonina es la principal hormona producida por la glándula pineal de los
mamíferos, la cual cumple diferentes funciones entre las que se encuentra la regulación
del crecimiento de células tumorales; los mecanismos que ejercen este efecto
oncostático pueden ser directos sobre el ciclo celular o indirectos por su capacidad
inmunoestimulante (PANZER, A. 1997).
El presente trabajo se realizó con el objetivo de establecer el efecto de la melatonina
sobre la proliferación, apoptosis y ciclo celular de las líneas celulares hematopoyéticas
KG1a y U937; se observó que la hormona inhibe el crecimiento de las dos líneas
tumorales de manera significativa a una concentración farmacológica de 1x10-3 M luego
de 72 horas de cultivo. En la literatura revisada no se encontraron trabajos sobre el
efecto de la melatonina en estas líneas; pero se discuten los resultados obtenidos con
base en su efecto oncostático en otros modelos experimentales. Por ejemplo, muchos
trabajos han mostrado la inhibición del crecimiento de diferentes líneas celulares en
presencia de melatonina por diferentes mecanismos: detención del ciclo celular en
G1/G0, disminución de la fracción en fase S, inducción de apoptosis y promoción de
diferenciación.
66
Algunos de estos efectos parecen estar mediados a través de receptores
citoplasmáticos tipo Mel, otros a través de receptores nucleares de la familia RZR
(JONES, M. 2000; SHIU, S. 1999) y otros mas por su capacidad de interferir con la
señalización intracelular del Ca++ (BRZEZINSKY, A. 1997; VANECEK, J. 1998).
En la línea tumoral de cáncer de seno, MCF-7, dependiente de estrógeno, la
melatonina retarda la transición G1/S del ciclo celular e induce diferenciación al parecer
porque evita la transcripción de receptores de estrógeno (Hill, S. 1088). En otras
líneas, la melatonina puede interferir en la estabilidad del citoesqueleto o estimular la
producción de inhibidores como TGF-β para detener la proliferación de las células
tumorales (PANZER, A.1997). Algunos de estos eventos están mediados por el
aumento de la expresión de p53 (MEDAVILLA, M. 1999) o por la modulación de los
miembros de la familia de proteínas Bcl-2 (ENRIQUEZ, E. 2000).
En la línea celular KG1a, el efecto antiproliferativo de melatonina 1x10-3 M se acompañó
de disminución de la fracción celular en fase S a las 48 horas de cultivo, hallazgo similar
al reportado en las células de cáncer de próstata LNCaP (MORETTI, R.2000); por otro
lado no se observaron rasgos de apoptosis como cambios en el ∆Ψm ni aumento de la
fracción hipoploide. Al respecto es importante recordar que KG1a es una línea
resistente a apoptosis inducida por diferentes agentes quimioterapéuticos debido a la
presencia de un factor conocido como glicoproteína P (gp P) (BEZOMBES, C.1998).
Además, se debe tener en cuenta que el tiempo de generación de esta línea es muy
67
largo (70 horas) y que es posible que no se hayan observado cambios mayores en el
diseño experimental efectuado.
Como no se conoce la expresión de receptores para melatonina en esta línea celular
solo es posible especular que el efecto antiproliferativo observado pudiera estar
mediado por mecanismos intracelulares directos de la hormona como la
desestabilización del citoesqueleto o el bloqueo de la señalización de Ca++ mediada por
calmodulina (PANZER, A.; 1997). Cuando la melatonina inhibe los influjos de Ca++ , es
posible que la calmodulina pierda su actividad enzimática y por lo tanto que la acción
de las proteincinasas dependientes de Ca++ (CamK) se inhiba; algunas de estas
enzimas son importantes en la fosforilación de CREB, factor de transcripción que activa
genes de proliferación celular (VANECEK, J. 1998). Al respecto es importante señalar
que en ensayos iniciales realizados en el laboratorio se vio que la melatonina es capaz
de proteger a las KG1a de la disrupción del ∆Ψm inducida por el ionóforo de calcio
A23189.
La línea U937 ha mostrado sensibilidad a la diferenciación y la muerte apoptótica
activada por agentes que afectan la viabilidad y las funciones celulares los cuales
activan mecanismos tales como la producción y/o liberación de citoquinas o proteinas
reguladoras del ciclo celular; estos
68
modelos de estudio han permitido postular algunas vías de señalización que se activan
cuando una señal apoptótica llega a la célula, como la activación de la PKC o de las
MAPKs. (TAKADA, Y. 1999).
En éste trabajo se observó que el efecto inhibitorio de la melatonina 1x10-3 M sobre la
proliferación de U937 estuvo acompañada de disminución de la fracción S, disrupción
del ∆Ψm y aumento de la población apoptótica a las 72 horas de cultivo. En esta línea
celular se expresan los receptores para melatonina tipo Mel y se puede inducir la
expresión de los receptores nucleares RZRα-1 y RZRα-2 (GUERRERO, J. 2000). Es
posible entonces que los mecanismos de inhibición de la proliferación en esta línea
tumoral, se deban a dos efectos diferentes mediados por los receptores Mel 1: por un
lado la regulación del ciclo celular y por otro la inducción de apoptosis. El primer efecto
podría deberse a que los receptores de melatonina tipo Mel están acoplados a proteína
Gi que al inhibir la síntesis de AMPc, puede bloquear la acción de factores de
transcripción involucrados en la progresión del ciclo celular como c-fos (TANNOCK, I.
1998). El segundo efecto, podría estar relacionado con un aumento de p53
(MEDAVILLA, M .1999), o la disminución de Bcl-2 ( ENRIQUEZ, E. 2000), ambas
proteínas estan presentes en U937, (YEUNG, M. 1998); actualmente se están
realizando en el laboratorio algunos ensayos para determinar cambios en la expresión
de Bcl-2 en presencia de la hormona.
69
También es importante señalar que a diferencia de lo observado en las KG1a, la
melatonina no inhibe la disrupción del ∆Ψm inducida por el ionóforo de calcio A23189
en las células U937 y que por tanto algunos de los efectos de la melatonina mediados
por las CamKs podrían no estar presentes en las U937.
En conclusión, la melatonina tuvo un efecto antiproliferativo sobre las celulas U937 y
KG1a. En las dos líneas este efecto parece estar mediado por una intervención de la
hormona en el ciclo celular que disminuye la fracción celular en fase S; adicionalmente
en las U937se presentaron evidencias de apoptosis. Estas observaciones preliminares
al igual que las realizadas en la línea eritropoyética K562, ( CALLEJAS, F. 2000)
muestran que a pesar de provenir de un progenitor común, los efectos y las vías de
señalización de la melatonina en estas líneas depende de varios factores como el
genotipo y el estado del cultivo celular. La resolución de los múltiples interrogantes que
han surgido en el desarrollo de éste trabajo permitirá configurar un cuadro más
completo de las complejas vías de relación entre el eje neuroendocrino y la regulación
del crecimiento tumoral.
70
8. CONCLUSIONES
1. La melatonina 1x10-3 M inhibe la proliferación de las células KG1a y U937 a las
72 horas de cultivo .
2. El efecto antiproliferativo de la melatonina 1x10-3 M en las células KG1a y U937
esta relacionado con la disminución de la fracción de células en fase S del ciclo
celular.
3. Las células U937 muestran disrupción del ∆Ψm y aumento de la población
apoptótica a las 72 horas de cultivo con melatonina 1x10-3 M.
71
9. RECOMENDACIONES
1. Para establecer si la melatonina 1x10-3 M induce apoptosis en la línea celular
U937, como se infiere por la disminución de ∆Ψm y el aumento de la hipoploidía
a las 72 horas de tratamiento con la hormona, sería ideal realizar la detección de
rupturas en el DNA mediante un ensayo como el TUINEL.
2. Debido al largo tiempo de generación de las células KG1a se propone ampliar los
tratamientos con melatonina hasta 96 y 120 horas para evaluar en estos tiempos
los cambios en el ∆Ψm y el ciclo celular.
3. La sincronización de los cultivos para determinar el efecto de la melatonina sobre
una población celular homogénea permitiría un mejor análisis de los resultados.
72
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