TRABAJO COLABORATIVO 2

Presentado Por:Wilson Ernesto OviedoDiana Mara HernndezMari Stella MartnezCarolina Villa

Presentado A:Carlos German PastranaBiotecnologa Alimentaria-211619-10

Universidad Nacional Abierta y a Distancia UNADEscuela de Ciencias Bsicas Tecnologa e Ingeniera ECBTESeptiembre - 2015

DESARROLLO DEL CUESTIONARIOARTICULO 3

3.1 Qu tipos de tecnologas son mostrados en el artculo?

TECNOLOGA DE ENZIMAS O ENZIMTICALa tecnologa enzimtica tiene como objetivo la superacin de todos aquellos inconvenientes que parecen retrasar la aplicacin de las enzimas en estos procesos a escala industrial, las enzimas son protenas cuya funcin biolgica es catalizar las reacciones que suceden en las clulas. Esta rea tiene aplicaciones desde tiempos remotos como la fermentacin, actualmente en diferentes industrias a diferentes niveles, ya que implica la utilizacin de sistemas enzimticos diversos que optimizan el procesamiento en la obtencin de detergente, aditivos alimenticios, productos qumicos y farmacuticos. La tecnologa enzimtica se presenta como alternativa biotecnolgica basada en que las industrias desarrollen productos de calidad homognea, aprovechen ptimamente sus materias primas, aceleres sus procesos de produccin, minimicen desperdicios y disminuyan el deterioro del medio ambiente.Dextransucrase (CE 2.4.1.5), la enzima extra celular perteneciente a la familia glucsido hidrolasa 70, es de inmensa importancia industrial debido a su dextrano y prebiticas propiedades de oligosacridos de sntesisDextransucrase es una glucosiltransferasa (EC 2.4.1.5) que cataliza la transferencia de residuos de glucosilo a partir de sacarosa (S) a polmero de dextrano y libera fructosa (F) de acuerdo con la siguiente ecuacin (8): n S n F + dextrano (glucosa) n.Los dextranos se puede utilizar como aumentador de la viscosidad, estabilizantes, emulsionantes, edulcorante, gelificante o agentes fijadores de agua en los alimentos produccin, as como en las industrias no alimentarias.El dextrano es un de alto peso molecular en masa (10 7 a 10 8 Da) glucano (26). Se compone de una cadena lineal de residuos de glucosilo todos ellos vinculados a travs de (1 6) enlaces glucosdicos y varios (1 2), (1 3), o (1 4) ramificado vnculos (27).El dextrano tiene numerosas aplicaciones industriales y mdicas. Purifica mtodos tales como sal o precipitacin con alcohol, el fraccionamiento por poli-etilenglicol, ultrafiltracin, cromatografa y la particin de fase han empleado con xito para la purificacin de dextransucrase de diferentes cepas de bacterias de cido lctico.El cultivo de Pediococcus pentosaceus P. pentosaceus (GenBank nmero de acceso EU569832) se asla a partir de la muestra de suelo recogida de una caa campo en Assam (Cerca de Guwahati, India) se proyecta para la actividad de dextransucrase. El aislado se mantiene como una cultura pualada en medio de agar MRS modificado (que contiene 2 % de sacarosa en masa por volumen) a 4 C y se subcultivan cada 2 semanas. Para el desarrollo de inculo, un asa de siembra de cultivo a partir modificado Stab agar MRS se transfiri a 5 ml de la produccin de enzimas medio como se describe por Tsuchiya et alM.R.S Agar: Fue desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe, y por su formulacin permite el adecuado desarrollo de lactobacilos y otras bacterias cidos lcticos.La actividad enzimtica es analizada por la estimacin del azcar reductor a travs del Mtodo Nelson-Somogyi.La absorbancia se determina por El Cary 100: El cary 100 es un espectrofotmetro UV-visible y rentable con un conjunto verstil de accesorios para el trabajo rutinario de laboratorio. Est controlado por el software Cary WinUV, un software basado en Windows que ofrece un diseo modular y fcil de usar. El instrumento se suministra con soportes de muestra de lquido y se puede equipar con una amplia gama de accesorios para proporcionar capacidades adicionales. El instrumento es muy popular en laboratorios docentes universitarios.Poliacrilamida SDS electroforesis en gel se realiza con una unidad de mini placa de gel vertical en el laboratorio (Bio-Rad Laboratories, Hrcules, CA, EE.UU.)SDS-PAGE se lleva a cabo por el mtodo de Laemmli.El dextransucrase obtenido despus de la purificacin PEG se ejecutar en dos geles de SDS-PAGE idnticos no desnaturalizantes en deteccin de la actividad in situ.Efecto disolvente en la actividad y la estabilidad de dextransucrase: El efecto de dimethysulphoxide (DMSO), etanol, acetona y acetonitrilo en dextransucrase purificada a partir de Su estudi Pediococcus pentosaceus.Efecto de disolventes orgnicos de la actividad de dextransucrase: El Comportamiento de dextransucrase de Leuconostoc mesenteroides NRRL B- 512F en diversos disolventes orgnicos era estudiado por Girard y LeGoy. Este estudio se realiz para hacerse una idea de la solubilidad, la actividad y estabilidad de los aceptantes en disolventes orgnicos, lo que puede mejorar Las interacciones entre los aceptores y enzimas, facilitando las reacciones aceptores. El contenido de protena del sobrenadante libre de clulas se estiman por otras muestras de protenas purificadas por el mtodo de Lowry et al.

3.2 Segn su criterio las polticas o tecnologas descritas en los artculos. Cmo pueden ser aplicadas o implementadas, en el contexto nacional colombiano?

Tecnologa descrita en el artculo:Dextransucrase (CE 2.4.1.5), la enzima extra celular perteneciente a la familia glucsido hidrolasa 70, es de inmensa importancia industrial debido a su dextrano y prebiticas propiedades de oligosacridos de sntesisDextransucrase es una glucosiltransferasa (EC 2.4.1.5) que cataliza la transferencia de residuos de glucosilo a partir de sacarosa (S) a polmero de dextrano y libera fructosa (F) de acuerdo con la siguiente ecuacin (8): n S n F + dextrano (glucosa) n.Aplicacin en el contexto nacional ColombianoLa Dextransacarasa Microbiano Se puede aplicar en las industrias lcteas, frutas y vegetales Produccin de biopolmeros tipo dextrano que actan como estabilizantes, viscosantes y produccin de pelculas comestibles. Se utiliza para la produccin de dextranos a partir de sacarosa (por su fermentacin). Se utiliza como aditivo alimentario de grado tcnico como espesante en la industria de alimentos y en el rea de tratamiento de aguas residuales como floculante.

Su aplicacin abarca la obtencin de productos para todas las necesidades materiales humanas (ejemplo, alimentos, alimentos para animales, productos farmacuticos, productos qumicos, fibras, la higiene, y la tecnologa del medio ambiente), as como en una amplia gama de productos analticos, aplicados al diagnstico.A partir de los desechos industriales las frutas son fuente de materia prima para obtener la enzima dextransacarasa, adems se producen dextranos y fructosa a partir de estos desechos. De sta manera se ofrece una alternativa biotecnolgica para disminuir el impacto ambiental causado por los desechos.Es usado en diferentes mbitos, como el mdico (es usado como antiplaqueta o para reducir la viscosidad de la sangre), el farmacutico o en la industria agricultora. Tambin se puede encontrar en abundancia en la placa dental. Tiene un rea de aplicacin muy amplia que abarca desde estabilizadores de componentes biolgicos hasta aplicaciones en el mbito de la oftalmologa (ingrediente activo para elaborar lgrimas artificiales) por su propiedad lubricante.Acta estimulando la formacin de eritrocitos o incrementando el contenido de hemoglobina en sangre especialmente en el hgado y el bazo, tambin es empleado en veterinaria con el mismo fin teraputico.Trasplante de rganos: Uno de los principales requisitos de las soluciones para perfusin y preservacin de rganos durante operaciones quirrgicas es que deben ser iso-osmticas con los fluidos intracelulares de los tejidos que contienen, garantizando la preservacin de rganos como el hgado, rin y crnea, pero su uso es cada vez ms generalizado en otros tejidos. Tiene actividad anticoagulante y antiinflamatoriaLa Dextransacarasa puede producirse tambin industrialmente mediante dos tcnicas biotecnolgicas: Fermentacin y Sntesis enzimtica. Tienen diversas aplicaciones en diferentes mbitos industriales: Tienen unaalta solubilidad en agua, aunque son insolubles en alcoholes mono hdricos, como elmetanolo eletanol. Sonbiocompatibles, es decir, son tolerados por el organismo Sonbiodegradables, ya que se ha observado que hay enzimas naturales, llamadas dextranasas, como las del hongo Penicillium o las de algunas bacterias como la Cellvibrio, que pueden degradarlos. Pueden ser estables durante muchos aos.

3.3 Especifique la relacin directa existente entre los temas tratados y la biotecnologa Alimentaria.La biotecnologa ofrece un nmero importante de recursos a la industria alimentaria, que comprenden desde la produccin de materias primas y su transformacin, hasta el control de la seguridad alimentaria. La biotecnologa alimentaria se vale de los conocimientos existentes sobre la ciencia vegetal y la gentica para mejorar los alimentos y su forma de produccin. Los genes son los que determinan rasgos como el color de los ojos de una persona o el sabor de una verdura. Gracias a la biotecnologa moderna, los cientficos pueden mover genes de una planta o animal a otro. De esta forma, los agricultores pueden cultivar plantas y criar animales que estn protegidos de ciertas enfermedades y producir una mayor cantidad de alimentos. Asimismo, los alimentos pueden mejorar en sabor o ser ms nutritivos.En industrias directamente de produccin, la biotecnologa est totalmente implicada en la produccin de biomasa microbiana para alimentacin animal (y en el futuro en alimentos para humanos), de algunos productos qumicos como cido ctrico, cido glutmico y otros aminocidos y de algunos productos qumicos especiales, fundamentalmente antibiticos y ciertas vitaminas. En competicin con la tecnologa petroqumica puede producir productos a gran escala, como etanol, acetona/butanol, cido actico, etc., y en competicin con la explotacin de organismos enteros, puede ser usada para fabricar sustancias especiales de plantas y productos de clulas microbianas transformadas para que produzcan antgenos, anticuerpos o distintos agentes teraputicos o de diagnstico.La biotecnologa puede proporcionar a la agricultura una variedad de agentes tiles, desde inoculantes para suelos hasta productos veterinarios, con extensin en el futuro a cultivos acuticos y marinos. Estn empezando a ampliarse los mtodos genticos tradicionales para el desarrollo de cepas nuevas o mejoradas de plantas o animales para uso convencional en agricultura. Proporciona a las industrias de alimentacin agentes clave como cultivos iniciadores o enzimas, proporciona cada vez ms, conocimientos y tcnicas al procesamiento de los alimentos. En las industrias de servicios la biotecnologa tiene un papel fundamental en el tratamiento de los residuos tanto acuosos como slidos, en la valoracin de las basuras y en la purificacin del agua. Lnea de investigacin: Tecnologa de alimentos y Biocatlisis. En el campo de las fermentaciones en procesamiento de alimentos, as como la Mejora gentica de microorganismos de aplicacin en tecnologa de alimentos y la Produccin de protenas y enzimas de uso alimentario. Mejora gentica de microorganismos: Obtencin de cepas recombinantes de microorganismos de utilidad en tecnologa de alimentos, mediante tcnicas de ingeniera gentica. Se obtienen microorganismos como bacterias capaces de producir determinadas enzimas de utilidad en procesamiento de alimentos. Produccin de protenas y enzimas de uso alimentario: Produccin de enzimas con una actividad enzimtica dada, a partir de clulas microbianas. Esta actividad se vale de varias disciplinas, como la microbiologa, la ingeniera gentica, ingeniera de protenas e ingeniera bioqumica. Resumiendo, se puede decir que la Biotecnologa tiene un amplsimo rango de aplicacin en la industria de alimentos, ofreciendo los medios para producir alimentos de mejor calidad en forma ms eficiente y segura para la salud y el medio ambiente.Una de las promesas de la Biotecnologa es generar innovaciones y mejoras en los alimentos conduciendo a prcticas agrcolas ms ecolgicas, contribuyendo a una agricultura sustentable que utiliza con respeto los recursos del medioambiente.

3.4 Como se realiza la determinacin de la actividad enzimtica de la enzima del artculo elegido.La actividad enzimtica es analizada por la estimacin del azcar reductor a travs del Mtodo de Nelson-Somogyi.El ensayo de Actividad Enzimtica se realiz de la siguiente forma:1. Se separa 1 ml de la muestra2. Contiene: 5% de Sacarosa, 20ml de solucin buffer, acetato de Sodio pH 5.4, 20 microlitros sobrenadante libre de clulas.3. Se incuba a 30C por 15 horas.4. Luego se analiza la actividad enzimtica a travs del mtodo de Nelson-Somogyi. 5. La absorbancia se registr a 500 nm en un espectrofotmetro UV-VIS (Varian UV-VIS, ABSORBANCIA 50NM. 6. Se determina la actividad enzimtica y concentracin de protena.

3.5 Explique la metodologa para la determinacin de la actividad enzimtica de las siguientes protenas:a. Glucosa Isomerasa: Proveniente de Streptomyces lividens al que se le ha inserto el gen de Actinoplanes. Permite obtener, a partir de glucosa, jarabes ricos en fructosa, con mayor poder endulzante. b. Peptinasa: Pectinasas producidas por Aspergillus oryzae transformada con el gen de A. aculeatus. Permiten la clarificacin de jugos concentrados al degradar las pectinas provenientes de restos de semillas.c. Proteasa: Son enzimas proteolticas, es decir, actan rompiendo los enlaces que unen los aminocidos de las protenas facilitando su digestin. Las proteasas son consideradas un aditivo alimentario y se nombra como E-1101i. Se considera un potenciador del sabor, estabilizador y se utiliza en el tratamiento de harinas. Estas enzimas hidrolizan la unin entre el carboxilo de un aminocido y el grupo -amino del siguiente aminocido dentro de la protena.Aunque en ocasiones se emplean indiferentemente, el trmino peptidasas se suele emplear para definir a las enzimas que cortan pptidos pequeos, mientras que proteasas o proteinasas se aplica ms frecuentemente para las enzimas capaces de hidrolizar pptidos mayores y protenas.Las proteasas pueden encargarse de romper enlaces peptdicos especficos, denominndose en ste caso protelisis limitada o pueden encargarse de romper un pptido completo de aminocidos, denominndose en ste caso, protelisis ilimitada.En el cuerpo humano las principales proteasas son las pancreticas (tripsina, quimiotripsina y la carboxi-peptidasa) son secretadas en forma inactiva (tripsingeno, quimiotripsingeno y procarboxipeptidasa) y son activadas al llegar al intestino gracias a la enteroquinasa, proteasa secretada por la mucosa gstrica. Este es un mecanismo para proteger los tejidos corporales de la accin de estas enzimas. Las proteasas se inactivan mediante la fijacin de protenas inhibidoras fuertemente al sitio activo de la enzima.Las proteasas pueden obtenerse de diferentes fuentes como animales (quimosina, tripsina y peptina), vegetales (bromelana, papana) bacterias u hongos. En general son enzimas estables incluso a temperaturas elevadas (85C).Las proteasas tambin se clasifican segn el mecanismo proteoltico que realicen: serin proteasas, treonin proteasas, cistein proteasas, aspartil proteasas, metaloproteasas, glutamil proteasas y pptidas Mixtas (serina, cistena, treonina). Otras formas de clasificarlas son segn la zona por la que rompen la cadena proteica y el pH ptimo en el que actan por ejemplo:-Proteasa 3.0: pH ptimo 3, rango de 2-7.-Proteasa 4.5: pH ptimo 4.5, rango 2-6.-Proteasa 6.0: pH ptimo 6, rango 4-11.Las proteasas tienen muchas aplicaciones en la industria como por ejemplo en la fabricacin de medicamentos, fermentaciones, produccin de condroitina, aditivos alimentarios o suplementos digestivos. La adicin de proteasas a productos proteicos mejora su digestibilidad, su solubilidad y su sabor.Existen alimentos que de manera natural contienen proteasas como es el caso de la papaya, la pia y el kiwi, entre otros.Algunas enzimas proteolticas cuando son consumidas en forma de complemento alimenticio, pueden ser degradadas en el estmago, por esta razn suelen estar incluidas en cpsulas o tabletas resistentes que liberan su contenido en el intestino. Aunque hay algunos tipos de enzimas fngicas o vegetales que son estables al pH gstrico.Beneficios de su aporte-Mejora de la digestibilidad de las protenas.-El consumo de proteasas contribuye a la digestin de las protenas presentes en la dieta. Son especialmente interesantes para personas con problemas para digerir las protenas.-La adicin de proteasas en los complementos alimenticios proteicos mejora su solubilidad y en consecuencia su digestibilidad. En protenas de buena calidad como la protena de suero incrementa la tasa de absorcin y en protenas de baja digestibilidad la administracin adicional de proteasas mejora su calidad.Inflamacin y funcin muscular.Existen estudios que han relacionado el consumo de enzimas proteolticas (proteasas fngicas, bromelana y papana) con una mejor funcin muscular despus del entrenamiento excntrico gracias a la regulacin de la inflamacin. La bromelana de forma aislada tambin se ha mostrado efectiva para prevenir la ruptura de las clulas y favorecer la recuperacin muscular del trabajo excntrico.Otras combinaciones de enzimas proteolticas junto con amilasa y lipasa tambin han demostrado mejorar la recuperacin muscular y reducir el dolor muscular tardo, tambin conocido como agujetas, despus del entrenamiento intenso.Estudios realizados muestran como el consumo de proteasas controla la inflamacin sin disminuir sus efectos positivos sobre la recuperacin o acciones de proteccin.DosisEn el caso de las enzimas digestivas, ms que la cantidad en gramos es importante la actividad de las enzimas, por esta razn lo mejor es seguir las indicaciones del fabricante.

PrecaucionesNo existe una dosis mxima para su utilizacin en alimentacin y la dosis queda sujeta a la cantidad adecuada para conseguir sus efectos dentro de un marco de buenas prcticas de fabricacin.d. Amilasa: Es una enzima hidrolasa que tiene la funcin de catalizar la reaccin de hidrlisis de los enlaces 1-4 del componente -amilasa al digerir el glucgeno y el almidn para formar azcares simples. Se produce principalmente en las glndulas salivales (sobre todo en las glndulas partidas) y en el pncreas. Tiene actividad enzimtica a un pH de 7. Cuando una de estas glndulas se inflama, como en la pancreatitis, aumenta la produccin de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre (amilasemia).ClasificacinLas amilasas son enzimas dependientes de calcio, completamente funcionales en ausencia de iones de calcio. Actan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponindolos en dextrina desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es ms rpida que la -amilasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH ptimo est entre 6,7 y 7,2.UsosLa amilasa sirve en el diagnstico de enfermedades al determinar sus niveles en plasma para saber si se puede producir una pancreatitis. Sus niveles pueden estar elevados por un dao a las clulas productoras de la enzima en el pncreas, o bien, por una deficiencia renal (excrecin reducida) o tambin por paperas.Las enzimas amilasas son empleadas en la fabricacin de pan para romper azcares complejos como el almidn (presente en la harina) en azcares simples. La levadura puede entonces alimentarse de esos azcares simples y convertirlos en productos de fermentacin alcohlica. Este proceso da sabor al pan y hace elevar la masa. Las clulas de la levadura contienen amilasas pero necesitan tiempo para fabricar la suficiente cantidad para romper el almidn. Este es el motivo de la necesidad de largos tiempos de fermentacin (especialmente para determinadas masas). Las tcnicas modernas de elaboracin de masas incluyen la presencia de amilasas para facilitar y acelerar estos procesos.Algunas amilasas bacterianas se emplean como detergentes para disolver almidones en determinados procesos industriales. Aportan en la eliminacin del polvo y tierra de la ropa que quedan atrapados en el tejido de las telas.En la maduracin de frutas la amilasa es sintetizada, degradando el almidn de las frutas en azcar, y volvindolas ms dulces.La amilasa obtenida a partir de Bacillus subtilis recombinante. Esta enzima licua el almidn y lo convierte en dextrina en la produccin de jarabes. En la industria cervecera, favorece la retencin de la humedad del producto y baja el contenido calrico del producto.1. Toma de muestras: 0. % kg de suelos de cultivos de caa de azcar2. Aislamiento de bacterias productoras de amilasa:

3.6. Una de los mtodos ms utilizados para el rompimiento celular es la sonicacin, describa y explique el fundamento fsico de esta tcnica.La sonicacin es el proceso de convertir una seal elctrica en una vibracin fsica que puede ser dirigida hacia una sustancia. Los sonicadores son equipos vitales de laboratorio y se utilizan para muchos propsitos. La sonicacin se realiza generalmente para separar compuestos o clulas para su examen ms detallado. La vibracin tiene un efecto muy poderoso en las soluciones, haciendo que sus molculas se separen y las clulas se rompan. Un primer ejemplo est en las pruebas de ADN, donde las clulas que pueden contener informacin del ADN son sometidas a la sonicacin para poderlas romper para que as liberen las protenas del ADN para poder ser probadas. La parte principal de un dispositivo de sonicacin es el generador elctrico ultrasnico. Este crea una seal (generalmente alrededor de 20 KHz) que alimenta un transductor. Este transductor convierte la seal elctrica utilizando cristales piezoelctricos, o cristales que responden directamente a la electricidad creando una vibracin mecnica. Esta vibracin, molecular en origen, es conservada cuidadosamente y amplificada por el aparato de ultrasonidos, hasta que pasa a travs de la sonda.

Como funciona:La sonda de sonicacin transmite la vibracin a la solucin sometida a ultrasonidos. Esta sonda es una punta cuidadosamente construida que se mueve a ritmo con la vibracin, transfirindola a la solucin. La sonda se mueve hacia arriba y abajo a una velocidad muy alta, aunque la amplitud puede ser controlada por el operador y es elegida segn las cualidades de la solucin que ha sido sometida a ultrasonidos. El rpido movimiento de la sonda crea un efecto llamado cavitacin. La cavitacin se produce cuando las vibraciones crean una serie de burbujas microscpicas en la solucin, bolsillos de espacio situados entre las molculas que se forman y que luego vuelven a colapsar bajo el peso de la solucin, enviando minsculas ondas de choque a la sustancia circundante. Miles de estas burbujas que se forman y colapsan constantemente crean poderosas ondas de vibracin que ocurren en ciclos en la solucin y separan las clulas.La Ultrasonificacin genera intensas ondas snicas en medio lquido. Se transmite una corriente elctrica a un sistema mecnico, que la convierte en vibraciones de alta densidad generando ondas ultrasnicas que forman millones de micro burbujas que se expanden y colapsan contra las clulas: Cavitacin: El choque de ondas rompe membranas y aun enlaces covalentes. Mayor accin por adicin de esferas de vidrio. El sonicador tiene dos formas de operar, por Pulsos: Las vibraciones de ultrasonido pueden transmitirse en un rango de 0.1 a 0.9 pulsos por segundo, permitiendo una adecuada sonicacin sin generacin importante de calor continuo: Puede ser usado de orma continua hasta por 15 minutos.Con este sistema se puede lograr la ruptura de levaduras entre 3 y 10 minutos o de E.Coli con 40 segundos. Presenta los siguientes inconvenientes: Alta generacin de calor de las muestras que se mantienen en congelamiento, los tejidos duros (piel o tendn) se deben macerar previamente; se pueden generar radicales libres, el dao por oxidacin de radicales libres puede minimizarse adicionando cistena, ditiotreitol o algn otro componente-SH en el medio. Por Radicales Libres: Lesin en membrana celular, aberraciones, cromosmicas menores y cambio de tipo fisiolgicas. Uso en transferencia de DNA plasmdico en protoplasmos y clulas intactas; con expresin temporal de un gen testigo. Flexible: Protoplasmos, Clulas en suspensin y en fragmentos de tejido con la misma sencillez.

3.7. Determine la sensibilidad de dos mtodos de determinacin de protenas, junto con las tinciones de comassie y nitrato de plata.

TINCIN DE GELES CON AZUL DE COOMASSIE.El colorante Azul de Coomassie R-250 es generalmente el ms aceptado para la tincin de los geles. El Coomassie R-250 se une a las protenas, y la intensidad de la coloracin es relativamente y hasta cierto punto independiente de la concentracin y de la naturaleza qumica de las protenas; de esta forma, cuando se tiene que cuantificar una protena es el colorante ms recomendado. La solucin de tincin del gel tiene entre sus constituyentes metanol y cido actico, lo cual permite que las protenas se fijen en el gel y no eluyan durante el proceso de tincin y desteido del gel; adems, el metanol es el solvente adecuado para disolver el Coomassie Blue.El tiempo de tincin del gel depende de varios factores; entre ellos, el espesor y tamao del gel, vejez del colorante, coloracin en agitacin, etc. La tincin se efecta entre 30 minutos a toda la noche (overnight). Seguidamente a la tincin, el gel debe ser desteido por difusin del Coomassie que no se ha unido a protena, a fin de contrastar las bandas de protenas del fondo del gel.Materiales:Solucin de tincin. Azul brillante de Coomassie R-250 (0.25%) contenidos para 1L de solucin: 2.50 g azul brillante de Coomassie R-250, 100 ml de cido actico concentrado, 400 ml de metanol, enrasar a 1L con agua destilada o desionizada. Se recomienda disolver el colorante en un poco de metanol. Filtrar la solucin antes de utilizar por primera vez.Solucin desteidora. 400 ml de metanol, 100 ml de cido actico concentrado, enrasar hasta 1L con agua destilada o desionizada.Protocolo:1)Terminada la electroforesis. Remover el gel y marcar un punto de referencia para identificar los carriles.2)Sumergir el gel en un recipiente que contenga la solucin de tincin. El colorante debe ser suficiente para cubrir el gel.3)Dejar el recipiente en agitacin suave durante 20-30 minutos. Los geles con espesor < 1mm son muy delicados, la agitacin debe ser muy suave o dejarlos sin agitar.4)Retirar la solucin de tincin (vertir o aspirar).5)Aadir la solucin desteidora. Dejar el recipiente a temperatura ambiente y en agitacin suave. Cambiar la solucin desteidora. Este proceso puede durar desde varias horas hasta toda la noche. El desteido es satisfactorio cuando el color de fondo es claro y las bandas de las protenas contrastan adecuadamente del fondo del gel.Comentarios:La solucin de tincin puede ser filtrada en papel Whatman #1. Frecuentemente, el colorante es reusado y si la tincin no es satisfactoria, el gel puede ser teido nuevamente con solucin fresca. Rutinariamente, 30 minutos son suficientes para teir el gel, pero tiempos mayores pueden ser necesarios dependiendo del tamao y espesor del gel, etc.La solucin desteidora puede ser reusada varias veces, luego de ser reciclada por filtracin a travs de carbn activo en un filtro Whatman #1. Un criterio para considerar envejecidas la solucin de tincin y/o desteido es el hinchamiento del gel a consecuencia de la hidratacin de las soluciones (en realidad, se debe a la evaporacin del metanol). La sensibilidad de la tincin con Coomassie R-250 puede variar desde 0.5-5.0 g/banda en un mini gel de 10 pozos. Desteido el gel puede ser fotografiado en blanco y negro, se puede mejorar el contraste del gel usando un filtro amarillo.TINCIN CON NITRATO DE PLATACantidades de protena menores a 0.3 y 1g (dependiendo de la naturaleza de la protena) no pueden ser detectadas por tincin con azul de Coomassie. Sin embargo, la tincin de los geles con plata permite detectar concentraciones muy pequeas de protenas, del orden de los nanogramos (g). Existen diversos protocolos para teir geles con plata, y la deteccin del mtodo

puede variar entre 2 a 5 g. La tincin con plata se basa en su unin a distintos grupos qumicos de las protenas, como los grupos sulfidrilo o carboxilo. La deteccin con plata es exclusivamente cualitativa. No puede ser utilizada para cuantificar protenas por diversas razones, entre ellas: dependiendo de la naturaleza de la protena, sta puede adquirir un color particular (entre marrones y amarillos), o incluso puede teirse negativamente contrastando del fondo del gel.La tincin con plata se realiz de acuerdo al mtodo de Blum et al. (1987). ste mtodo utiliza dos propiedades del tiosulfato: mejora la imagen por el pretratamiento del gel fijado, y evita el color de fondo (background) no especfico durante el desarrollo de la tcnica. Cuando se quiere producir imgenes reproducibles se debe trabajar con mucho cuidado y exactitud en los tiempos. La tcnica puede ser desarrollada en agitacin a temperatura ambiente (20-250C). Se puede usar algn sistema de succin para retirar las soluciones rpidamente del gel.Protocolo:1)Mantener el gel al menos 1 hora en solucin de fijacin (50% metanol, 12% cido actico). Los geles pueden ser mantenidos en esta solucin varios das, sin perder la calidad de la tincin. Geles teidos con azul de Coomassie pueden ser teidos con plata, el prerrequisito de esto es desteir completamente el gel, luego se inicia todo el procedimiento desde la fijacin.2)Lavar el gel en 50% etanol, 3 veces durante 20 minutos cada vez. Los geles de espesor < 1mm, pueden ser lavados los ltimos 20 minutos con etanol 30%, para evitar la deformacin.3)Sumergir el gel en la solucin de tiosulfato de sodio (0.2 g/L Na2S2O3.5H2O), exactamente, durante 1 minuto. Si se sobrepasa ste perodo de tiempo se puede tener una tincin con gran color de fondo.4)Lavar el gel con agua, tres veces durante 20 segundos cada lavado.5)Sumergir el gel durante 20 minutos en solucin de nitrato de plata (2 g/L AgNO3 , 0.75 ml/L de solucin stock de formaldehdo al 37%). Despus de este paso, el gel puede tomar un color amarillento, esto no tiene ningn efecto sobre la sensibilidad o color de fondo de la tincin.6)Lavar el gel dos veces con agua durante 20 segundos cada vez. Este paso remueve el exceso de plata.7)Sumergir el gel en la solucin de revelado (60 g/L Na2CO3, 0.5 ml/L de formaldehdo al 37%, 4 mg/L Na2S2O3.5H2O),en agitacin suave durante 10 minutos. Si la solucin de revelado en contacto con el gel se toma el marrn, cambiarla inmediatamente por otra fresca (esto ocurre a consecuencia que el tiosulfato libre se ha consumido). Como referencia, una banda que contiene 500 g de protena puede ser detectada en aprox. 30 segundos de revelado, y una banda con 50 g puede tardar cerca de 2 minutos. Si se consigue la deteccin y contraste adecuado antes de los 10 minutos de revelado, este paso puede pararse. Si el revelado se prolonga sobre los 10 minutos puede aparecer un color de fondo amarillento. La temperatura de revelado puede ser de 180 - 250C.8)Lavar el gel dos veces con agua durante 2 minutos cada vez. Esto remueve el exceso de tiosulfato que puede descomponerse en la solucin de fijacin y producir color de fondo.9)Mantener el gel durante 10 minutos en solucin de fijacin del gel (paso 1).10)Lavar el gel en metanol al 50% al menos durante 20 minutos. Despus puede ser conservado a 40C en metanol al 50%. Si se quiere secar el gel, mantener en agitacin a 40C durante 30 minutos en metanol al 30%, y luego otros 30 minutos en glicerol al 3%.

3.8 Si se tiene 65 ml de extracto enzimtico para realizar una purificacin de protenas, cunto sulfato de amonio hay que adicionarle a dicha solucin para llevarla a una saturacin del 30%, y cuanto hay que adicionarle de ms para llevarla al 50%?

Cantidad de sulfato de amonio que hay que adicionar a la solucin para una saturacin del 30 %.

G = valor estimado de la tabla 1.17 (Sulfato de amonio en gramos (g) requerido para adicional a 1 litro de solucin)

X

Valor estimado G = 18,55 g

La cantidad en gramos de esta sal a agregar es 6,494 gramos

Cantidad que hay que adicionarle de ms para llevarla al 50%

La cantidad de sulfato de amonio a agregar es de 5,73 gramos.

3.9 Defina y explique y el fundamento de las siguientes cromatografas:

a. Cromatografa preparativa: Se usa para purificar suficiente cantidad de sustancia para un uso posterior, ms que para anlisis. La cromatografa preparativa forma parte de los mtodos estndar habituales de un laboratorio. La cromatografa es un componente de gran calidad y una manipulacin sencilla son una de las condiciones principales para la obtencin de resultados rpidos y seguros. La cromatografa preparativa comprende un amplio campo de aplicaciones, desde el aislamiento de 1 g. de muestra para identificacin espectroscpica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g. La cromatografa preparativa se diferencia de la tcnica bsica en muchos aspectos, desde la preparacin de la papilla. sta debe hacerse con menos agua que de ordinario. Una papilla ms espesa ayuda a estabilizar el grosor de las placas que se precisa para una carga de mayor magnitud. El espesor ptimo oscila desde un mnimo de 1 mm. Hasta un mximo de 2 mm.La siembra de la muestra se realiza mediante la ayuda de una jeringuilla o tubo capilar. La siembra se realiza a lo largo de una lnea recta (existen en el mercado diverso utensilios para evitar torcerse). Si al terminar la primera siembra todava queda muestra, se seca la primera siembra y se aplica la segunda, intentando que sta quede sobre la anterior, para as conseguir que el frente sea lo ms estrecho posible. La siembra debe realizarse a lo ancho de la placa.Una vez sembrada la muestra se desarrolla la cromatografa. Se utiliza un adsorbente con indicador fluorescente para ver en la lmpara ultravioleta donde han quedado las manchas de los diferentes compuestos, dichas manchas se marcan.Una vez localizados los compuestos, stos se extraen de la fase estacionaria, uno a uno, con la ayuda de una esptula, sobre un papel de filtro u otro soporte. Posteriormente se coloca cada componente en un erlenmeyer, y se mezcla con un disolvente (metanol). Una vez disuelto el compuesto se filtra varias veces para separar el compuesto y la fase estacionaria.

b. La cromatografa de exclusin por tamaos La cromatografa de exclusin molecular (a menudo tambin llamada filtracin en gel o de tamiz molecular) es una de las tcnicas ms sencillas de las empleadas en la separacin de protenas y cidos nucleicos. Este tipo de cromatografa se realiza en columnas cilndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por grnulos (partculas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamao de dimetro determinado. La cromatografa de exclusin por tamao es una tcnica eficiente para preparar grupos de solutos la cual se basa en su tamao efectivo en solucin. Las fases estacionarias utilizadas para lograr estas separaciones son polmeros que han sido entrecruzados de modo que formen una red abierta con numerosos poros de tamao uniforme. El grado de entrecruzamiento se controla de manera cuidadosa para obtener una serie de geles con diferentes tamaos de poro y rangos de fraccionamiento.c. Cromatografa de intercambio inico: Es un proceso que permite la separacin de iones y molculas polares basadas en las propiedades de carga de las molculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molcula cargada, incluyendo grandes protenas, pequeos nucletidos y aminocidos. La solucin que debe inyectarse es usualmente llamada "muestra" y los componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a menudo en purificacin de protenas, anlisis de agua o control de calidad.La cartografa de intercambio inico Se compone de dos fases: la fase estacionaria o intercambiador inico, y la fase mvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostticas fijas, que retienen contra iones mviles que pueden intercambiarse por iones de la fase mvil, la cual suele ser una disolucin acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgnico miscible con agua que contiene especies inicas generalmente en forma de buffer. Los iones de sta compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria.FUNDAMENTO: El principio bsico de la cromatografa de intercambio inico es que las molculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas molculas pueden ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente inico. La separacin mediante intercambiadores inicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unin fuerte y estable; a continuacin, se elude de la columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza inica, compitiendo los componentes del buffer con el material por los sitios de unin.d. Cromatografa de intercambio catinico: Resinas de intercambio catinico:Estas resinas estn disponibles en 3 tamaos diferentes de cuentas. El medio (