DIAGNOSTICA DIAGNOSTICA DELL’EMOFILIA ACQUISITADELL’EMOFILIA ACQUISITA

Serena TorreLaboratorio di Emostasi e Trombosi

Ospedale San Giovanni Bosco

SINDROMI “EMORRAGICHE” SINDROMI “EMORRAGICHE” ACQUISITE da ACQUISITE da AUTOANTICORPIAUTOANTICORPI

S. dell’emofilia acquisita Fattore VIII

S. di von Willebrand acquisita Fattore von Willebrand

Altri deficit acquisiti Fattore IX, V, VII, da autoanticorpi XI, XIII

EMOFILIA ACQUISITAEMOFILIA ACQUISITA

Patologia emorragica “acquisita” rara

Incidenza: 0.2 - 1.0 caso/milione/anno

Distribuzione bifasica dell’età di insorgenza con

picchi tra 20-30 e 60-80 anni

Quadro clinico dominato spesso da emorragie

gravi

Mortalità fino al 22% in diverse casistiche

CONDIZIONI CLINICHE SPESSO CONDIZIONI CLINICHE SPESSO ASSOCIATE A EMOFILIA ASSOCIATE A EMOFILIA ACQUISITAACQUISITA

Tumori Solidi (prostata, polmone)/ Emopatie maligne (leucemia linfatica cronica, linfoma)

Neoplasie

Gravidanza/Periodoperi/post-partum

Interventi chirurgici

Penicillina/ Ampicillina/ Cloramfenicolo/ Fenintoina ed altri anticonvulsivanti / Sulfonamide/ Interferone α/Fludarabina

Reazioni farmacologiche

A. Reumatoide/ LES/ Arterite temporale/ Colite ulcerosa/ Dermatomiositi/ Polimiositi/ Miastenia grave /Sclerosi multipla/ Asma/ Penfigo/ Dermatosi aspecifica/GVHD/Sclerosi multipla

Malattie autoimmuni/Malattie a base immunologica

SPECIFICITÀ EPITOPICA DEGLI SPECIFICITÀ EPITOPICA DEGLI AUTOANTICORPIAUTOANTICORPI

Più frequentemente gli autoanticorpi riconoscono epitopi localizzati tra gli aa 454-509 e 593 del dominio A2, 1804-1819 del dominio A3, 2181-2243 del dominio C2

MECCANISMO D’ INIBIZIONEMECCANISMO D’ INIBIZIONE

Anti-C2: inibiscono il legame del FVIII : inibiscono il legame del FVIII ai PL e possono interferire con il legame ai PL e possono interferire con il legame al vWFal vWF

Anti-A2 e Anti-A3:: impediscono il impediscono il legame con il FIX e il FXlegame con il FIX e il FX

ALLOANTICORPI(Emofilia)

Diretti contro più epitopi

Inibizione FVIII con cinetica di Tipo I (lineare)

AUTOANTICORPI(Emofilia Acquisita)

Diretti contro un unico epitopo

Inibizione FVIII con cinetica di Tipo II (complessa)

CINETICHE DI INATTIVAZIONE CINETICHE DI INATTIVAZIONE DEL FVIIIDEL FVIII

Boggio NL. Rev Clin Exp Haematol 2001

CARDINI DIAGNOSTICICARDINI DIAGNOSTICI

Anamnesi negativa per precedente diatesi emorragica

PT normale Normale conta piastrinica aPTT allungato non corretto

dall’aggiunta di un eguale volume di plasma normale (test di miscela)

Bassi livelli di FVIII

aPTT: TEST di MISCELAaPTT: TEST di MISCELA

Plasma normale

miscela 1:1

incubazione a 37°C

aPTT

Plasma del paziente

VALUTAZIONE DEL TEST VALUTAZIONE DEL TEST DELLA MISCELADELLA MISCELA

SecondiM- N < 5 s : corregge. M- N 5 s : non

corregge. Ratio M/N

< 1.20: corregge. 1.20: non corregge. Indice di Rosner (ICA) = (M - N/P) x 100

< 15% corregge. 15% non corregge. % di correzione = (P-M)/(P-N) x 100

> 70% corregge. < 58% non corregge. % di correzione = (P-M 4:1)/(P-N) x 100

Immediato: 50% corregge. < 50% non corregge.

Incubato: > 10% corregge. (100% Sens. e Spec.)

Chang S. Am J Clin Pathol 2002

DIAGNOSI DI LABORATORIODIAGNOSI DI LABORATORIO

Test aPTT della miscela

aPTT mix allungato: presenza di inibitori

Dosaggio FVIII, FIX,FXI,FXII

Un fattore ridotto

Ricerca inibitore specifico (metodo Bethesda)

Più fattori ridotti

Ricerca LAC

aPTT mix normale: carenza di fattori

Dosaggio FVIII, FIX, FXI, FXII,

Carenza di un fattore

DOSAGGIO DELL’INIBITORE: DOSAGGIO DELL’INIBITORE: principioprincipio

Il test viene eseguito creando miscele (in parti uguali) di un pool di plasma normale con il plasma del paziente

(mix da testare) e di

un pool di plasma normale con tampone imidazolo a pH 7.4 (mix di controllo)

Dopo 2h di incubazione a 37°C, viene determinata la percentuale relativa di attività di FVIII della mix da testare che, rapportata a quella della mix di controllo, determina l’attività residua di FVIII.Si possono esaminare solo campioni privi di attività FVIII.

•Plasma citratato ( può essere congelato)

•Plasma normale di riferimento ( pool di plasma normale)

•Tampone Imidazolo 0.1M, pH 7.4

•Reagenti per il dosaggio fattori, metodo ad un tempo

DOSAGGIO DOSAGGIO DELL’INIBITORE: materialiDELL’INIBITORE: materiali

METODO BETHESDA-METODO BETHESDA-NIJMEGENNIJMEGEN

Limiti del metodo Bethesda:

Numerosi falsi positivi per valori vicino al cut-off di consenso (BU < 0.5/ml) bassa specificità

– Aumento del pH nella miscela da testare Inattivazione del FVIII

– Diminuzione della concentrazione proteica nella miscela da testare Inattivazione del FVIII

Plasma del paziente

50/50 mix

Incubare 2h 37°C

Dosaggio del FVIII

METODO BETHESDA-METODO BETHESDA-NIJMEGENNIJMEGEN

Plasma normale tamponato a pH

7.4

Plasma carente di

FVIII

Giles A.R. Thromb Haemost 1998

Miscela da testare

Miscela di controllo

DEFINIZIONE DI UNITÀ DEFINIZIONE DI UNITÀ NIJMEGEN-BETHESDANIJMEGEN-BETHESDA

1 Unità Bethesda-Nijmegen è pari alla quantità di inibitore in grado di inattivare il 50 % di FVIII di un pool di riferimento, dopo 2 h di incubazione.

IN BASE ALLA DEFINIZIONE DI UNITA’ DI INIBITORE SI COSTRUISCE UNA TABELLA DI CONVERSIONE TRA:

FVIII RESIDUO % e U. DI INIBITORE per mL di plasma

PNP pool

Plasma del

Paziente

PNP FVIII 100%

Miscela isovol.

Paziente/PNP FVIII

50%

Attività residua = x 100 FVIII miscela di controllo

FVIII miscela da testare

0

510

15

2025

3035

40

4550

55

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 2,8 3 3,2 3,4 3,6 3,8 4 4,2

Unità Bethesda/mL

FVIII%

resi

duo

ASSENTE

PRESENTEESEMPIO

18%

CURVA DI CONVERSIONE

1,5U/ml

ALGORITMO DIAGNOSTICOALGORITMO DIAGNOSTICO

aPTT della miscela

Negativo (carenza)

FVIII (1 tempo)

FVIII <<<

Bethesda positivoLAC test

PositivoNegativo

Diagnosi EAA

Positivo (interferenz

a)

FVIII <

FVIII cromogenico normale

LAC test

Positivo

Diagnosi LACDiagnosi EAA complicata da

LAC

DIAGNOSI LUPUS ANTICOAGULANTCriteri per la diagnosi di LA proposti dai SSC della ISTH

Prolungamento di un test PL dipendente (test di screening) Mancata correzione del prolungamento

aggiungendo al plasma del paziente plasma normale

(studi di mixing) = esclusione eventuali carenze di fattori

Correzione del prolungamento aggiungendo al plasma del paziente un eccesso di fosfolipidi

(test di conferma) = dimostrazione che l’inibitore presente è diretto contro i PL

Brandt JT, Thromb Haemost 1995; 74: 1185-90

TESTs PER LA RICERCA DEL LATest di

screening:

PTT-LA

PTT-LA mix

KCT (sec.)

KCT mix

DRVVTest

DRVVT mix

Test di conferma:

SCT1 ratio (bassa conc. PL)

SCT2 ratio (alta conc. PL)

DRVVTest confirm

DIAGNOSI DIFFERENZIALEDIAGNOSI DIFFERENZIALE

Test di screening PL dipendenti

Studi di mixing 1:1

Dosaggio fattori

Test di conferma con eccesso di PL

Test per Ab anti fattori

Diagnosi di LA

corregge non corregge

non corregge corregge

CONCLUSIONI

Dati clinici anamnestici ed attuali

Dati di laboratorio

La diagnosi deriva dalla corretta valutazione delle informazioni cliniche e dei dati di laboratorio ottenuti mediante la esecuzione di tests mirati.

Diagnosi