ÚVOD

DIAGNOSTIKA, TERAPIE A ANALYTICKÉ METODY U MATRIXOVÉ CYSTOLITIÁZY

1 2 2 3Plasgura P. , Martinec P. , �èuèka J. , Matýsek D.1) 2) 3)Urologické oddìlení, Nemocnice Frýdek Místek, p.o. Ústav geoniky AV ÈR, Ostrava-Poruba, V�B-Technická universita, Ostrava- Poruba

Konkrementy moèových cest jsou tvoøeny rùznými druhy minerálù a organickou matrix. Tato matrix je tvoøena mukoproteiny,

mukopolysacharidy a lipidy [1].V nìkterých pøípadech se na tvorbì matrix podílejí zánìtlivé procesy vznikající pùsobením baktérií. Choong

a Whitefield popsali úlohu exopolysacharidového biofilmu vyluèovaného baktériemi [2]. Vìtšina konkrementù obsahuje jen malé množství

organické matrix, a to 2-5% [3]. Matrixový konkrement však obsahuje více než 30% této organické matrix. Pojem matrixový konkrement

se zaèal používat až v 70 letech 20.století [4].

Je však problém se správnou identifikací organické matrix, protože u nativních nedenaturovaných a nedehydratovaných vzorkù konkrementù

je problém spolehlivé identifikace bílkovin rutinními metodami infraèervené spektroskopie a optické mikroskopie pod 30% jejich obsahu.

V našem souboru 14933 pacientù z Ostravska z let 1978-2014 se vyskytly matrixové konkrementy se struvitem a pøímìsí dahlitu nebo

Ca-oxalátu v 1,4 % a to èastìji u mužù než u žen ( nepublikovaná data). Autor Shah et al. identifikovali na souboru 1368 pacientù, kteøí

podstoupili PCNL u 1,24% matrixovou nefrolitiázu [5].

MATERIÁL A METODY

1. PØÍPADMuž ve vìku 88let, polymorbidní. Poprvé byl vyšetøen v prosinci 2010 s moèovou

retenci, infekcí moèových cest, s oboustrannou hydronefrozou a chronickou renální

insufficienci. Byl zaveden katetr a vyšetøením zjištìna hyperplazie prostaty. Kultivace

moèi prokázala 1x10/6 Proteus mirabilis. Objevila se taky symptomatická infekce

moèových cest, která byla léèena antibiotiky a následnì byla podávána dlouhodobá

profylaxe. V bøeznu 2012 byla zjištìna u pacienta pøi ultrazvukovém vyšetøení

cystolitiáza. Navrhovanou operaci pacient odmítal. K hospitalizaci a operaci nastoupil

až v bøeznu 2013, když pøedtím prodìlal symptomatickou cystitidu a cystolitiáza mìla

již v prùmìru 55 mm. CT moèového mìchýøe potvrdilo velký konkrement v moèovém

mìchýøi prùmìru 57mm (obr.1). Cystoskopicky jsme nalezli v moèovém mìchýøi velký,

bìlavý, kulovitý konkrement pøipomínající snìhovou kouli. Svým charakterem

nepøipomínal „klasický“ konkrement v moèovém mìchýøi a byl mìkký. Snažili jsme

se konkrement odsát, ale to nebylo možné. Provádìli jsme transuretrální resekci (TUR)

ve fyziologickém roztoku, ale opìt neúspìšnì. Poté jsme vyzkoušeli vaporizaci energií

300W a laserovou tripsi energií 40W. Úèinnìjší byla laserová tripse, pøi které

se postupnì narušila struktura konkrementu a bylo možné potom èásti konkrementu

odsávat a vyplachovat. Konkrement jsme takto celý odstranili. Pacient je nadále

na permanentním katetru a je provádìná profylaxe infekce moèových cest. Zatím

nemá recidivu cystolitiázy. Obr.1 CT snímek matrixového konkrementu v moèovém mìchýøi.

2. PØÍPADmuž ve vìku 55 let, polymorbidní, tìžký diabetik, inkontinentní, s amputovanými

konèetinami, byl poprvé vyšetøen 9/2012 s hematurii, retenci a infekci moèových cest.

Na základì sonografického vyšetøení bylo vysloveno podezøení na cystolitiázu, tumor,

cizí tìleso nebo koagulum v moèovém mìchýøi. Nativní snímek bøicha neprokázal

kontrastní cystolitiázu. Bylo provedeno CT, kde je popsán nehomogenní, objemný

útvar, ostøe ohranièený, vel. 61x60x57mm, se stìnou denzity až 190HU a útvar

se postkontrastnì nemìnil (obr.2). V obou ledvinách byla zjištìna drobná litiáza 4 a 5

mm. Prostata nebyla zvìtšená. Byla pøítomná infekce moèových cest, kultivaènì E.coli

a Proteus mirabilis. Pøi cystoskopii jsme zjistili velký, bíložlutý konkrement, který

vyplòoval témìø celý moèový mìchýø. Byl mìkký, houbovitý a vrstevnatý. Byla

provedena laser tripse energií 32W a fragmenty byly postupnì z moèového mìchýøe

odsávány. Histologie prokázala pouze bezstrukturní organickou hmotu.

Byla provádìna dlouhodobá profylaxe infekce moèových cest. Pacient mìl chronické

reziduum do 100ml, katetr však odmítal.

V roce 2013 mìl pacient ještì dvakrát recidivu matrixové cystolitiázy a souèasnì taky

matrixovou ureterolitiázu a pyelolitiázu vlevo. Vše bylo øešeno endoskopicky pomocí

laserové tripse. Pøi poslední kontrole byl pacient bez recidivy cystolitiázy.Obr.2 CT snímek matrixového konkrementu v moèovém mìchýøi.

ANALYTICKÉ METODYCílem analytických rozborù bylo identifikovat a kvantitifikovat složení matrixového konkrementu a podrobnìji identifikovat monokrystalický

struvit. Matrixový konkrement není možné analyzovat v nativním stavu. Konkrement byl po vyjmutí zbaven fyziologického roztoku

opakovaným vymytím v destilované vodì a zbaven volné vody. Poté byl dehydratován v etylalkoholu a vysušen pøi 40°C. Pro analýzu byl použit

komplex metod:

1) Infraèervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR)

2) SEM mikroskopie s lokální analýzou prvkù EDAX

3) Mikro-CT na pøístroji XTH 225 ST Nikon v laboratoøi ÚG AV v Ostravì

4) X-Ray Powder Diffraction

5) Diferenèní kalorimetrie a termogravimetrická analýza (DSC/TG)

6) Optická mikroskopie a analýza obrazu mikro CT a SEM

7) Biochemická analýza

Charakteristika použitých pøístrojù a experimentálních podmínek jsou k dispozici u autorù.

VÝSLEDKY ROZBORU MATRIXOVÝCH KONKREMENTÙ1. PØÍPAD Mikroskopicky nativní vzorek konkrementu tvoøí ploché slupkovité útvary z organické matrix, která je tvoøena z fibril, kolonií bakterií a

gelovitého mukoproteinu. Na povrchu jsou rozmístìny idiomorfní monokrystaly struvitu s mediánem velikosti od 50 m do maximální velikostí

? 270 m. Tento obraz je patrný i na snímcích mikro CT (obr.3). Ze snímkù SEM a z lokální analýzy EDAX je však evidentní orientované prorùstání

organické matrix krystaly struvitu (obr.4).

Identifikace a složení matrixového konkrementu bylo provedeno metodou FTIR. Touto metodou byl identifikován struvit 70-80% hmotn.,

proteinová matrix 20-30% hmotn. a dahlit 2-3% hmotn. Dahlit byl zjištìn v povrchových partiích konkrementu.

Pøepoèet prvkových analýz EDAX prokázalo, že povrchová vrstva monokrystalù je tvoøena struvitem.

Analýza konkrementu metodou DSC/TG v oxidaèní a inertní atmosféøe potvrdila pøítomnost struvitu a organické matrix. Støední hodnoty

obsahu stanovené z kombinace úbytkù hmotnosti v obou pecních atmosférách vykazují obsahy struvitu ? 73 % hmotn. a organické matrix ? 27%

hmotn. Podle ztráty žíháním pøi statickém ohøevu po dobu 1 h je obsah struvitu 73,5% hmotn. a organické matrix 26,5% hmotn.(Tbl.1).

Tbl.1 Støední složení denaturovaného a a dehydratovaného matrixového konkrementu stanovené metodou FTIR, DSC/TG a ztrátou žíháním

pøi statickém ohøevu

Fig.3 Mikro-CT øez vzorkem denaturovaného a dehydratovaného

matrixového konkrementu: organická matrix tmavá a krystaly struvitu

bílé. Pøípad è.1.

Fig. 4 Aglomerát krátce prizmatických a vzácnì tence tabulkovitých monokrystalù struvitu pojených koloniemi kulovitých bakterií v dehydratovaném a denaturovaném vzorku matrixového konkrementu. Pøípad è.1. SEM. Lomová plocha konkrementu. Pokoveno. Mìøítko na snímku.

2. PØÍPAD Z optické mikroskopie v procházejícím svìtle nativního vzorku je patrné, že obdobnì jako v prvním pøípadì, konkrement tvoøí

organická matrix z bílkovinových vláken (fibril) a kolonie bakterií s gelovitými mukoproteiny na povrchu vláken, a vytváøejí výraznou

slupkovitou strukturu s drobnými krystaly struvitu. Na snímcích mikro CT je zøetelné, že v jednotlivých slupkách matrixového konkrementu je

obsah a velikost struvitových krystalù velmi rozdílná (Obr.5).

Ze snímkù SEM a lokálních analýz EDAX je evidentní intimní prorùstání organické matrix krystaly struvitu, které je intenzivnìjší, než u prvního

pøípadu (Obr.6,7). Identifikace organické výplnì byla provedena infraèervenou mikroskopií a analýzou EDAX monokrystalu struvitu.

V konkrementu byl metodami FTIR, DSC/TG a Xray-difraction identifikován dominantní struvit, organická matrix a pøímìs dahlitu a Ca-

oxalátu Podle DSC/TG analýzy je obsah struvitu 75,3 % hmotn. a 24,7 % hmot. dehydratované a denaturované organické matrix.

CÍLCílem práce bylo provést podrobnou analýzu dvou ménì èastých matrixových konkrementù moèového mìchýøe s urèením podílu organické

matrix a seznámit s vlastními zkušenostmi terapie matrixové cystolitiázy.

U dvou mužù ve vìku 56 a 88 let byl diagnostikován velký matrixový konkrement v moèovém mìchýøi. Po endoskopickém odstranìní

konkrementù pomocí holmiového laseru byla provedena jejich podrobná analýza stavby a mineralogického složení.

POPIS PØÍPADÙ

Obr.5 Mikro CT øez vzorkem denaturovaného a dehydratovaného

matrixového konkrementu. Konkrement je tvoøen slupkami z

bílkovinové matrix silnými kolem 1 mm s bakteriálními koloniemi

(šedobílé plochy) s krystaly struvitu mezi jednolivými slupkami (bílé

krystaly v matrix). Pøípad 2. Mìøítko na snímku.

Obr. 6 Separované monokrystaly struvitu z dehydratovaného

a denaturovaného vzorku matrixového konkrementu pøípadu

2: Vzorek použitý pro stanovení strukturních parametrù

struvitu. Na monokrystalech je zøetelné prorùstání

monokrystalu organickou matrix. SEM. Pokoveno. Mìøítko na

snímku.

Obr.7 Aglomerát monokrystalù struvitu s kulovitými koloniemi bakterií

a s patrným prorùstáním organické matrix monokrystalem v

dehydratovaném a denaturovaném vzorku matrixového konkrementu

pøípadu 2. SEM. Lomová plocha konkrementu. Pokoveno. Mìøítko na

snímku.

DISKUSESložení organické matrix konkrementù lze pøirovnat k extracelulární matrix. Je tvoøena pøevážnì dvìmi proteinovými složkami fibrilárními proteiny, kolageny a elastinem a proteoglykany a glykoproteiny. Na rozdíl od matrixových konkrementù, vìtšina konkrementù moèových cest obsahuje pøevážnì krystalickou komponentu a organické matrix je ménì mezi 2-5% [3]. V rutinních analýzách (FTIR) je však problém s identifikací organické matrix pøi jejím obsahu pod 30%. Proto mùže být tento typ konkrementù zahrnut mezi konkrementy s asociací struvit+dahlit+NH -urát. 4

Matrixové konkrementy se vyskytují v horních i dolních moèových cestách. Èastìji jsou uvádìny v horních moèových cestách. V literatuøe se uvádí výskyt od 0,7 do 1,3% [6,7] Vznik matrixového konkrementu je vždy spojen s infekcí moèových cest a vìtšinou taky s obstrukcí. To se potvrdilo u obou našich pøípadù. Vznik matrixového konkrementu je iniciován baktériemi, které pùsobí dvojím mechanismem. V našem pøípadì se jednalo o Proteus mirabilis a E.coli. Tyto baktérie vyluèují exopolysacharidový biofilm a zánìtlivým pùsobením zvyšují produkci hlenu, který mùže být absorbován na povrchu vznikajících struvitových krystalù a vede k jejich agregaci [2]. Druhým mechanizmem úèinku baktérií je pøemìna urey na amoniak pomocí enzýmu ureázy, který produkují mnohé baktérie zpùsobující zánìty moèových cest. Amoniak zvyšuje pH moèi a to napomáhá zvyšovat saturaci a krystalizaci moèi magnesiem a kalciem. Dochází pak ke vzniku struvitových (MgNH PO .6H O) krystalù a Ca- apatitových 4 4 2

[Ca (PO ).CO ] krystalù. 10 4 4

Otázkou je, proè nìkdy vzniká struvitový konkrement, který má pouze malé procento organické matrix a jindy matrixový konkrement, který také obsahuje struvitové krystaly, ale organická matrix tvoøí vìtší procento objemu konkrementu. Zøejmì tady hrají roli další faktory, jako jsou obstrukce a retence moèi, diabetes mellitus, snížená imunita u závažnì nemocných pacientù, zhoršená mobilita a nízký pøíjem tekutin. S pøípravou vzorku k analýze souvisí i zmìny na spektru FTIR a také strukturní zmìny struvitových monokrystalù. Z analytického pohledu je závažné zjištìní citlivosti struvitu na zahøátí do 100°C a na rychlosti zahøívání .Dalším specifikem je stavba organické matrix. Složení matrixového konkrementu denaturovaného a dehydratovaného v etylalkoholu v obou našich pøípadech je blízké a konkrementy obsahují kolem 75 % hmotn. struvitu v organické matrixPodle mikro CT stavba konkrementu ukazuje na postupný vývoj mineralizace a struktury. Vznik vìtších krystalù struvitu probíhá ne již v prostorové struktuøe matrixového konkrementu, ale na povrchu slupky matrix. Pøipomíná mineralizaci bakteriálního plaku za krátkodobì se mìnících podmínek (napø. pH). Pro tuto alternativu by svìdèilo støídání kontrastních slupek s vyšším zastoupením MgNH4-fosfátu - struvitu a slupek bohatých organickou hmotou. Biochemický rozbor potvrdil jen malé množství bílkovin . Obsah aminokyselin byl cca 1% a jednalo se o glutamovou kyselinu, metionin, izoleucin a lysin. Z mastných kyselin a ketokyselin byla pøítomna pøedevším kyselina palmitová. K. Kaneko ve své práci ukazuje na význam nìkterých bílkovin, které mohou hrát dùležitou roli pøi vzniku a rùstu konkrementù (napø. osteopontin, prothrombin, protein S a protein Z, uromodulin a albumin [3]. Tyto konkrementy se taky liší makroskopicky a nìkdy i diagnosticky [8] V pøípadì matrixové cystolitiázy se jedná o velký, houbovitý, bíložlutý konkrement, který na první pohled jako konkrement nevypadá. Mùže pøipomínat „snìhovou kouli“. Diagnostika, hlavnì v horních moèových cestách je proto nìkdy obtížnìjší.V diagnostice hraje dùležitou roli myslet na možnost výskytu matrixových konkrementù u pacientù s výskytem chronické infekce moèových cest, imobilních, diabetikù s chronickým reziduem v moèovém mìchýøi. První vyšetøení ultrazvukem èasto nedá jednoznaèný závìr. Nativní rtg snímek nemusí být pøínosem, protože se vìtšinou jedná o nekontrastní konkrementy. CT moèového mìchýøe a ledvin upøesòuje diagnostiku a znázorní se velký útvar v moèovém mìchýøi, který není zcela solidní a mùže taky imitovat nádor nebo cizí tìleso. V horních moèových cestách mùže matrixový konkrement imitovat tumor dutého systému ledviny [8].U matrixové cystolitiázy cystoskopický nález již upøesòuje diagnostiku. Pro velikost nelze hned urèit, zda je útvar fixovaný ke stìnì mìchýøe zvláš�, když na CT je nález taky sporný.Endoskopické odstranìní takového konkrementu není úplnì jednoduché. Mìkký konkrement s vysokým obsahem organické matrix, jak jsme zjistili, se nedá z mìchýøe odsát. Bez efektu bylo použití TUR. Vrstevnatá struktura tìchto matrixových konkrementù se dá však narušit elektrovaporizací energií 300W a nebo ještì lépe tripsi holmiovým laserem energií 30-50W. Po narušení struktury již lze jednotlivé fragmenty z mìchýøe odsát. Výsledkem operace je odstranìní celého konkrementu, který však má makroskopicky charakter bezstrukturní, bìlavé hmoty. U pacientù s tímto druhem konkrementu je velké riziko recidivy. Souvisí to s chronickou infekcí a obstrukcí. Je proto dùležité zabezpeèit dostateèný pøíjem tekutin, acidifikaci moèi a protibakteriální léèbu[9,10]. Ideální je pH moèi 5,5-6,0 a pøíjem tekutin minimálnì 2,5l/24hod.v pravidelných intervalech. Doporuèuje se podávání metioninu ( 200-500mg 2-3x/den), Suby-G roztok nebo amonium chlorid (1g 2-3x/den)[11,12]. Je však velmi tìžké tìmto recidivám zabránit a to právì s ohledem na polymorbiditu tìchto pacientù.

ZÁVÌRMatrixová litiáza je vzácný typ konkrementù moèových cest a tvoøí pøibližnì 1,5% všech konkrementù. Matrixové konkrementy jsou svou

strukturou zcela odlišné od jiných konkrementù právì vysokým obsahem organické matrix. Tato matrix tvoøí pojivo mezi krystaly struvitu a

mùže jimi i prorùstat. Monokrystaly struvitu v matrixovém konkrementu se proto liší od struvitových krystalù jiných typù konkrementù. V

nìkterých pøípadech bývá diagnostika matrixového konkrementu obtížnìjší a mùže imitovat nádorové onemocnìní, zejména v horních

moèových cestách. Vzhledem k tomu, že je tato litiáza spojena s chronickou infekcí moèových cest, musíme pøí léèbì postupovat co nejménì

invazivnì. Je velké riziko recidivy. Jako nejvhodnìjší se nám osvìdèil holmiový laser. Dokáže narušit vláknitou strukturu matrixového

konkrementu a to umožní odstranit matrixové hmoty z mìchýøe ven. Dùležitá jsou potom další preventivní opatøení k zabránìní recidiv, jako je

léèba chronické infekce, dostateèný pøíjem tekutin, acidifikace moèi a zajištìní dobrého vyprázdòování moèového mìchýøe. Pochopení

struktury a tvorby matrixového konkrementu nám mùže pomoci pøi diagnostice, pøedcházení a léèbì tohoto onemocnìní.

PODÌKOVÁNÍAutoøi dìkují Grantové agentuøe Èeské republiky za podporu: Projekt reg.è. 203/93/1394 (2009-2011)and, project „Long-term conceptual

development fund for research organizations“ reg. No. RVO no. 68145535 Institute of Geonics Academy of Science (Ostrava). Podìkování za

provedení mikroCT analýz náleží projektu „Institute of clean technologies for mining and utilisation of raw materials for energy use“, reg.

no. CZ.1.05/2.1.00/03.0082, which is supported by the Research and Development for Innovations Operational Programme financed by the

Structural Founds of the Europe Union and the state budget of the Czech Republic.

LITERATURA[1]. Jou YC, Tsai YS, Fang CY, Chen SY, Chen FH, Huang CH, Li YH, Shen CH. Massspectrometric study of stone matrix proteins of human bladder stones. Urology.2013 Aug;82(2):295-300. doi: 10.1016/j.urology.2013.04.011. PubMed PMID: 23896093.[2].Choong S.,Whitfield H. Biofilms and their role in infections in urology. BJU Int. 200086(8):935-941[3]. Kaneko K, Kobayashi R, Yasuda M, Izumi Y, Yamanobe T, Shimizu T. Comparison of matrix proteins in different types of urinary stone by proteomic analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Int J Urol. 2012 Aug;19(8):765-72. doi: 10.1111/j.1442-2042.2012.03005.x. Epub 2012 Apr 11. PubMed PMID: 22494008. [4].Allen TD, Spence HM. Matrix stones. Trans Am Assoc Genitourin Surg. 1965;57:77-83. PubMed PMID: 5855566.[5].Shah HN, Kharodawala S, Sodha HS, Khandkar AA, Hegde SS, Bansal MB. The management of renal matrix calculi: a single-centre experience over 5 years. BJU Int. 2009 Mar;103(6):810-4. doi: 10.1111/j.1464-410X.2008.08065.x. Epub 2008 Sep 8. PubMed PMID: 18782302. [6]. Schubert G. Stone analysis. Urol Res. 200634:146-150 [7]. Geavlete P, Mulþescu R, Jecu M, Georgescu D, Geavlete B. Percutaneous approach in the treatment of matrix lithiasis. Experience of the urological department of "Saint John" Emergency Clinical Hospital]. Chirurgia (Bucur). 2009 Jul-Aug;104(4):447-51. Romanian. PubMed PMID: 19886053.[8]. Okochi H, Iiyama T, Kasahara K, Moriki T, Inoue K, Shuin T. Renal matrix stones in an emphysematous pyelonephritis. Int J Urol. 2005 Nov;12(11):1001-4. PubMed PMID: 16351660.[9]. Bani-Hani AH, Segura JW, Leroy AJ. Urinary matrix calculi: our experience at a single institution. J Urol. 2005 Jan;173(1):120-3. PubMed PMID: 15592051.[10]. Hori N, Hoshina A, Tajima K, Tochici H, Tada S. [A case of soft vesical calculi]. Hinyokika Kiyo. 1986 Apr;32(4):592-4. Japanese. PubMed PMID: 3526838.[11]. Hesse A, Heimbach D. Causes of phosphate stone formation and the importance of metaphylaxis by urinary acidification: a review. World J Urol. 1999 Oct;17(5):308-15. Review. PubMed PMID: 10552150.[12]. Wall I, Tiselius HG. Long-term acidification of urine in patients treated for infected renal stones. Urol Int. 1990;45(6):336-41. PubMed PMID: 2288050.

W W W . N E M F M . C Z P L A S G U R A @ N E M F M . C ZCOPYRIGHT 2015 P E T R @ D O L I T R U C Z.