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DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS POR IFI SISTEMAS DE LECTURA AUTOMÁTICA Dra Mª Belén Aparicio Hernández Complejo Asistencial Universitario Salamanca

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Pruebas de diagnóstico: Detección autoanticuerpos

(1)2011. Humbel. History of autoimmune serology. From prediction to prevention of autoimmune diseases. Autoantigens, auroantibodies, autoimmunity. Volume 7 (2) 1997. Fulton. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrixTM system. Clinical chemistry (3)2011. Araujo-Filho. POTENTIAL APPLICATIONS OF THE CHEMILUMINESCENT METHODS IN TUMORAL DISEASES INVESTIGATION. International journal of Pharma

and Bioscience

Hewett Coons

Sussman-Yahow & Bersus

Herbrink

AÑO Técnica Investigador

Perlmann, Engvall, Weenen & Schuurs

Horan

1888

1896

1897

1901

1905

1950

1959

1971

1977

1982

2001

Aglutinación (1)

Inmunoprecipitación (1)

Fijación complemento (1)

Inmunodifusión (1)

Radionmunoensayo (1)

Inmunofluorescencia (1)

ELISA (1)

Microesferas- Citometria flujo (2)

Inmunodot (1)

EliA

Quimioluminiscencia (3)

Weideman

Gruber & Durhan

Kraus

Bordet & Gengou

Belchhold


INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

e

orientar y caracteriza

Antiinmunoglobulina marcada Corte de tejido


INMUNOFLUORESCENCIA

llevan unidos compuestos Emplea anticuerpos que

fluorescentes o fluorocromos.

Isotiocianato de fluoresceína 488nm 530nm

Rodamina B 545nm 585nm

Excitación Emisión

Ficoeritrina 488nm 576nm

Y directa

Y indirecta

Fluoróforos: hidrocarburos poliaromáticos o heterociclicos

llamados fluoróforos o colorantes fluorescentes. Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

400 800 1000

t( s)

detección decaimiento

Fluorescencia

quelatos

componentes

fluorescentes de la

muestra

Inmunoensayos de fluorescencia

resuelta en el tiempo Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Detección de ANA mediante IFI

•American College of Rheumatology (ACR)

• IFA en células HEp-2 es el gold standard para estudio

de ANA (100-150 Ags, nucleares y celulares)

• Grupos de expertos internacionales


RECOMENDACIONES EXPERTOS

Agmon-Levin N et al; Ann Rheum Dis 2014


CÉLULAS HEP 2

Imagen Homogénea + Periférica Imagen Moteada

Imagen Nucleolar

Imagen Centromérica

Imagen Citoplasmática


C-ANCA (PR3)

p-ANCA (MPO)

ANCA atípico

ETANOL

FORMALINA

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA ANCAS Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Figure 3 | Visual representation of the 1999 recommendations and revised 2017 recommendations. a| In the 1999 consensus document, the recommended approach for anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA) detection was to screen for ANCA by indirect immunofluorescence (IIF) and to test for proteinase 3 (PR3)-ANCAs and myeloperoxidase (MPO)-ANCAs in IIF-positive samples; the ideal approach was to perform IIF and immunoassay on all samples. b| In the 2017 consensus, the use of high-quality immunoassays is recommended as the preferred first screening method for ANCA detection in patients suspected of having the ANCA-associated vaculitides granulomatosis with polyangiitis (GPA) and microscopic polyangiitis (MPA). ANCA detection for non-ANCA-associated vasculitis conditions is not included in this consensus. *A second PR3-MPO-ANCA or IIF can be considered for negative results in patients with a high clinical suspicion (to increase sensitivity) or in case of low antibody levels (to increase specificity). Take antibody level into account.

a 1999 consensus

Ideal approach

b 2017

consensus

IIF

IIF+

ANCA–

IIF+

ANCA+

IIF

• PR3-ANCA and MPO-ANCA

• Immunoassays


• Immunoassays

Not covered by this consensus

ANCA– ANCA+

Second assay*

Second assay*

Gating strategy

Suspected AAV

Non AAV

Recommended approach Recommended approach

IIF– IIF+


• Immunoassays

IIF–

ANCA–

IIF–

ANCA+

IIF+

ANCA–

IIF+

ANCA+

CONSENSUS S TATEMENT

POS IT ION PAPER

Revised 2017 international consensus on testing of ANCAs in granulomatosis with polyangiitis and microscopic polyangiitis

Xavier Bossuyt1, Jan-Willem Cohen Tervaert2, Yoshihiro Arimura3, Daniel Blockmans4, Luis Felipe Flores-Suárez5, Loïc

Guillevin6, Bernhard Hellmich7, David Jayne8, J. Charles Jennette9, Cees G. M. Kallenberg10, Sergey Moiseev11, Pavel

Novikov11, Antonella Radice12, Judith Anne Savige13, Renato Alberto Sinico14, Ulrich Specks15, Pieter van Paassen16,

Ming-hui Zhao17, Niels Rasmussen18, Jan Damoiseaux19 and Elena Csernok7


INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA ENDOMISIO

ESÓFAGO DE MONO INTESTINO DE MONO

CORDÓN UMBILICAL HUMANO


La determinación de EMA se realizará para detectar enfermedad residual, o en casos en que la

t-TG2 IgA supere el cutoff establecido o esté en zona gris con clínica sugestiva.

- Si los EMA son positivos no se realizarán diluciones seriadas.

Niños y adolescentes con síntomas sugestivos de EC, dieta con gluten y valores de t-TG2 IgA

> 10 veces VR, deben ser confirmados mediante la determinación de EMA. Es aconsejable

realizar estudio genético de EC con el fin de reforzar el diagnostico y evitar la realización de BI.

El paciente presenta valores de t-TG2 IgA moderadamente elevados (<10 veces VR), se

confirmarán mediante EMA IgA, en caso de título positivo sería recomendable realizar biopsia

intestinal, si el título fuera negativo, repetir estudio serológico pasados 3 – 6 meses,

manteniendo dieta con gluten.

CLINICAL GUIDELINE

European Society for Pediatric Gastroenterology,

Hepatology, and Nutrition Guidelines for the Diagnosis of

Coeliac Disease J. Pediatr Gastroenterol Nutr.2012 Jan;54(1):136-60

Working Group on Coeliac Disease Diagnosis, on behalf of the ESPGHAN Gastroenterology Committee Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

ASMA AMA LC1

CP ADRENAL ICA

PIEL MUSCULO ESTRIADO ONCONEURONAL


F F

?

F F

Antígeno

Muestra,

Controles Positivo

y Negativo

Conjugado - FITC

Medio montaje

Diluyente /

Tampón lavado

Portaobjetos

Informe

Positivo/negativo

Patrón fluorescencia

Intensidad/título

Intervalos referencia

Tipo de sustrato a

Tipo de muestra Tipo de conjugado

IFI


DESVENTAJAS IFI

•Subjetivo

•No estandarizado

•Necesaria experiencia

•Microscopio

•Baja sensibilidad ciertos Ags

•Baja especificidad


INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA AUTOMATIZADA

LABORATORIO DE AUTOINMUNIDAD Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

DE GRUYTER DOl 10.1515/ cclm-2012-0191 - Clin Ch em La b M e d 2013; 51(1): 129 - 138

Review

Renato Tozzoli, Chiara Bonaguri, Alessandra Melegari, Ant onio Ant i co, Dan il a Basse tt i

an d Nicola Bizzaro*

Current state of diagnostic technologies in the

autoimmunology laboratory

Varelisa

Report

3 r-

; i l .. , ..

... :::,

_g. M anual

§' M onoplex methods

t-

(IIF, DID, WB)

1 970

Automated

Monoplex methods

(EIA, FIA, LIA, RIA)

1995

Low automated

Multjplex methods

(line blot, array)

2003

Full automated

lndirect lmmunofluorescence

2009

Fu ll automated l Mu l t iplex methods

(microarray)

2006

l IIF Western Blot 1

Time

Figure 1 The evolu t ion o f te ch nolog i e s for a u t oa nt i body d etec t ion: t he ro le of a uto mat io n (see text for le ge nd s) .


Autoimmunity Reviews

Automated antinuclear immunofluorescence antibody screening: A

comparative study of six computer-aided diagnostic systems

Nicola Bizzaro a,⁎, Antonio Antico b, Stefan Platzgummer c, Elio Tonutti d, Danila Bassetti e,

Fiorenza Pesente a, Renato Tozzoli f, Marilina Tampoia g, Danilo Villalta h, Study Group on Autoimmune Diseases of the Italian Society of Laboratory Medicine, Italy

Contents lists available at ScienceDirect

journal homepage: www.elsevier.com/locate/autrev

Review


http://www.sciencedirect.com/science/journal/15689972

http://www.elsevier.com/locate/autrev

http://www.elsevier.com/locate/autrev

Suite software include (a) homogeneous, (b) speckled, (c) nuclear dots, (d) nucleolar and (e) centromeres. Additionally, the following patterns of related antibodies can be recognized: (f) nuclear membranes and (g) cytoplasmic. Finally, negative and unspecific results (h) are recognized and selected in a different tab. ANA: antinuclear antibodies; IIF: indirect immunofluorescence.


Lupus (2015) 24, 516–529

http://lup.sagepub.com

SPECIAL ARTICLE

EUROPattern Suite technology for computer-aided immunofluorescence

microscopy in autoantibody diagnostics

C Krause1, K Ens1, K Fechner1, J Voigt1, J Fraune1, E Rohwa¨der1, M Hahn1, M Danckwardt1, C Feirer1, E Barth2, T Martinetz2 and W Sto¨cker1

1Institute for Experimental Immunology, Euroimmun AG, Lu¨beck, Germany; and 2Institute for Neuro-

and Bioinformatics, University of Lu¨beck, Lu¨beck, Germany


http://lup.sagepub.com/

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA AUTOMATIZADA

EUROPattern


Cargador 50 portas

cLED

Objetivos (20x, 40x)

Binocular Integrado

LECTURA E INTERPRETACIÓN

AUTOMÁTICA

EUROPattern


MOSAICO BIOCHIP

Tecnología EUROPLUS

EUROPattern


EtOH HEp-2/EtOH

HCHO MBG

PR3 MPO

pANCA

cANCA

xANCA

MBG

PR3

MPO

ANA positivo EUROPattern


Riñon

Granulocitos

Chritidia

Esófago

Intestino

delgado

Células

HEp-2

Nervios EUROPattern


PROCESADO IFI

LECTOR CB MUESTRAS

LECTOR CB PORTAS

MICROSCOPIO INCORPORADO

CAPTURA IMÁGENES

ORDENADOR INCORPORADO

HELIOS

Grifols


Captación de imagen integrada: Microscopio motorizado LED integrado

ÓPTICA NIKON

• Objetivo 20X

• Zoom digital hasta 40X

MICROSCOPIO MOTORIZADO

• Desarrollado por AESKU (ingeniería alemana)

• Autoenfoque rápido y preciso

HELIOS

Grifols


HELIOS

HEp-2 ANCA nDNA

rLKS mLKS EMA

SUSTRATOS DISPONIBLES LECTURA AUTOMÁTICA

Grifols


HELIOS

Atlas de patrones de fluorescencia para HEp-2, Triple tejido, Endomisio, Crithidia y ANCA

SOFTWARE VALIDACIÓN INTEGRADO

Grifols


HELIOS Automatización total procesado

y lectura IFI

PROCESADO Y LECTURA EN 1 INSTRUMENTO

Grifols

HELIOS


LECTOR AUTOMÁTICO DE PORTAS

© Palex Medical SA


Portas disponibles:

Hep-2

Hep-2000®:

• Células transfectadas que sobreexpresan

SSA/Ro 60 kDa

• Sobreexpresión en 10-20% de las células del

cultivo

Crithidia luciliae

ANCAS

Triple tejido

Endomisio.

IMAGE NAVIGATOR 3.0

Palex


Revisión Controles

© Palex Medical SA 05.2017

35

Revisión Positivos

Revisión Negativos

Asistente

Palex

Navigator 3.0 HEP 2/HEP 2000


SISTEMA INTERPRETACION IFA: NOVA View

Werfen


¿Cómo trabaja NOVA View?

1

2

3 4

5

NOVA View escanea 3-5 regiones alrededor del centro de

cada pocillo: enfoque con DAPI / FITC.

Selecciona una única imagen por región para el análisis

final.

Archiva 3-5 imágenes: confirmación y revisión del

resultado.

Reconocimiento de patrones por algoritmos

matemáticos: imagen holográfica 3D.

El algoritmo mide los picos y valles de cada imagen y

propone un patrón.

Patrón moteado

Werfen


Werfen


NOVA View

Werfen


ANA - IFI AUTOMATIZADO


Zenit PRO

ACCESO REMOTO

RECONOCIMIENTO PATRONES

SOLO COMO LECTOR

PATRONES HEP 2, ANCAS, CRITHIDIA, EMA.

PORTAS MÚLTIPLES EN UNA SESIÓN


Combinación preparación de portas y lectura.


ZENIT PRO: IMÁGENES


Zenit PRO


IMÁGENES EN MINIATURA


ZENIT PRO: IMÁGENES


MITOSIS

ATLAS DE PATRONES Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Nuevas tecnologías para el estudio de Autoanticuerpos

Técnicas proteómicas

Métodos de separación e

identificación de proteínas

Arrays

Secuenciación masiva


MUCHAS GRACIAS Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

detecciÓn de autoanticuerpos por ifi …€¦ · quimioluminiscencia (3) weideman gruber &...

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