design und synthese niedermolekularer inhibitoren der...
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Max-P lanck- Ins t i tu t fü r B iochemie
Mar t ins r i ed
Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren
der Serinproteasen uPA und FXa
Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen bzw. anti-thrombotischen
Therapie
Dissertation
Stefan Sperl
Martinsried 2000
online: http://tumb1.biblio.tu-muenchen.de/publ/diss/allgemein.html
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Max-P lanck- Ins t i tu t fü r B iochemie
Mar t ins r i ed
Design und Synthese niedermolekularer Inhibitoren der
Serinproteasen uPA und FXa
Neuartige Wirkstoffe zur anti-metastatischen bzw. anti-thrombotischen Therapie
Stefan Sperl
Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen
Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
genehmigten Dissertation.
Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. Dr. Adelbert Bacher
Prüfer der Dissertation: 1. apl. Prof. Dr. Luis Moroder
2. Univ.-Prof. Dr. Johannes Buchner
3. Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Hiller
Die Dissertation wurde am 13.06.2000 bei der Technischen Universität München
eingereicht und durch die Fakultät für Chemie am 18.07.2000 angenommen.
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Teile der vorliegenden Arbeit wurden wie folgt zusammengefaßt:
Publikationen:
Sperl, S.; Bergner, A.; Stürzebecher, J.; Bode, W.; Moroder, L. (2000). Urethanyl-3-
Amidinophenylalanine Derivatives as Inhibitors of Factor Xa; X-Ray Crystal Structure
of a Trypsin/Inhibitor Complex and Modeling Studies. Biol. Chem. 381, 321-329.
Sperl, S.; Jacob, U.; Arroyo de Prada, N.; Stürzebecher, J.; Wilhelm, O. G.; Bode, W.;
Magdolen, V.; Huber, R.; Moroder, L. (2000). (4-aminomethyl)-phenylguanidine
derivatives as non-peptidic highly selective inhibitors of human urokinase. X-ray crystal
structure of an uPA/inhibitor complex at 1.8 Å resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
97, 5113-5118.
Zeslawska, E.; Schweinitz, A.; Karcher, A.; Sondermann, P.; Sperl, S.; Stürzebecher, J.;
Jacob, U. (2000). Crystals of the urokinase type plasminogen activator variant βc-uPAin complex with small molecule inhibitors open the way towards structure based drug
design. J. Mol. Biol. 301, 465-475.
Magdolen, V.; Arroyo de Prada, N.; Sperl, S.; Muehlenweg, B.; Luther, T.; Wilhelm, O.
G.; Magdolen, U.; Graeff, H.; Reuning, U.; and Schmitt, M. (2000). Natural and
synthetic inhibitors of the tumor-associated serine protease urokinase-type plasminogen
activator. Adv. Exp. Med. Biol. 477, 331-342.
Bürgle, M.; Sperl, S.; Stürzebecher, J.; Schmalix, W.; Kessler, H.; Magdolen, V.; Wilhelm,
O. G.; Schmitt, M. (2000). Urokinase and its Receptor (CD87): new targets for tumor
therapy. in: Proteinase and peptidase inhibition: recent potential targets for drug
developement. (Smith, J. & Simons, C., ed.), Gordon & Breach Science Publishers,
Lausanne, Suisse. (im Druck).
Schmitt, M.; Wilhelm, O. G.; Reuning, U.; Krüger, A.; Harbeck, N.; Lengyel, E.; Graeff,
H.; Gänsbacher, B.; Kessler, H.; Bürgle, M.; Stürzebecher, J.; Sperl, S.; Magdolen, V.
(2000). The urokinase plasminogen activator system as a novel target for tumour
therapy. Fibrinolysis & Proteolysis 14, 114-132.
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Patentanmeldungen:
Sperl, S., Moroder, L., Magdolen, V., Stürzebecher, J., Wilhelm, O. G. (1999). Selektive
Inhibitoren des Urokinase -Plasminogen Aktivators. (DE 199 403 89.9)
Sperl, S., Jacob, U., Arroyo de Prada, N., Stürzebecher, J., Wilhelm, O. G., Bode, W.,
Magdolen, V., Huber, R., Moroder, L. (2000). Hochselektive Inhibitoren des Urokinase-
Plasminogenaktivators. (DE 100 137 15.6)
Sperl, S., Stürzebecher, J, Moroder, L. (2000). Derivate des (R)-3-Amidinophenylalanins
als Inhibitoren des Faktors Xa (eingereicht).
Vorträge:
Sperl, S. (1998). Design and synthesis of substrate-based inhibitors of urokinase. 16th
Winter School on Proteinases and their Inhibitors. Recent Developments. Tiers, Italien.
Sperl, S. (1999). New Lead Structures for uPA and Factor Xa Inhibitors. 17th Winter
School on Proteinases and their Inhibitors. Recent Developments. Tiers, Italien.
Sperl, S. (1999). Design und Synthese von selektiven uPA Inhibitoren. 4. Jenaer
Proteolysetag, DFG-Rundgespräch, Erfurt.
Sperl, S. (2000). Design, Synthesis and X-Ray Structure of a new class of selective uPA
Inhibitors. International Symposium on Proteinase Inhibitors and Activators – Strategic
Targets for Therapeutic Intervention, Oxford, UK.
Poster:
Sperl, S.; Jacob, U.; Arroyo de Prada, N.; Stürzebecher, J.; Wilhelm, O. G.; Bode, W.;
Magdolen, V.; Huber, R.; Moroder, L. (2000). Design, synthesis and X-ray crystal
structure of a new class of selective uPA-inhibitors. 15th International Congress on
Fibrinolysis and Proteolysis, Hamamatsu, Japan.
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Meinen Eltern
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Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juni 1997 bis Juni 2000 am Max-
Planck-Institut für Biochemie in Martinsried unter Anleitung von Herrn Prof. Dr.
Luis Moroder angefertigt.
Mein besonders herzlicher Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Luis
Moroder, der mir diese sehr interessante Aufgabe gestellt hat. Er hatte immer ein
offenes Ohr für unkonventionelle Ideen und ließ mir gleichzeitig den nötigen
Freiraum zur Ausgestaltung des Themas und zur Umsetzung der Ideen. Darüber
hinaus möchte ich mich bei ihm auch für die übertragene Verantwortung innerhalb
der Arbeitsgruppe und das mir damit erwiesene Vertrauen bedanken.
Desweiteren bedanke ich mich recht herzlich bei allen Kooperationspartnern, ohne
die diese interdisziplinäre Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Ich danke
Ewa Zeslawska, Dr. Uwe Jakob und Prof. Dr. Robert Huber (Abteilung
Strukturforschung) für die Röntgenstrukturanalyse des uPA/Inhibitor-Komplexes,
Dr. Andreas Bergner und Prof. Dr. Wolfram Bode (Abteilung Strukturforschung)
für die Röntgenstrukturanalyse des Trypsin/FXa-Inhibitor-Komplexes und die
Durchführung der Modelling-Experimente,
PD Dr. Jörg Stürzebecher, Christa Böttner und Reiner Sieber (Klinikum der
Universität Jena, Zentrum für vaskuläre Biologie und Medizin, Erfurt) für die
rasche Bestimmung der Inhibitionskonstanten und die pharmakokinetischen
Untersuchungen,
Nuria Arroyo de Prada und Dr. Viktor Magdolen (Klinikum rechts der Isar der
Technischen Universität München) für die Toxizitätsuntersuchungen und die
zahlreichen interessanten und hilfreichen Diskussionen,
Prof. Dr. Marianne Jochum und Prof. Dr. Hans Fritz für die finanzielle
Unterstützung durch den Sonderforschungsbereich 469 der LMU München.
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Mein weiterer Dank gilt:
PD Dr. Olaf G. Wilhelm (Wilex Biotechnology GmbH, München) für sein großes
Vertrauen und Interesse an meiner Arbeit.
Der ganzen Arbeitsgruppe „Bioorganische Chemie“, die mich sehr freundlich
aufgenommen hat und deren Mitglieder mich stets nach Kräften unterstützt haben.
Namentlich hervorheben möchte ich Constanze Müller, die sehr viel Zeit und
Geduld bewies, um einen ehemaligen „Anorganiker“ in einen brauchbaren
bioorganischen Chemiker zu konvertieren. Günther Loidl, der mich bei etlichen
Gläsern Wein den Frust über nicht-inhibierende „Inhibitoren“ vergessen ließ.
Bernhard Gabriel und Norbert Schaschke danke ich für die zahlreichen
Diskussionen bei Syntheseproblemen. Besonders danken möchte ich Jürgen Musiol,
der zu jedem Problem stets hilfreiche Literatur bereithielt, aber auch für die netten
Kaffeepausen. Lissy Weyher und Sigi Bauer danke ich für die zuverlässige
Durchführung der Massenspektrometrie ebenso wie Hans Stocker für seine Hilfe
bei allen technischen Fragen. Meinem „Nachfolger“ Markus Michael Müller
wünsche ich weiterhin viel Erfolg und danke ihm, daß er mich diese Arbeit
weitgehend ungestört schreiben ließ. Vielen Dank auch an Bernd Mühlenweg, der
sich drei Jahre mit mir eine Stelle teilen mußte und während unserer
„Gründungsphase“ viel Engagement bewies.
Bei meiner WG (Ela, Flo, Julia und Amely) bedanke ich mich herzlichst für die
lustige Zeit und für das große Verständnis, wenn ich mich mal wieder um die
Hausarbeit gedrückt habe.
Besonderer Dank gebührt schließlich meinem cariñito Nuria, die mir durch ihre
unendliche Liebe die Freizeit versüßt und immer für mich da ist.
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung __________________________________________________________ 1
1.1. Klassifizierung der Proteasen _____________________________________________ 1
1.2. Struktur trypsin-ähnlicher Serinproteasen __________________________________ 2
1.3. Struktur der aktiven Zentren von Faktor Xa, uPA, Thrombin, tPA und Trypsin __ 4
2. Urokinase Inhibitoren ________________________________________________ 7
2.1. Die Rolle von uPA bei der Tumorprogression und Metastasierung ______________ 7
2.2. Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator__________________________________ 10
2.3. Das uPA-uPAR-System _________________________________________________ 12
2.4. Klinische Relevanz von uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2 _______________________ 13
2.5. Inhibition des uPA-uPAR-Systems – Prinzipielle Therapieansätze______________ 14
2.6. uPA-Inhibitoren _______________________________________________________ 16
2.6.1. Natürliche uPA-Inhibitoren _________________________________________________ 16
2.6.2. Synthetische uPA-Inhibitoren________________________________________________ 18
2.7. Zielsetzung____________________________________________________________ 21
2.8. Ergebnisse und Diskussion ______________________________________________ 22
2.8.1. Tripeptid-Methylketone ____________________________________________________ 22
2.8.2. Phenylguanidin-Derivate als selektive uPA-Inhibitoren____________________________ 27
3. Faktor Xa Inhibitoren________________________________________________ 51
3.1. Die Blutgerinnungskaskade ______________________________________________ 51
3.2. Natürliche und synthetische FXa Inhibitoren _______________________________ 54
3.3. Zielsetzung____________________________________________________________ 59
3.4. Ergebnisse und Diskussion ______________________________________________ 60
3.4.1. Inhibition von FXa und verwandten trypsin-ähnlichen Serinproteasen ________________ 60
3.4.2. Synthese von 3- und (4-Amidino)-Phenylalanin-Derivaten _________________________ 63
3.4.3. Röntgenstrukturanalyse des FXa-Inhibitors 84 im Komplex mit Trypsin und Modelling-
Experimente _____________________________________________________________ 64
3.4.4. Einfluß der Chiralität von Amidino-Phenylalanin-Derivaten auf die Inhibition von FXa __ 69
4. Zusammenfassung und Ausblick _______________________________________ 73
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4.1. uPA-Inhibitoren _______________________________________________________ 73
4.2. FXa-Inhibitoren _______________________________________________________ 74
5. Summary __________________________________________________________ 77
5.1. uPA-inhibitors_________________________________________________________ 77
5.2. fXa-inhibitors _________________________________________________________ 78
6. Experimenteller Teil _________________________________________________ 80
6.1. Materialien und Methoden ______________________________________________ 80
6.2. Enzymkinetik _________________________________________________________ 82
6.2.1. Ermittlung der Inhibitionskonstanten (Ki-Werte)_________________________________ 82
6.2.2. Eingesetzte Enzyme und Substrate zur Ki-Wert-Bestimmung _______________________ 82
6.3. Röntgenstrukturanalyse des Inhibitor/uPA Komplexes _______________________ 83
6.3.1. Kristallisation mit Benzamidin als Inhibitor_____________________________________ 83
6.3.2. Soaking des uPA-Inhibitors 75 und Röntgenstrukturanalyse ________________________ 84
6.4. Röntgenstrukturanalyse des Faktor Xa Inhibitor 84/Trypsin-Komplexes ________ 85
6.5. Modelling-Experimente mit Faktor Xa Inhibitoren __________________________ 87
6.6. In vivo Eliminationsstudien ______________________________________________ 87
6.7. Toxizitätsstudien am uPA Inhibitor 75 ____________________________________ 88
6.8. Synthese der uPA Inhibitoren ____________________________________________ 89
6.8.1. Tripeptid-Methylketone ____________________________________________________ 89
6.8.2. nicht-peptidische Inhibitoren / Phenylguanidine _________________________________ 90
6.9. Synthese der Faktor Xa Inhibitoren ______________________________________ 111
7. Literaturverzeichnis ________________________________________________ 121
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Abkürzungen
Die Nomenklatur der Aminosäuren und Peptide entspricht den Vorschlägen der
IUPAG-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur (Europ. J. Biochem.,
1984, 138, 9-37)
Ac Acetyl
ACN Acetonitril
AcOH Essigsäure
AcOEt Essigsäure-Ethylester
Adoc 1-Adamantyloxycarbonyl
ATF Aminoterminales Fragment des uPA
Boc tert-Butyloxycarbonyl
ber. berechnet
Bz Benzyl
DC Dünnschichtchromatografie
DCC N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
DCM Dichlormethan
DIEA Diisopropylethylamin
DIPE Diisopropylether
DMF Dimethylformamid
ESI Elektro-Spray-Ionisierung
EtOH Ethanol
FAB Fast Atom Bombardement
Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
FXa Faktor Xa (aktiviert)
h Stunde(n)
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HBTU O-(Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium
Hexafluorophosphat
HOBt 1-Hydroxybenzotriazol
HOSu Hydroxysuccinimid
HPLC High Performance Liquid Chromatographie
HV Hochvakuum
i-PrOH Isopropanol
Ki Inhibitionskonstante
LM Lösungsmittel
M Molar
MS Massen-Spektrometrie
MeOH Methanol
n. b. nicht bestimmt
p. a. Pro Analyse
PAI-1/2 Plasminogenaktivator-Inhibitor Typ 1/2
Pbf 2,2,4,4-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl
pNA p-Nitroanilid
Rf Retentionsfaktor in der Dünnschichtchromatographie
RT Raumtemperatur
TBTU 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-
tetrafluoroborat
TFA Trifluoressigsäure
TFE Trifluorethanol
TIPS 2,4,6-Triisopropylphenylsulfonyl
Tos p-Toluolsulfonyl
tR Retentionszeit in der HPLC
uPA Urokinase-Typ Plasminogenaktivator
uPAR uPA-Rezeptor
Z Benzyloxycarbonyl
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1. Einleitung 1
1. Einleitung
1.1. Klassifizierung der Proteasen
Proteolytische Enzyme sind eine große und wichtige Gruppe von Proteinen die eine
Spaltung von Peptidbindungen katalysieren. Eine grobe Einteilung der Proteasen
läßt sich nach ihrem unterschiedlichen Katalysemechanismus vornehmen (Barrett,
A. J. et al. 1998).
A. Endopeptidasen: katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen im
inneren der Polypeptidkette
1. Serin-Proteasen Serin, Histidin und Aspartat im aktiven Zentrum
2. Cystein-Proteasen Cystein im aktiven Zentrum
3. Aspartat-Proteasen Aspartat-Reste im aktiven Zentrum
4. Metalloproteasen Metallion im aktiven Zentrum
5. Nicht klassifizierte Proteasen
B. Exopeptidasen: katalysieren die Abspaltung einer oder mehrerer
Aminosäuren vom N- oder C-Terminus des Substrats
1. Aminopeptidasen spalten eine Aminosäure vom N-Terminus ab
2. Dipeptidyl-Peptidasen spalten zwei Aminosäuren vom N-Terminus ab
3. Tripeptidyl-Peptidasen spalten drei Aminosäuren vom N-Terminus ab
4. Carboxy-Peptidasen spalten eine Aminosäuren vom C-Terminus ab
5. Peptidyl-Dipeptidasen spalten zwei Aminosäuren vom C-Terminus ab
Jede der aufgeführten Klassen läßt sich in Unterklassen („Clans“) aufteilen. Die
Serinproteasen werden zum Beispiel nach der Aminosäuresequenz ihrer
katalytischen Reste Asp, His und Ser unterteilt. Für trypsin-ähnliche Serinproteasen
gilt also die sequenzabhängige Reihenfolge His57–Asp102–Ser195, wohingegen
Subtilisin (eine extrazelluläre Endopeptidase aus Bacillus subtilis) die Reihenfolge
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1. Einleitung 2
Asp–His–Ser aufweist. Die folgenden Kapitel befassen sich näher mit der Klasse
der trypsin-ähnlichen Serinproteasen.
1.2. Struktur trypsin-ähnlicher Serinproteasen
Die dreidimensionale Röntgenstruktur des Rinder-Trypsins wurde bereits 1974
aufgeklärt (Huber, R. et al. 1974) und entwickelte sich zum Prototypen der
Serinproteasen mit Argininspezifität. Die Tertiärstrukturen dieser Enzyme zeigen
ein stark konserviertes Strukturmerkmal, obwohl die Primärstrukturen stark
voneinander abweichen können. Das allgemeine Nummerierungssystem der
Aminosäurereste folgt dem der homologen Protease Chymotrypsin. Chymotrypsin
hat eine beinahe identische Tertiärstruktur wie Trypsin, obwohl die beiden Enzyme
weniger als 50% Identität in der Primärstruktur aufweisen und Chymotrypsin eine
Substratspezifität für aromatische Reste besitzt. Die Positionen von
„Schlüsselresten“, wie jenen der katalytischen Triade (Asp102, His57 und Ser195) und
Asp189 am Boden der S1-Spezifitätstasche, sind in allen trypsin-ähnlichen
Serinproteasen identisch.
Die Tertiärstruktur dieser Proteasen besteht vorwiegend aus β-Faltblättern. Sie ist
charakterisiert durch 2 Domänen, wobei jede Domäne ein „β-barrel“ ausbildet. Die„Active-Site Cleft“ mit der katalytischen Triade ist genau zwischen den beiden
Domänen lokalisiert (Abbildung 1). Jede der „barrel“-ähnlichen Domänen ist aus 6
anti-parallel laufenden Strängen aufgebaut, wobei 4 der 5 verbindenden „loops“
Haarnadel-Schleifen sind. Neben wenigen, kurzen Helices besitzen alle Enzyme
eine lange C-terminale α-Helix (Abbildung 1, rot).
Mitte Mai 2000 verzeichnete die Brookhaven Protein-Datenbank 160
Röntgenkristallstrukturen von Trypsin, 97 von Thrombin, 4 von Faktor Xa und 2
vom Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (uPA). Viele dieser Strukturen sind
Komplexe mit synthetischen oder natürlichen Inhibitoren, die aufgeklärt wurden,
um die Bindung und Selektivität der Inhibitoren rationell verbessern zu können. Die
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1. Einleitung 3
Tatsache, daß es vergleichsweise wenige Röntgenstrukturen von FXa und uPA gibt,
spiegelt die Schwierigkeiten wieder, die bei der Kristallisation dieser beiden
Enzyme auftreten. Da aber gerade diese Enzyme interessante Zielmoleküle in der
Therapie schwerwiegender Erkrankungen darstellen, kann man die hohe strukturelle
Ähnlichkeit der trypsin-ähnlichen Serinproteasen nutzen und Komplexstrukturen
von FXa- oder uPA-Inhibitoren mit Trypsin anfertigen.
Abbildung 1: Richardson-Diagramm der Tertiärstruktur von β-Trypsin imKomplex mit dem Thrombin-Inhibitor NAPAP (PDB-Code:
1PPC). Die Sekundärstrukturelemente α-Helix und β-Faltblattsind dargestellt als helikales Band bzw. verdrehte Pfeile (Bode,
W. et al. 1990)
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1. Einleitung 4
Anschließend überlagert man die Trypsin/Inhibitor-Komplexstruktur mit einer
bekannten Struktur des Targetenzyms und erhält so Informationen über den
Bindungsmodus des Inhibitors (Banner, D. W. et al. 1991; Bode, W. et al. 1990;
Gabriel, B. et al. 1998; Matsuzaki, T. et al. 1989; Renatus, M. et al. 1998; Stubbs,
M. T. et al. 1995; Turk, D. et al. 1991).
1.3. Struktur der aktiven Zentren von Faktor Xa, uPA, Thrombin, tPA
und Trypsin
Obwohl Sekundär- und Tertiärstruktur aller trypsin-ähnlichen Serinproteasen
identisch sind, unterscheiden sie sich doch in einigen Bereichen entscheidend in der
Aminosäuresequenz (Primärstruktur). Gerade diese Unterschiede sind es aber, die
für die Selektivität der einzelnen Proteasen verantwortlich zeichnen. In Abbildung 2
sind die strukturellen Gemeinsamkeiten und Unterschiede der aktiven Zentren (S1-
S3/S4) von Faktor Xa, uPA (Urokinase-Typ Plasminogenaktivator), Thrombin, tPA
(Gewebe-Typ Plasminogenaktivator) und Trypsin schematisch dargestellt (Renatus,
M. et al. 1998).
Allen trypsin-ähnlichen Serinproteasen gemeinsam ist die relativ tiefe,
argininspezifische S1-Tasche. Die selektive Erkennung der basischen
Argininseitenkette erfolgt über die Ausbildung einer Salzbrücke zwischen der
positiv geladenen Guanidiniumfunktion des Arginins und der negativ geladenen
Carboxylgruppe des Asp189 am Boden der S1-Tasche. In uPA und Trypsin ist
außerdem die Bildung einer Wasserstoffbrücke zwischen der Seitenkette des Ser190-
Restes und der ε-NH Gruppe der Guanidinofunktion möglich. DieseWechselwirkung ist bei Thrombin, FXa und tPA nicht möglich, da diese Enzyme
anstelle von Serin eine Alanin-Mutation besitzen.
In der S2-Region gibt es bereits größere Unterschiede. Durch den sogenannten „60-
Insertion-Loop“ – bestehend aus Tyr60A, Pro60B, Pro60C und Trp60D – ist diese Region
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1. Einleitung 5
zusammen mit His57, Ser214 und Leu99 in Thrombin zu einer großen, lipophilen
Tasche ausgebildet, die z. B. Prolinreste in P2 sehr gut beherbergen kann. Bei uPA
tritt hingegen der entgegengesetzte Effekt auf. Hier ist die S2-Tasche durch den
„99-Insertion-Loop“ aus Thr98A und Leu98B in Verbindung mit His99 stark
verkleinert, so daß in dieser Region nur kleine Aminosäurereste wie Glycin binden
können. Dieser „99-Loop“ hat Auswirkungen bis in die S3/S4-Region, die in uPA
ebenfalls räumlich beschränkt und sehr hydrophob ist.
Die S3/S4-Region von Faktor Xa ist größer als die von uPA und ebenfalls sehr
hydrophob. Am Ende dieser Region befindet sich jedoch ein elektronegativer
Hohlraum, der von Glu97 und den Carbonyl-Sauerstoffen von Ile75 und Thr98 erzeugt
wird. Dieser Bereich kann z. B. von bis-basischen synthetischen Inhibitoren für eine
weitere ionische Interaktion genutzt werden (Gabriel, B. et al. 1998). Allerdings
besitzen auch tPA und Thrombin diesen elektronegativen Bereich, so daß auf diese
Weise keine selektiven FXa-Inhibitoren erzeugt werden können. Andererseits ist die
S3/S4-Region von tPA durch die räumliche Nähe der Arg174-Seitenkette weniger
hydrophob als die entsprechende Region in FXa, Trypsin oder Thrombin.
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1. Einleitung 6
HN
O
OO
NH2
NH2N
O O
Asp189
Tyr99
Thr98
Asp97Thr175
Arg174
Trp215
Leu217
δ− δ−
δ−
OH
HN
O
OO
O O
Asp189
Tyr99
Thr98
Glu97Ile175
Phe174
Trp215
Glu217
δ− δ−
δ−
OH
O
O
O O
Asp189
His99
Trp215
Arg217
NH
HN
NH2H N2
NH
NH
Leu98BThr98AHO
OH
Tyr272
HN
O
O
O O
Asp189
Leu99
Thr98
Asn97
Gln175
Trp215
Ser217
δ−
δ−
HO
O N
HN
O
OO
O O
Asp 189
Thr 98
Arg 97Val 175
Ile 174
Trp 215
Glu 217
δ− δ−
δ−
O
O
Leu 99
Trp 60D
Pro 60C
Pro 60B
Tyr 60A
OH
Faktor Xa uPA
Thrombin
tPA Trypsin
Abbildung 2: Schematische Darstellung der aktiven Zentren von FXa, uPA,
Thrombin, tPA und Trypsin
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2. Urokinase Inhibitoren 7
2. Urokinase Inhibitoren
2.1. Die Rolle von uPA bei der Tumorprogression und Metastasierung
Bei der Tumorinvasion wandern Tumorzellen aus einem Primärtumor aus, um an
einer entfernten Stelle des Körpers einen Sekundärtumor (Metastase,
Tochtergeschwulst) zu bilden. Dafür sind eine Reihe aufeinanderfolgender
Vorgänge notwendig, welche als metastatische Kaskade bezeichnet werden
(Abbildung 3) (McKinnell, R. G. et al. 1998; Reuning, U. et al. 1998).
Der Prozeß der Metastasierung beinhaltet die Loslösung einzelner Tumorzellen aus
dem Primärtumor-Zellverband, die Adhäsion an und Invasion dieser Zellen durch
die extrazelluläre Matrix, Intravasation, den Transport mit dem allgemeinen
Blutkreislauf, erneute Adhäsion an die Basalmembran, Extravasation und
anschließend erneute Invasion der Zellen durch die extrazelluläre Matrix um die
Metastase zu bilden.
Für den Abbau der extrazellulären Matrix ist eine gerichtete proteolytische Aktivität
der Tumorzelle nötig. Diese wird durch verschiedene proteolytische Systeme
vermittelt, die miteinander interagieren und sich gegenseitig aktivieren (Koblinski,
J. E. et al. 2000). Im Einzelnen sind es
(1) die Serinproteasen Plasmin, uPA und tPA) (Danø, K. et al. 1985; Schmitt, M.
et al. 1997)
(2) die Matrixmetalloproteinasen (MMPs) (Cockett, M. I. et al. 1998; Kahari, V.
M. et al. 1999; Kleiner, D. E. et al. 1999; Westermarck, J. et al. 1999)
(3) die Cysteinproteinasen, z. B. Cathepsin B, H und L (Michaud, S. et al. 1998;
Sloane, B. F. 1990)
(4) die Aspartatproteinasen, z. B. Cathepsin D (Garcia, M. et al. 1996; Rochefort,
H. et al. 1996; Rochefort, H. et al. 1999)
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2. Urokinase Inhibitoren 8
Klonale Expansionund Wachstum
Adhäsion an undInvasion durch die
Basalmembran
Intravasation
Tumorzellhaufen
MetastaseMetastase
Basal-membran
Basal-membran
Primär-tumor
Transformierte Zelle
Metastatischer Subklon
Invasion durch dieExtrazellulärmatrix
Interaktion mitLymphozyten
Tumorzellhaufen
Adhäsion an dieBasalmembran
Extravasation
Metastase
Basal-membran
Basal-membran
Lymphozyt
Vene
Blutplättchen
Basal-membranExtrazellulär-
matrix
Abbildung 3: Weg der Krebszelle vom Primärtumor zum Ort der Metastase nach
McKinnell, R. G. et al. (1998)
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2. Urokinase Inhibitoren 9
uPA/uPAR
Plasminogen
Plasmin
pro-uPA/uPAR +
+Abbau von EZM- Fibrin- Fibronektin- Proteoglykane
Cathepsin B, L
+
pro-MMPs MMPs
+
-
PAI-1,2
+
Abbau vonBasalmembran-Kollagen-
TIMPs
α2-Antiplasmin
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CystatineSteffine
-
Abbildung 4: Aktivierungskaskade der perizellulären Plasmin-Proteolyse
Eine zentrale Rolle bei der Tumorinvasion und Metastasierung spielt uPA
(Abbildung 4). Nach Bindung des Zymogens pro-uPA an den
zelloberflächengebundenen uPA-Rezeptor (uPAR, CD87) wird uPA rasch durch die
Cathepsine B oder L aktiviert. Die proteolytische Aktivität wird durch die Bindung
an den Rezeptor auf die Zelloberfläche fokussiert. Plasminogen wird durch den
uPA-uPAR-Komplex zu Plasmin aktiviert, das verschiedene Bestandteile der
extrazellulären Matrix abbauen kann. Desweiteren ist Plasmin durch einen positiven
„Feedback“-Mechanismus in der Lage, erneut uPA zu aktivieren. Zum anderen
werden durch uPA auch Matrixmetalloproteasen aktiviert, die schließlich zum
Abbau von Basalmembran-Kollagenen beitragen. Diese proteolytischen Prozesse
ermöglichen den Krebszellen schließlich die Invasion in benachbartes Gewebe
sowie die Metastasierung. Wegen der zentralen Rolle des uPA an diesen
pathologischen Prozessen, stellt die Inhibition der proteolytischen Aktivität des
Plasminogenaktivators ein vielversprechendes Ziel in der Tumortherapie dar.
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2. Urokinase Inhibitoren 10
2.2. Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator
Der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator (Urokinase, uPA, EC 3.4.21.31) wurde
erstmals bereits 1966 von White und Mitarbeitern aus Urin isoliert, wovon sich
auch der Name ableitet (White, W. F. et al. 1966). Das Interesse an diesem Enzym
stieg sprunghaft an, nachdem der schwedische Gynäkologe Åsted entdeckte, daß
uPA sehr stark von humanen Ovarialkarzinomzellen produziert wird (Åstedt, B. et
al. 1976). Inzwischen ist bekannt, daß uPA von einer Vielzahl normaler und
maligner Zellen synthetisiert und sekretiert wird (Danø, K. et al. 1985).
uPA wird als einkettiges Zymogen pro-uPA exprimiert, das aus 411 Aminosäuren
aufgebaut ist, 12 Disulfidbrücken enthält und mit Asn302 über eine
Glykosylierungsstelle verfügt (Wun, T. C. et al. 1982). Das Proenzym besteht aus
drei Domänen, wie in Abbildung 5 dargestellt.
• „Growth-Factor-Like Domain“ (GFD) uPA1-44:
In der N-terminalen GFD-Domäne befindet sich die Bindungsstelle zum
zelloberflächenassoziierten uPA-Rezeptor (Pollanen, J. J. 1993; Stoppelli, M.
P. et al. 1985). Diese Domäne besitzt eine starke Sequenzhomologie mit dem
epidermalen Wachstumsfaktor („Epidermal Growth Factor“, EGF) (Gunzler,
W. A. et al. 1982; Steffens, G. J. et al. 1982). Trotz dieser Homologie besteht
keine Affinität zwischen EGF und uPAR .
• Kringle-Domäne uPA45-135:
Diese Domäne besitzt Affinität zum extrazellulären Matrix-Proteoglykan
Heparin.
• Protease-Domäne uPA136-411:
In dieser C-terminalen Domäne befinden sich die Reste His204, Asp255 und
Ser356, die zusammen die katalytische Triade der Serinprotease bilden
(Strassburger, W. et al. 1983).
-
2. Urokinase Inhibitoren 11
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Domänen von pro-uPA
Durch enzymatische Spaltung, z. B. durch Plasmin, Kallikrein, Cathepsin D oder L,
der Peptidbindung zwischen Lys158 und Ile159, wird das inaktive, einkettige pro-
uPA zum zweikettigen HMW-uPA („high molecular weight uPA“) aktiviert. Die A-
Kette (uPA1-158) ist nach der Spaltung mit der B-Kette (uPA159-411) über eine
Disulfidbrücke zwischen Cys148 und Cys279 verknüpft. Erst durch die mit der
Spaltung einhergehende Konformationsänderung wird das aktive Zentrum
exponiert. HMW-uPA kann durch weitere Proteolyse in das aminoterminale
Fragment (ATF, uPA1-135) und „low molecular weight uPA“ (LMW-uPA, uPA136-
411) weiter prozessiert werden. LMW-uPA besitzt die volle proteolytische Aktivität
(Ellis, V. et al. 1991), kann aber nicht mehr an der uPA-Rezeptor binden.
Die Röntgenkristallstruktur der uPA-B-Kette, die das katalytische Zentrum enthält,
wurde erstmals 1995 von Spraggon und Mitarbeitern beschrieben (Spraggon, G. et
al. 1995). Die Auflösung dieser Struktur war mit 2,5 Å vergleichsweise gering. Erst
kürzlich wurden hochaufgelöste Röntgenstrukturen der uPA-B-Kette im Komplex
mit bekannten, synthetischen Inhibitoren veröffentlicht (Nienaber, V. et al. 2000)
-
2. Urokinase Inhibitoren 12
(mehrere Komplexstrukturen, Auflösung: =1,5 Å), (Katz, B. A. et al. 2000)
(Auflösung 1,75, PDB-Code: 1C5X).
2.3. Das uPA-uPAR-System
Der uPA-Rezeptor (uPAR, CD 87) ist ein aus 313 Aminosäuren aufgebautes,
hochglycosyliertes (Kohlenhydratanteil 30%) Protein mit einem auffällig hohen
Cysteinanteil (Danø, K. et al. 1994). Der Rezeptor besteht aus 3 strukturell
ähnlichen Domänen und einem C-terminalen GPI-Anker, wobei die N-terminale
Domäne die GFD-Bindungsstelle enthält (Behrendt, N. et al. 1991), über die uPA
an uPAR bindet. Da uPAR keine Transmembrandomäne besitzt, ist eine
Signaltransduktion nur durch Wechselwirkung mit anderen Transmembranproteinen
möglich.
Der wichtigste natürliche Inhibitor des uPA ist der Plasminogenaktivator-Inhibitor
Typ 1 (PAI-1; siehe Kapitel 2.6.1). PAI-1 hemmt sowohl HMW-uPA als auch
LMW-uPA in freier oder rezeptorgebundener Form, tPA und in geringerem Maße
auch Plasmin.
Sobald sich auf der Zelloberfläche ein trimärer Komplex aus uPAR, uPA und PAI-1
gebildet hat, wird dieser mittels des Macroglobulinrezeptors (CD 91) in die Zelle
internalisiert (Casslen, B. et al. 1998; Conese, M. et al. 1995; Nykjaer, A. et al.
1997). Dort werden PAI-1 und uPA lysosomal abgebaut, während der uPAR auf der
Zelloberfläche regeneriert wird und erneut uPA binden kann. Bei Tumorzellen wird
der uPAR an die Migrations-/Invasionsfront regeneriert, wodurch die gerichtete
proteolytische Aktivität zustande kommt.
Im Gegensatz dazu wird der trimäre Komplex aus uPAR-uPA-PAI-2 (siehe Kapitel
2.6.1) nicht internalisiert, sondern auf der Zelloberfläche prozessiert. Durch
Spaltung des Komplexes entstehen 2 Fragmente: Ein 70 kD großes Fragment, das
PAI-2 und das aktive Zentrum von uPA enthält und ein 22 kD-Fragment, das das
ATF von uPA sowie uPAR enthält. Das ATF bleibt an uPAR gebunden und
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2. Urokinase Inhibitoren 13
verhindert dadurch die erneute Bindung von uPA an den Rezeptor (Ragno, P. et al.
1995; Ragno, P. et al. 1998).
Somit kann PAI-2 als „wirklicher“ Inhibitor von uPA und uPAR betrachtet werden,
während PAI-1 zwar die proteolytische Aktivität von uPA inhibiert, der uPAR aber
nach erfolgter Internalisierung des trimären Komplexes wieder auf die
Zelloberfläche zurückkehrt und erneut uPA binden kann. Dieser Unterschied ist ein
Grund für die unterschiedliche prognostische Relevanz von PAI-1- und PAI-2-
Konzentrationen in Tumoren (siehe Kapitel 2.4).
2.4. Klinische Relevanz von uPA, uPAR, PAI-1 und PAI-2
Nach der chirurgischen Entfernung eines soliden Tumors muß anhand geeigneter,
experimentell bestimmbarer Parameter das Risiko einer Neuerkrankung abgeschätzt
werden, um die Art und Intensität einer notwendigen Nachbehandlung (z. B.
Chemotherapie oder Bestrahlung) festzulegen. Seit einigen Jahren haben sich die
Bestandteile des uPA-uPAR-Systems zu wichtigen prognostischen Markern bei
einer Vielzahl von Krebserkrankungen entwickelt. Allein in den letzten 5 Jahren
sind weit über Hundert Veröffentlichungen zu diesem Thema erschienen. Der
interessierte Leser sei deshalb an dieser Stelle nur auf einige neuere Reviews
verweisen: (Allgayer, H. et al. 1997; Duffy, M. J. et al. 1999; Harbeck, N. et al.
1998; Look, M. P. et al. 1999; Pappot, H. et al. 1995; Reuning, U. et al. 1998).
Untersuchungen haben ergeben, daß hohe uPA-Werte nach der operativen
Entfernung verschiedener Tumoren mit einer schlechten Prognose für das
krankheitsfreie Überleben des Patienten verbunden sind. PAI-1-Werte stellten sich
mit der Zeit als noch bessere prognostische Marker heraus. Interessanterweise sind
es ebenfalls hohe Werte dieses uPA-Inhibitors, die eine schlechte Prognose
bedeuten, obwohl zunächst die proteolytische Aktivität von uPA gehemmt wird.
Eine mögliche Erklärung dieses Phänomens ist die Tatsache, daß der uPAR nach
Internalisierung des trimären Komplexes aus PAI-1/uPA/uPAR an der
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2. Urokinase Inhibitoren 14
Invasionsfront der Tumorzelle regeneriert wird und es nach Bindung von uPA
wieder zur gerichteten Proteolyse kommt.
Untersuchungen des uPAR-Gehalts zeigten ebenfalls, daß hohe Antigenwerte im
Tumorgewebe, aber auch im Blut, mit einer schlechten Prognose korrelieren, wenn
auch mit geringerer Signifikanz. Im Gegensatz zu den anderen Komponenten des
PA-Systems korrelieren hohe PAI-2-Werte mit einer guten Prognose für
rezidivfreies und Gesamtüberleben.
2.5. Inhibition des uPA-uPAR-Systems – Prinzipielle Therapieansätze
Wie in den Kapiteln 2.1-2.3 erläutert, spielt uPA eine zentrale Rolle in der Plasmin-
aktivierungskaskade und damit in den Prozessen der Tumorinvasion und
Metastasierung. Im vorangehenden Kapitel wurde gezeigt, daß hohe uPA- und
uPAR-Werte mit einer schlechten Prognose für das Überleben eines Krebspatienten
einhergehen. Aus diesen Befunden ergeben sich vier unterschiedliche Ansatzpunkte
zur therapeutischen Interaktion mit dem uPA-uPAR-System wie in Abbildung 6
erläutert.
-
2. Urokinase Inhibitoren 15
GPI
GFD
Kringle
Protease
uPAR
GFD
Kringle
Protease
GFD
Kringle
Protease
GPI
uPAR
Inhibitor desaktiven Zentrums
uPA-Antagonist
uPAR-Antagonist
Inhibition derGenexpression(Antisense)
Aktives Zentrum
Abbildung 6: Inhibitionsmöglichkeiten des uPA/uPAR-Systems
• Reduktion der uPA- und/oder uPAR-Expression durch Antisense-Nukleotide
• uPAR-Antagonisten: Die Blockade des uPAR führt zu einer langsamerenAktivierung von uPA und vor allem zur Aufhebung der Zelloberflächen-
fokussierung der proteolytischen Aktivität. Hierzu wurden z. B. zyklische,
vom ATF abgeleitete Peptide entwickelt, die etwa genauso gut an den
Rezeptor binden wie uPA selbst (Burgle, M. et al. 1997).
• uPA-Antagonisten: ähnlich wie uPAR-Antagonisten können auch uPA-Antagonisten die Fokussierung der Proteolyse auf die Zelloberfläche
verhindern. Als möglicher Ansatzpunkt erwies sich „löslicher“ uPAR der
mit zelloberfächengebundenem uPAR um die Bindungsstelle zu uPA
konkurriert (Behrendt, N. et al. 1996)
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2. Urokinase Inhibitoren 16
• synthetische „uPA-Active-Site“-Inhibitoren zur Verringerung derproteolytischen Aktivität von uPA. Solche Inhibitoren müssen
hochspezifisch sein, da sonst auch verwandte Serinproteasen gehemmt
werden, wodurch sich eventuell schwere Nebenwirkungen ergeben könnten.
2.6. uPA-Inhibitoren
Die proteolytische Aktivität von uPA wird durch 2 natürliche Inhibitoren reguliert.
Wegen der zentralen Rolle von uPA in pathologischen Prozessen wie der
Tumorinvasion und der Metastasierung, werden zunehmend auch synthetische
Inhibitoren als potentielle Arzneimittel interessant. Für eine Zusammenstellung
natürlicher und synthetischer Inhibitoren siehe auch Magdolen, V. et al. (2000).
2.6.1. Natürliche uPA-Inhibitoren
Die Aktivität des uPA/uPAR-Systems wird durch die Plasminogenaktivator-
Inhibitoren Typ 1 (PAI-1) und Typ 2 (PAI-2) reguliert [für Reviews zu diesen
Inhibitoren siehe Egelund, R. et al. (1997) und Ny, T. et al. (1997)]. Diese beiden
Inhibitoren gehören zur Serin-Protease-Inhibitor Superfamilie (Serpine) und
besitzen 55% Sequenzhomologie (33% Aminosäureidentität). Die strukturelle
Ähnlichkeit der beiden Proteine wurde durch Röntgenkristallstrukturen aktiver
Mutanten bewiesen [PAI-1: PDB-Code: 1B3K (Sharp, A. M. et al. 1999); PAI-2:
PDB-Code: 1BY7 (Harrop, S. J. et al. 1999)]. Beide Inhibitoren hemmen sowohl
uPA als auch tPA („Tissue-Type Plasminogen Activator“) durch Bildung eines 1:1
Komplexes. Aktives PAI-1 ist nur metastabil (Halbwertszeit etwa 2 h) und geht
spontan in eine latente, inaktive Konformation über. Durch Einführen von 4
Punktmutationen kann die Halbwertszeit allerdings auf über 140 h verlängert
werden (Berkenpas, M. B. et al. 1995). In vivo wird die Halbwertszeit von aktivem
PAI-1 durch Bindung an das extrazelluläre Matrix- und Plasma-Protein Vitronektin
auf etwa 4 h verdoppelt (Kanse, S. M. et al. 1996). Im Gegensatz zu PAI-2, wird
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2. Urokinase Inhibitoren 17
PAI-1 mit einem Signalpeptid (21 Aminosäuren) synthetisiert und von den Zellen in
glycosylierter Form sezerniert. Dem Inhibitor PAI-2 hingegen fehlt ein spaltbares
Signalpeptid. Es liegt zu 80% in nicht-glycosylierter Form intrazellulär vor (Ny, T.
et al. 1997).
Zwei weitere Serpine, die neben Thrombin, Trypsin, Plasmin bzw. Protein C auch
uPA und tPA hemmen, sind die Inhibitoren der Proteinase Nexin-1 und des Protein-
C. Unter physiologischen Bedingungen reagieren sie allerdings wesentlich
langsamer mit den Plasminogenaktivatoren als PAI-1 und PAI-2 (Andreasen, P. A.
et al. 1997; Sprengers, E. D. et al. 1987). Aprotinin und der Tumor-assoziierte
Trypsininhibitor (TATI) wurden ebenfalls als Inhibitoren von uPA beschrieben. Die
Inhibitionskonstanten dieser Enzyme gegen uPA liegen jedoch im mikromolaren
Bereich, so daß diesen Inhibitoren keine physiologische Bedeutung zukommt.
Tabelle 1: Natürliche uPA-Inhibitoren
Inhibitor Inhibition von uPA Literatur
PAI-1 k2=1-2 x 107 mol-1 s-1 (Thorsen, S. et al. 1988)
PAI-2 k2=2,4 x 106 mol-1 s-1 (Thorsen, S. et al. 1988)
Tumor-Associated TrypsinInhibitor (TATI) Ki = 0,3 µM (Turpeinen, U. et al. 1988)
Aprotinin Ki = 27 µM (Lottenberg, R. et al. 1988)
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2. Urokinase Inhibitoren 18
2.6.2. Synthetische uPA-Inhibitoren
Verglichen mit der Vielzahl reversibler synthetischer Inhibitoren die gegen andere
trypsin-ähnliche Serinproteasen wie z. B. Thrombin (Hauptmann, J. et al. 1999)
oder FXa (siehe Kapitel 3.2) entwickelt wurden, gibt es nur sehr wenige effiziente
uPA-Inhibitoren. Das gemeinsame Strukturmerkmal dieser uPA-Inhibitoren ist eine
basische Amidino- oder Guanidinogruppe, die die Ausbildung einer Salzbrücke zu
Asp189 in der S1-Tasche ermöglicht. Eine Übersicht bekannter uPA-Inhibitoren ist
in Tabelle 2 zusammengestellt. Die meisten dieser Verbindungen zeigen kaum oder
keine Selektivität für uPA, sondern hemmen auch Enzyme des Verdauungstraktes
(Trypsin) sowie der Blutgerinnungskaskade (z.B. Faktor Xa und Thrombin). Die
besten Verbindungen weisen lediglich Inhibitionskonstanten im niederen
mikromolaren Bereich auf.
Billström und Mitarbeiter konnten bei oraler Gabe des Inhibitors p-Amino-
Benzamidin im Mausmodell eine klare Verlangsamung des Wachstums von DU145
Tumoren feststellen (Billström, A. et al. 1995). Das Diuretikum Amilorid stellt
einen selektiven uPA-Inhibitor mit einer allerdings relativ hohen
Inhibitionskonstante von 7 µM dar. Im Mausmodell wurde gezeigt, daß Amilorid
die Bildung von Lungenmetastasen verhindert (Vassalli, J. D. et al. 1987). Die
derzeit potentesten und selektivsten "Active-Site" uPA-Inhibitoren sind die
substituierten Benzo[b]thiophen-2-Carboxamidine B-428 und B-623 mit einem Ki-
Wert von 0,53 bzw. 0,16 µM (Towle, M. J. et al. 1993). Für einen dieser
Inhibitoren, B-428, konnte gezeigt werden, daß diese Verbindung uPA-vermittelte
Prozesse wie die proteolytische Degradation von extrazellulären Matrixproteinen,
Tumorzelladhäsion, -migration und -invasion in vitro effektiv inhibieren kann
(Alonso, D. F. et al. 1996a). Desweiteren hemmt der synthetische Inhibitor in einem
syngenen Mammakarzinom-Maus-Modell die lokale Tumorinvasion (Alonso, D. F.
et al. 1996b; Alonso, D. F. et al. 1998) sowie die Metastasierung von Ratten-uPAR
überexprimierenden Zellen in einem syngenen Modell für Ratten-Prostata-
-
2. Urokinase Inhibitoren 19
Karzinom (Rabbani, S. A. et al. 1995). Bei einer Kombinationstherapie mit dem
Anti-Östrogen Tamoxifen konnte ebenfalls eine Verringerung des Tumorvolumens
und von Metastasen in einem Ratten-Mammakarzinom-Modell beobachtet werden
(Xing, R. H. et al. 1997).
Tabelle 2: Synthetische uPA-Inhibitoren
Inhibitor Inhibition vonuPA
Literatur
NH2NH
NH2
p-Amino-Benzamidin
Ki = 82 µM(Billström, A. et al. 1995;Geratz, J. D. et al. 1981;Jankun, J. et al. 1997)
NH
NH2NH
R
mono-subst. Phenylguanidine
Ki = 6 µM(Yang, H. et al. 1990)
NH
NH2R
Benzamidine
Ki = 5 µM (Stürzebecher, J. et al. 1978)
N
N NH NH2
NHO
NH2
Cl
NH2
Amilorid
Ki = 7 µM(Jankun, J. et al. 1997;Vassalli, J. D. et al. 1987)
NH
NNH
NH2
R
5-Amidinobenzimidazole undAmidinoindole
Ki > 4 µM(Geratz, J. D. et al. 1981;Tidwell, R. R. et al. 1983)
-
2. Urokinase Inhibitoren 20
Inhibitor Inhibition vonuPA
Literatur
SH
R
NH
NH2
Benzo[b]thiophen-2-Carboxamidine
Ki [µM]:
B428: 0,53
B623: 0,16
(Alonso, D. F. et al. 1996a;Alonso, D. F. et al. 1996b;Alonso, D. F. et al. 1998;Rabbani, S. A. et al. 1995;Swiercz, R. et al. 1999;Towle, M. J. et al. 1993;Xing, R. H. et al. 1997)
O
NH O
R
S O
NH2NH
3-Amidinophenylalanin-Derivate
Ki ≥ 0,5 µM(Stürzebecher, J. et al. 1999)
Pyr-Leu-Arg-H (Peptidaldehyd) IC50 = 11 µM(Kawada, M. et al. 1995;Saino, T. et al. 1988)
Ecotin Variante: M84R + D70R Ki = 50 pM(Yang, S. Q. et al. 1998a;Yang, S. Q. et al. 1998b)
-
2. Urokinase Inhibitoren 21
2.7. Zielsetzung
In den vorangehenden Kapiteln wurde die hohe klinische Relevanz des Urokinase-
Typ Plasminogenaktivatorsystems in der Tumorprogression und Metastasierung
näher erläutert. Ziel dieser Arbeit war es, Inhibitoren der proteolytischen Aktivität
von uPA als Leitstrukturen für Therapeutika zu entwickeln. Aufgrund der, auf
medizinische Anwendung hin ausgerichteten Themenstellung, sollten die
Inhibitoren eine möglichst hohe Selektivität gegenüber den strukturverwandten,
trypsin-ähnlichen Serinproteasen aufweisen. Aus dem gleichen Grund sollte es sich
um reversible Inhibitoren, also ohne „Active-Site“-reaktive Gruppe handeln.
Desweiteren sollte das Molekulargewicht aus pharmakokinetischen Gründen nicht
über 500 D betragen.
Als Ausgangspunkt für die Inhibitorenentwicklung diente die Röntgenkristall-
struktur, die 1995 von Spraggon und Mitarbeitern publiziert wurde (Spraggon, G. et
al. 1995). Da die Selektivität sehr wichtig war, sollten alle Verbindungen auch auf
die Inhibition der trypsin-ähnlichen Serinproteasen Thrombin, FXa, tPA, Trypsin
und Plasmin untersucht werden.
Mit vielversprechenden Leitstrukturen sollten Röntgenkristallstruktur-
Untersuchungen durchgeführt werden, um das rationelle Design noch aktiverer
Hemmstoffe zu ermöglichen.
-
2. Urokinase Inhibitoren 22
2.8. Ergebnisse und Diskussion
2.8.1. Tripeptid-Methylketone
Modelling der Tripeptid-Methylketone
Bis vor kurzem war nur eine einzige Röntgenkristallstruktur von uPA im Komplex
mit dem irreversiblen Inhibitor H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon bekannt
(Spraggon, G. et al. 1995). Dieser Inhibitor bildet unter Abspaltung eines
Chloridions eine kovalente Bindung zwischen dem Imidazolring des His57 und der
Methylengruppe des Inhibitors aus. Desweiteren bildet die Seitenkette von Ser195
mit dem Keton ein Halbketal (siehe Abbildung 7), das durch Wasserstoffbrücken
mit Gly193 NH und Ser195 NH stabilisiert ist.
Ausgehend von dieser Struktur wurden Tripeptid-Methylketone als reversible
Inhibitoren synthetisiert, die keine kovalente Bindung mit His57 eingehen können.
Durch Angriff des Ser195 O? an das Keton, ist auch bei diesen Verbindungen die
Halbketalbildung prinzipiell möglich. Dieses Halbketal ist ein Analogon des
tetraedrischen Übergangszustands, der während der Substratspaltung auftritt.
Allerdings können Ketone durch Serinproteasen nicht gespalten werden und eignen
sich deshalb als Inhibitoren, die den genannten Übergangszustand stabilisieren.
-
2. Urokinase Inhibitoren 23
Ser
His
195
57NH N
H
NH2NH
NH
CH2
N
NH
NH2+
NH2
O
ON
O O
O O
S1-TascheS3-Tasche
Gly193
O O
NH2+
NH2
NH
Asp189
Arg217
Abbildung 7: Bindungsmodus des irreversiblen Inhibitors H-Glu-Gly-Arg-
Chloromethylketon an uPA (Spraggon, G. et al. 1995). Wasserstoffbrücken sind als
gestrichelte rote Linien, kovalente Bindungen als durchgezogene rote Linien
dargestellt.
Neben der, direkt aus der Röntgenstruktur entnommenen Peptidsequenz, wurden
auch noch weitere Sequenzen synthetisiert. Eine Studie von Song-Hua Ke (Ke, S.
H. et al. 1997) mit verschiedenen peptidischen Substraten ermittelte eine Präferenz
von uPA für die Sequenz Ser-Gly-Arg (P3-P1), so daß davon auszugehen ist, daß
auch der analoge Tripeptid-Methylketon-Inhibitor eine höhere Affinität zu uPA
besitzen sollte. Modelling-Experimente mit der bekannten uPA-Röntgenstruktur
(Spraggon, G. et al. 1995) ergaben, daß sich der P2-Rest Glycin auch durch das
starrere Prolin ersetzten läßt, wodurch man die Flexibilität des Inhibitors
einschränken und damit den entropischen Verlust bei der Bindung an das Enzym
verringern könnte.
-
2. Urokinase Inhibitoren 24
Festphasensynthese nach der Fmoc-Strategie
Zur Synthese von Methylketonen aus Peptiden sind 2 verschiedene Methoden
gebräuchlich. Die von John S. McMurray und Douglas F. Dyckes beschriebene
Abwandlung der Dakin-West-Reaktion (Dakin, H. D. et al. 1928; McMurray, J. S.
et al. 1985) hat allerdings den Nachteil, daß die C-terminale Aminosäure während
der Reaktion vollständig racemisiert. Eine weitere Methode stellt die Umsetzung
von N-Methoxy-N-Methylamiden (Weinrebamid) mit Methyl-Grignard-Reagenz
dar (Nahm, S. et al. 1981) (Abbildung 8).
R N
O
Me
OMe MeMgBr
THF NMe
OMeRMe
O Mg
R Me
OH3O+
Abbildung 8: Synthese von Methylketonen aus Weinrebamiden
Die N-Methylgruppe des Weinrebamids kann auch durch einen mit einem
polymeren Träger verbundenen Linker ersetzt werden (Dinh, T. Q. et al. 1996). Zur
Synthese der Tripeptid-Methylketone wurde eine Festphasensynthese nach Fmoc-
Strategie an einem Weinreb AM-Harz (NovaBiochem) gewählt (Abbildung 9). Da
das Weinrebamin sehr wenig nukleophil ist, wurde die erste Aminosäure [Fmoc-
Arg(Pbf)-OH] mit HATU/HOAt/DIEA im Verhältnis 1:1:1:2 mit einem 4-fachen
molaren Überschuß an den Harzlinker gekoppelt. Der weitere Aufbau der
Peptidkette erfolgte standardmäßig mit 4 Äquivalenten Fmoc-Xaa-
OH/TBTU/HOBt/DIEA (1:1:1:2). Die Fmoc-Abspaltung war nach 2
aufeinanderfolgenden Zyklen von 3 min und 12 min mit 20% Piperidin in DMF
quantitativ. Im letzten Schritt wurde das seitenkettengeschützte Produkt mit 20
Äquivalenten Methyl-Grignard-Reagenz in absolutem THF unter gleichzeitiger
-
2. Urokinase Inhibitoren 25
Ausbildung des Methylketons vom Harz abgespalten. Die Schutzgruppenabspaltung
erfolgte schließlich in 95% TFA.
PNOMe
ArgFmoc
PNOMe
HCH3 +Arg
PNOMe
Fmoc
1. Piperidin2. Fmoc-Xaa1-OH/ HOBt/HBTU/DIEA
1. Piperidin2. Fmoc-Xaa2-OH/ HOBt/HBTU/DIEA
PNOMe
ArgXaa1Fmoc
1. Piperidin2. Fmoc-Arg(Pbf)-OH/ HOAt/HATU/DIEA
PNOMe
ArgXaa1Xaa2Fmoc
PNOMe
ArgXaa1Xaa2Ac
Xaa1Xaa2Ac
1. CH3MgBr2. H+
1. Piperidine2. Ac2O
Abbildung 9: Synthese von Tripeptid-Methylketonen am polymeren Träger
-
2. Urokinase Inhibitoren 26
Inhibition von uPA und strukturverwandten Enzymen
Alle dargestellten Tripeptid-Methylketone wurden auf Inhibition von uPA und den
strukturverwandten Serinproteasen Plasmin, FXa, Thrombin und Trypsin untersucht
(Tabelle 3). Die Inhibitionskonstanten aller getesteter Verbindungen waren größer
als 1 mM (mit Ausnahme von Verbindung 3, die Trypsin mit 12 µM hemmt).
Aus diesen Ergebnissen wird ersichtlich, daß die Hemmwirkung des irreversiblen
Inhibitors H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon praktisch ausschließlich durch
Bildung einer kovalenten Bindung mit His57 erzielt wird und nicht durch
Wechselwirkung mit den uPA-Bindungstaschen S1-S3. Daraus folgt direkt, daß der
irreversible Inhibitor praktisch keine Selektivität gegenüber den verwandten
Serinproteasen aufweisen kann und deshalb in vivo nicht verwendet werden kann.
Auf der Basis von Peptidaldehyden, die den tetraedrischen Übergangszustand
besser stabilisieren können als Methylketone, könnten vermutlich auch uPA-
Inhibitoren entwickelt werden. Aus oben genannten Gründen würde aber auch mit
solchen Inhibitoren das Selektivitätsproblem nicht zufriedenstellend gelöst werden.
Deshalb wurde schließlich mit der Entwicklung kleiner, organischer Moleküle als
uPA-Inhibitoren ein vollkommen neuer Weg eingeschlagen (Kapitel 2.8.2).
Tabelle 3: Struktur-Wirkungsbeziehung der Tripeptid-Methylketone auf dieInhibition von uPA und verwandten Serinproteasen
Ki [µM]Nr. Sequenz
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(1) Ac-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
(2) Ac-Glu-Gly-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
(3) H-Glu-Pro-D,L-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 12
(4) Ac-Glu-Hyp-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
(5) Ac-Ser-Hyp-Arg-CH3 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
-
2. Urokinase Inhibitoren 27
2.8.2. Phenylguanidin-Derivate als selektive uPA-Inhibitoren
Strukturbasiertes Inhibitordesign
Abbildung 10 zeigt das katalytische Zentrum der Röntgenkristallstruktur von uPA
im Komplex mit dem irreversiblen Inhibitor H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon
(Spraggon, G. et al. 1995). Aus dem Bindungsmodus dieses substratähnlichen
Inhibitors lassen sich einige wichtige Rückschlüsse für das Inhibitordesign ziehen:
• Das natürliche Substrat Plasminogen wird von uPA nach Arginin 560 gespalten.Die Guanidinogruppe des Arginins interagiert dabei mit der Seitenkette von
Asp189 in der S1-Tasche über eine Salzbrücke.
• Verglichen mit der S2-Tasche in Thrombin, ist die S2-Tasche von uPA durchdie Insertion von Thr97A und Leu97B im sogenannten „99-Loop“ stark
verkleinert. In der P2-Position des Substrats oder Inhibitors sind aus diesen
sterischen Gründen kleine Aminosäurereste wie Glycin bevorzugt.
• Ebenso wie in Thrombin gibt es eine S3/S4-Tasche die vorwiegend von denhydrophoben Seitenketten aromatischer Aminosäuren gebildet wird.
Ein möglicher uPA-Inhibitor sollte somit ein Argininmimetikum in P1, einen
kleinen Spacer in P2 und einen hydrophoben Rest in P3 enthalten.
-
2. Urokinase Inhibitoren 28
Abbildung 10: Röntgenkristallstruktur von uPA im Komplex mit dem irreversiblen
Inhibitor H-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon
Untersuchung verschiedener Argininmimetika
Zunächst wurden verschiedene Kopfgruppen synthetisiert und auf ihre
inhibitorische Wirkung getestet (Tabelle 4). Alle enthalten einen hydrophoben
Benzolring, substituiert mit basischen Amidino- bzw. Guanidino-Gruppen.
Prinzipiell sind alle diese Derivate also in der Lage an Asp189 in der S1-Tasche über
eine Salzbrücke zu binden.
Benzamidin (111) und Phenylguanidin (6) inhibieren uPA im mikromolaren
Bereich. Benzylcarbamidin (112), das zu Phenylguanidin isoster ist, hatte hingegen
-
2. Urokinase Inhibitoren 29
keine inhibitorische Aktivität auf die untersuchten trypsinartigen Serinproteasen.
Wegen der besseren Selektivität wurde aufgrund dieser Ergebnisse Phenylguanidin
(6) als Kopfgruppe gewählt.
Tabelle 4: Struktur-Wirkungsbeziehung verschiedener Argininmimetika
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(111)NH2
NH81 350 410 220 35
(6) NH
NH2NH
30 > 1000 > 1000 > 1000 163
(112) NH2NH
> 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
(7) NH NH2
NH> 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
Screening verschiedener Phenylguanidin-Derivate – Suche nach einem
geeigneten P2-Spacer
Im nächsten Schritt wurde versucht, einen P2-Spacer geeigneter Länge zu finden.
Sämtliche Derivate der 4-Guanidino-Benzoesäure (8-11), des 4-Guanidino-Anilins
(31), sowie des 4-Guanidino-Phenylalanins (15, 18, 21) zeigten keine oder nur sehr
geringe hemmende Wirkung auf uPA (Tabelle 5). Interessanterweise sind die zu
Verbindung 18 und 21 analogen 3- bzw. 4-Amidino-Phenlalaninderivate als Serin-
proteaseinhibitoren bekannt (Gabriel, B. 1998; Gabriel, B. et al. 1998;
Stürzebecher, J. et al. 1999). Durch die Guanidinofunktion scheint sich also eine
-
2. Urokinase Inhibitoren 30
völlig andere Bindungsgeometrie zu ergeben. Derivate von 3-Guanidinobenzylamin
erfüllen offensichtlich ebensowenig die strukturellen Voraussetzungen für einen
uPA-Inhibitor (66, 73, 74) wie Sulfonamid-Derivate des 4-Guanidinobenzylamins
(37–45). Einzig und allein Urethanyl- oder Acyl-Derivate des 4-
Guanidinobenzylamins (28, 29, 47, 49, 50) zeigten die gewünschte uPA Inhibition.
Während die Acyl-Derivate 47, 49 und 50 zumindest Trypsin noch mit
vergleichbaren Inhibitionskonstanten hemmen wie uPA, konnte für die
Urethanylderivate 28 und 29 keine Hemmwirkung auf Trypsin, Thrombin, FXa und
Plasmin nachgewiesen werden. Das tert-Butyloxycarbonyl-Derivat (29) wurde nun
als neue Leitstruktur für weitere Derivatisierungen eingesetzt.
Tabelle 5: Substituierte Phenylguanidine – Suche nach einem geeigneten Spacer umdie S2-Tasche zu überbrücken.
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(8) NNH
NH2NH
O
O
O
O
59 400 >1000 36 500
(9) NH
NH2NH
O
N MeMeO
100 100 >1000 >1000 >1000
(10) ONH
NH2NH
O
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(11) NH
NH2NH
O
OMe >1000 n. b. >1000 >1000 >1000
-
2. Urokinase Inhibitoren 31
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(15)NH
NH2NH
NH
OO
OOMe
200 >1000 >1000 85 >1000
(18) NHNH2
NH
NH
OO
OOMe
>1000 300 >1000 >1000 >1000
(21) NHNH2
NH
NH
OOMe
SO
O>1000 >1000 >1000 54 >1000
(37)NH
NHNH2
NH
SO
O
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(38) NHNH
NH2
NH
SO
O
FF
F
F F
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(39) NH
NHNH2
NH
SO
ONH
O >1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(41) NH
NHNH2
NH
SO
OCF3
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(42) SN
NH
NHNH2
NH
SO
ONH
O
240 >1000 >1000 >1000 >1000
-
2. Urokinase Inhibitoren 32
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(43) NHNH
NH2
NH
SO
OF3C
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(44)SO
ON
OCF3
NH
NHNH2
NH
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(45)S
O
OS
O
O
O
NH
NH NH2
NH
NH
NHNH2
NH
>1000 >1000 >1000 >1000 63
(66)NH
NHNH2
NH
ONH >1000 450 600 >1000 >1000
(73)NH
S NH
NH2 NH
O
O >1000 >1000 1300 >1000 >1000
(74)NH
O
ONH
NH2 NH
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(31)NH
ONH
NHNH2O
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(28) NHNH
NH2
NHO
O 16 >1000 >1000 >1000 >1000
-
2. Urokinase Inhibitoren 33
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(29) NH
NHNH2
NHO
O 36 >1000 >1000 >1000 >1000
(47)NH
NHNH2
NHO
NH
OO
37 n. b. >1000 >1000 >1000
(49)NH
NHNH2
NHO
NH
SO
O
NH
O
21 >1000 >1000 >1000 42
(50)NH
NHNH2
NHO
NH
SO
O
32 >1000 >1000 >1000 36
Einfluß der hydrophoben Wechselwirkungen in P3
Im nächsten Schritt sollten die hydrophoben Wechselwirkungen optimiert werden.
Hierzu wurde die tert-Butylgruppe der Leitstruktur 29 sukzessive durch andere
Alkyl-, Zykloalkyl- und aromatische Gruppen ausgetauscht (Tabelle 6). Bei allen
durchgeführten Variationen stellten wir fest, daß der Einfluß der hydrophoben
Wechselwirkungen weitaus geringer war als der Einfluß des geeigneten P2-Spacers
(siehe Tabelle 5). So bewegen sich die Inhibitionskonstanten nur im Bereich
zwischen 10 und 50 µM. Der bis-basische Inhibitor 54 hebt sich mit einer
Inhibitionskonstante von 2,8 µM etwas aus diesem Umfeld ab. Durch die zwei
Guanidino-Benzylaminreste in einem Molekül ist die Konzentration des Inhibitors
formal aber doppelt so hoch, d. h. hätte der Inhibitor nur eine Guanidinofunktion,
-
2. Urokinase Inhibitoren 34
wäre der Ki-Wert etwa 6 µM. Deshalb ist auch nicht davon auszugehen, daß die
zweite Phenylguanidin-Einheit außerhalb der uPA-„Active-Site“ bindet, während
der erste Phenylguanidinrest in der S1-Tasche gebunden ist. Eine deutlichere
Verbesserung der Inhibitionskonstante findet man für diese Verbindung allerdings
in Bezug auf Tryptase, die ein Tetramer mit vier katalytisch aktiven Untereinheiten
bildet. Für die Kopfgruppe 4-Guanidino-Benzylamin (59) wurde gegen Tryptase
eine Inhibitionskonstante von 200 µM ermittelt. Durch den bis-basischen Inhibitor
54 verbessert sich hier der Ki auf 1 µM, was zumindest teilweise für bivalentes
Binden (gleichzeitiges Binden in zwei Untereinheiten der Tryptase) spricht.
Wegen der beobachteten leichten Präferenz für den sperrigen und inerten
Adamantylrest (Verbindung 36) und wegen der kommerziellen Verfügbarkeit der
benötigten Derivate, wurde der Inhibitor 36 als Leitstruktur für die weiteren
Optimierungsschritte gewählt.
Tabelle 6: Optimierung der hydrophoben Wechselwirkungen in P3
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(29) NH
NHNH2
NHO
O 36 >1000 >1000 >1000 >1000
(33) NH
NHNH2
NH
O
O
27 >1000 >1000 >1000 >1000
(34) NH
NHNH2
NHO
O 51 >1000 >1000 >1000 >1000
-
2. Urokinase Inhibitoren 35
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(35) NH
NHNH2
NHO
O 52 >1000 >1000 >1000 >1000
(36) NH
NHNH2
NHO
O 13 >1000 >1000 >1000 >1000
(32) NH
NHNH2
NH
NH2
NH
46 >1000 >1000 >1000 >1000
(59)NH
NHNH2
NH2
>1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(53) NHNH NH2
NH
O
O
NN 11 >1000 >1000 >1000 >1000
(52)NH
NH
NH2NH
O
O
NO2
MeOOMe
35 >1000 >1000 >1000 >1000
(28) NHNH
NH2
NHO
O 16 >1000 >1000 >1000 >1000
(51)O2N
NH
NH
NH2NH
O
O 12 200 >1000 >1000 36
(54) NHNH
NH2
NH
O
OO
ONH
NH
NHNH2
2,8 47 >1000 >1000 11
-
2. Urokinase Inhibitoren 36
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin
(64) NH
NHNH2
NHO
NH
OO
70 390 >1000 >1000 >1000
(65)NH
NHNH2
NHO
NH252 250 >1000 >1000 >1000
Untersuchung der Wasserstoffbrücken-Donor/Akzeptor-Eigenschaften des P2-
Spacers
Als nächstes wurde untersucht, welche Atome des P2-Spacers für die Bindung zum
Enzym wichtig sind. Hierzu wurden einzelne Atome durch isostere Gruppen mit
anderen Wasserstoffbrücken-Donor- bzw. Akzeptoreigenschaften ausgetauscht
(Tabelle 7). So wurde zum Beispiel der Wasserstoffbrückenakzeptor O (Verbindung
36) durch die inerte Gruppierung CH2 (Verbindung 58) bzw. den Donor NH (75)
ausgetauscht. NH als H-Brückendonor scheint an dieser Stelle stark bevorzugt zu
sein, so daß sich die Inhibitionskonstante auf 2,4 µM verbesserte (75). Tauscht man
den Harnstoff in Verbindung 75 durch den isosteren Thioharnstoff (60) aus, ist
keinerlei uPA-Inhibition mehr zu messen. Beim Austausch des benzylischen NH in
Verbindung 75 durch die inerte Methylengruppe (62) verschlechtert sich die
Inhibitionskonstante auf 120 µM. Dieser Austausch beeinflußt auch die Selektivität,
so daß Plasmin vergleichbar gehemmt wird. Das Verkürzen des P2-Spacers von
Verbindung 75 um ein Atom in Verbindung 63 führte ebenso zu einer
Verschlechterung der uPA-Inhibition wie auch der Austausch der Adamantylgruppe
-
2. Urokinase Inhibitoren 37
durch einen Phenylring (Verbindung 77, Ki=29 µM). Der zu Verbindung 77 analoge
Thioharnstoff (55) hemmt uPA nicht-kompetitiv (allosterisch) bei einer
Konzentration von 1 µM, während Trypsin mit Ki=37 µM kompetitiv gehemmt
wird. Diese Beispiele zeigen gut, wie wichtig jedes einzelne Atom eines kleinen
Inhibitors für eine hohe Affinität zum Enzym sein kann.
Die Analyse aller durchgeführten Derivatisierungen ergab folgende Ergebnisse (
Abbildung 11):
NH
NHNH2
NHO
NH
wichtigsehrwichtig
wichtig
essentiell
kann ersetztwerden
Abbildung 11: Analyse des Inhibitors 75, basierend auf den durchgeführten
Derivatisierungen
• Die 4-Guanidino-Benzyleinheit ist essentiell für die Bindung in der S1-Tascheund läßt keine Veränderungen zu
• Der anschließende Harnstoff ist für gute Inhibitionskonstanten wichtig; dasErsetzen einzelner Atome in dieser Gruppe und die damit verbundene
Abnahme der uPA-Inhibition, stützt die Annahme, daß die Harnstoffgruppe
in drei Wasserstoffbrücken involviert ist.
• Die Art und Größe der hydrophoben Gruppe (hier Adamantan) spielt eineuntergeordnete Rolle – durch andere Derivate mit Wasserstoffbrücken-
Donor/Akzeptoreigenschaften läßt sich die uPA-hemmende Wirkung des
Inhibitors eventuell noch verbessern
-
2. Urokinase Inhibitoren 38
Tabelle 7: Optimierung des P2-Spacers durch Austausch einzelner Atome durchisostere Gruppen mit anderen Wasserstoffbrücken-Donor/Akzeptor-eigenschaften
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin tPA
(36) NH
NHNH2
NHO
O 13 >1000 >1000 >1000 >1000
(58) NH
NHNH2
NHO
40 >1000 >1000 >1000 n. b.
(75) NH
NHNH2
NHO
NH 2,4 >1000 >1000 600 >1000
(62) NH
NHNH2
CH2O
NH
120 130 >1000 >1000 n. b.
(60) NH
NHNH2
NHS
NH >1000 >1000 >1000 >1000 >1000
(77) NH
NHNH2
NHO
NH
29 170 >1000 >1000 >1000
(76) NH
NHNH2
NHO
NH 7,4 200 220 >1000 n. b.
(63) NH
NHNH2
NHO
102 460 >1000 >1000 n. b.
-
2. Urokinase Inhibitoren 39
Ki [µM]Nr. Formel
uPA Plasmin FXa Thrombin tPA
(56)NH
NH
NH2NH
O
18 >1000 >1000 >1000 >1000
(78) NH
NHNH2
NHO
NHO
Cl37 180 >1000 >1000 n. b.
(55) NH
NHNH2
NHS
NH
nicht-
kompetitiv>1000 >1000 >1000 n. b.
Synthese des Inhibitors N-Adamantyl-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff (75)
Zur Synthese von N-Adamantyl-N'-(4-Guanidinobenzyl)-Harnstoff (Abbildung 12)
geht man vom kommerziell erhältlichen p-Aminobenzylamin aus. Im ersten Schritt
wird die Aminomethylgruppe mit tert-Butyloxycarbonyl geschützt (22).
Anschließend erfolgt die Umsetzung mit einem bis-Benzyloxycarbonyl-geschützten
Guanidinylierungsreagenz (Feichtinger, K. et al. 1998). Nach Abspaltung der Boc-
Schutzgruppe (23) wird das freie Amin mit Adamantylisocyanat zum
Adamantylharnstoff umgesetzt. Im letzten Schritt wird die Guanidinofunktion durch
katalytische Hydrierung an einem Pd-Katalysator entschützt um Inhibitor 75 zu
erhalten.
-
2. Urokinase Inhibitoren 40
NH2
NH2
BOC2O (NH-Z)CF3SO2 N C (NH-Z)
NH
NH2
NH
N
Z
Z
H2/Pd/C
NHNH
N
Z
Z
NH
O
NH H
HH
NH2
NH
O
O *HCl
1.
2. 6M HCl/Dioxan
NHNH2
NH
NH
O
NH H
HH
1-Adamantylisocyanat/TEA
(75)
(23)(22)
Abbildung 12: Synthese des Inhibitors N-Adamantyl-N'-(4-Guanidinobenzyl)-
Harnstoff (75)
Röntgenkristallstruktur-Untersuchung des uPA/Inhibitor-75-Komplexes
In Kooperation mit der Arbeitsgruppe für Strukturforschung ist es gelungen die
rekombinant hergestellte uPA-B-Kette im Komplex mit Benzamidin zu
kristallisieren. Da Benzamidin ein schwacher uPA-Inhibitor ist, konnte es im
Kristall mittels der „Soaking“-Technik durch den Inhibitor 75 ersetzt werden.
Abbildung 13 zeigt die halbtransparente Oberflächendarstellung der
Röntgenstruktur von uPA im Komplex mit dem Inhibitor 75. Das Enzym ist in der
Standardorientierung für Serinproteasen abgebildet, das heißt die „Active-Site
Cleft“ verläuft von links nach rechts.
-
2. Urokinase Inhibitoren 41
Abbildung 13: Halbtransparente Oberflächendarstellung des uPA/Inhibitor 75-
Komplexes
Wie erwartet bindet der Phenylguanidinteil in die S1-Tasche unter Ausbildung der
canonischen Salzbrücke zu Asp189. Die Harnstoffgruppe durchquert das katalytische
Zentrum und plaziert den sperrigen Adamantylrest in die S1'-Tasche.
-
2. Urokinase Inhibitoren 42
Abbildung 14: Vergleich der Bindungsmodi des irreversiblen Inhibitors H-Glu-
Gly-Arg-Chloromethylketon (C-Atome in gelb) und des Inhibitors
75 (C-Atome in grün)
Wie oben erläutert, wurde der Inhibitor ursprünglich dahingehend entwickelt, daß er
die Taschen S1-S3 von uPA zur Bindung nutzt. Substratähnliche Inhibitoren wie
das in Abbildung 14 gezeigte Tripeptid-Chloromethylketon (C-Atome in gelb)
würden in diese Taschen binden. Der Inhibitor 75 (C-Atome in grün) durchquert in
unerwarteter Weise das aktive Zentrum und plaziert den hydrophoben Rest in die
S1’-Tasche. Dieser völlig neue Bindungsmodus ermöglicht es erstmals die
gestrichene Seite der „Active-Site“ für strukturbasierte Verbesserungen des
Inhibitors zu nutzen.
Das Schema in Abbildung 15 zeigt den experimentellen Bindungsmodus des
Inhibitors 75 in uPA.
-
2. Urokinase Inhibitoren 43
NH
NH2NH2
NH
O
NH
OO
+
-
O
H2O
Ala183
Asp189
OHO
O
Gly219
Ser190
H2O
O
Ser214
H2O
NH2
O
Gln192
SS
Cys58
Cys42NH
NHis57
NH
Gly193
BackboneGly 193Asp194Ser195
2.72Å
2.67Å
2.90Å
2.58Å
2.82Å
2.90Å
2.66Å
2.91Å
3.20Å
3.10Å
2.78Å
Abbildung 15: Bindungsmodus des Inhibitors 75 (blau) an uPA (wichtige Reste in
schwarz). Wasserstoffbrückenbindungen sind als rote, punktierte
Linien wiedergegeben.
Neben der canonischen Salzbrücke zu Asp189 ist die Guanidinofunktion noch in
zwei weitere Wasserstoffbrücken zu Gly219 O und der Seitenkette von Ser190
involviert. Interessanterweise binden die Stickstoffatome der Harnstoffgruppe über
Wassermoleküle einerseits zu Ser214 O und andererseits zur Seitenkette von Gln192.
Das Sauerstoffatom der Harnstoffgruppe formt eine starke Wasserstoffbrücke mit
Gly193 N. Wie bereits auf Seite 36 gezeigt, ist das Austauschen eines Atoms der
Harnstoffgruppe stets mit einem Verlust an Hemmwirkung des Inhibitors
verbunden. In Anbetracht der Tatsache, daß die Harnstoffgruppe in drei
Wasserstoffbrücken involviert ist, läßt sich dieser Befund sehr leicht erklären.
-
2. Urokinase Inhibitoren 44
Die Adamantylgruppe ist an hydrophoben Wechselwirkungen beteiligt. Zum einen
mit den „Backbone“-Atomen zwischen Gly193 und Ser195, mit der Disulfidbrücke
zwischen Cys58 und Cys42 und schließlich mit der hydrophoben Ebene des
Imidazolrings von His57.
Der Inhibitor durchquert die „Active-Site“ ohne direkte Wechselwirkung mit den
katalytischen Resten Ser195 und His57. In der aktiven Konformation dieser Reste
wäre das Binden des Inhibitors im gefundenen Bindungsmodus aus sterischen
Gründen nicht möglich. Um die Bindung des Inhibitors dennoch zu ermöglichen,
müssen die Seitenketten von Ser195 und His57 eine andere Konformation einnehmen.
Abbildung 16: Umordnung der „Active-Site“-Reste His57 und Ser195 durch die
Bindung von Inhibitor 75. (violett: aktive Konformation der
katalytischen Triade; grün: umgeordnete Konformation während
der Bindung des Inhibitors 75)
-
2. Urokinase Inhibitoren 45
In violett ist in Abbildung 16 die natürliche, aktive Anordnung der katalytischen
Triade dargestellt, wie man sie auch in der Röntgenstruktur von uPA im Komplex
mit Benzamidin vorfindet. Der Imidazolring von His57 bildet Wasserstoffbrücken-
Bindungen zu Asp102 und Ser195.
Während der Bindung des Inhibitors 75 werden diese Reste nun aus Platzgründen
umgeordnet, wie in Abbildung 16 in gün dargestellt. Dabei wird das ursprüngliche
Netz aus Wasserstoffbrücken zerstört. Um den damit verbundenen energetischen
Verlust wenigstens teilweise zu kompensieren, wird ein Wassermolekül neu in die
Struktur eingefügt. Dieses Wassermolekül ist nahezu perfekt tetraedrisch zwischen
Ser195, His57, Asp102 und Ser214 koordiniert.
Die hier beobachtete Umordnung zeigt ganz klar die Grenzen der heutigen
Modellingprogramme, die solche Adaptionen des Enzyms nicht berücksichtigen
können. Deshalb war es auch nicht möglich, den gefundenen Bindungsmodus mit
dem Computerprogramm FlexX vorherzusagen.
Diskussion der Selektivität des Inhibitors 75
Wie aus Tabelle 8 hervorgeht, besitzt der Inhibitor eine sehr hohe Selektivität. Die
wichtigsten Enzyme der Blutgerinnungskaskade sowie tPA und Plasmin, die für die
Fibrinolyse notwendig sind, werden von diesem Inhibitor nicht beeinflußt.
Wodurch die hohe Selektivität für uPA zustande kommt, ist aber trotz gelöster
Röntgenkristallstruktur nicht einfach zu verstehen. Im Falle von Thrombin, FXa
und tPA ist Ser190 durch Ala ersetzt (siehe Abbildung 15). Dadurch kann in diesen
Enzymen die Wasserstoffbrücken-Bindungskapazität der Guanidinogruppe nicht
vollständig abgesättigt werden. Desweiteren ist in Thrombin (Bode, W. et al. 1989)
und FXa (Padmanabhan, K. et al. 1993) die S1'-Tasche durch die Seitenketten von
Lys60F bzw. Gln61 kleiner als in uPA. In tPA befinden sich die geladenen
Seitenketten von Arg39 und Glu60A nahe an der S1'-Tasche, und würden die
-
2. Urokinase Inhibitoren 46
hydrophoben Wechselwirkungen der Adamantylgruppe stören. Aus sterischen
Gründen wäre auch die notwendige Umorientierung des His57 (siehe Seite 44) in
Thrombin, FXa und tPA stark gehindert. Die synergistische Wirkung aller dieser
und wahrscheinlich noch weiterer kleiner Unterschiede, wird also letztlich zur
beobachteten hohen Selektivität des Inhibitors 75 beitragen.
Tabelle 8: Inhibitionskonstanten von Inhibitor 75 für verschiedene Serinproteasen
Ki [µM]Inhibitor
uPA Plasmin FXa Thrombin Trypsin tPA TryptasePlasma-
KallikreinFXIIa
75 2,4 >1000 >1000 600 46 >1000 400 >1000 >1000
Strukturbasierte Vorschläge zur Verbesserung der Leitstruktur 75
Die genaue Kenntnis des Bindungsmodus des Inhibitors 75 wird in Zukunft die
Optimierung dieser Leitstruktur stark vereinfachen. In diesem Kapitel sollen einige
Verbesserungsvorschläge vorgestellt werden, die wahrscheinlich eine stärkere
Bindung des Inhibitors zum Enzym ermöglichen würden und somit die
Inhibitionskonstante verbessern könnten (Abbildung 17).
• Optimierung der hydrophoben Wechselwirkungen in der S1'-Tasche:Insbesondere die hydrophobe Wechselwirkung mit der Disulfidbrücke
zwischen Cys58 und Cys42 dürfte sich durch Einführung eines
Chlorsubstituenten im Adamantylrest deutlich verbessern lassen.
• Optimierung von Wasserstoffbrückenbindungen in des S1'-Tasche:Südöstlich der Adamatylgruppe befindet sich im Kristall ein
Wassermolekül, das zwischen Tyr151 Oγ, Val41 O und Tyr40 O dreifachkoordiniert und somit in der Elektronendichte gut definiert ist. Durch einen
Hydroxymethl-Substituenten am Adamantylrest, ließe sich dieses
Wassermolekül aus der Struktur verdrängen und die Hydroxyfunktion wäre
-
2. Urokinase Inhibitoren 47
anschließend nahezu perfekt tetraedrisch koordiniert. Anstelle der
Hydroxymethl-Gruppe könnte z. B. auch eine Carbonsäureamidfunktion
verwendet werden.
• Optimierung der Wasserstoffbrücken-Bindungen der Harnstoffgruppe:Wie in Abbildung 15 dargestellt, binden die Stickstoffatome des bis-
substituierten Harnstoffs über Wassermoleküle an Ser214 O und an die
Seitenkette von Gln192. Durch Substitution der Harnstoff-Stickstoffatome
mit Hydroxyethylfunktionen, ließen sich zwei direkte Wasserstoffbrücken
zwischen dem Inhibitor und dem Enzym verwirklichen, die eine höhere
Bindungsstärke bewirken als die beiden wasservermittelten Bindungen.
Beispiele für die Realisierung eines solchen Inhibitors sind in Abbildung 17 und 18
zusammengefaßt.
NH
NH2NH2
O
Cl
OH
OH
OH
OO
+
-
Asp189
OHO
O
Gly219
Ser190
O
Ser214NH2
O
Gln192
SS
Cys58
Cys42NH
NHis57
NH
Gly193
2.72Å
2.67Å
2.90Å 2.90Å
2.78Å
OH
Tyr151
O
O
Tyr40
Val41
Abbildung 17: Möglicher Bindungsmodus eines strukturbasiert verbesserten
Inhibitors (Änderungen sind in grün dargestellt)
-
2. Urokinase Inhibitoren 48
NH
NHNH2
N
O
Cl
NH2
NH2
OH
O
O NH
NHNH2
O
HHH
Cl
NH2
NH2
OH
O
O
NH
NHNH2
O
NH2
OH
O
NH2
O
Abbildung 18: Weitere Strukturvorschläge für Inhibitoren mit verbesserten
Bindungseigenschaften
Untersuchung der Toxizität des Inhibitors 75
Die Zytotoxizität des Inhibitors wurde für drei verschiedenen Krebszellinien
bestimmt, indem steigende Inhibitorkonzentrationen zusammen mit den Zellen
inkubiert wurden und anschließend die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmt wurde.
Die abgebildeten Kurven (Abbildung 19) repräsentieren die Ergebnisse nach 48 h
Inkubation, wobei sich nach 24 bzw. 72 h aber sehr ähnliche Resultate ergaben.
Dies bedeutet, daß bestimmte Inhibitorkonzentrationen toxisch wirken, die
Inkubationszeit hingegen scheinbar keinen Einfluß auf die Toxizität einer
bestimmten Konzentration hat. Für zwei Zellinien (MDA-MB-231 und OV-MZ-6)
war der Inhibitor bis zu einer Konzentration von 250 µM nicht toxisch.
Interessanterweise beeinflußte diese Konzentration bereits die Überlebensrate der
Keratinozyten-Krebszellinie A431. Auf jeden Fall liegen die toxischen
Konzentrationen aber 50- bis 100-fach über den Inhibitionskonstanten, was einen
großen therapeutischen „Spielraum“ für Tierexperimente schafft.
-
2. Urokinase Inhibitoren 49
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
0 1 5 10 15 20 50 100
250
500 750 1000
Inhibitor-Konzentration [µM]
Abs
orpt
ion
[560
-640
nm
]
MDA-MB-231 OV-MZ-6A431 Puffer Kontrolle
Abbildung 19: Effekt des Inhibitors 75 auf die Zellproliferation. Die
Pufferkontrolle ist nur für OV-MZ-6-Zellen dargestellt
Pharmakokinetische Charakterisierung
Ein guter Anhaltspunkt für die orale Bioverfügbarkeit einer Substanz ist der
Verteilungskoeffizient zwischen Oktanol und Wasser. Eine sehr gute orale
Aufnahme erhält man normalerweise wenn der Logarithmus des
Verteilungskoeffizienten (logPOktanaol/Wasser) etwa +2 ist. In Übereinstimmung mit der
bei physiologischem pH positiv geladenen
Guanidinogruppe entspricht der Logarithmus des
Verteilungskoeffizienten der Verbindung 75 einem
Wert von –1,3 (experimentell mittels HPLC
bestimmt). Dies bedeutet, daß die orale
Bioverfügbarkeit des Inhibitors wahrscheinlich
eher schlecht ist, sofern keine aktiven
Transportsysteme für diese Verbindung existieren.
SO
NH
O
O
NH
O N
NH2 NHNAPAP
-
2. Urokinase Inhibitoren 50
Für Clearance-Studien wurde der Inhibitor intravenös in Ratten appliziert. Die
Dosis betrug 1 mg/kg. Wie in Abbildung 20 dargestellt, wird der Inhibitor 75 sehr
rasch aus der Blutzirkulation eliminiert. Die Eliminationsrate ist vergleichbar mit
der Eliminationsrate des bekannten Thrombin-Inhibitors NAPAP (siehe
Formelzeichnung) der ebenfalls eine basische Gruppe und einen hydrophoben Rest
besitzt. Leider liegen noch keine Ergebnisse bezüglich des Eliminationsweges oder
in Bezug auf den Metabolismus der Verbindung 75 vor.
Abbildung 20: Plasma-Elimination des Inhibitors 75 nach intravenöser
Applikation von 1 mg/ml in Ratten
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3. Faktor Xa Inhibitoren 51
3. Faktor Xa Inhibitoren
3.1. Die Blutgerinnungskaskade: ein therapeutischer Ansatz bei
Thromboseerkrankungen
Die Blutgerinnung hat eine Notfallfunktion: größere Blutverluste sollen bei
Gefäßverletzungen vermieden werden. Der Hauptvorgang dieser Gerinnung besteht
darin, daß lösliches Fibrinogen (Faktor I) in unlösliches Fibrin überführt wird, das
anschließend durch Faktor XIIIa zu einem festen Fibringerinsel vernetzt wird.
Hierfür ist ein proteolytischer Katalysator, das Thrombin, notwendig. Durch
Proteolyse wird das Zymogen Prothrombin (Faktor II) in Thrombin umgewandelt.
Diese Aktivierung wird von Faktor Xa (FXa, andere Namen: Plasma-
Thrombokinase, Plasma-Thromboplastin, Stuart-Power-Factor, Autoprothrombin
C) katalysiert. FXa seinerseits wird wiederum durch proteolytische Spaltung aus der
inaktiven Vorstufe Faktor X gebildet. Die komplette Kaskade der einzelnen
Aktivierungsschritte, die letztendlich zur Bildung von Fibrin führt ist in Abbildung
21 dargestellt.
Man unterscheidet zwei unterschiedliche Aktivierungskaskaden die letztlich bei der
Aktivierung von FX zusammenlaufen. Beim intrinsischen System beginnt die
Blutgerinnungskaskade intravasal durch Kontaktaktivierung von FXII an
„Rauhigkeiten“ der endothelialen Auskleidung der Gefäße. Der extrinsische
Aktivierungsprozeß beruht hingegen auf der Freisetzung von FIII („tissue factor,
TF) aus dem endoplasmatischen Retikulum beschädigter oder zestörter
Gewebszellen. Die extrinsische Aktivierungskaskade läuft somit nach einer
Verletzung der Blutgefäße ab, aber auch bei einem Herzinfarkt oder anderen
pathologischen Zuständen (z. B. Entzündung oder Blutvergiftung) wird FIII
freigesetzt. Nach Bindung von FVII an den freigesetzten TF wird FVIIa durch
Autoaktivierung oder durch Proteolyse (Thrombin, FXa, FXIIa) erzeugt. Da beide
Enzymkaskaden bei der Aktivierung von FX zusammenlaufen, spielt der
entstehende FXa eine zentrale Rolle innerhalb des Blutgerinnungssystems.
-
3. Faktor Xa Inhibitoren 52
Faktor XI Faktor XIa
+
Faktor IX Faktor IXa
Ca2+
+
Faktor X Faktor XaCa
2+ +Faktor VIIIa, PL,
+
Prothrombin ThrombinCa
2+ +Faktor Va, PL,
+
+
Fibrinogen Fibrin
Faktor XIIIa
Fibrin(quervernetzt)
+
OberflächeFaktor XIIHMW-KininogenPrekallikrein
+
+
Faktor VIIa Faktor VII
Faktor IX
Faktor X
+
+ PL
+ Faktor III, PL
ThrombinFaktor XaFaktor XIIa
+
+Aktivierung
Co-Faktoren
Legende:
Intrinsischer Weg Extrinsischer Weg
Spaltprodukte
-
+
Plasminogen Plasmin
uPA,tPA
- Abbau FIBRINOLYSE
BLUTGERINNUNG
PL: Phospholipid
Abbildung 21: Die Blutgerinnungskaskade
-
3. Faktor Xa Inhibitoren 53
Die Synthese der Zymogene Prothrombin, FXII, FIX und FX ist Vitamin-K
abhängig. Sie enthalten γ-Carboxyglutaminsäurereste (Gla) die zusammen mitCalciumionen die funktionelle Gla-Domäne bilden und sich dadurch an
Phospholipidmembranen anheften können. Bei Vitamin-K-Mangel kann die
zusätzliche γ-Carboxylgruppe nicht in vorhandene Glutaminsäurereste eingebautwerden. Nach ihrer
Aktivierung sind die
Proteasen ohne Gla-Reste
viel weniger aktiv als jene
mit funktioneller Gla-
Domäne. In diesen
Mechanismus greifen die
oral wirksamen Vitamin-K-
Antagonisten Dicumarol,
Warfarin, Acenocoumarin
und Phenocumaron
(Abbildung 22) ein (Gulba,
D. C. 1996). Allerdings sind bei der Behandlung mit diesen Wirkstoffen auch viele
andere Proteasen betroffen, so daß eine Dauerbehandlung von Patienten nur unter
ständiger ärztlicher Kontrolle möglich ist. Die Anwendung beschränkt sich daher
auf die Prophylaxe nach akuten thrombotischen Ereignissen (Glusa, E. et al. 1996).
Ein weiterer Nachteil der Coumarin-Derivate ist der um 24 bis 36 h verzögerte
Wirkungseintritt nach Behandlungsbeginn, sowie die sich erst nach einigen Tagen
wieder einstellende Normalisierung des Blutgerinnungssystems nach Absetzen des
Medikaments.
Bestehende Blutgerinsel werden durch Plasmin wieder aufgelöst. Zur Fibrinolyse
bei akuten Thrombosen werden deshalb tPA oder andere Plasminogenaktivatoren
intravenös verabreicht (siehe Abbildung 21 unten).
O
OH
O O
OH
O O O
O
OH
O O
OH
O O
OH
NO2
O
Dicumarol Warfarin
Acenocoumarin Phenocoumaron
Abbildung 22: Vitamin-K-Antagonisten als oralwirksame Antikoagulantien
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3. Faktor Xa Inhibitoren 54
3.2. Natürliche und synthetische FXa Inhibitoren
Die Blutgerinnungskaskade ist ein hochreguliertes System. Bis auf FVIIa werden
alle aktiven Gerinnungsenzyme durch das Glykoprotein Antithrombin III (ATIII)
inhibiert. Durch Heparin wird die ansonsten langsam verlaufende Bildung des
Enzym-Inhibitor-Komplexes zwischen ATIII u