destilador de nitrogenio

UNIVERSIDADE FEDERAL

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA COMO ALTERNATIVA À METODOLOGIA KJELDAHL PARA DETERMINAÇÃO DO TEOR DE

NITROGÊNIO EM AMOSTRAS DE TECIDO VEGETAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA





LORENA MENDES DE SOUZA

Uberlândia – MG

2012

DE UBERLÂNDIA





UNIVERSIDADE FEDERAL





UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA





Lorena Mendes de Souza

Monografia de graduação

Universidade Federal de Uberlândia como

parte dos requisitos necessários

aprovação na disciplina de Trabalho de

Conclusão de Curso do curso de

Química

Uberlândia – MG

2012

DE UBERLÂNDIA





raduação apresentada à

Universidade Federal de Uberlândia como

parte dos requisitos necessários para a

aprovação na disciplina de Trabalho de

Conclusão de Curso do curso de Engenharia

FICHA CATALOGRÁFICA

(Coloca-se na parte inferior da página e do lado direito)

MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA DA MONOGRAFIA DA DISCIPLINA

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO DE LORENA MENDES DE SOUZA

APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÃNDIA, EM (DATA).

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________

Prof. ...............................................

Orientador (FEQ/UFU)

____________________________________________

Prof. .............................................

FEQ/UFU

____________________________________________

Prof. .............................................

FEQ/UFU

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho à minha mãe Nilma Mendes de Souza

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, que me deu força e garra para superar todas as dificuldades enfrentadas ao longo deste curso, bem como me proporcionou alegrias e bênçãos imensuráveis.

Agradeço ao meu pai Adalberto e em especial à minha mãe Nilma, pelo apoio, credibilidade,

amor e dedicação, pelos ensinamentos valiosos e por terem me dado a oportunidade de cursar e me formar no curso de Engenharia Química.

Ao meu irmão Diego, pelo exemplo maravilhoso de dedicação, pelos ensinamentos e apoio. Ao meu irmão Thiago e sobrinha Yasmin pelo carinho de todos os momentos. À minha irmã

Loyane pelo companheirismo inestimável, pelo apoio nos estudos, enfim por enfrentar comigo, com muita fé, perseverança e convicção, a mesma batalha.

Ao meu namorado Heitor pela compreensão, companheirismo, confiança e principalmente

pelo carinho e paciência.

A todos os membros da EMBRAPA arroz e feijão, pelo suporte e por viabilizar a realização deste trabalho. Agradeço em especial ao Ivã Matsushige, supervisor do Laboratório de

Análises Agroambientais e ao analista Diego Mendes de Souza pelo ensinamento e paciência no Laboratório.

Ao Prof. Eloízio Júlio Ribeiro pela credibilidade depositada em mim, credibilidade esta que

foi fundamental para realização deste trabalho.

A todos os professores da Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia por transmitirem muita sabedoria, sendo assim, essenciais para o meu

crescimento pessoal e profissional. Agradeço em especial ao Prof. Luís Cláudio Oliveira Lopes por me acompanhar desde o início da faculdade, me orientando, ensinando e

contribuindo para minha formação.

Aos meus colegas que compartilharam comigo seus conhecimentos.

A todos aqueles que de alguma forma contribuíram ou torceram pela concretização deste projeto.

EPÍGRAFE

“O conhecimento chega, mas a sabedoria demora." (Alfred Tennyson)

SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. i

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................... ii

LISTA DE SÍMBOLOS ............................................................................................................ iii

RESUMO .................................................................................................................................. iv

ABSTRACT ............................................................................................................................... v

1- INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1

2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................... 4

2.1- Bioquímica Vegetal .......................................................................................................................4

2.2- Amostragem Vegetal.....................................................................................................................4

2.3- Preparação das amostras para análise química ............................................................................5

2.4- Destruição da matéria orgânica ....................................................................................................6

2.4.1- Digestão Úmida ........................................................................................................ 7

2.5- Método Kjeldahl para determinação de Nitrogênio .....................................................................8

2.5.1- Fundamentos da titulação ......................................................................................... 8

2.5.2- O método Kjeldahl ................................................................................................... 9

2.6- Método espectrofotométrico para determinação de Nitrogênio ............................................. 10

2.6.1- Fundamentos da espectrofotometria....................................................................... 10

2.6.2- Lei de Lambert-Beer na espectrofotometria........................................................... 11

2.6.3- Instrumentação analítica na espectrofotometria ..................................................... 12

2.6.3.1- Fontes de Radiação ............................................................................................. 12

2.6.3.2- Monocromadores ................................................................................................ 13

2.6.3.3- Cubetas ................................................................................................................ 14

2.6.4- O método espectrofotométrico baseado na reação de Berthelot ............................ 14

2.7- Validação de um método analítico ............................................................................................ 16

2.7.1- Especificidade/Seletividade ................................................................................... 17

2.7.2- Faixa de trabalho .................................................................................................... 17

2.7.3- Linearidade ............................................................................................................. 18

2.7.4- Sensibilidade .......................................................................................................... 18

2.7.5- Exatidão .................................................................................................................. 18

2.7.6- Precisão .................................................................................................................. 19

2.7.7- Teste de decomposição dos reagentes .................................................................... 20

2.7.8- Teste de estabilidade da coloração ......................................................................... 20

2.7.9- Limite de Detecção (LD)........................................................................................ 20

2.7.10- Limite de quantificação (LQ) ............................................................................... 21

2.8- Estatística ................................................................................................................................... 21

2.8.1- Importância da estatística ....................................................................................... 21

2.8.2- Testes estatísticos ................................................................................................... 22

2.8.2.1- Teste de Hipóteses ............................................................................................... 22

2.8.2.2- Teste F para comparação de variâncias ............................................................. 23

2.8.2.2- Teste T para comparação de médias................................................................... 24

2.9- Gerenciamento de Resíduos gerados em Laboratórios ............................................................. 26

3- METODOLOGIA ................................................................................................................ 27

3.1- Amostragem ............................................................................................................................... 27

3.2- Preparação das amostras para análise química ......................................................................... 27

3.3- Lavagem e descontaminação de vidrarias ................................................................................. 27

3.4- O método Kjeldahl ..................................................................................................................... 27

3.4.1- Insumos, equipamentos e utensílios ....................................................................... 27

3.4.2- Digestão úmida para o método Kjeldahl ................................................................ 29

3.4.3-Destilação ................................................................................................................ 29

3.4.4- Titulação ................................................................................................................. 30

3.5- O método espectrofotométrico baseado na reação de Berthelot ............................................ 30

3.5.1- Insumos, equipamentos e utensílios ....................................................................... 30

3.5.2- Preparo de soluções ................................................................................................ 31

3.5.3- Digestão úmida para o método espectrofotométrico baseado na reação de Berthelot .......................................................................................................................................... 33

3.5.4- Diluição intermediária ............................................................................................ 35

3.5.5- Leitura das amostras ............................................................................................... 36

3.6- Validação .................................................................................................................................... 36

3.6.1- Teste de Especificidade .......................................................................................... 36

3.6.2- Faixa de trabalho/Teste de Linearidade/Teste de Sensibilidade ............................ 36

3.6.3- Teste de Exatidão/Teste de Precisão ...................................................................... 37

3.6.4- Teste de decomposição dos reagentes .................................................................... 37

3.6.5- Teste da estabilidade da coloração ......................................................................... 37

3.6.6- Limite de detecção e Limite de quantificação ........................................................ 38

3.6.7- Comparação de Média e Variância ........................................................................ 38

3.7- Tratamento dos resíduos gerados pelas análises químicas ....................................................... 38

3.7.1- Tratamento de resíduos contendo cobre ................................................................. 38

3.7.2 Tratamento de resíduos contendo selênio ................................................................ 38

4- RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 39

4.1- Reagentes utilizados nos métodos ............................................................................................ 39

4.2- Digestão úmida .......................................................................................................................... 39

4.3- Validação do método ................................................................................................................. 40

4.3.1-Teste de especificidade............................................................................................ 40

4.3.2- Faixa de trabalho, linearidade e sensibilidade ........................................................ 42

4.3.3- Teste de Exatidão ................................................................................................... 43

4.3.4- Teste de Precisão .................................................................................................... 44

4.3.5- Teste de Decomposição dos reagentes ................................................................... 45

4.3.6- Teste da estabilidade da coloração ......................................................................... 47

4.3.7- Limite de Detecção e Limite de Quantificação ...................................................... 48

4.3.8- Comparação de média e variância .......................................................................... 49

4.4-Tratamento dos resíduos gerados pelas análises químicas ........................................................ 50

4.4.1- Tratamento de resíduos contendo cobre ................................................................. 50

4.4.2- Tratamento de resíduos contendo selênio .............................................................. 51

5- CONCLUSÕES .................................................................................................................... 51

I

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Principais componentes de um espetrofotômetro .................................................... 12

Figura 2- Monocromador prismático ........................................................................................ 14

Figura 3- Destilador de Nitrogênio Marconi MA-036 ............................................................. 29

Figura 4- Preparação do reagente R1 ....................................................................................... 32

Figura 5- Pesagem das amostras em papel livre de Nitrogênio ................................................ 33

Figura 6- Sais catalisadores da digestão ................................................................................... 33

Figura 7- Digestão das amostras em bloco digestor ................................................................. 34

Figura 8- Diferença da amostra na primeira hora da digestão e ao término da digestão.......... 35

Figura 9- Adição dos reagentes R1 e R2. ................................................................................. 35

Figura 10- Espectrofotômetro HACH DR2800 ........................................................................ 36

Figura 11- Curva padrão e absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com possíveis

interferentes. ............................................................................................................................. 41

Figura 12- Faixa de trabalho testada......................................................................................... 42

Figura 13- Linearidade e sensibilidade do método ................................................................... 43

Figura 14- Curva padrão com R1 e R2 novos .......................................................................... 45

Figura 15- Curva padrão com R1 velho e R2 novo .................................................................. 46

Figura 16- Curva padrão com R1 e R2 velhos ......................................................................... 47

Figura 17- Coloração dos padrões ............................................................................................ 47

Figura 18- Evolução da absorbância ao longo do tempo.......................................................... 48

II

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Quantidade máxima de minerais presentes no extrato e quantidade máxima testada

pela HACH. .............................................................................................................................. 40

Tabela 2- Absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com possíveis interferentes. 41

Tabela 3- interferência máxima na leitura. ............................................................................... 41

Tabela 4- Teor de nitrogênio na amostra certificada obtido pelos métodos avaliados ............. 43

Tabela 5- Erro relativo dos métodos em relação ao valor certificado ...................................... 44

Tabela 6- Média, desvio padrão e coeficiente de variação das análises obtidas ...................... 44

Tabela 7- Coeficiente de variação médio das análises ............................................................. 45

Tabela 8- Absorbância dos brancos .......................................................................................... 49

Tabela 9- Limite de Detecção e Limite de Quantificação ........................................................ 49

Tabela 10- Teste de comparação de variância e média ............................................................ 50

III

LISTA DE SÍMBOLOS

A- absorbância

Α- Nível de significância

c- concentração do material absorvedor [ML-3]

CV-coeficiente de variação

DPa- desvio padrão do intercepto com o eixo do Y [ML-3]

DPb- desvio padrão do branco [ML-3]

DPR- desvio padrão relativo

ε- absorvidade molecular ou coeficiente de extinção [L2M-1]

Gerelab- Gerenciamento dos resíduos sólidos

io- intensidade de luz incidindo na solução [Cd]

i- Intensidade da luz saindo da solução [Cd]

l- espessura da amostra da amostra através da qual a luz passa [L]

L.A.A- Laboratório de Análises Agroambientais

LD- limite de detecção

LQ- limite de quantificação

λ- Comprimento de onda [L]

µ- média populacional [ML-3]

t 95% - valor tabelado de t de student para n amostras (95% de confiança)

S- sensibilidade do aparelho

σ- desvio padrão populacional [ML-3]

T- transmitância

IV

RESUMO

O termo nitrogênio total de Kjeldahl (Ntk) refere-se ao nitrogênio orgânico presente em uma determinada amostra e sua determinação consiste basicamente na conversão de toda forma nitrogenada a amônio que por sua vez pode ser detectado por diferentes métodos, tais como, titulação, potenciometria e espectrofotometria. Determinar este elemento em amostras de tecido vegetal tem inestimável importância já que o mesmo está intimamente ligado ao metabolismo de aminoácidos e proteínas envolvendo processos enzimáticos e assimilações através de reações de oxiredução (Dougall & Estaba, 1980). O método mais utilizado para esta análise é o método de Kjeldahl, proposto pelo dinamarquês Johan Gustav Kjeldahl em 1883 que determina o Nitrogênio orgânico total, isto é, o nitrogênio proteico e o nitrogênio não proteico, porém orgânico. Tal método baseia-se na digestão sulfúrica de uma amostra sob alta temperatura, o amoníaco é então liberado e destilado com hidróxido de sódio (NaOH), logo em seguida é titulado com uma solução ácida padrão. A simplicidade deste método torna-o muito empregado em análises de diferentes amostras, contudo o método é lento e a operacionalidade do mesmo, no Laboratório de Análises Agroambientais (LAA) da EMBRAPA arroz e feijão, ainda é questionável já que o laboratório disponibiliza-se de apenas um destilador. Além disso, há uma grande quantidade de solicitações de análise de Nitrogênio total no LAA. Em 2011, o laboratório recebeu cerca de 4000 solicitações sendo que apenas 2500 destas foram realizadas no mesmo ano. Neste contexto, o objetivo deste trabalho é o ajuste da análise espectrofotométrica, baseada na reação de Berthelot como alternativa à metodologia de Kjeldahl para determinação do teor de nitrogênio em amostras de tecido vegetal. Tal método, que é sobretudo mais operacional na rotina do laboratório, foi validada e comparada com a metodologia Kjeldahl. Palavras-chave: Nitrogênio, tecido vegetal, método Kjeldahl, método espectrofotométrico.

V

ABSTRACT

The term total Kjeldahl nitrogen (TKN) refers to organic nitrogen present in a given sample and the determination basically consists in the conversion of the ammonium nitrogen form throughout which in turn can be detected by various methods, such as titration, potentiometry and spectrophotometry. Determine this element in samples of plant tissue has inestimable importance since it is closely linked to the metabolism of amino acids and proteins and enzymatic processes involving assimilation through reactions oxiredução (Estaba & Dougall, 1980). The method used for this analysis is the Kjeldahl method, proposed by Danish Gustav Johan Kjeldahl in 1883 that determines the total organic nitrogen, ie nitrogen protein and non-protein nitrogen, but organic. This method relies on digestion sulfuric a sample under high temperature, ammonia is then released and distilled with sodium hydroxide (NaOH) is then immediately titrated with a standard acid solution. The simplicity of this method makes it widely used in analyzes of different samples, but the method is slow and operability of the same in AE Analytical Laboratory (AAL) EMBRAPA rice and beans, is still questionable since the lab is available only a distiller. In addition, there are a lot of requests for analysis of total nitrogen in the LAA. In 2011, the lab received about 4000 requests and only 2500 of these were made in the same year. In this context, the objective of this work is the setting of spectrophotometric analysis, based on the Berthelot reaction as an alternative to the Kjeldahl method for determining nitrogen content in samples of plant tissue. This method, which is more particularly operating in routine laboratory was validated and compared with the Kjeldahl method.

Keywords: Nitrogen, plant tissue, Kjeldahl method, spectrophotometric method

1

1- INTRODUÇÃO

O desenvolvimento ou aprimoramento de métodos para determinação de nitrogênio

total em materiais vegetais torna-se necessário devido à importância do controle deste

nutriente, em função principalmente de seu papel no metabolismo de aminoácidos e proteínas

envolvendo processos enzimáticos e assimilações através de reações de oxiredução.

(DOUGALL; ESTABA, 1980)

O Nitrogênio é um importante componente quanto às funções no metabolismo das

plantas, participando como constituinte de moléculas de proteínas, coenzimas, ácido

nucleicos, citocromos, clorofila etc. (FERREIRA et al, 2001). Além disso, é um dos nutrientes

mais relevantes para o aumento da produção, pois está diretamente associado à atividade

fotossintética, aos processos de multiplicação e expansão celular, bem como à fixação de

vagens e ao enchimento dos grãos.

Quando ocorre na planta em níveis inferiores a 2,8% ou superiores a 6,0%, podem

ser desencadeados estados de deficiência ou toxidez, respectivamente. A deficiência de

nitrogênio ocorre principalmente, em solos arenosos e lixiviados, com baixo teor de matéria

orgânica (< 2 %). Em solos férteis, quando cultivados intensamente, fortemente lixiviados ou

inundados por tempo prolongado, também pode ocorrer deficiência de nitrogênio. Essa

deficiência também pode ser verificada como consequência de aplicação excessiva de

fertilizantes fosfatados. Podem ocorrer em plantas deficientes de nitrogênio: amarelecimento

das folhas, iniciando-se pelas mais velhas; crescimento reduzido; baixa produção de ramos e

botões florais; menor pegamento de vagens, redução no tamanho das sementes e

consequentemente, baixa produtividade e qualidade inferior de grãos conforme MANUAL

EMBRAPA RONDÔNIA (2005).

O nitrogênio altera-se entre várias formas e estados de oxidação, sendo as de maior

interesse, em ordem decrescente do estado de oxidação, nitrato (NO3-), nitrito (NO2-), amônia

(NH3 ou NH4+) e nitrogênio orgânico (dissolvido ou em suspensão).

Nitrogênio orgânico inclui matéria natural (proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos,

ureia) e numerosos compostos orgânicos sintéticos. A amônia está naturalmente presente em

águas superficiais e águas residuárias e esta é produzida largamente pela amonificação de

nitrogênio orgânico e pela hidrólise da ureia. Nitrato e nitrito são formas oxidadas, sendo que

o nitrato geralmente ocorre em pequenas quantidades em águas superficiais, mas podem

alcançar altos níveis em algumas águas subterrâneas. Nitrito é um estado de oxidação

2

intermediário do nitrogênio, obtido tanto da oxidação da amônia a nitrato como da redução do

nitrato. (KRAMER, 2009)

A maioria dos métodos para determinação de nitrogênio total requer a transformação

de todas as formas nitrogenadas a amônio e, neste contexto, o método Kjeldahl de digestão

desenvolvido em 1883 tem sido o mais utilizado para a análise de materiais vegetais. (JONES,

1987).

É válido ressaltar que a metodologia de Kjeldahl detecta não apenas o nitrogênio

proteico de uma amostra, mas também o nitrogênio orgânico de fonte não proteica.

Entretanto, na maioria dos alimentos este último é muito pequeno em relação ao proteico, o

que não confere grandes desvios ao teor real de nitrogênio presente na amostra.

Íons amônio podem ser quantificados por potenciometria (SHEN et al., 1997),

titulação (OHLWEILER, 1976) ou espectrofotometria utilizando reagente de Nessler

(DORICH; NELSON, 1983), salicilato de sódio (BREMNER; MULVANEY, 1982), etc, em

procedimentos que frequentemente requerem etapas de difusão gasosa ou destilação.

Há também metodologias a seco para determinação de nitrogênio presente em uma

amostra de tecido vegetal, como é o caso da metodologia Dumas, proposta por Jean-Baptiste

Dumas, que é um processo oxidativo seco que determina nitrogênio de uma amostra após a

combustão da mesma.

Ambos os métodos são utilizados atualmente na rotina do laboratório de análises

agroambientais da EMBRAPA arroz e feijão, localizada no município de Santo Antônio de

Goiás-GO. Porém, o alto custo de manutenção do analisador elementar utilizado no método

Dumas e a falta de operacionalidade da metodologia Kjeldahl, tendo em vista o processo ser

relativamente lento faz com que alternativas a essas metodologias sejam ajustadas ao

laboratório.

Durante a realização deste trabalho foi ajustado o método espectrofotométrico

baseado na reação de Berthelot para determinação de Nitrogênio total em amostras de tecido

vegetal. A operacionalidade, a média das concentrações de nitrogênio bem como a precisão

do método foi comparada com a metodologia padrão Kjeldahl.

As análises da validação foram feitas em amostras de feijão, arroz e braquiária

(Brachiaria sp.) já que o L.A.A de química de plantas da EMBRAPA arroz e feijão realiza,

principalmente, em sua rotina laboratorial, análises de teor mineral em amostras de arroz e

feijão. Além destes dois, a braquiária também foi escolhida para as análises da validação

porque esta apresenta maior dificuldade de extração dos seus elementos, devido ao seu alto

teor de lignina. Assim, é possível inferir que se a braquiária consegue ser oxidada na etapa de

3

digestão do método validado neste trabalho, grande parte das outras amostras de tecido

vegetal também poderão ser analisadas por este.

A análise de nitrogênio em feijão tem grande importância principalmente porque este

é uma leguminosa produtora de frutos ricos em proteína. Pelo fato desta tamanha importância

do feijão na alimentação, há grandes necessidades de se fazer adubação nitrogenada nas

culturas já que o nitrogênio é um nutriente com deficiência freqüente em leguminosas,

sobretudo nos feijoeiros.

Em arroz, faz-se de grande valia determinar a quantidade de nitrogênio, já que a

proteína do arroz é a mais nobre entre os cereais. A fração proteica do arroz, embora

quantitativamente pequena, apresenta a melhor composição de aminoácidos para o

metabolismo humano (entre os cereais). Quando metabolizado, gera menos resíduos

nitrogenados, favorecendo a função renal de filtragem desses catabólitos.

A braquiária foi introduzida no Brasil há mais de 50 anos e atualmente possui grande

relevância econômica, devido aos seus usos como forragem animal, cobertura e adubo verde

em sistemas de produção vegetal. Sua importância na nutrição animal pode ser avaliada

através das estimativas da área sob pastagem de braquiárias no Brasil, as quais já atingiam ao

redor de 85 milhões de ha em 2002 (SOUZA et al., 2012). Assim, faz-se importante

determinar o teor de nitrogênio presente em amostras de braquiária tendo em vista sua

importância na nutrição animal, bem como sua caracerística peculiar de apresentar grande teor

de lignina.

A análise de nitrogênio em rotinas de laboratório serve como fonte de determinação

do teor bruto de proteína em uma amostra. Assim, em amostras de tecido vegetal determina-se

o teor bruto de proteína a partir do nitrogênio total multiplicado por um fator de correção 6,25

(GALVANI, 2008).

Para realização das análises, recomenda-se escolher laboratórios idôneos, que

participam de programas de controle de qualidade, os quais divulgam anualmente aqueles

com padrões desejáveis de qualidade. O Laboratório de Análises Agroambientais do Centro

Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijão da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

(EMBRAPA), em Goiás, onde foi realizado este trabalho, é certificado pelo Programa

Interlaboratorial de Análise de Tecido Vegetal (PIATV).

4

2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1- Bioquímica Vegetal

Na natureza vários elementos estão disponíveis às plantas, porém uma simples

análise química de um vegetal não é capaz de determinar quais destes elementos são

essenciais, pois a planta pode absorver e armazenar em seus tecidos muitos elementos que não

lhe são essenciais. É necessário determinar os nutrientes de acordo com um critério de

essencialidade.

A maneira mais comum de se determinar a essencialidade de um elemento às plantas

é através de experimentos com soluções nutritivas preparadas com água e sais purificados.

Assim, pode-se omitir os elementos da solução um a um, podendo ser classificados como

essenciais os que atendam aos seguintes critérios (MALAVOLTA et al., 2006): Na ausência

do elemento a planta não cresce normalmente nem completa o seu ciclo de vida, ou seja, não

se desenvolve corretamente e não se reproduz; o elemento é insubstituível, ou seja, deficiência

só pode ser corrigida através do seu fornecimento e não de algum outro e o último critério

estabelece que o elemento químico faz parte de uma molécula, de um constituinte ou de uma

reação bioquímica essencial à planta.

Para classificar os elementos essenciais, dividem-se estes em dois grandes grupos:

macronutrientes e micronutrientes. O primeiro refere-se aos elementos básicos necessários em

maior volume às plantas: carbono, oxigênio, nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, magnésio e

enxofre. O segundo refere-se aos elementos requeridos em pequenas quantidades pela planta:

boro, cloro, cobre, ferro, manganês, molibdênio, cobalto, níquel e zinco.

Quando um elemento essencial está disponível em quantidades insuficientes ou em

combinações químicas que são dificilmente absorvidas, a deficiência deste elemento

provocará desarranjos nos processos metabólicos da planta. Muitas vezes esse distúrbio é

demonstrado por sintomas visíveis, como desenvolvimento lento, amarelecimento e outras

anormalidades. A intensidade desses sintomas é dependente do elemento em falta, da espécie

ou variedade da planta e de fatores ambientais.( EPSTEIN; BLOMM, 2006)

2.2- Amostragem Vegetal

5

A análise dos minerais presentes em amostras de tecido vegetal é uma das técnicas

utilizadas para a verificação do estado nutricional das plantas. A coleta de tecido para

análise deve ser feita, portanto, de forma adequada e representativa, já que os nutrientes

não existem nas diversas partes da planta em quantidades iguais, alternando de acordo com a

idade da planta e a variedade considerada. Os resultados da análise foliar somente serão

eficientes se a amostragem for bem feita e representativa da lavoura. (VELOSO et al., 2004)

Havendo suspeita de alguma deficiência nutricional, deve-se coletar separadamente

o tecido de plantas com e sem sintomas. Segundo a COMISSÃO DE QUÍMICA E

FERTILIDADE DO SOLO (2004), na maior parte dos casos a concentração de

nutrientes em folhas completamente expandidas de plantas é a melhor indicação do seu

estado nutricional, refletindo a condição de fertilidade do solo.

As amostras são geralmente colhidas quando as culturas estão em pleno crescimento

vegetativo e o órgão colhido, em geral, é a folha recém madura. Mas, em condições eventuais,

analisa-se porções do caule ou ramos. Como a composição de diferentes partes das plantas é

heterogênea, bem como o estágio de crescimento influi na concentração de nutrientes, há

necessidade não só de estabelecer as partes das plantas que devem ser amostradas, mas

também, a melhor época. Devido a essas variações, a amostragem deve ser feita de acordo

com as recomendações indicadas, para o sucesso da diagnose foliar.

Estudos realizados por MALAVOLTA et al. (1997) indicam diferentes

metodologias para amostragem de diferentes espécies vegetais. Em seu trabalho, ele

predefiniu a parte da planta a ser amostrada, bem como a idade, época, posição e número de

folhas e plantas a serem amostradas para cada cultura vegetal.

2.3- Preparação das amostras para análise química

O sucesso da análise química de tecido vegetal em laboratório depende, em grande

parte, do procedimento de coleta do material e do tempo decorrido entre a coleta e a chegada

deste no laboratório de análise. Recomenda-se que esse tempo seja o mais breve para que os

processos de respiração e de decomposição do vegetal não venham comprometer os

resultados da análise. O ideal seria que a amostra chegasse ao laboratório no mesmo dia da

coleta, acondicionada em saco plástico para transporte a baixa temperatura ou em sacos de

papel. Ao chegar no laboratório, as amostras devem ser registradas e identificadas.

O preparo de amostras de tecido vegetal para análise química consiste em quatro

operações unitárias: lavagem, secagem, moagem e peneiramento. Em resumo, a lavagem

consiste na eliminação de qualquer contaminante do tecido vegetal, seja solo, pesticida ou

6

adubos foliares; a secagem consiste na eliminação ou redução significativa da água livre

(umidade) e estabilização enzimática da amostra e a moagem é a redução da granulometria do

tecido vegetal seco para facilitar a extração dos minerais presentes neste tecido e o

peneiramento é uma homogeneização da dimensão do material moído.

Inicialmente, deve-se fazer a descontaminação do tecido vegetal através da lavagem,

eliminando folhas ou outros componentes vegetais que estejam secos, murchos ou

deteriorados. Deve-se lavar com solução de detergente antes de seguir para a lavagem

convencional tecidos contendo resíduos de pesticias ou adubos. É importante ressaltar que as

lavagens devem ser feitas rapidamente, pois existe a possibilidade de perdas por solubilização

de nitrato, boro, potássio e cloreto. (SILVA, 1999).

Após a lavagem, deve-se realizar a secagem em que a umidade da amostra deverá ser

removida por volatilização, causada por secagem ao calor ou a frio. Em casos de secagem em

estufas, deve-se haver um sistema de circulação forçada de ar, com temperatura variando de

65-70º C, até peso constante (aproximadamente 72h). A percentagem da amostra que sobra

após a remoção desta umidade é conhecida como percentagem de matéria seca ou matéria

parcialmente seca. O objetivo deste procedimento é obter matéria seca do material coletado.

O próximo passo é a moagem da amostra seca que é feita, geralmente, em moinhos

de facas de aço inoxidável, tipo Willey, passando em peneira de 1 mm de malha (20 mesh)

para que os grânulos tenham tamanhos mais homogêneos possíveis. É importante ressaltar a

importância da limpeza do moinho entre uma amostra e outra que evita a contaminação das

amostras. As amostras moídas devem ser preferencialmente armazenas em frasco com tampa

rosquiável, a fim de evitar a umidificação. Além disto a amostra pode ser armazenada por

longo período de tempo se mantida a baixa temperatura, protegida da luz e de umidade.

(FAQUIN, 2002)

2.4- Destruição da matéria orgânica

Poucas amostras podem ser analisadas sem a necessidade de alterações físicas ou

químicas. Na maioria dos instrumentos empregados em análises químicas, é preciso que o

analito esteja dissolvido em água ou em algum solvente. Para isso existem os métodos onde

ocorre a destruição da matéria orgânica por via úmida: digestão úmida em bloco digestor e

digestão úmida em forno microondas; outro método de obtenção do analito dissolvido é o

método extrativo através da solubilização em HCl 1mol.L-1, em que não ocorre destruição da

matéria orgânica, apenas solubilização dos elementos em ácidos com o auxílio de calor e

agitação.

7

Além destes métodos, existe a destruição da matéria orgânica através da digestão

seca em que o material vegetal é submetido a uma mufla a temperatura de 500 a 550°C por 4

a 8 horas. Nesse processo a matéria orgânica é destruída (oxidada) pela ação do calor. As

cinzas restantes são solubilizadas em ácidos diluídos. (KARLA, 1998)

Nos métodos estudados neste trabalho: Método Kjelhdal e método

espectrofotométrico baseado na reação de Berthelot, ambos para determinação de nitrogênio

em amostras de tecido vegetal, a digestão das amostras são realizadas via úmida.

2.4.1- Digestão Úmida

A característica básica da digestão úmida é a decomposição das plantas (matéria

orgânica) em ácidos ou misturas de ácidos, com ou sem água oxigenada. Para isso utiliza-se

blocos digestores para que possa ocorrer a digestão a quente.

Os ácidos clorídrico, nítrico, perclórico e sulfúrico são utilizados individualmente ou

em conjunto. A escolha de qual ou quais ácidos utilizar irá depender de características da

amostra e do que se quer analisar. De uma maneira genérica, não se pode utilizar ácido

clorídrico na determinação de Cloreto (Cl-), porque esse ânion constitui o ácido; não se utiliza

ácido nítrico em determinação de nitrogênio. O ácido sulfúrico é recomendado quando se tem

amostras com alto teor de cinzas, pois ele diminui o efeito de respingos.

A mistura nitro-perclórica, ácido nítrico e ácido perclórico, é a mais utilizada. É

recomendada para um grande número de amostras, tais como: folhas, sementes, raízes, caules

e cascas.

Na quantificação de nitrogênio em amostras de tecido vegetal, utiliza-se a digestão

úmida com ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio com o auxílio de um catalisador. Os

catalisadores mais utilizados para acelerar o processo de decomposição da matéria orgânica

são o sulfato de cobre, óxido de mercúrio, óxido de cobre, selênio, dentre outros.

A maior limitação da digestão úmida é o desprendimento de vapores e gases tóxicos

dentro do laboratório e salas vizinhas. Geralmente, o sistema de exaustão das capelas não são

suficientemente eficientes para evitar que os vapores e gases difundam no interior das salas. É

comum, mesmo quando os vapores e gases são eliminados para o exterior através de um

eficiente sistema de exaustão, os gases e vapores retornarem ao laboratório e salas próximas

principalmente nos dias de umidade relativa baixa. (MORAES; RABELO, 1986)

8

2.5- Método Kjeldahl para determinação de Nitrogênio

2.5.1- Fundamentos da titulação

A determinação da concentração de um ácido ou de uma base através da destilação é

uma das aplicações mais importantes de uma reação ácido-base. Este procedimento é

conhecido como titulação ácido base.

Segundo a INFOPÉDIA (2012), no procedimento citado, adiciona-se uma solução de

concentração rigorosa – o titulante, que se encontra numa bureta a uma solução contida num

balão Erlenmeyer de concentração desconhecida – o titulado. A reação processa-se enquanto

houver excesso de ácido ou base, ou seja, até que sejam adicionadas quantidades equivalentes

das duas soluções. Atinge-se nessa altura o ponto de equivalência. Do ponto de vista prático, a

deteção do ponto de equivalência pode ser feita usando um indicador ácido-base apropriado,

que, mudando de cor para um valor de pH, o mais próximo possível do ponto de equivalência,

assinala o fim da titulação. No entanto, existem outros processos de detecção como o uso de

um medidor de pH (método potenciométrico) ou a medição da condutividade elétrica do

titulado (método condutimétrico).

As titulações de ácido-base baseiam-se no pH do titulado que varia ao longo da

titulação, à medida que se adiciona o titulante. Essa propriedade, torna de grande importância,

conhecer o tipo de variação do valor do pH no decurso da reação.

Podem considerar-se quatro tipos de titulações: ácido forte/base forte; ácido

fraco/base forte; ácido forte/base fraca e ácidofraco/base fraca. Numa titulação de um ácido

forte com uma base forte, pode concluir-se que no ponto de equivalência, a 25 ºC, a solução é

neutra, pelo que o pH da solução é 7. Numa titulação de um ácido fraco com uma base forte,

pode concluir-se que no ponto de equivalência, a 25 ºC, dada a formação do íon OH-, o pH do

titulado é superior.

Numa titulação de um ácido forte com uma base fraca pode concluir-se que no ponto

de equivalência, a 25 ºC, dada a formação do íon H3O+, o pH do titulado é inferior a 7.

Finalmente, numa titulação de um ácido fraco com uma base fraca o valor do pH poderá estar

situado na zona ácida, básica ou neutra, dependendo da força relativa de cada espécie

envolvida.

9

2.5.2- O método Kjeldahl

O método Kjeldahl, proposto por Johan Gustav Kjeldahl é um processo oxidativo via

digestão úmida em que a amostra é aquecida com ácido sulfúrico até temperaturas elevadas

por algumas horas. Para aumentar a temperatura de ebulição do ácido são utilizados sais como

sulfato de potássio-K2SO4 ou sulfato de sódio-Na2SO4. Além disso, selênio, cobre ou chumbo

são utilizados como catalisadores promovendo maior velocidade de oxidação da matéria

orgânica (BREMMER, 1982).

A utilização de sais, como o sulfato de sódio ou de potássio, tem como finalidade, a

eliminação de umidade da amostra, para permitir o ataque dos reagentes, esses sais também

diminuem a pressão de vapor da amostra que está sendo digerida, diminuindo assim sua

temperatura de ebulição, já que para um processo eficiente a digestão acorre a altas

temperaturas chegando a até 500ºC e o ácido sulfúrico utilizado que tem ponto de ebulição

300ºC não pode ser totalmente vaporizado.

Neste processo, carbono e hidrogênio são oxidados e o nitrogênio reduz-se à sulfato

de amônio. Este, por sua vez, é convertido à amônia na presença de uma base concentrada

(NaOH) segundo as reações seguintes.

�NH��SO� + 2NaOH∆→ 2NH�OH +Na�SO�

(1) NH�OH

∆→NH� + H�O (2)

Em seguida, a amônia desprendida na reação junto a um indicador é coletada em um

recipiente contendo ácido bórico em um processo de destilação. A medida que vai se

formando borato de amônio, segundo a reação a seguir, a solução passa de uma coloração

rósea para azulada.

H�BO� + NH� →NH� H�BO� (3)

Por fim, o borato de amônio é titulado com ácido clorídrico (HCl) de título

conhecido até o ponto de viragem do indicador, segundo a reação que se segue (GALVANI,

2008).

10

NH� H�BO� + HCl →H�BO� + NH�Cl

(4)

Deste modo, através de uma titulação volumétrica ácido-base é possível conhecer o

teor de nitrogênio inicial presente na amostra.

2.6- Método espectrofotométrico para determinação de Nitrogênio

2.6.1- Fundamentos da espectrofotometria

A espectrofotometria é definida como toda técnica analítica que usa a luz para medir

as concentrações das soluções, através da interação da luz com a matéria. Os métodos

espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ou emissão de radiação eletromagnética por

muitas moléculas, quando os seus elétrons se movimentam entre níveis energéticos,

permitindo comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma

quantidade desconhecida de soluto, com uma quantidade conhecida da mesma substância.

(JONES; ATKINS, 2006)

Esta técnica baseia-se, portanto, na absorção da radiação nos comprimentos de onda

que corresponde a uma gama de comprimentos de onda que vai desde o ultravioleta ao

infravermelho no espectro da radiação eletromagnética. O espectro visível está contido

essencialmente na zona entre 400 e 800 nm. A espectrofotometria visível e ultravioleta são

um dos métodos analíticos mais usados nas determinações analíticas em diversas áreas e são

aplicadas para determinações de compostos orgânicos e inorgânicos, como, por exemplo, na

identificação do princípio ativo de fármacos.

A espectroscopia de absorção molecular é valiosa para a identificação dos grupos

funcionais na molécula. Mais importante, entretanto, são as aplicações da espectroscopia de

absorção visível/ ultravioleta para a determinação quantitativa de compostos contendo grupos

absorventes.

O espectrofotômetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática

através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução.

Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda

(tal como acontece no arco íris com a separação das cores da luz branca). Pode-se assim fazer

passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de um único comprimento de

onda, ou quase) permitindo-nos saber que quantidade de luz é absorvida a cada comprimento

de onda. (HARRIS, 1999)

11

Diferentes substâncias têm diferentes padrões de absorção, a espectrofotometria

permite-nos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu espectro. Permite também

quantificá-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está relacionada com a

concentração da substância.

2.6.2- Lei de Lambert-Beer na espectrofotometria

A absorção da luz depende de dois princípios,o primeiro é que a absorção será tanto

maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada, e o segundo princípio

baseia-se no fato de que a absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância

percorrida pelo feixe luminoso através das amostras. Para que seja possível relacionar a

quantidade de luz absorvida por uma amostra com a concentração do analito investigado, é

preciso correlacionar estas grandezas. Isto é possível pela lei de Beer- Lambert, que dá a

relação entre a intensidade da luz incidindo na solução (io), e a intensidade da luz saindo da

solução (i).

Log (io/ i) =A=ε.c.l

(5)

A razão entre a intensidade de luz que incide na solução com a intensidade de luz

que sai da solução é determinada de transmitância.

T= i/io

(6)

Assim, a transmitância se encontra entre 0 (0%) e 1 (100%). A absorbância A é,

portanto, definida como o logaritmo do inverso da transmitância. Quando nenhuma luz é

absorvida i = io, então, T = 1 e A = 0. A absorbância é muito importante, pois tem, segundo

Lambert-Beer, relação linear com a concentração da espécie absorvedora da radiação.

(HARRIS, 1999)

Embora largamente aplicável, a Lei de Lambert-Beer tem suas limitações que devem

ser observadas pelo analista. Essa lei só é válida para radiação monocromática passando

através de uma solução diluída (<0,01 mol.L-1), já que em soluções muito concentradas, as

moléculas de soluto influenciam uma às outras devido suas proximidades, gerando desvios na

absortividade. Além disso, a Lei de Lambert-Beer só pode ser utilizada onde a espécie

12

absorvente não está participando de um equilíbrio que seja dependente da concentração.

(HARRIS, 1999)

2.6.3- Instrumentação analítica na espectrofotometria

Quando a região espectral usada é a ultravioleta/visível, são necessários componentes

óticos de quartzo e detectores altamente sensíveis capazes de detectar radiações nessa extensa

faixa espectral em que atua o instrumento. Os espectrofotômetros, em geral, contêm cinco

componentes principais: fontes de radiação, monocromador, recipientes para conter as

soluções, detectores e indicadores de sinal. A Figura 1 mostra o esquema dos componentes

principais de um espectrofotômetro.

2.6.3.1- Fontes de Radiação

As fontes de radiação mais comuns baseiam-se na incandescência e são muito práticas

no infravermelho e no visível, mas devem atuar em temperaturas elevadas na faixa do

ultravioleta. As fontes de radiação são constituídas por filamentos de materiais que são

excitados por descargas elétricas com elevada voltagem ou aquecimento elétrico e estas

devem gerar radiação continua, ou seja, emitir todos os comprimentos de onda, dentro da

região espectral utilizada. Além disso, as fontes de radiação devem ter intensidade de potência

radiante suficiente para permitir a sua detecção pelo sistema detector da máquina, bem como

devem ser estáveis, isto é, a potência radiante deve ser constante com vida longa e baixo

custo. Existem diferentes tipos de fontes de radiação (SILVERSTEIN et al.,1979) e

(VINADÉ, 2005):

Fontes de radiação Monocromador Compartimento Amostra/padrão

Sistema detector Dispositivo de processamentos de dados

Figura 1 - Principais componentes de um espetrofotômetro

13

Lâmpada de filamento de tungstênio: incandescente, produz emissão continua na

faixa e 320 a 2500nm. O invólucro de vidro absorve toda radiação abaixo de 320nm,

limitando o uso da lâmpada para o visível e infravermelho.

Lâmpada de quartzo-iodo: incandescente, o invólucro de quartzo emite radiação de

200 a 3000nm. Sua vantagem é que pode atuar na região do ultravioleta.

Lâmpada de descarga de hidrogênio ou de deutério: é a mais usada para emissão de

radiação ultravioleta. Consiste em um par de eletrodos fechados em um tubo de quartzo ou

vidro, com janela de quartzo, preenchido com gás hidrogênio ou deutério. Aplicando alta

voltagem, produz-se uma descarga de elétrons que excitam outros elétrons gasosos a altos

níveis energéticos. Quando os elétrons voltam a seus estados fundamentais, emitem radiação

contínua de 180 a 370nm.

Lâmpada de catodo oco: tipo especial de fonte de linha. É preenchida com um gás

nobre, a fim de manter uma descarga de arco. O cátodo tem a forma de um cilindro oco,

fechado em uma extremidade, revestido com o metal cujas linhas espectrais se desejam obter.

O ânodo é um fio reto ao lado do cátodo. A energia do arco causa ejeção dos átomos

metálicos do revestimento do cátodo os quais, excitados, emitem os seus espectros

característicos.

Laser: pelo processo de emissão estimulada, os lasers produzem uma enxurrada de

feixes muito estreitos e intensos de radiação. Todas as ondas procedentes ao material emissor

estão em fase entre si, e, por isso, praticamente não apresenta dispersão quando se propaga.

2.6.3.2- Monocromadores

Os monocromadores são dispositivos essenciais dos espectrofotômetros e tem como

função a seleção do comprimento de onda de interesse para a análise. Este é constituído de

uma fenda de entrada de um elemento de dispersão de radiação e de uma fenda de saída. O

elemento de dispersão pode ser um prisma ou uma rede de difração (SILVERSTEIN et

al.,1979) e (VINADÉ, 2005).

Monocromador prismático: a radiação policromática procedente da fonte de radiação

passa pela fenda de entrada e incide sobre a face de um prisma, sofrendo desvio. Os prismas

de quartzo são indicados para trabalhar na região ultravioleta, embora tenham mais dispersão

que o vidro. Na região do visível são empregados primas de vidro. Os prismas de quartzo

apresentam desvantagem de serem altamente refringentes e oticamente ativos. A Figura 2

mostra a ação de um monocromador prismático.

14

Figura 2- Monocromador prismático

Monocromador reticular: o principal elemento de dispersão dos monocromadores

reticulares é a rede de difração, que consiste em uma placa transparente com inúmeras

ranhuras paralelas e de mesma distância. As redes de difração dispersam a radiação

policromática baseadas no fenômeno da interferência, e a dispersão resultante desta rede é

linear. As redes de difração possuem resolução melhor que os prismas e podem ser utilizadas

em todas as regiões espectrais.

2.6.3.3- Cubetas

São usados como recipientes das amostras a serem analisadas, cubas ou cubetas

retangulares de vidro ou quartzo. As cubetas de vidro são usadas quando se trabalha na região

do visível. Para a região do ultravioleta, devem-se usar as cubetas de quartzo, que são

transparentes à radiação ultravioleta, pois o vidro absorve a mesma (SILVERSTEIN et

al.,1979) e (VINADÉ, 2005).

Para simplificar os cálculos da expressão da Lei de Beer, costuma-se utilizar cubetas

de 1 cm. As cubetas, no entanto, podem ter dimensões diferentes, e esse dado deve ser

considerado no cálculo.

Para aplicações industriais, como, por exemplo, no controle de qualidade de lotes de

produção, utiliza-se um sistema automatizado em que as amostras circulam em série em

cubetas adequadas. Esse sistema é chamado de análise por injeção de fluxo ou FIA (do inglês

Flow Injection Analysis).

2.6.4- O método espectrofotométrico baseado na reação de Berthelot

O método espectrofotométrico para determinação de nitrogênio total baseia-se na

reação de Berthelot (BERTHELOT, 1859). Os reagentes utilizados na reação de Berthelot ou

15

em alguma versão modificada são um composto fenólico, um catalisador e um agente

oxidante, sendo que a reação deve ocorrer em pH alto, aproximadamente 12. (FEREIRA,

2007)

Nessa reação, ocorre a produção do azul de indofenol a partir da reação de fenol com

amônia e hipoclorito em meio alcalino (PATTON, 1977) e (BOLLTER, 1961). O mecanismo

da reação de Berthelot é mostrado a seguir (HARFMANN; CROUCH, 1989).

(7)

(8)

(9)

Na reação 7 a amônia reage com o hipoclorito, formando a monoclorimina. Na

reação 8, a monoclorimina reage com um fenol formando a benzoquinaclorimina e na reação

9, a benzoquinaclorimina reage com outra molécula de fenol formando assim o azul de

indofenol. (SEARLE, 1984).

O azul de indofenol confere uma coloração azulada à amostra a ser analisada e assim,

é possível através de um espectrofotômetro, determinar de forma indireta a quantidade de

nitrogênio total presente na amostra. No entanto, o fenol é uma substância tóxica e altamente

volátil, o que fez com que a utilização do mesmo neste método fosse suspendida. Além disso,

nesta reação há a formação de um intermediário de odor muito forte. Tal intermediário foi

estudado por VERDOUW et al (1978) através de espectroscopia por infravermelho e

determinou-se a presença de orto-clorofenol no mesmo. Este composto tem a capacidade de

penetrar na pele humana, sendo cerca de três vezes mais tóxico que o fenol. (BOWER;

HOLM-HANSEN, 1980)

Um substituto ao fenol nesta reação é o salicilato que também faz a determinação

colorimétrica do nitrogênio amoniacal sem, contudo, promover a formação de orto-clorofenol.

Apesar da não utilização do fenol nesta metodologia, o termo “azul de indofenol” prevalece

na literatura. O mecanismo da reação de Berthelot modificada, utilizando salicilato, é

mostrado a seguir (DEEPA et al., 2003)

16

(10)

(11)

(12)

A substância mais utilizada como catalisadora dessa reação é o nitroprussiato de

sódio Na2[Fe(CN)5NO].2H2O (DEEPA et al., 2003) que promove um aumento da velocidade

de formação do composto colorido, aumentando o sinal espectrofotométrico. Entre as fontes

de oxidantes mais empregadas pode-se citar o hipoclorito (DEEPA et al., 2003) e o

hipobromito (GLEBKO et al., 1967). Uma solução realizada com hipobromito apresenta

estabilidade de até 4 semanas se mantida entre 4ºC e 5ºC e em geral é utilizada quando o

composto fenólico utilizado é o timol. (SEARLE, 1984).

Após a reação se completar, é possível determinar a quantidade de nitrogênio

presente na amostra utilizando um espectrofotômetro.

2.7- Validação de um método analítico

Para o desenvolvimento de um novo método analítico, adaptação ou implementação

de método conhecido, deve-se fazer uma avaliação que estime a eficiência do método na

rotina do laboratório. A este processo, costuma-se dar o nome de validação. O objetivo da

validação consiste em demonstrar que o método analítico é adequado para o seu propósito.

(WALSH, 1999). Alguns parâmetros envolvidos na validação de uma metodologia analítica

são: Especificidade/Seletividade, Faixa de Trabalho, Linearidade, Sensibilidade, Exatidão,

Precisão, Limite de Detecção (LD), Limite de Quantificação (LQ) e Robustez.

17

2.7.1- Especificidade/Seletividade

É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto específico

independente da matriz da amostra e de suas impurezas. Para análise qualitativa (teste de

identificação) é necessário demonstrar a capacidade de seleção do método entre compostos

com estruturas relacionadas que podem estar presentes. Isto deve ser confirmado pela

obtenção de resultados positivos em amostras contendo o analito, comparativamente com

resultados negativos obtidos com amostras que não contém o analito, contendo estruturas

semelhantes. A especificidade e a seletividade estão relacionadas ao evento da detecção. A

especificidade refere-se a um método específico para um único analito e a seletividade refere-

se a um método utilizado para vários analitos com capacidade de distinção entre eles (SILVA;

ALVES, 2006).

Os testes de especificidade objetivam determinar os componentes que precisam ser

analisados na amostra, para isso, é necessário definir a matriz, assim como os possíveis

interferentes. A especificidade pode ser determinada pela comparação dos resultados obtidos

de amostras contaminadas com quantidades conhecidas de impurezas com amostras não

contaminadas. Dessa forma é possível demonstrar que o resultado do teste não é afetado por

esses materiais contaminantes.

2.7.2- Faixa de trabalho

Em qualquer método quantitativo, existe uma faixa de concentrações do analito no

qual o método pode ser aplicado. Os primeiros valores da faixa podem ser dos valores dos

limites de detecção e de quantificação, que serão discutidos nos próximos tópicos, e os

últimos dependem do sistema de resposta do equipamento de medição (SILVA; ALVES,

2006).

A faixa linear é definida como a faixa de concentrações na qual a sensibilidade pode

ser considerada constante e são normalmente expressas nas mesmas unidades do resultado

obtido pelo método analítico. Para escolher a faixa de trabalho deve-se proceder da seguinte

maneira: quando se tem uma amostra específica, a concentração esperada deve se situar no

meio da faixa de trabalho e quando a concentração do analito é desconhecida utiliza-se a faixa

de trabalho estudada para amostras diversificadas. Os valores medidos têm que estar dentro da

faixa de trabalho. No caso de concentração do analito muito pequena, os valores medidos

devem estar próximos ao limite inferior da faixa de trabalho, sendo, porém, diferente dos

brancos dos métodos.

18

Geralmente, os analistas selecionam o intervalo de trabalho (baseado no nível de

concentração do analito que desejam estudar) e depois determinam se a relação sinal versus

concentração é linear.

2.7.3- Linearidade

Segundo a International Conference on Harmonisation (ICH) a linearidade refere-se

à capacidade do método de gerar resultados linearmente proporcionais à concentração do

analito, enquadrados em faixa analítica especificada.

A linearidade é obtida por padronização interna ou externa e formulada como

expressão matemática (equação da regressão linear) usada para o cálculo da concentração do

analito a ser determinado na amostra real. O coeficiente de correlação linear (r) é

freqüentemente usado para indicar a adequabilidade da curva como modelo matemático. Um

valor maior que 0,90 é, usualmente, requerido. O método pode ser considerado como livre de

tendências (unbiased) se o corredor de confiança da reta de regressão linear contiver a origem.

(SILVA; ALVES, 2006)

2.7.4- Sensibilidade

A sensibilidade é a capacidade do método em distinguir, com determinado nível de

confiança, duas concentrações próximas (AMARANTE et al., 2001). Este parâmetro pode ser

expresso pela inclinação da curva de regressão linear de calibração.

Em métodos sensíveis, uma pequena diferença na concentração do analito causa

grande variação no valor do sinal analítico medido. Esse critério expressa a capacidade do

procedimento analítico gerar variação no valor da propriedade monitorada ou medida,

causada por pequeno incremento na concentração ou quantidade do analito.

2.7.5- Exatidão

Exatidão é o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados e um

valor de referência aceito como verdadeiro (MENDHAM, 2002).

A RESOLUÇÃO Nº899 de 29 de maio de 2003 define que a exatidão é calculada

como porcentagem de recuperação da quantidade conhecida do analito adicionado à amostra,

ou como a diferença porcentual entre as médias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos

intervalos de confiança. Ainda de acordo com esta resolução, a exatidão é expressa pela

19

relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica

correspondente.

Exatidão = �� çã�!é"# �$%��#!�� &�� çã��ó�#� *100 (13)

2.7.6- Precisão

A RESOLUÇÃO Nº899 (2003) define a precisão como a avaliação da proximidade

dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma

amostra. Esta é considerada em três níveis: repetibilidade (precisão intra-corrida) que é a

concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista

e mesma instrumentação; precisão intermediária (precisão inter-corridas) que é a

concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com

analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes e a reprodutibilidade (precisão inter-

laboratorial) que é a concordância entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes como

em estudos colaborativos, geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica

A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de

variação (CV%), segundo a Equação 14.

DPR�CV%� = ,�-.#�/ "�ã�� çã�!é"# "��!#� " *100 (14)

20

2.7.7- Teste de decomposição dos reagentes

O teste de decomposição dos reagentes é importante para a operacionalidade do

método em questão. Neste caso, este teste está relacionado com a verificação da necessidade

de se preparar os reagentes utilizados nas análises no mesmo dia da realização das mesmas.

Para uma melhor operacionalidade, o ideal é que os reagentes possam ser preparados

em um dia e serem utilizados em todas as análises da semana. Para tanto, isto só poderá ser

feito caso os reagentes não se decomponham ao longo de um curto intervalo de tempo.

2.7.8- Teste de estabilidade da coloração

Apesar deste teste não estar comumente apresentado em livros de validação

metodológica, nesta validação espectrofotométrica este é de suma importância para que se

possa determinar por quanto tempo a solução de coloração verde é estável sem se decompor.

2.7.9- Limite de Detecção (LD)

A RESOLUÇÃO Nº899 (2003) define limite de detecção como sendo a menor

quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porém não

necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas.

Este parâmetro é estabelecido por meio da análise de soluções de concentrações

conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível detectável.

Segundo a resolução, no caso de métodos não instrumentais (CCD, titulação,

comparação de cor), esta determinação pode ser feita visualmente, onde o limite de detecção é

o menor valor de concentração capaz de produzir o efeito esperado (mudança de cor,

turvação, etc). No caso de métodos instrumentais (CLAE, CG, absorção atômica), a

estimativa do limite de detecção pode ser feita com base na relação de 3 vezes o ruído da

linha de base. Podendo ser determinado pela equação 15.

LD = ,/ 1 *3 (15)

Em que DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de, no mínimo, 3

curvas de calibração construídas contendo concentrações do fármaco próximas ao suposto

21

limite de quantificação. Este desvio padrão pode ainda ser obtido a partir da curva de

calibração proveniente da análise de um número apropriado de amostras do branco; S é a

sensibilidade do método.

No caso dos processos estatísticos, utiliza-se o "teste de hipótese" para estimar o LD

com valores obtidos de várias medidas do branco, conforme a Equação 16.

LD = 2 ∗ DP3 ∗ t45%S

(16)

Em que t 95% é o valor tabelado em função do número de análises; DPb é o desvio-

padrão do branco. Quando se obtém poucos valores de medidas do branco ou quando tais

valores se apresentam como linha de base, esse tipo de estimativa pode não ser adequado.

2.7.10- Limite de quantificação (LQ)

A RESOLUÇÃO Nº899 (2003) define limite de quantificação como sendo a menor

quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão

aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.

O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise de soluções contendo

concentrações decrescentes do analito até o menor nível determinável com precisão e exatidão

aceitáveis. Pode ser expresso pela equação 17.

LQ = ,/31 *10 (17)

2.8- Estatística

2.8.1- Importância da estatística

Ao propormos ou validarmos uma metodologia em nível de laboratório, infelizmente,

não existe nenhum método amplamente aplicável para a determinação da confiabilidade de

um dado com absoluta certeza. O uso da estatística na análise dos dados experimentais é de

suma importância para que um resultado analítico possua uma confiabilidade aceitável.

A confiabilidade necessária de um resultado justifica o esforço extra requerido para

que análises em replicatas sejam realizadas, uma vez que os resultados individuais de um

conjunto de medidas raramente são iguais.

22

KEITH et al. (1983) fazem relevante observação sobre a estatística na tomada de

decisões:

“Químicos analíticos sempre devem enfatizar ao público que a característica mais

importante de qualquer resultado obtido de uma ou mais medidas analíticas é uma afirmação

adequada de seus intervalos de incerteza. Advogados geralmente tentam prescindir de

incertezas e tentam obter sentenças inequívocas; portanto, um intervalo de certeza deve ficar

claramente definido no caso que envolvem questões judiciais e/ou processos de execução. Por

outro lado, um valor de 1,001 sem uma incerteza especificada, por exemplo, pode ser visto

como excedendo um nível tolerável de 1.”

2.8.2- Testes estatísticos

Para que se possa estabelecer uma comparação entre dois conjuntos de dados é

necessário fazer uma comparação de médias e variância já que o pesquisador precisa de um

método que forneça a diferença mínima significante entre duas médias.

Toda vez que o valor absoluto da diferença entre duas médias é igual ou maior do

que a diferença mínima significante, as médias são consideradas estatisticamente diferentes,

ao nível de significância estabelecida (VIEIRA et al., 1989).

Segundo VIEIRA et al. (1989), a comparação de médias só pode ser feita após a

análise de variância. Isto porque todos os procedimentos para obter o desvio de médias

exigem o cálculo do quadrado médio do resíduo.

Segundo FONSECA et al. (1982) o método de análise de variância indica a aceitação

ou rejeição da hipótese de igualdade das médias. Se a hipótese de nulidade (Ho) for rejeitada,

estaremos admitindo que, pelo menos, uma das médias é diferente das demais.

2.8.2.1- Teste de Hipóteses

Os testes de hipóteses constituem procedimentos estatísticos cujo maior objetivo é

tomar decisões baseadas nas evidências fornecidas pelos dados amostrais ou populacionais.

Supondo que seja levantada uma hipótese sobre o valor do parâmetro, essa hipótese será

considerada até que prove o contrário Deste modo, o teste de hipótese é o procedimento que

nos fará tomar a decisão de rejeitar ou não determinada hipótese. Para formulação levantamos

duas hipóteses:

Hipótese nula (Ho): Sugere que a afirmação que estamos fazendo sobre o parâmetro

23

populacional ou amostral é verdadeira. Ho, portanto sempre inclui o sinal de igualdade.

Hipótese alternativa (Ha): Sugere que a afirmação que estamos fazendo sobre o

parâmetro populacional ou amostral é falsa, isto é, que o valor do parâmetro é diferente,

menor ou maior que o estipulado. Há, portanto, inclui sempre o sentido de variação.

Para tomarmos a decisão em um teste estatístico, isto é, decidirmos se rejeitamos ou

não a hipótese de nulidade precisamos comparar o valor especificado para o parâmetro com

aquele estimado a partir de uma amostra da população.

Do ponto de vista matemático, o valor estimado pode diferir do valor esperado para o

parâmetro. Esta diferença matemática nem sempre representa que a hipótese de nulidade deva

ser rejeitada, pois como o valor estimado é uma variável aleatória, é esperado que ele assuma

valor esperado dentro de um intervalo.

O que um teste de hipóteses faz é comparar o valor especificado para um parâmetro

com a estimativa fornecida pelo estimador. Se a variação entre os dois valores for pequena

diz-se que o valor do parâmetro é realmente o especificado. Logo, a diferença entre o valor

paramétrico e sua estimativa não é significativa e não se rejeita a hipótese de nulidade.

2.8.2.2- Teste F para comparação de variâncias

Suponha que queremos comparar as variâncias σ12 e σ2

2 de duas populações normais

independentes. Para isso, retiramos uma amostra aleatória X1, X2, ..., Xn1 da população 1, com

distribuição N (µ1, σ12), e uma amostra Y1, Y2, ..., Yn2 da população 2, com distribuição N(µ2,

σ22).

Primeiramente, como em qualquer outro teste, precisamos fazer a formulação das

hipóteses, que nesse caso são dadas pelas Equações 18 e 19.

(18)

(19)

Nesta formulação de hipótese, a hipótese nula é que o desvio padrão dos conjuntos

populacionais é estatisticamente igual. A hipótese alternativa, por sua vez, afirma que o

desvio padrão dos conjuntos populacionais é estatisticamente diferente. (GUIMARÃES,

2008).

Quando desejamos comparar variâncias, devemos utilizar a estatística F (ou teste de

Fisher-Snedecor). O Fcalculado ou simplesmente Fc é dada pelo quociente entre as duas

24

estimativas de variâncias ao quadrado. Assim, é preciso utilizar n-1 graus de liberdade para

cada um dos conjuntos de amotras (neste caso utiliza-se o desvio padrão amostral) ou

populações (neste caso utiliza-se o desvio padrão populacional).

(20)

O Fcrítico ou Ftabelado é obtido na tabela da distribuição F apresentada no ANEXO 1,

com n1-1 e n2-1 e com um nível de confiabilidade α fixado. Em que n1 é o número de

elementos da população 1 e n2 é o número de elementos da população 2.

A conclusão do teste pode ser feita comparando o valor de F calculado com os dados

da amostra (Fc) e o valor de F tabelado (Fcrítico), obtido na tabela da ditribuição F. Assim, se

Fc≥ Fcrítico, rejeita-se Ho. Neste caso não podemos dizer, a nível α de confiança que as

variâncias dos dois conjuntos populacionais são estatisticamente iguais. Se, por outro lado,

Fc< Fcrítico podemos inferir a nível α de confiança que as variâncias dos dois conjuntos

populacionais são estatisticamente iguais.

2.8.2.2- Teste T para comparação de médias

Fazer a comparação de médias de dois conjuntos amostrais ou populacionais é de

suma importância em validação de um método analítico, isto porque é através deste que

podemos considerar que dois métodos fornecem valores médios estatisticamente iguais.

Para realizarmos este teste, precisamos primeiramente ter realizado o teste F. Isto

porque o teste de comparação de médias se difere para casos em que foi comprovada

igualdade estatística entre as variâncias dos casos em que não foi comprovada igualdade

estatística entre as variâncias. Consideremos uma das seguintes hipóteses:

Ho: µ1 = µ2

Ha: µ1 < µ2

(21)

Ho: µ1 = µ2

Ha: µ1 > µ2

(22)

Ho: µ1 = µ2

(23)

25

Ha: µ1 ≠ µ2

As duas primeiras hipóteses estabelecem os chamados testes unilaterais, já que a

região de rejeição está somente em uma das caudas da distribuição. A última situação

estabelece o teste bilateral, no qual a região de rejeição se distribui igualmente em ambas as

caudas da distribuição.

Assim, se estivermos interessados em mostrar que um parâmetro é significativamente

superior ou inferior a um determinado valor, teremos que realizar um teste unilateral e

teremos uma única região de rejeição, do tamanho do nível de significância fixado. Mas se, no

entanto, estivermos interessados em mostrar que um determinado parâmetro é diferente de um

determinado valor (sem especificar se inferior ou superior) teremos que realizar um teste

bilateral e a região de rejeição será dividida em duas partes iguais, nas extremidades da curva

do teste, em que cada região de rejeição terá metade do nível de significância. Dessa forma,

para realização do teste, deveremos primeiramente estimar a média e o desvio padrão de cada

uma das amostras envolvidas e calcular a estatística do teste. (GUIMARÃES, 2008)

A Equação 24 é a estimativa do parâmetro t de t de Students e deve ser utilizada

quando o teste F mostrar equivalência estatística entre as variâncias da amostra.

t = μ8 −μ�Sp.< 1n8 + 1n�

(24)

O parâmetro Sp é calculado pela Equação 25:

Sp = �n8 − 1�. s8� + �n� − 1�. s��n8 +n� − 2 (25)

No caso em que o Teste F não ter mostrado equivalência estatística entre as

variâncias, deve-se utilizar a Equação 25.

t = μ8 −μ�@s8�n8 + s��n�

(26)

26

Em que:

µ1 e µ2 são as médias do grupo 1 e 2, respectivamente;

S1 e S2 são os desvios padrões do grupo 1 e 2 respectivamente;

n1 e n2 são os tamanhos de amostra do grupo 1 e 2 respectivamente.

Para o caso de testes bilaterais, rejeita-se Ho se Tcalculado > t (α/2) n1+n2-2,

com nível α de significância. O valor de t (α/2) n1+n2-2 é tabelado conforme a distribuição T

de Student apresentada no ANEXO 1.

2.9- Gerenciamento de Resíduos gerados em Laboratórios

Em laboratórios de análises químicas, os resíduos gerados merecem uma

considerável atenção, já que estes apresentam elevada complexidade, principalmente pela

inconstância e variação do nível de toxidade, bem como das características físico-químicas

dos compostos. Outro aspecto é a complexidade, em nível de estrutura dos compostos, que

torna tal gerenciamento uma atividade difícil. Além disso, os resíduos gerados em unidades

laboratoriais são, muitas vezes, manuseados inadequadamente e tem-se observado que os

resíduos que apresentam maior periculosidade são acondicionados e armazenados no próprio

laboratório, em áreas inseguras, e outros com menor periculosidade são descartados

diretamente na pia (SCHNEIDER, 2007).

Surge então, a necessidade de um gerenciamento capaz de minimizar a geração de

resíduos, além de tratar aqueles que não são passíveis de serem evitados. Além disso, é

necessária também uma racionalização dos reagentes, visando maior economia dos mesmos, o

que garante um melhor aproveitamento do ponto de vista econômico, bem como ambiental,

devido a menor geração de resíduos.

A prevenção da poluição é a forma mais eficaz para preservação ambiental. Se não

for possível reduzir a fonte de geração de resíduo, deve-se promover a reciclagem do mesmo

de forma ambientalmente segura. Se ainda assim, a reciclagem não for possível, então a

poluição deve ser evitada, com modificação na metodologia analítica ou tratamento do

resíduo gerado. O descarte no ambiente deverá ser entendido e praticado como último recurso,

sendo realizado de maneira ambientalmente segura.

A implementação de um programa de gestão de resíduos é algo que exige, antes de

tudo, mudança de atitudes, e por isto, é uma atividade que traz resultados a médio e longo

prazo, além de requerer realimentação contínua. (JARDIM, 1997)

27

3- METODOLOGIA

3.1- Amostragem

Coletou-se amostras da cultura de feijão-vagem (Phaseolus vulgaris) do tipo Rudá,

BRS Esplendor Yoki, além de amostras de Folha de Arroz e Braquiária (Brachiaria

ruziziensi), selecionando-se brotos e folhas verdes. O material foi coletado em quantidade

suficiente para as análises subsequentes.

3.2- Preparação das amostras para análise química

Antes das análises químicas, preparou-se as amostras de mandeira que o primeiro

passo foi a descontaminação do material foliar. Realizou-se uma lavagem com água destilada,

a seguir com detergente neutro, na concentração de 0,1%. Em seguida, o material foi

novamente lavado com água destilada.

Após o processo de lavagem, as amostras foram submetidas à secagem em estufa

com temperatura controlada em 80°C (+/-5°C) por 24 horas.

Depois de seco, o material foi moído em moinho de facas de aço inoxidável (tipo

Willey). No intervalo de moagens entre as amostras de Feijão-Vagem e Braquiária realizou-

se a limpeza do moinho com auxílio de escova plástica e aspirador.

3.3- Lavagem e descontaminação de vidrarias

Durante as análises, todas as vidrarias utilizadas foram lavas e descontaminadas. Na

descontaminação das vidrarias, fez-se a lavagem das mesmas com detergente neutro e em

seguida estes foram enxaguados com água corrente. Após esta etapa, cada vidraria foi

enxaguada três vezes com água deionizada (Mili Q- System Millipore, Bedford, MA) e

descontaminadas em seguida com a imersão das mesmas em solução de ácido nítrico (5%)

por 24 horas. Por fim, as vidrarias foram enxaguadas novamente com água deionizada.

3.4- O método Kjeldahl

3.4.1- Insumos, equipamentos e utensílios

Insumos:

• Mistura catalisadora: sulfato de potássio (K2SO4) e sulfato de cobre penta-

28

hidratado (CuSO4.5H2O);

• Ácido sulfúrico (H2SO4) P.A 98%;

• Solução de NaOH 40%;

• Solução Indicadora de H3BO3 2%;

• Solução Fatorada de H2SO4 0,01 mol/L

Equipamentos e Utensílios:

• Tubos de digestão;

• Frascos conta-gotas;

• Erlenmeyer de 125 mL;

• Proveta graduada de 50 mL;

• Béquer 100 mL.

Instrumentos de medição e equipamentos:

• Balança analítica;


• Bloco digestor para 40 tubos;

• Tubo digestor de 100 mL ou balão Kjeldahl de 100 mL;

• Destilador de Nitrogênio;

• Bureta eletrônica;

• Dispensador para ácido sulfúrico;

• Dispensador para solução indicadora de H3BO3 2%.

29

3.4.2- Digestão úmida para o método Kjeldahl

Pesou-se 40 tubos de ensaio (1 bateria) e com uma caneta de retroprojetor

identificou-se com números sequenciais os tubos de digestão limpos e secos. O número de

cada tubo, bem como o peso dos tubos vazios foram anotados em uma planilha de registro de

dados brutos.

A seguir foram pesados em torno de 0,1000 a 0,1500 g de amostra de cada amostra

em balança analítica e o peso exato foi anotado. Essas amostras foram pesadas em papel

vegetal livre de nitrogênio para que não ficasse nenhuma massa retida na parede do tubo de

ensaio, garantindo a posterior digestão completa de toda a amostra pesada. Cada papel livre

de nitrogênio, contendo uma amostra foi empacotado e adicionado a um tubo, exceto no caso

do branco, em que o papel não continha nenhuma amostra.

Com o auxílio de uma colher dosadora, adicionou-se 1,2 g da mistura de sais

catalisadora. Em seguida, os tubos foram levados para capela e o exaustor foi ligado.

Utilizando-se um dispensador de ácido sulfúrico, adicionou-se 3,5 mL de ácido concentrado

98% PA em cada tubo de digestão.

A seguir, os tubos foram colocados no bloco digestor e a temperatura do mesmo foi

aumentada até 360°C de forma lenta e gradativa.

3.4.3-Destilação

Para destilação das amostras, utilizou-se o Destilador de Nitrogênio Marconi MA-

036 (Figura 3).

Figura 3- Destilador de Nitrogênio Marconi MA-036

30

Neste processo, deslocou-se a mesa suporte do erlenmeyer e introduziu-se pelo bico

do condensador um erlenmeyer contendo 20 mL de solução indicadora de ácido bórico 2%.

Essa solução foi transferida utilizando-se um dispensador de líquidos dedicado à solução de

ácido bórico.

Para que o bico do condensador ficasse submerso na solução de ácido bórico,

evitando a perda de nitrogênio não condensado, regulou-se a altura da mesa através do

parafuso com canopla presente na mesa.

O tubo de digestão com o produto digerido foi acoplado ao bocal apropriado para

que não houvesse vazamento de nitrogênio. No copo de soda do destilador, foi adicionado

12,5 mL de solução de hidróxido de sódio, com o auxílio de uma proveta de 25 mL. Em

seguida, a torneira frontal foi aberta lentamente para a passagem da solução de hidróxido,

iniciando-se assim a destilação.

Foi coletado 50 mL de destilado de cada amostra, que por sua vez foi titulado com

ácido sulfúrico 0,01 mol/L, conforme o item 3.4.4.

3.4.4- Titulação

Utilizando-se uma bureta eletrônica, titulou-se o destilado utilizando a solução

padronizada de ácido sulfúrico 0,01 mol/L. O volume de ácido gasto para viragem foi anotado

para que fosse possível calcular a concentração de nitrogênio total presente na amostra.

3.5- O método espectrofotométrico baseado na reação de Berthelot

3.5.1- Insumos, equipamentos e utensílios

Para as análises de nitrogênio via método espectrofotométrico, utilizou-se em cada

amostra:

• 1g de sulfato de potássio (K2SO4) com pureza do reagente apresentada nas

especificações do rótulo de 99% e quantidade máxima de nitrogênio de 0,0005%;

• 35 mg de selênio metálico ;

• 3 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) P.A 98%

• 2 mL de peróxido de hidrogênio (H2O2) 30%

• 8 mL de R1 + 1,5 mL de R2 (Estes reagentes serão detalhados no item 3.5.2)

31

Para as análises os seguintes instrumentos foram utilizados:

• Tubos de digestão: tubo micro em vidro borossilicato de 100mL (25x250mm);

• Dispensador graduado de 0 a 20 mL;

• Suporte para tubos;

• Espátula (de material polimérico ou aço inox).


• Bloco digestor com capacidade para 40 provas micro. Controle de temperatura

digital; Temperatura: de ambiente +7 até 450ºC; Sensor: tipo J; Precisão: ±2ºC;

Uniformidade: ±5ºC; Potência da resistência: 2200 Watts; Gabinete: em aço

inoxidável 304; Bloco em alumínio fundido com profundidade dos orifícios de

45mm; Segurança: resistência blindada evitando contato com o ácido; Tensão:

220 Volts.

3.5.2- Preparo de soluções

• Reagente 1 (R1)

Em uma balança analítica pesou-se 32,68 g de Salicilato; 56,96 g de Fosfato de

Sódio Dibásico e 1 g de Nitroprussiato. Em um béquer de plástico de 2L foram adicionados

aproximadamente 800 mL de Água Deionizada. Em seguida, adicionou-se o Salicilato e o

Fosfato de Sódio Dibásico pesados anteriormente e agitou-se a mistura até que os mesmos

fossem dissolvidos. Com o auxilio de um pHmetro, ajustou-se o pH para 13,1 com uma

solução de NaOH 40%. Adicionou-se o nitroprussiato e manteve a agitação até que o mesmo

fosse dissolvido. Em seguida a solução foi transferida para um balão volumétrico de 2L e

aferiu-se o volume. A Figura 4 mostra a etapa de agitação no preparo do reagente R1.

32

Figura 4- Preparação do reagente R1

• Reagente 2 (R2)

Diluiu-se 20mL da solução de hipocolrito de sódio 6% em 1000mL de água

deionizada.

33

3.5.3- Digestão úmida para o método espectrofotométrico baseado na reação de

Berthelot

Pesou-se 40 tubos de ensaio (1 bateria) e com uma caneta de retroprojetor

identificou-se com números sequenciais os tubos de digestão limpos e secos. O número de

cada tubo, bem como o peso dos tubos vazios foram anotados em uma planilha de registro de

dados brutos.

A seguir foram pesados em torno de 0,1000 a 0,1500 g de amostra de cada amostra

em balança analítica e o peso exato foi anotado. Essas amostras foram pesadas em papel

vegetal livre de nitrogênio para que não ficasse nenhuma massa retida na parede do tubo de

ensaio, garantindo a posterior digestão completa de toda a amostra pesada. Cada papel livre

de nitrogênio, contendo uma amostra foi empacotado e adicionado a um tubo, exceto no caso

do branco, em que o papel não continha nenhuma amostra. A Figura 5 retrata a pesagem das

amostras.

Figura 5- Pesagem das amostras em papel livre de Nitrogênio

A seguir, adicionou-se, com o auxilio de uma colher dosadora, aproximadamente 1,0

g de sulfato de potássio e 35 mg de Selênio (Figura 6). Os tubos de digestão contendo as

amostras foram levados para a capela e o exaustor foi ligado.

Figura 6- Sais catalisadores da digestão

34

Com auxílio do dispensador adicionou-se a cada tubo de digestão 3,5 mL de ácido

sulfúrico PA, e deixou-os em over night. A seguir, adicionou-se 2,0mL de Peróxido de

Hidrogênio a 30% e com o auxílio do suporte para tubos colocou-se os mesmos no bloco

digestor.

Em seguida, regulou-se a temperatura do bloco digestor para 360º C e os tubos foram

mantidos no bloco por 3h após atingir esta temperatura. (Figura 7)

Figura 7- Digestão das amostras em bloco digestor

Em casos que foram formados materiais carbonizados nas paredes do tubo, a

seguinte metodologia foi realizada: O tubo foi retirado cuidadosamente do bloco digestor,

inclinou-se o tubo e este foi girado para que o ácido entrasse em contato com o material

carbonizado na parede do tubo, direcionando assim todo o material ao fundo do mesmo. Este

procedimento dói feito com muito cuidado para que não fosse derramado nenhum material

durante o procedimento.

Ao término da digestão, retirou-se os tubos do bloco e esperou-se até que os mesmos

estivessem resfriados à temperatura ambiente. A Figura 8 mostra o tubo da esquerda com a

amostra após 1 hora de digestão e o tubo da direita com a amostra no final da digestão.

35

Figura 8- Diferença da amostra na primeira hora da digestão e ao término da digestão.

Após resfriados, foram adicionados a cada tubo 40mL de Água Deionizada e em

seguida, pesou-se os tubos contendo o extrato.

Após a pesagem, os tubos foram agitados por aproximadamente 40 segundos até que o

sólido contido no fundo deste fosse dissolvido.

3.5.4- Diluição intermediária

Pipetou-se do tubo digestor 0,5mL e este foi transferido para um tubo de ensaio. Em

seguida adicionou-se 9,5mL de Água Deionizada e agitou-se. Da diluição intermediaria

retirou-se uma alíquota de 0,5mL e transferiu-a para um tubo micro borosilicato, marca Pirex.

Adicionou-se em seguida 8,0mL do R1 e 1,5 mL do R2, nesta ordem. Os tubos foram

fechados imediatamente. A Figura 9 mostra a etapa de adição dos reagentes utilizando pipetas

automáticas. Na esquerda está representada a adição do Reagente R1 e na direita a adição do

Reagente R2.

Figura 9- Adição dos reagentes R1 e R2.

36

3.5.5- Leitura das amostras

Para a leitura das amostras foi utilizado o espectrofotômetro HACH DR2800 (Figura

10). Ajustou-se o comprimento de onda (λ) para 685nm e o equipamento foi zerado com o

padrao de zero. Em seguida foi anotado a Absorbância de cada leitura.

Figura 10- Espectrofotômetro HACH DR2800

3.6- Validação

3.6.1- Teste de Especificidade

Para o teste de especificidade preparou-se em triplicata duas soluções padrão de 100

ppm contendo possíveis interferentes. A primeira solução foi preparada com 1,19 ppm de

fósforo e a segunda solução contendo 0,06 ppm de manganês. O procedimento para diluição

intermediária, adição dos reagentes e leitura são idênticos aos aplicados para as amostras.

Além das duas soluções contendo quantidades conhecidas dos possíveis interferentes, foi

preparada, também em triplicata, uma solução padrão de 100 ppm sem interferentes. Após a

leitura, verificou-se a possível interferência destes elementos na determinação de nitrogênio

pelo método espectrofotométrico.

3.6.2- Faixa de trabalho/Teste de Linearidade/Teste de Sensibilidade

A faixa de trabalho foi determinada preparando-se padrões em triplicata de 0, 5, 10,

15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 180, 210, 240, 270 e 300 ppm de amônio. Após este preparo

realizou-se o procedimento para diluição intermediária, adição dos reagentes e leitura

idênticos aos aplicados para as amostras. Em seguida, construiu-se a curva da absorbância

37

pela concentração dos padrões, obtendo em seguida o coeficiente de correlação da curva.

Para o teste de linearidade, preparou-se em triplicatas soluções padrão de 25, 50, 75,

100, 125 e 150 ppm de amônio, além de triplicatas de brancos (soluções preparadas sem

adição do analito). Após a leitura, construiu-se uma curva da absorbância pela concentração e

calculou-se os coeficientes angulares e lineares da curva de calibração, bem como o

coeficiente de correlação. O coeficiente angular da curva de calibração é determinado como o

fator de sensibilidade do método (S).

3.6.3- Teste de Exatidão/Teste de Precisão

Para o teste de exatidão, utilizou-se como referência uma amostra certificada pela

IPE- International Plant-Analytical Exchange (IPE sample 903). Esta amostra foi analisada

pelos método de Kjeldahl e pelo método espectrofotométrico. Os valores obtidos foram

comparados e em seguida determinou-se a exatidão de cada método.

Para o teste de precisão fez-se as análises de nitrogênio em quintuplicata pelo método

espectrofotométrico para as amostras de Folha de Arroz, Braquiária, Feijão Rudá, Feijão

Esplendor e Feijão Yoki. Dos resultados obtidos fez-se a média, o desvio padrão e calculou-se

o coeficiente de variação de cada conjunto de quintuplicatas. Após este processo, determinou-

se o coeficiente de variação (CV%) médio do método.

3.6.4- Teste de decomposição dos reagentes

Para realização do teste de decomposição dos reagentes, preparou-se em um dia o

reagente R1 e R2 e em seguida, realizou-se o processo de análise do teor de nitrogênio das

amostras padrão de 0 a 150 ppm. Em uma segunda bateria de análises, preparou -se em um

dia o reagente R2 e na semana seguinte, preparou–se o reagente R1, fazendo em seguida a

leitura das amostras. Por último, realizou-se as mesmas análise com os reagentes R1 e R2

velhos, isto é, preparados ambos na semana anterior.

O resultado destas análises foram plotados em uma curva de absorbância por

concentração do padrão e em seguida analisados.

3.6.5- Teste da estabilidade da coloração

Para realização do teste da estabilidade da coloração verde obtida após a adição dos

reagentes nos extratos diluídos, realizou-se a leitura no espectrofotômetro da absorbância de

uma amostra em intervalos de tempo de 10 em 10 minutos por 4 horas e anotou-se cada

38

leitura em uma planilha de registro de dados brutos. Feito isto, plotou-se uma curva das

absorbâncias medidas por tempo.

3.6.6- Limite de detecção e Limite de quantificação

O limite de detecção e de quantificação foram obtidos calculando o desvio padrão da

absorbância observada a partir da leitura de 10 amostras de branco realizadas em dias

diferentes. Além disso, utilizou-se a sensibilidade do método, calculada no item 3.6.2.

3.6.7- Comparação de Média e Variância

A comparação de médias e variâncias foi feita a partir das análises de nitrogênio em

quintuplicata pelo método de Kjeldahl e pelo método espectrofotométrico para as amostras de

Folha de Arroz, Braquiária, Feijão Rudá, Feijão Esplendor e Feijão Yoki. A partir das análises

foi calculado as médias, variâncias e desvio padrão de cada conjunto de quintuplicas. Em

seguida, aplicou-se o Teste F para comprovar se havia ou não igualdade estatística entre as

variâncias dos dois métodos e aplicou-se o Teste T para comprovar se havia ou não igualdade

estatística entre as médias dos dois métodos.

3.7- Tratamento dos resíduos gerados pelas análises químicas

3.7.1- Tratamento de resíduos contendo cobre

Para reduzir o volume de resíduos de cobre gerados pelas análises, fez-se a

decantação dos íons Cu2+ na forma de hidróxidos insolúveis. Para tanto, esperou-se a

decantação do resíduo básico formado nas análises e em seguida, fez-se a sifonação, retirando

o sobrenadante e descartando-o na pia. O sólido formado foi seco em estufa e encaminhado ao

GERELAB (Gerenciamento de Resíduos Químicos de Laboratório) da EMBRAPA Arroz e

Feijão.

A reação que se segue é a de formação do composto sólido insolúvel hidróxido de

Cobre-Cu(OH)2.

CuSO�� B� + 2NaOH� B� → Cu�OH��-� + Na�SO�� B�

3.7.2 Tratamento de resíduos contendo selênio

A solução ácida de selênio foi tratada com metabissulfito de sódio (Na2S2O5),

39

ocorrendo a precipitação de um sólido vermelho que é uma das formas alotrópicas desse

elemento, tendo uma estrutura semelhante àquela do enxofre amarelo (S8). Abaixo está a

reação de redução com metabissulfito de sódio.

8SeO��E + 8Na�S�O5 → SeF ↓ +8Na�SO� + 8SO��E

Em seguida fez-se a neutralização com hidróxido de sódio (NaOH), e esperou-se até

ocorrer a decantação. Logo em seguida, retirou-se o sobrenadante por sifonação, descartando-

o na pia. O precipitado de coloração vermelha (S8) foi seco e encaminhado ao Gerelab. A

reação de neutralização segue abaixo.

H�SO� + 2NaOH → Na�SO� + 2H�O

4- RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1- Reagentes utilizados nos métodos

O catalisador da reação de Berthelot Modificada, utilizado na determinação de

nitrogênio pelo método espectrofotométrico é o selênio metálico. Este não interfere na

coloração final após a adição dos reagentes colorimétricos. O sulfato de cobre, por sua vez,

tem uma coloração levemente azulada e interfere na coloração obtida após a adição dos

reagentes colorimétricos. Esta interferência é significante na absorbância detectada pelo

espectrofotômetro e poderia levar a erros consideráveis nas análises de nitrogênio.

Ambos catalisadores são considerados tóxicos, sendo assim, o resíduo gerado pelas

análises dos dois métodos foram devidamente tratados.

4.2- Digestão úmida

A digestão úmida é bastante operacional, pois trabalha com tubos de digestão em

estantes, porém existe a desvantagem da necessidade desta exigir um sistema de exaustão.

Durante a digestão úmida ocorre a liberação de vapores ácidos oxidantes já que neste

processo, a matéria orgânica é oxidada e expelida na forma de gases (CO2, NOx e H2O).

Ao final da digestão úmida, a amostra de brachiaria não foi digerida totalmente,

restando material particulado no fundo do tubo. Do ponto de vista analítico, isso acarretaria

menor recuperação de nitrogênio, podendo acarretar em erro negativo nas análises. Contudo,

40

foi observado nas análises realizadas pelo Laboratório de Análises Agroambientais da

Embrapa Arroz e Feijão, que alguns tipos de tecido vegetal não digerem totalmente nem

perdurando o tempo no bloco digestor. Isso ocorre devido a existência de compostos

orgânicos (principalmente a lignina) que são mais resistentes ao ataque ácido e térmico. A

lignina, um polímero não-carboidrato é um dos principais componentes responsáveis pela

queda da digestibilidade dos nutrientes das plantas forrageiras. (FUKUSHIMA et al, 1999)

4.3- Validação do método

4.3.1-Teste de especificidade

A HACH, fabricante do espectrofotômetro presente no laboratório L.A.A, testou

possíveis interferentes na determinação de nitrogênio pelo método espectrofotométrico e

apresentou em seu manual a quantidade máxima testada sem que fosse observado

interferência na leitura. Além disso, está apresentada no Handbook de tecido vegetal (MILLS;

JONES, 1996), a quantidade máxima de diversos nutrientes que pode ser encontrada em

amostras de tecido vegetal, sendo possível conhecer a quantidade máxima destes nutrientes

nos extratos analisados pelo método em questão. O fósforo e manganês foram os únicos

elementos em que a quantidade máxima possível de ser encontrada nos extratos foi superior a

máxima testada pela HACH. Desta forma, foi feito neste trabalho, o teste de especificidade

apenas para os elementos fósforo e manganês e a quantidade máxima destes minerais no

extrato e testados pela HACH são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1- Quantidade máxima de minerais presentes no extrato e quantidade máxima testada

pela HACH.

Quantidade máxima em tecido

vegetal presente no extrato

(ppm)

Máximo testado pela HACH

(ppm)

Fósforo 1,19 0,65

Manganês 0,06 0,05

A escolha pelo padrão de 100 ppm de amônio na elaboração do teste foi feita pelo

fato deste ser um valor médio de nitrogênio observado nos extratos das análises de amostras

de tecido vegetal. A Tabela 2 mostra a absorbância lida das triplicatas sem interferentes; com

1,19 ppm de fósforo e com 0,06 ppm de manganês.

Tabela 2- Absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com possíveis interferentes.

Sem interferentes

P

Mn

Estes valores foram plotados

proximidade das leituras obtidas para o padrão de 100 ppm.

Figura 11- Curva padrão e absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com

Assim, a partir da média dos valores de cada triplicata, a Tabela 3 apresenta

interferência máxima na leitura ca

Tabela

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0

Ab

sorb

ân

cia

1,19 ppm de fósforo e com 0,06 ppm de manganês.

Absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com possíveis interferentes.

Padrões (ppm de amônio) Absorbância100 0,245 100 0,252

100 0,240

Estes valores foram plotados (Figura 11) de forma a ser possível observar a

proximidade das leituras obtidas para o padrão de 100 ppm.

Curva padrão e absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com

possíveis interferentes.

, a partir da média dos valores de cada triplicata, a Tabela 3 apresenta

máxima na leitura causada por interferentes.

Tabela 3- interferência máxima na leitura.

y = 0,002x + 0,001

R² = 0,999

50 100 150

Concentração de amônio (ppm)

Curva Padrão

Padrão de 100 ppm com fósforo

Padrão de 100 ppm com manganês

41

Absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com possíveis interferentes.

Absorbância 0,242 0,240 0,240 0,244

0,245 0,244

de forma a ser possível observar a

Curva padrão e absorbância do padrão de 100 ppm de amônio sem e com

, a partir da média dos valores de cada triplicata, a Tabela 3 apresenta a

200

42

Interferência (%)

Fósforo 1,23

Manganês 0,27

Estes valores de interferência são muito baixos (<5%) e não são considerados

significativos pelos solicitantes das análises feitas pelo Laboratório de Análises

Agroambientais.

4.3.2- Faixa de trabalho, linearidade e sensibilidade

A Figura 12 mostra a faixa de trabalho testada para o método espectrofotométrico de

determinação de Nitrogênio.

Figura 12- Faixa de trabalho testada

Com o coeficiente de correlação de 0,996 é possível inferir que o método em questão

é capaz de fornecer resultados satisfatórios para amostras com concentrações entre 0 e 300

ppm.

A figura 13 mostra o resultado do teste de linearidade e sensibilidade do método.

y = 0,004x + 0,013

R² = 0,996

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 50 100 150 200 250 300 350

Ab

sorb

ân

cia

-6

85

nm

Concentração (ppm)

43

Figura 13- Linearidade e sensibilidade do método

A boa aproximação dos pontos a uma curva linear nos testes de faixa de trabalho,

linearidade e sensibilidade mostra que a menor diferença de concentração do analito gera a

maior diferença na absorbância. Assim, se duas amostras apresentarem uma pequena

diferença na concentração de amônio, a análise irá gerar sinais diferentes suficientemente para

distinguir a concentração das duas amostras. Dessa forma, o método em questão é dito

sensível a concentração de amônio. A sensibilidade em questão é o coeficiente angular da

curva de regressão (S=0,002).

4.3.3- Teste de Exatidão

A tabela 4 mostra as concentrações de nitrogênio obtidas pelos métodos

espectrofotométrico e pelo método Kjeldahl a partir de uma amostra certificada pela

Internacional Plant-Analytical Exchange (IPE sample 903).

Tabela 4- Teor de nitrogênio na amostra certificada obtido pelos métodos avaliados

Método

Espectrofotométrico Método Kjedahl

Valor Certificado

N (g/kg)

44,93 Média 44,63 Média 45,4 - 46,5

47,07

45,60 45,13

44,78 Média Esperada

44,80 44,59 45,95

A partir da média dos valores obtidos em ambos os métodos, determinou-se o erro

y = 0,002x + 0,003

R² = 0,998

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 50 100 150 200

Ab

sorb

ân

cia

-6

85

nm


44

relativo dos métodos em relação ao valor certificado.

Tabela 5- Erro relativo dos métodos em relação ao valor certificado

Método Espectrofotométrico Método Kjedahl

Erro Relativo (%) 0,76 2,54

Assim, é possível verificar que o método espectrofotométrico se mostrou mais exato

que o método Kjeldahl, já que o método espectrofotométrico apresentou um erro relativo em

relação ao valor certificado menor.

4.3.4- Teste de Precisão

A Tabela 6 mostra a média, o desvio padrão e o coeficiente de variação das análises

de nitrogênio obtidas por ambos os métodos.

Tabela 6- Média, desvio padrão e coeficiente de variação das análises obtidas

Amostras Método Espectrofotométrico Método Kjeldahl

Média (g/kg)

Desvio Padrão

CV (%) Média (g/kg)

Desvio Padrão

CV (%)

Folha de arroz

26,46 1,34 5,08 25,66 0,37 1,42

Braquiária 15,36 0,46 3,00 15,09 0,25 1,65

Feijão Rudá

28,45 0,47 1,64 28,89 0,23 0,79

Feijão Esplendor

35,96 1,02 2,84 34,44 0,29 0,84

Feijão Yoki

37,93 1,45 3,83 38,31 0,98 2,56

A tabela 7 mostra o valor médio do coeficiente de variação para cada método.

45

Tabela 7- Coeficiente de variação médio das análises

Teste de Precisão Método Espectrofotométrico Método Kjeldahl

CV médio(%) 3,01 1,42

A partir da análise da Tabela 7 é possível verificar que o método espectrofotométrico

é menos preciso que o método Kjeldahl, isto é, a repetibilidade representada pelo coeficiente

de variação se mostrou mais precisa no método Kjeldahl.

Segundo a Resolução-RE Nº 899, de 29 de maio de 2003, O valor máximo aceitável

para o coeficiente de variação deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a

concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método, não se

admitindo valores superiores a 5%.

Nas análises realizadas no Laboratório de Análises Agroambientais, o teor de

nitrogênio presente nas amostras é baixo, sendo que o valor de CV=3,01% é admitido

aceitável pelos solicitantes das análises.

4.3.5- Teste de Decomposição dos reagentes

O primeiro passo para verificar a possível decomposição dos reagentes R1 e R2, foi

preparar uma curva padrão com os reagentes novos, isto é, preparados no mesmo dia da

realização das análises. A Figura 14 mostra a curva obtida da absorbância pela concentração.

Figura 14- Curva padrão com R1 e R2 novos

O coeficiente de correlação R2=0,996, mostra o bom ajuste linear dos dados obtidos.

y = 0,002x - 9E-05

R² = 0,996

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Ab

sorb

ân

cia

-6

85

nm


46

Para verificar a possibilidade da preparação do reagente R1 alguns dias antes da análise,

preparou-se o reagente R1 em uma semana e apenas na semana posterior realizou análises de

nitrogênio utilizando este reagente. A Figura 15 mostra a curva obtida.

Figura 15- Curva padrão com R1 velho e R2 novo

O coeficiente de correlação R2=0,997 mostra que não há, ao longo de uma semana,

decomposição do reagente R1, sendo que este pode ser preparado dias antes da análise. Este

teste se mostra importante na validação do método já que a preparação do reagente R1 é uma

etapa lenta no processo, sendo assim, o preparo deste reagente em volumes maiores torna o

processo mais operacional ao analista, que não precisa realizar o procedimento a cada dia.

Por fim, foi realizada as análises de nitrogênio utilizando os dois reagentes (R1 e R2)

velhos, isto é, preparados na semana anterior ao processo de análise. A Figura 16 mostra a

curva obtida.

y = 0,002x - 0,000

R² = 0,997

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 50 100 150 200

Ab

sorb

ân

cia

-6

85

nm


47

Figura 16- Curva padrão com R1 e R2 velhos

Pelo coeficiente de correlação R2=0,999, percebe-se que não há decomposição de

ambos os reagentes com o tempo. Assim, é possível preparar os reagentes e armazená-los para

que se possa ser utilizados nas análises subsequentes.

4.3.6- Teste da estabilidade da coloração

A coloração obtida após a adição dos reagentes colorimétricos ao extrato diluído,

provoca uma coloração verde mais intensa quando há alto teor de nitrogênio na amostra e

menos intensa, quando há baixo teor de nitrogênio na amostra, segundo as reações químicas

apresentadas pelas equações 10, 11 e 12. A Figura 17 mostra, da esquerda para a direita, a

intensificação da coloração verde para o padrão de zero ppm (branco) ao padrão de 150 ppm.

Figura 17- Coloração dos padrões

y = 0,003x + 0,000

R² = 0,999

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Ab

sorb

ân

cia

-6

85

nm


Para verificar a estabilidade da coloração

absorbância de cada padrão pelo tempo. A Figura 18 mostra tal evolução.

Figura 18

A Série azul mostra os valores médios da absorbância dos padrões com o passar do

tempo. As séries vermelha e verde mostram respectivamente, os valores mínimos e máximos

de absorbância obtidos nas leituras dos padrões em cada tempo medido.

A partir da análise desta curva, fica perceptível que a absorbância provocada pela

coloração decai lentamente com o passar do tempo, sendo estável por pelo menos 4 horas.

Além disso, os valores mínimos e máximos obtidos para a absorbância dos padrões mostr

proximidade destes em relação à média, isto é, em cada instante de leitura, não houve

variações significativas de absorbância.

O instante cuja absorbância é máxima acontece por volta de 40 minutos após a adição

dos reagentes colorimétricos, sendo assim

instante ótimo de leitura das amostras.

4.3.7- Limite de Detecção e Limite de Quantificação

A Tabela 8 mostra os valores das absorbância

0,400

0,450

0,500

0,550

0,600

0,650

0,700

0,750

0,8000

:25

0:3

5

0:4

5

0:5

5

1:0

5

Ab

sso

rbâ

nci

a

Para verificar a estabilidade da coloração verde, foi feita uma análise da evolução da


18- Evolução da absorbância ao longo do tempo



de absorbância obtidos nas leituras dos padrões em cada tempo medido.



Além disso, os valores mínimos e máximos obtidos para a absorbância dos padrões mostr


variações significativas de absorbância.


dos reagentes colorimétricos, sendo assim, a partir deste teste, determinou

instante ótimo de leitura das amostras.

Limite de Detecção e Limite de Quantificação

A Tabela 8 mostra os valores das absorbâncias de 10 amostras de zero ppm, isto é,

1:0

5

1:1

5

1:2

5

1:3

5

1:4

5

1:5

5

2:0

5

2:1

5

2:2

5

2:3

5

2:4

5

2:5

5

3:0

5

3:1

5

3:2

5

3:3

5

Tempo (horas)

Média das absorbâncias Absorbância mínima Absorbância máxima

48

verde, foi feita uma análise da evolução da


tempo





Além disso, os valores mínimos e máximos obtidos para a absorbância dos padrões mostra a



, a partir deste teste, determinou-se 40 minutos o

s de 10 amostras de zero ppm, isto é,

3:3

5

3:4

5

3:5

5

49

amostras branco em relação ao nitrogênio.

Tabela 8- Absorbância dos brancos

Brancos Absorbância 1 0,000 2 0,000 3 0,000 4 0,000 5 0,001 6 0,000 7 0,000 8 0,000 9 0,000

10 0,002

Para a determinação do Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ),

determinou-se o desvio padrão dos brancos (DPa). Além disso, foi resgatado o coeficiente

angular da curva de calibração, isto é, a sensibilidade do método, de acordo com item 4.3.2.

A Tabela 9 mostra o desvio padrão dos brancos, a sensibilidade do método, bem

como os limites de detecção e de quantificação.

Tabela 9- Limite de Detecção e Limite de Quantificação

Desvio padrão Sensibilidade Limite de Detecção

(LD) Limite de quantificação

(LQ)

0,0007 0,002 0,0079 0,0247

Assim, a partir do Limite de detecção (LD) podemos estabelecer que a menor

quantidade de analito que é "significativamente diferente" de um branco é 0,0079 ppm. Além

disso, pelo Limite de quantificação (LQ) podemos estabelecer que o sinal suficientemente

forte para ser medido com mais exatidão é aquele gerado por uma concentração de analito

igual a 0,0247 ppm.

4.3.8- Comparação de média e variância

A partir dos dados obtidos pela Tabela 6, foi possível construir a Tabela 10, em que é

mostrado os valores dos testes de hipóteses F e T. Os valores calculados foram obtidos a partir

50

da média e do desvio padrão das concentrações de nitrogênio obtida para a quintuplicata de

cada amostra e os valores críticos foram determinados com o auxílio da tabela F e T tendo

como base 95% de confiança.

Tabela 10- Teste de comparação de variância e média

Amostras Comparação de variâncias Comparação de médias

F calculado F crítico T calculado T crítico

Folha de arroz 13,54 6,39 0,26 2,31

Braquiária 3,41 6,39 0,34 2,31

Feijão Rudá 4,13 6,39 0,24 2,31

Feijão Esplendor 12,61 6,39 0,24 2,31

Feijão Yoki 2,19 6,39 0,64 2,31

A variância dos métodos espectrofotométrico e de Kjeldahl não é estatisticamente

igual apenas para a folha de arroz e para o feijão esplendor, já que o F calculado foi maior que

o crítico. Para todas as amostras, porém, a média dos resultados se mostrou estatisticamente

igual. Assim, é possível inferir, com 95% de confiança que as análises de nitrogênio

realizadas por ambos os métodos fornecem valores médios estatisticamente iguais.

4.4-Tratamento dos resíduos gerados pelas análises químicas

4.4.1- Tratamento de resíduos contendo cobre

Na determinação de Nitrogênio pelo método convencional de destilação (Método

Kjeldahl) utiliza-se uma mistura de reagentes contendo 86,44% em massa de sulfato de sódio

e 13,56% de sulfato de cobre penta-hidratado como catalisador da reação de oxidação da

matéria orgânica presente no tecido vegetal.

Cada análise de Nitrogênio por este método gera aproximadamente 15 ml de NaOH

(40%V:V) e 3,5 ml de H2SO4 P.A. Neste volume está contido também 1 g de mistura

catalisadora contendo 0,864 g de K2SO4 e 0,136 g de sulfato de potássio penta hidratado

(CuSO4.5H20).

O resíduo gerado apresenta, portanto, uma concentração de 1868,42 mg/L de íons

51

Cu2+.

Para reduzir o volume de resíduos de cobre gerados pelas análises, faz-se a

decantação dos íons Cu2+ na forma de hidróxidos insolúveis. Para tanto, espera-se a

decantação do resíduo básico formado nas análises. Em seguida, faz-se a sifonação, retirando

o sobrenadante e descartando-o na pia. O sólido formado é seco e encaminhado ao

GERELAB.

Na neutralização da solução alcalina formada (pH=14,073) foram necessários 0,643

ml de H2SO4 para cada amostra analisada.

4.4.2- Tratamento de resíduos contendo selênio

Nas análises de nitrogênio total pelo método espectrofotométrico são gerados

extratos ácidos cuja concentração de selênio é de 875 mg.L-1 e extratos diluído de

concentração de selênio 43,75 mg.L-1. Cada amostra gera 43,5 mL de extrato ácido e 10,0 mL

de extrato ácido diluído, totalizando 53,5 mL a 719 mg.L-1.

A solução ácida de selênio foi tratada com metabissulfito de sódio (Na2S2O5),

ocorrendo a precipitação de um sólido vermelho. Assim, são necessários para cada 1 litro de

resíduo 1,73 g de metabissulfito. Partindo-se de 10% de excesso usa-se 1,91g de Na2S2O5 ou

103 mg por amostra.

Em seguida faz-se a neutralização com hidróxido de sódio (NaOH), e espera-se até

ocorrer a decantação. Logo em seguida, retira-se o sobrenadante por sifonação, descartando-o

na pia. O precipitado de coloração vermelha (S8) é seco e em seguida encaminhado ao

Gerelab.

O extrato resultante da mistura do extrato ácido com o diluído contém 4,9% de

H2SO4 sendo necessário, portanto, 69,04 g de NaOH para neutralização de cada litro do

extrato, ou 3,69 g de NaOH com 10% em excesso para cada amostra analisada.

5- CONCLUSÕES

O método de determinação de nitrogênio a partir do método espectrofotométrico,

baseado na reação de Berthelot modificada é compatível com a metodologia Kjeldah e pode

ser utilizada em rotinas laboratoriais, tendo em vista sua maior operacionalidade, quando

comparada com a metodologia Kjeldah. Para comprovar tal compatibilidade, os testes de

validação realizados neste trabalho mostraram que o método espectrofotométrico é seletivo,

52

linear, apresenta grande faixa de trabalho, é sensível e exato, porém menos preciso que o

método convencional de Kjeldahl.

Além disso, com os testes estatísticos de comparação de média e variância, foi

possível concluir que os métodos geram resultados médios estatisticamente iguais.

53

ANEXO 1 Distribuição F

55

Distribuição t-Studentes

56

REFERÊNCIAS: AMARANTE Jr., O. P. de; CALDAS, E. P. A.; BRITO, N. M.; SANTOS, T. C. R. dos; VALE, M. L. B. F. Validação de métodos analíticos: uma breve revisão. Cad. Pesq., v. 12, p. 116-131, 2001. BERTHELOT, M. P. E. Violet d’aniline. Report. Chim. Appl. v.1, p.282-284, 1859. BOWER, C. E., AND T. HOLM-HANSEN. 1980. A salicylatehypochlorite method for determining ammonia in seawater. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 37:794–798. BOLLTER, W.T.; BUSHMAN, C.J.; TIDWELL, P.W.; Anal. Chem. (1961) BREMNER, J.M.; MULVANEY, C.S. Nitrogen total. In: PAGE, A.L. (Ed.). Methods of soil analysis. Madison: Soil Science Society of America, 1982. p.595-624. COMISSÃO DE QUÍMICA E FERTILIDADE DO SOLO - RS/SC. Manual de adubação e calagem para os Estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina. 10. Ed. Porto Alegre, 2004. DEEPA, B., BALASUBRAMANIAN, N. e NAGARJA, K. S. Spectrophotometric determination of Cyanide based on Berthelot reaction. Analytical Letters, vol.36, no.13, p.2865-2874, 2003

DORICH, R.A.; NELSON, D.W. Direct colorimetric measurement of ammonium in potassium chloride extracts of soils. Soil Science Society of America Journal, v.47, p.833-836, 1983.

57

DOUGALL, D.K.; ESTABA, D.J. Nutrition and metabolism. In: STABA, E.J. (Ed.) Plant tissue culture as source of biochemicals. Boca Raton: CRS Press, 1980. p.21-58. EPSTEIN, E.; BLOOM, A. J.; “Nutrição mineral de plantas: princípios e perspectivas”, 2ª ed., Londrina: PLANTA , p. 209-243, 2006. FAQUIN, V. Diagnose do estado nutricional das plantas / Valdemar Faquin. Lavras: UFLA/FAEPE, 2002. FERREIRA, Alexandre Cunha de Barcellos; ARAUJO, Geraldo Antônio de Andrade; PEREIRA, Paulo Roberto Gomes and CARDOSO, Antônio Américo. Características agronômicas e nutricionais do milho adubado com nitrogênio, molibdênio e zinco. Sci. agric. [online]. 2001, vol.58, n.1, pp. 131-138. ISSN 0103-9016. FERREIRA, F.A. Estudos da modificação da resina não iônica Amberlite XAD-7 com monoetanolamina (MEA) para retenção de espécies de S(IV). Dissertação (Mestrado em ciências). Dissertação (Mestrado em Química Analítica). Faculdade de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.

FONSECA, J. S.; MARTINS, G. A. M. Curso de estatística. 3. ed. São Paulo: Atlas, 1982. 286p.

FUKUSHIMA, R. S.; MAGALHÃES ROSA; A. J.; LIMA, C. G.; CUNHA, J. A.; “Comparação entre dois métodos analíticos para determinação da lignina de algumas gramíneas forrageiras”. Pesquisa agropecuária brasileira, 34 , 1025-1030 (1999).

GALVANI, D.B.; PIRES, C.C.; KOZLOSKI, G.V. et al. Energy requirements of Texel crossbred lambs. Journal of Animal Science, v.86, n.12, p.3480-3490, 2008.

GUIMARAES, P. R. B. Métodos quantitativos estatísticos. Curitiba IESD Brasil, 2008. pg146, 2

GLEBKO, L. I., ULKINA, J. I e VASKIVSKY, V. E. Spectrophotometrical method for determination of nitrogen in biological preparations based on tymol-hypobromite reaction. Analytical Biochemistry, v. 20, p.16-23, 1967

HARFMANN, R. G.; CROUCH, S. R.; Talanta 1989, 36, 261.

HARRIS, DANIEL C.; Análise Química Quantitativa;tradução Carlos Alberto Riehl. 5.ed. LTC Editora, Rio de Janeiro:1999. cp.19,20,21.

JARDIM WF. Gerenciamento de resíduos químicos em laboratórios de ensino e pesquisa. Química Nova. 1998.

JONES, LORETTA; ATKINS, PETER. Princípios de Química – Questionando a Vida Moderna e o Meio Ambiente – 3 ª Ed-Porto Alegre:Bookman, 2006

58

JONES Jr, J.B. Kjeldahl nitrogen determination-What’s in a name. Journal of Plant Nutrition, v.10, p.1675-1682, 1987 KARLA, Y. P.; “Handbook of reference methods for plant analysis”, Nova Yorque: CRC, p. 37-60, p.137-140 e p. 157-163, 1998. KEITH, L. H., CRUMMETT, W.; DESGAN JR., T.; LIBBY, R. A., TAYLOR, J. K.; WENTLER, G.; “Principles of environmental analysis”. Analytical Chemistry, 55, 2210 (1983). KRAMER, V.M.S. Indicativos de poluição na Bacia do Ribeirão Paranavaí-PR, um desrespeito ao meio ambiente. Departamento de Geografia da FAFIPA. 2009. LENHINGER, ALBERT LESTER; Princípios de Bioquímica.3.ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro:1992. cp.3.

MALAVOLTA, E. Manual de nutrição mineral de plantas. São Paulo. Ceres. 2006. 638 p.

MALAVOLTA, E.; VITTI, G. C.; OLIVEIRA, S. A. Avaliação do estado nutricional das plantas: princípios e aplicações. 2. ed. Piracicaba: POTAFOS, 1997. MANUAL EMBRAPA RONDÔNIA. Cultivo do Feijão Comum em Rondônia. Issn 1807-1805. Dez. 2005. MENDHAM, J. et al. VOGEL: Análise Química Quantitativa. Rio de Janeiro: LTC, 2002. MILLS HA, JONES JB JR. Plant analysis handbook II: a practical sampling, preparation, analysis, and interpretation guide. Athens (GA): Micro-Macro Publishing, 1996. MORAES, J.F.V; RABELO, N.A. Um método simples para a digestão de amostras de plantas. Departamento de Difusão de Tecnologia. ISSN 0101-9716. Brasília-DF, 1986. OHLWEILER, O. A. Química Analítica Quantitativa: volume3. 2a ed. Rio de Janeiro: R.J. Livros Técnicos e Científicos Editora, 1976. 1039p. PATTON, C.J.; CROUCH, S.R.; Anal. Chem. (1977) RESOLUÇÃO Nº 899/2003. Publicada no DOU, de 02 de junho de 2003. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/899_03re.htm. Acessado em Julho de 2012 SEARLE, P. L. The Berthelot or indophenols reaction and its use in the analytical chemistry of nitrogen. Analyst, v. 109, p. 549-568, 1984

SILVA, A.P e ALVES, M. C. C. A. Como iniciar a validação de métodos analíticos. Congresso e Feira da Qualidade em Metrologia Rede Metrológica do Estado de São Paulo – REMESP. São Paulo-SP, 2006. SILVA, F. C.; “Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes”, 1ª ed., Brasília: Embrapa Comunicação para Transferência de Tecnologia, p.49-73 e p.171-223, 1999.

59

SHEN Y, Halperin JA, Benzaquen L, Lee CM. Characterization of neuronal cell death induced by complement activation. Brain Res Brain Res Protoc 1997; 1: 186-94. SCHNEIDER, Sergio. Sementes e brotos da transição: inovação, poder e desenvolvimento em áreas rurais do Brasil (IPODE). Projeto Edital MCT/CNPq 15/2007, 2007.

SILVERSTEIN, R. M., BASSLER, G. C., MORRIL, T. C., Identificação Espectrofotométrica de Compostos Orgânicos, 2a Edição, Guanabara Dois, Rio de Janeiro, 1979

SOUZA, Diego M.; MADARI, Beata E. e SENA, Marcelo M.. Aplicação de métodos quimiométricos na otimização da extração de Ca, Mg, K, Fe, Zn, Cu e Mn em folhas de braquiária. Quím. Nova [online]. 2012, vol.35, n.1, pp. 175-179. ISSN 0100-4042.

TITULAÇÃO ÁCIDO-BASE. In Infopédia. Porto: Porto Editora, 2003-2012. Disponível na www: <URL: http://www.infopedia.pt/$titulacao-acido-base>. Acessado em: 29/07/2012

VALIDATION of analytical procedures: metodology: ICH harmonised tripartite guideline. In: INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONATION OF TECHINICAL REQUERIMENTS FOR REGISTRATION OF PHARMACEUTICALS FOR HUMAN USE, 1996. 8 p. VELOSO, C.A.C; ARAÚJO S.M.B; VIÉGAS, I.J.M; OLIVEIRA, R.F. Amostragem de plantas para Análise Química. Comunicado Técnico Embrapa. Belém-PA. ISSN 1517-2244, 2004. VERDOUW, H., C. J. A. VANECHTELD & E. M. J. DECKKERS. 1978. Ammonia determinations based on indophenol formation with sodium salicylate. Water Resources, 12: 399-402. VIEIRA, S.; HOFFMANN, R. Estatística experimental. São Paulo: Atlas, 1989. 175p. VINADÉ, M. E. C. C.; VINADÉ, E. R. C. Métodos espectroscópicos de análise quantitativa. Santa Maria: UFSM, 2005. WALSH, M. C. Moving from official to traceable methods. Trends in Analytical Chemistry, v.18, p.616-623, 1999

destilador de nitrogenio

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