diagnosi sintomo il percorso diagnostico in allergologia

DiagnosiDiagnosi

SintomoSintomo

Il percorso diagnostico in allergologia

L’Iter diagnostico si fonda su:

Anamnesi;

Esame obiettivo;

Indagini allergologiche

Anamnesi

Una anamnesi corretta permette da sola :

di individuare circa il 60 % dei pazienti allergici ;

ha una specificità che sfiora il 95% ;

consente di individuare la presenza di comorbidità

Non presenta caratteristiche peculiari,

Può essere negativo per la caratteristica accessionalità delle sindromi allergiche (utile esaminare il paziente in fase acuta e in fase intervallare, per confrontare i reperti osservati);

Esame Obiettivo:

• Test in vivo

Prick test

Intradermoreazioni

Patch test

Test di provocazione

• Test in vitro

Dosaggio IgE sieriche

Dosaggio mediatori

Indagini Allergologiche :

Principi diagnostici delle malattie IgE-mediate

Test Cutanei

Dosaggio delleIgE specifiche nel siero

Rilascio istamina

Attivazione basofili

Challenge specifico nasale, bronchiale, congiuntivale, oraleConta Eosinofili

Cute

Sangue

Mucosa

Indagini allergologiche in vivo

Prick testPrick test Prick test alimentiPrick test alimenti Patch testPatch test

Test intradermicoTest intradermico TPOTPO

• Prick & Storia Clinica Positivi Entrambi

• Prick & Storia Clinica Negativi Entrambi

• Prick & Storia Clinica Controversi




Prick test e allergia respiratoria




• TPO




• TPO

Prick test e allergia alimentare

• Determinazione IgE totali e specifiche verso estratti e verso singole

moleole

• Determinazione di anticorpi non-IgE verso allergeni

• Dosaggio di mediatori chimici flogogeni

• Dosaggio di immunocomplessi

• Dosaggio di frazioni complementari

• Eosinofili su secreto nasale

TEST IN VITRO

Determinazione delle IgE

IgE Totali

IgE Specifiche

Le IgE totali costituiscono lo 0,004% di tutte le immunoglobuline. .

Dosaggio delle IgEs

IgE Specifiche verso estratti

IgE Specifiche verso singole molecole

TERMINOLOGIA• Fonte allergenica

• Estratto allergenico

• Allergene

• Isoallergene

• Epitopo

FONTE ALLERGENICA

Indica il contenitore materiale degli allergeni, ad es. : la parietaria, l’uovo, sono fonti allergeniche,

non allergeni, come spesso siamo soliti far riferimento.

ESTRATTI ALLERGENICI

Gli estratti allergenici comunemente impiegati perla diagnostica in vivo (Ptick test) e in vitro

(RAST, ELISA ecc.) provengono da fonti allergeniche (polline di graminacee,parietaria,uovo ecc.).

Caratteristiche degli Estatti Allergenici:

il il Materiale GrezzoMateriale Grezzo viene viene sottoposto a processo sottoposto a processo estrattivo della componenteestrattivo della componente proteica,proteica,

Gli Estratti Allergenici Grezzi contengono: gli allergeni responsabili della sensibilizzazione, altre sostanze e proteine

La La Componente ProteicaComponente Proteica viene trattata per individuare viene trattata per individuare le sostanze con potere le sostanze con potere antigenico (mappa antigenica antigenico (mappa antigenica dell’ estratto),non tutte fornite dell’ estratto),non tutte fornite di potere allergenicodi potere allergenico

L’Estratto AntigenicoL’Estratto Antigenico viene viene sottoposto a processo disottoposto a processo di tipizzazione degli allergenitipizzazione degli allergeni facendolo reagire con il facendolo reagire con il siero di pazienti contenentisiero di pazienti contenenti le IgE specifiche.le IgE specifiche.

Ciascun soggetto allergico Ciascun soggetto allergico possiede infatti un proprio possiede infatti un proprio caratteristico caratteristico Assetto Assetto AllergenicoAllergenico per la presenza per la presenza di IgE specifiche rivolte di IgE specifiche rivolte verso l’uno o l’altro verso l’uno o l’altro componente allergenico componente allergenico dell’estratto. dell’estratto.

ALLERGENI

Gli allergeni sono proteine, glicoproteine o apteniconiugati a carrier, con peso molecolare tra 5 e150 kDa, e punto isoelettrico compreso tra 2-10

ISOALLERGENI

Indicano forme molecolari multiple dello stesso allergene proveniente dallo stesso organismo con un’estesa, ma non obbligatoria, cross-reattività. Hanno in genere un peso molecolare molto simile, la stessa struttura terziaria e la stessa funzione biologica e hanno almeno il 67% d’identità nella sequenza aminoacidica. Ad esempio di Bet v 1 si conoscono 31 isoallergeni con identità di sequenza tra il 73 e il 98%.

Isoallergeni

Xxx y1.01Xxx y1.01Xxx y1Xxx y1

EPITOPI

Gli Epitopi sono la porzione di allergene effettivamente riconosciuta e legata da un anticorpo specifico

Ciascun allergene può presentare un numero elevato di epitopi pertanto ad es. non esistono IgE specifiche per latte (fonte

allergenica) o per caseina (allergene del latte) ma IgE specifiche dirette verso gli epitopi della caseina.

Gli Epitopi possono essere lineari o conformazionali

EPITOPO Lineare

Epitopi “lineari” (aminoacidi in sequenza, contigui e presenti sulla struttura primaria dell’allergene) solitamente termo- e gastro-resistenti

EPITOPO Conformazionale

Epitopi “conformazionali” (aminoacidi non in sequenza, non contigui, distanti tra loro ma che a causa del ripiegamento della catena proteica possono diventare contigui, la loro formazione dipende quindi dalla struttura tridimensionale dell’allergene) solitamente termo- e gastro- labili

Effetto della cottura e della digestione sulle proteine alimentari

Processing1

1

2

2GG

GE

E G E GG

G

E

G

Sampson & Cooke. J Immunol 1997; 159:2026-2032.

CLASSIFICAZIONE DELLE MOLECOLE ALLERGENICHE

Le molecole allergeniche si possono ulteriormente classificare in:

-“GENUINE”, vere marcatrici di una determinata fonte (es. Ole e 1 è la proteina marcatrice dell’allergia al polline dell’olivo e delle altre Oleaceae)

- “PANALLERGENI”, proteine condivise da fonti allergeniche anche tassonomicamente tra loro non correlate, responsabili di apparenti polisensibilizzazioni ai test eseguiti con estratti

Dalla Fonte allergenica alle molecole

Genuine Panallergeni

Dosaggio delle IgEs

IgE Specifiche vs estrattiRAST

Si può eseguire, in casi di dubbi, dopo aver effettuato i prick test, per ottenere conferma diagnostica

Possono essere eseguite, al posto dei test cutanei, quando questi risultino poco affidabili per:

iporeattività cutanea legata a: - età (primi anni di vita, età avanzata) - farmaci (anti h-1, steroidi, ecc.) - precedenti reazioni cutanee intensamente positive

alterata reattività cutanea (ipo o iperreattività) legata a: - malattia allergica in fase acuta e grave - affezioni cutanee estese -. dermografismo

Dosaggio delle IgEs

Il livello di IgE specifiche non è sempre correlato con la gravità della sindrome clinica

la positività delle IgE specifiche può non rivestire significato eziologico nei confronti della malattia in atto (es. Cross-reattività con alimenti vegetali, che si riscontra spesso nei pollinosici, senza che vi sia alcuna manifestazione clinica dopo ingestione di quegli alimenti).

Il dosaggio di IgE specifiche ha sensibilità e specificità inferiori rispetto ai test cutanei

Il Dosaggio delle IgE Specifiche va attentamente e criticamente

valutato

Ricerca delle IgEs

IgE Specifiche verso singole molecole

CRD: Component Resolved Diagnosis

Prick test con estrattodi Phleum

Diagnosi Allergologica in vivo tradizionaleCon estratto di Pleum pratense

Diagnosi Allergologica in vitro tradizionaleCon estratto di Phleum pratense

Allergologia Molecolare

kU /lA

kU /lA

kU /lA kU /lA kU /lA

kU /lA

kU /lA

kU /lA

kU /lA

Phleum: proteine e allergeniImmunoblotting di 12 paz. allergici al Phleum pratense

Estazione

Pattern delle proteine e immunoblotting del siero di pazienti allergici

Prick test con estrattodi Phleum

Phl p1 + - Phl p5

+ -

Phl p 7 + -

Phl p12 + -

Diagnosi Allergologica in vivo tradizionaleCon estratto di Phleum pratense

La fonte allergenica…

Phleum pratense: proteine e allergeni

…contiene milioni di molecole….…di cui solo alcune hanno proprietà allergeniche

Che cosa è un allergene ricombinante?Un allergene ricombinante è molecola allergenica prodotta con tecniche di biotecnologia originariamente identificata da un estratto allergenico. La maggior parte dei ricombinanti allergenici esistenti vengono espressi in Escherichia coli e sono normalmente confrontabili con il loro modello naturale(proteina) per quanto riguarda le caratteristiche strutturali e le proprietà immunologiche.

Gli allergeni ricombinanti vengono prodotti senza che le proteine subiscano variazioni genetiche, biologiche o di lotto.Questo assicura l’ottenimento di allergeni di qualità costante ed elevata standardizzazione

Caratteristiche

Phl p 1Genere Specie Cronologia Isoallergeni

IDENTICHE FUNZIONI BIOLOGICHE

PESO MOLECOLARE SIMILE

>67% IDENTITA’ DELLA SEQUENZA AA.

.01

IUIS – Nomenclatura WHO

1. Miglioramento nel profilo diagnostico

2. Maggiori informazioni sulle poli-sensibilizzazioni (distinzione tra co-sensibilizzazione e co-riconoscimento)

3. Valutazione della potenziale gravità di una reazione clinica (alcune molecole allergeniche possono essere ”più pericolose” di altre)

4. Ruolo decisionale nell’ambito della ITS

5. Monitoraggio della risposta immunologica durante il trattamento …

Lidholm J et al. Component-resolved diagnostics in food allergy. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2006;6:234-40

Molecole Allergeniche: principali applicazioni

Cosensibilizzazione o Cross Reattività Cosensibilizzazione o Cross Reattività

Polisensibilizzazione

CO-SENSIBILIZZAZIONE:presenza di IgE dirette verso epitopi distinti e unici presenti in fonti allergeniche diverse (molecole allergeniche genuine)

CO-RICONOSCIMENTO (cross-reattività):presenza di IgE verso molecole omologhe presenti in fonti allergeniche diverse (panallergeni)

Asero R, 2010, mod.Asero R, 2010, mod.

Polisensibilizzazione


PolisensibilizzazionePolisensibilizzazione

I “panallergeni” inalanti sono :

Profiline

CBP (Calcium binding protein o Polcalcine)

Phl p1, Phl p5 Phl p1290 % 85 %

PROFILINA

Pollini, alberi, erbe, graminacee

CBP

Phleum pratense

Phl p7

Allergia Molecolare - Graminacee

Genuine

La Diagnostica Molecolare nell’Allergia respiratoria

Phl p1, Phl p590 % 85 %

Phleum pratense


Genuine

Phl p1, Phl p5 Phl p1290 % 85 %

PROFILINA

Phleum pratense


Genuine

Phl p1, Phl p5 Phl p1290 % 85 %

PROFILINA

Pollini, alberi, erbe,

CBP

Phleum pratense

Phl p7


Genuine

Allergia Molecolare - Parietaria

Parietaria

Par j 2

83 %

Par j 3 PROFILINA

Pollini, alberi, erbe,

CBP

Par j 4Genuine

Allergia Molecolare - Olivo

Olivo, (frassino, ligustro,forsitia)

Ole e 3, Ole e 8 CBPOle e 1

< 30 %

Ole e 2 PROFILINAGenuine

Allergia Molercolare – Betulla

Betulla (fagales)

Bet v 1

90 – 98 %

Genuine

Allergia Molecolare - Betulla

Bet v 1 Bet v 2

90 – 98 %

10 – 20 %

PROFILINA

Birch (fagales)

Pollini, alimenti

Bet v 4

Polleni, alberi, graminacee, erbe

CBP

mela, ciliegia, pera, albicocca, carota, sedano, soia,pomodoro, ontano, nocciolo, carpino

Alberi, graminacee, erbe, frutta, vegetali, frutta con guscio, spezie, latice

Genuine

A) IDENTIFICAZIONE DELLE FONTI ALLERGENICHE PRIMARIE

Storia clinica (la sensibilizzazione esclusiva ad allergeni cross-reagenti è spesso Storia clinica (la sensibilizzazione esclusiva ad allergeni cross-reagenti è spesso clinicamente silente), SPT, IgE specifiche estrattoclinicamente silente), SPT, IgE specifiche estrattoIgE specifiche per gli IgE specifiche per gli allergeni genuiniallergeni genuini specifici (Phl p 1/5; Amb a 1; Bet v 1; Art specifici (Phl p 1/5; Amb a 1; Bet v 1; Art v 1; Par j 2; Ole e 1; Fel d 1; Alt a 1)v 1; Par j 2; Ole e 1; Fel d 1; Alt a 1)

B) IDENTIFICAZIONE REATTIVITA’ A PANALLERGENIIgE specifiche per IgE specifiche per panallergenipanallergeni (Phl p 7; Bet v 2; Der p 10) (Phl p 7; Bet v 2; Der p 10)

SCELTA DELLA TERAPIA IDONEASCELTA DELLA TERAPIA IDONEA

Allergia Molecolare come procedere in pratica

AM il razionale: Chi, Perchè e Quale vantaggio

1. Chi testare?

2. Perchè testare con AM?

3. Quale vantaggio l’AM comporta al clinico?

• Pazienti con estratto allergenico completo positivo• Pazienti poli-sensibili (inalanti, alimenti)• Pazienti con pattern e sintomi respiratori non chiari

• Fare una diagnosi differenziale• Definire il reale profilo di sensibilizzazione del paziente• Migliore gestione del paziente

• Definizione della ITS (o altra terapia)• Supporto nell’indicazione di eliminazione dell’allergene• Suggerimenti per le reazioni di cross-reattività

CRD e ITS

Selezione dei pazienti da avviare alla ITS

• Anamnesi• Esame Obiettivo• SPT o dosaggio IgEs basato

sugli estratti

Mugwort

Birch

Timothy

Si tratta di tre sensibilizzazioni genuine?

MugwortMugwort

BirchBirch

TimothyTimothy

..o di cross-reattività?

Profilins and polcalcins may cause positive tests

MugwortMugwort

BirchBirch

TimothyTimothy

La risposta è data dalla CRD

Genuine sensitization to timothy only

MugwortMugwort

BirchBirch

TimothyTimothy

Componenti genuine

Bet v 1

Art v 1

Phl p 1

Phl p 5

Indicazione Indicazione per ITSper ITS

Profilin Polcalcin

Bet v 2Bet v 2 Bet v 4Bet v 4

Art v 4Art v 4 Art v 5 Art v 5

Phl p 12Phl p 12 Phl p 7 Phl p 7

If only cross-reactive markes are identified

further investigation is needed

Componenti cross-reative

Bet v 1Bet v 1

Art v 1Art v 1

Phl p 1Phl p 1

Phl p 5Phl p 5

Allergia Molecolare: come procedere in praticaAllergia Molecolare: come procedere in pratica

Bianchi A, RIAP febbraio 2011;12-19Bianchi A, RIAP febbraio 2011;12-19

La Diagnostica Molecolare nell’Allergia La Diagnostica Molecolare nell’Allergia AlimentareAlimentare


PolisensibilizzazionePolisensibilizzazione

I “panallergeni“ alimentari sono :

Profiline (Bet v2 omologhe) PR10 (Bet v1 omologhe) LTP (Lipid Transfer Protein) SSD (Seed Storage Protein) CCD (Cross-reactive Carbohydrate Determinants)

Risk assessmentRisk assessment

Stabilità delle proteineStabilità delle proteine

Proteine Labili Reazioni localiProteine Labili Reazioni locali

Proteine Stabili Reazioni sistemicheProteine Stabili Reazioni sistemiche

Allergia Molecolare – PR -10Allergia Molecolare – PR -10

Betulla (Betulla (fagalesfagales))

Bet v 1Bet v 1

mela, ciliegia, pera, albicocca, carota, sedano, soia,pomodoro, ontano, nocciolo, carpino

Caratteristiche

• Estremamente labili, facilmente distrutte dal calore, dall’ossidazione, dai processi di estrazione e dalla digestione pepsinica • reazioni OAS• I pazienti allergici a proteine Bet v 1 omologhe riportano frequentemente una buona tolleranza per gli alimenti cotti e per i succhi di frutta commerciali

Allergeni

Pesca (Pru p 3), mela (Mal d 3), albicocca (Pru ar 3), ciliegia (Pru av 3), prugna (Pru d 3), nocciola (Cor a 8), castagna (Cas s 8), mais (Zea m 14), asparago (Aspa o 1), orzo ( Hor v ), uva (Vit v 1), lattuga (Lac s 1), arachide (Ara h 9 ), senape

Lipid Transfer Protein

Caratteristiche

• Presenti nella buccia delle Rosacee• Resistenza alla pepsina e al calore• Reazioni sistemiche• Pazienti allergici alle LTP riportano frequentemente una buona tolleranza alla frutta sbucciata• Essenzialmente presenti nel sud Europa (Italia e Spagna)

Famiglia delle Rosaceae Famiglia delle Rosaceae

Pru p 1Pru p 1

Pru p 3Pru p 3

Pru p 4Pru p 4

Pru ar 1Pru ar 1

Pru ar 3Pru ar 3

Pru ar 4Pru ar 4

Mal d 1Mal d 1

Mal d 3Mal d 3

Mal d 4Mal d 4

Pru d 1Pru d 1

Pru d 3Pru d 3

Pru d 4Pru d 4

Pyr c 1Pyr c 1

Pyr c 3Pyr c 3

Pyr c 4Pyr c 4

Pru av 1Pru av 1

Pru av 3Pru av 3

Pru av 4Pru av 4

Somiglianza di queste componenti tra differenti frutti con nocciolo

Pru p1Pru p1

Pru p3Pru p3

Pru p4Pru p4

LTP - Frutta e nociLTP - Frutta e noci

• Rosaceae– Pera– Pesca– Ciliegia– Albicocca– Mandorla– Zucca

• Noce• Nocciola• Mais• Semi di sesamo• Semi di girasole• Birra (LTP dell’orzo, stabilizzante per

fermentazione)

• Uva• Arachidi• Senape

Pru p 3

Pru p 3

Cor a 8

Cor a 8

Pru p 3Pru p 3 Par j 2Par j 2 Cor a 8Cor a 8

Non basta essere sensibilizzato all’LTP per avere anticorpi contro Non basta essere sensibilizzato all’LTP per avere anticorpi contro TUTTE le LTP!!!!TUTTE le LTP!!!!

Esiste solo una LTP?Esiste solo una LTP?

Plant nsLTP as food and pollen allergens Saledo G.et al Clin Exp Allergy 2004,34

Omologia tra LTPOmologia tra LTP

Allergia a proteine di depositoAllergia a proteine di deposito

2S AlbumineArachide (Ara h 2, 6, 7), senape, noce brasiliana (Ber e 1), noce (Jug r 1), semi di ricino (Ric c 1, 3), semi di sesamo (Ses i 1, 2), anacardio (Ana o 3), semi di girasole Caratteristiche

• Allergeni estremamente stabili • Sensibilizzazione sia per via gastrointestinale che respiratoria• Resistenza alla pepsina e al calore• Spesso associate a reazioni sistemiche

VicilineArachide (Ara h 1),lenticchia (len c 1), nocciola (Cor a 11), noce (Jug r 2), semi di sesamo (Ses i 3), anacardio (Ana o 1)

LegumineArachide (Ara h 3), noce (Jug r 4), anacardio (Ana o 2), nocciola (Cor a 9)

diagnosi sintomo il percorso diagnostico in allergologia

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