de rol van hypoxie op de expressie van...
TRANSCRIPT
De rol van hypoxie op de expressie
van leverprogenitorcellen op
verschillende tijdspunten in de
hepatocarcinogenese
Femke WULGAERT
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Hans Van Vlierberghe Vakgroep: Inwendige ziekten
Academiejaar 2014-2015
De rol van hypoxie op de expressie
van leverprogenitorcellen op
verschillende tijdspunten in de
hepatocarcinogenese
Femke WULGAERT
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Hans Van Vlierberghe Vakgroep: Inwendige ziekten
Academiejaar 2014-2015
“De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de
beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
05/05/2015
Femke Wulgaert Hans Van Vlierberghe
Voorwoord
Deze masterproef besluit de opleiding Biomedische Wetenschappen met een project dat
gewichtige thema’s in de geneeskunde en biowetenschappen verenigd. Kanker en
stam/progenitorcellen betekenden voor mij een introductie in de onderzoekswereld. De
afgelopen twee jaar leerde ik met proefdieren om te gaan, laboratoriumtechnieken uit te
voeren en resultaten te analyseren. Nu deze verhandeling geschreven is en mijn tijd op de
schoolbanken erop zit bedank ik graag enkele mensen voor hun steun gedurende deze periode.
In de eerste plaats betuig ik mijn dank aan Prof. Dr. Hans Van Vlierberghe, promotor van
deze masterproef, voor de mooie kans om aan dit project te mogen hebben meegewerkt. Prof.
Van Vlierberghe, uw oprechte betrokkenheid, snelle feedback en intelligent uitdagende
beschouwingen werden zonder meer gewaardeerd.
Daarnaast bedank ik mijn begeleidster Eliene met wie ik het beslist getroffen had. Eliene, jij
nam de tijd om me te leren kennen. Dat was nodig daar jij eerder efficiënt en gezwind te werk
gaat, terwijl ik punctueel ben wat dan de nodige tijd vraagt. Maar jij liet mij mijn eigenheid
behouden, gaf me voldoende verantwoordelijkheid en samen werkten we naar een mooi
eindresultaat toe. Jij stond steeds paraat met jouw verbluffende vakkennis om me te helpen.
Het ontbrak jou daarbij niet aan bemoedigingen en geduld. Jij hebt ook gewoonweg plezier in
je vak, dat straalt van je af en heb je zeker en vast weten over te brengen. Eliene, ik dank je
voor de fijne momenten en interessante gesprekken, en wens je veel succes met verdere
onderzoeken.
Verder dank ik iedereen van het labo Hepatologie/Gastrologie voor hun bijstand. De eerste
confrontatie met het euthanaseren van muizen, de hulp bij het inbedden van stalen in
paraffine, een luchtig praatje, een vrolijke glimlach en een leuk kerstgeschenk zullen
overigens niet worden vergeten. Tevens wordt de dienst Pathologie bedankt voor de
verwerking van de stalen en het uitvoeren van de reticuline kleuringen.
Vervolgens dank ik Jolien, Laurens, Mieke, Sarah en Valerie, vrienden met wie ik de
opleiding heb aangevangen, en Nina en Prisca, vrienden met wie ik de studie geslaagd
afrondt, voor de memorabele momenten die werden beleefd, de motivatie gedurende het
schrijven van deze scriptie en bovenal de altijddurende vriendschap.
In het bijzonder dank ik ook mijn vriend Samuel voor zijn niet aflatende steun en motivatie,
vooral in opwindende tijden wanneer deadlines naderden. Bovendien stond hij steevast klaar
om me met allerhande computerproblemen te helpen. Lief, jij kan nu beginnen uitzien naar
een tijdperk zonder rondslingerende cursussen in huis.
Ten slotte richt ik mij tot mijn ouders met een welgemeend dankwoord voor de kans die zij
mij gaven om aan deze opleiding deel te nemen. Mama en papa, jullie onvoorwaardelijke
steun en vertrouwen zijn ten allen tijde kostbaar geweest voor mij.
1
Inhoudsopgave
SAMENVATTING ......................................................................................................................................... 3
SUMMARY..................................................................................................................................................... 4
1. INLEIDING ................................................................................................................................................ 5
1.1. LEVER .................................................................................................................................................... 5
1.1.1. Anatomie ........................................................................................................................................ 5
1.1.2. Celtypes en hun functie ................................................................................................................... 6
1.2. PRIMAIRE LEVERTUMOREN ...................................................................................................................... 9
1.2.1. Hepatocellulair carcinoom ............................................................................................................... 9
1.2.2. Cholangiocarcinoom ..................................................................................................................... 10
1.2.3. Hepatocellulair-cholangiocarcinoom ............................................................................................. 11
1.3. HYPOXIE .............................................................................................................................................. 12
1.3.1. Hypoxie-induceerbare factor 1 ...................................................................................................... 13
1.3.2. Hypoxie in hepatocellulair carcinoom............................................................................................ 13
1.4. PROBLEEMSTELLING ............................................................................................................................. 15
2. MATERIALEN EN METHODEN ........................................................................................................... 16
2.1. MUISMODEL ......................................................................................................................................... 16
2.2. STAALNAME ......................................................................................................................................... 17
2.3. HISTOLOGIE.......................................................................................................................................... 17
2.3.1. Inbedden en coupes snijden ........................................................................................................... 17
2.3.2. Haematoxyline-eosine kleuring ..................................................................................................... 17
2.3.3. Sirius Red kleuring ....................................................................................................................... 18
2.3.4. Reticuline kleuring ........................................................................................................................ 18
2.3.5. Immunohistochemie ...................................................................................................................... 18
2.4. REAL-TIME KWANTITATIEVE POLYMERASE KETTINGREACTIE.................................................................. 19
2.4.1. RNA-isolatie en cDNA synthese ................................................................................................... 19
2.4.2. Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie ......................................................................... 19
2.5. STATISTISCHE ANALYSE ........................................................................................................................ 21
3. RESULTATEN ......................................................................................................................................... 22
3.1. ALGEMENE PARAMETERS ...................................................................................................................... 22
3.2. ALGEMENE HISTOLOGIE ........................................................................................................................ 23
3.2.1. Haematoxyline-eosine kleuring ..................................................................................................... 23
3.2.2. Sirius Red kleuring ....................................................................................................................... 24
3.2.3. Reticuline kleuring ........................................................................................................................ 25
3.3. IMMUNOHISTOCHEMIE .......................................................................................................................... 26
3.3.1. F4/80 ............................................................................................................................................ 26
3.3.2. CK19 ............................................................................................................................................ 27
3.3.3. EPCAM ........................................................................................................................................ 28
2
3.4. RT-QPCR ............................................................................................................................................. 30
3.4.1. Hypoxie merkers ........................................................................................................................... 30
3.4.2. Leverprogenitorcel merkers ........................................................................................................... 31
3.4.3. Fibrose.......................................................................................................................................... 33
3.4.4. Metastase en resistentiemerkers ..................................................................................................... 34
3.4.5. Correlaties .................................................................................................................................... 36
4. BESPREKING .......................................................................................................................................... 38
5. BESLUIT................................................................................................................................................... 46
6. REFERENTIES ........................................................................................................................................ 47
7. BIJLAGEN................................................................................................................................................ 51
7.1. LPC MERKERS ...................................................................................................................................... 51
7.2. VOORBEELDEN VAN RT-QPCR RESULTATEN WAARBIJ ADDITIONELE WT STALEN DUIDELIJKE
DISCREPANTIES MET EIGEN STALEN VERTONEN ............................................................................................. 52
7.3. PROTOCOL HAEMATOXYLINE-EOSINE KLEURING .................................................................................... 52
7.4. PROTOCOL SIRIUS RED KLEURING ......................................................................................................... 53
7.5. PROTOCOL IMMUNOHISTOCHEMISCH KLEURING F4/80............................................................................ 54
7.6. PROTOCOL IMMUNOHISTOCHEMISCHE KLEURING CK19 ......................................................................... 56
7.7. PROTOCOL IMMUNOHISTOCHEMISCHE KLEURING EPCAM...................................................................... 57
7.8. PROTOCOL RNA-ISOLATIE (QIAGEN RNEASY MINI KIT) ........................................................................ 59
7.9. PROTOCOL CDNA SYNTHESE (SENSIFAST CDNA SYNTHESIS KIT) ........................................................ 61
7.10. PROTOCOL RT-QPCR .......................................................................................................................... 61
3
Samenvatting
Inleiding: Prolyl hydroxylase domein 2 (PHD2) deletie leidt tot de stabilisatie van hypoxie
induceerbare factor 1 (HIF1), een centrale mediator in de cellulaire respons op hypoxie dat
geassocieerd is met de ontwikkeling van kanker. Onze onderzoeksgroep toonde reeds aan dat
PHD2 inactivatie resulteert in een verhoogde expressie van leverprogenitorcellen (LPC) en
een fenotypische switch van hepatocellulair carcinoom (HCC) naar het meer agressieve
hepato-cholangiocarcinoom in een diethylnitrosamine (DEN) geïnduceerd HCC muismodel.
We veronderstellen dat hypoxische condities het gedrag van bipotentiële LPCs in de
omgeving van de tumor beïnvloeden en de differentiatie richting cholangiocyten stimuleren.
In deze studie werd het effect van HIF1 stabilisatie op LPC activatie en differentiatie tijdens
de vroege ontwikkeling van HCC bestudeerd.
Materialen en methoden: PHD2 haplodeficiënte (PHD2+/-) en wild type (WT) muizen
werden wekelijks geïnjecteerd met 35 mg/kg DEN en geëuthanaseerd na 5, 10, 15, 17,5 en 20
weken DEN inductie. De levers werden gepreleveerd ter analyse van stroomafwaarts
gereguleerde genen van HIF1 en LPC kenmerken met behulp van RT-qPCR en
immunohistochemie. Neoplastische transformatie van hepatocyten werd bepaald aan de hand
van haematoxyline-eosine en reticuline kleuringen.
Resultaten: Vanaf 15 weken DEN inductie worden neoplastische veranderingen
waargenomen. Daarnaast wordt een sterke opregulatie in de RNA expressies van de
onderzochte hypoxie merkers gezien na 17,5 weken DEN inductie, en dit meer uitgesproken
in de PHD2+/- groep. De RNA expressies van de LPC merkers Krt19, Prom1 en Cd44 volgen
deze trend en vertonen eveneens een hoogtepunt na 17,5 weken, zonder significant verschil
tussen PHD2+/- en WT groepen. De expressies van de LPC merkers Krt7, Epcam, Ncam1 en
Afp veranderden weinig gedurende de vroege hepatocarcinogenese. Immunohistochemische
kleuringen daarentegen toonden een verhoogde eiwit expressie van LPC merkers CK19 en
EPCAM vanaf 15 weken na DEN behandeling.
Besluit: De expressies van LPC merkers zijn congruent met de expressies van HIF1
gevoelige genen en het optreden van neoplasticiteit gedurende de vroege
hepatocarcinogenese. Doch, het effect van een verhoogde stabilisatie van HIF1 op de
expressie van LPC kenmerken en het behoud van tumor fenotype in de hepatocarcinogenese
blijkt geen vroege gebeurtenis te zijn.
4
Summary
Background: Prolyl hydroxylase domain 2 (PHD2) deletion results in the stabilization of
hypoxia inducible factor 1 (HIF1), a key compound in the cellular response following hypoxia
which has been linked to cancer development. Our research group previously showed that
PHD2 inactivation results in an increased expression of liver progenitor cells (LPCs) which
coincided with a phenotypic switch from hepatocellular carcinoma (HCC) to hepato-
cholangiocarcinoma in a diethylnitrosamine (DEN) induced HCC mouse model. We assume
that hypoxic conditions affect the behaviour of bipotential LPCs in tumor environment and
stimulate the differentiation towards cholangiocytes. In this study, we investigated the effect
of a HIF1 stabilization on LPC activation and differentiation during early development of
HCC.
Methods: PHD2 haplodeficient (PHD2+/-) and wild type (WT) mice were weekly injected
with 35mg/kg DEN and euthanized after 5, 10, 15, 17,5 and 20 weeks of DEN induction.
Livers were prelevated and analyzed for the expression of downstream targets of HIF1 and
LPC markers using RT-qPCR and immunohistochemistry. Neoplastic transformation of
hepatocytes was determined by haematoxylin-eosin and reticulin stainings.
Results: Neoplastic changes are detected from 15 weeks on. Interestingly, markers of hypoxia
show a peak expression after 17,5 weeks of DEN induction. RNA expressions of LPC
markers Krt19, Prom1 and Cd44 follow this trend, with no significant difference between
PHD2+/- and WT groups. LPC markers Krt7, Epcam, Ncam1 and Afp show little changes in
expression throughout the first 17,5 weeks of DEN induced hepatocarcinogenesis. In contrast,
immunohistochemistry reveals an increased protein expression of LPC markers CK19 and
EPCAM from 15 weeks after DEN treatment.
Conclusion: These results show an increased expression of LPC characteristics, coinciding
with augmented expression of hypoxic markers during early HCC development. However, the
effects of PHD2 haplodeficiency were limited to non-existing. Based on this and our previous
reports we conclude that induction of the hypoxic response affects the expression of LPC
characteristics and tumor phenotype not in an early event but coincides with the occurrence of
neoplasticity.
5
1. Inleiding
1.1. Lever
1.1.1. Anatomie
De lever is, op de huid na, het grootste orgaan van het menselijk lichaam. De lever bevindt
zich rechtsboven in de abdominale holte, waar het vastgehecht is aan het diafragma en deels
beschermd wordt door de ribbenkas. Het overige gedeelte is bedekt met visceraal peritoneum.
Een plooi van het peritoneum, het ligamentum falciforme, verdeelt de lever in een rechterlob
en een kleinere linkerlob. De rechterlob is inferior posterior verder onderverdeeld in twee
accessoire lobben, de lobus caudatus en de lobus quadratus. Voorts wordt de lever
gekarakteriseerd door een duale bloedvoorziening. De arteria hepatica bevloeit de lever met
arterieel bloed (20%). De vena porta brengt veneus bloed (80%) van de darmen, pancreas,
milt en galblaas aan. Beide bloedstromen komen samen in de leversinusoïden. De afvloeiing
van dit gemengde bloed gebeurt via de venae hepaticae die uitmonden in de vena cava
inferior (1-3).
De lever staat in nauwe verbinding met de galblaas. Vertakkingen van de galkanalen vangen
het door de hepatocyten gesecreteerde gal op en sturen het naar de ductus hepaticus dextra en
sinister. Deze worden verenigd tot de ductus hepaticus communis dat samen met de ductus
cysticus, afkomstig van de galblaas, de ductus choledochus vormt. Ter hoogte van de ampulla
van Vater komen de ductus choledochus en de ductus pancreaticus samen en treden het
duodenum binnen (1-3).
Op microscopisch niveau vindt men de lobuli, de eenheidsstructuren van de lever. De
klassieke hepatische lobule is een hexagonale structuur gevormd door radiair geschikte
leverparenchymplaten, met de centrale venule als centrale as. Perifeer op elk zogenaamde
hoekpunt bevindt zich een portale triade dat een vertakking van de vena porta, een hepatisch
arteriool en een galkanaaltje bevat (Figuur 1) (1-3).
6
Figuur 1. Detail van de lever lobule (4)
Het bloed stroomt centripetaal van de portale ruimte naar de centrale vene. De gal
daarentegen vloeit centrifugaal vanuit de levercellen via de galcanaliculi in het kanaal van
Hering naar het galkanaal in de portale triade (1-3).
1.1.2. Celtypes en hun functie
De lever is een vitaal orgaan dat systemische homeostase onderhoudt en gespecialiseerd is in
het uitvoeren van verscheidene belangrijke functies zoals intermediaire metabolisatie,
detoxificatie, opslag van nutriënten, secretie van gal, afbraak van rode bloedcellen en immuun
regulatie. De verschillende celtypes waaruit de lever bestaat zijn aangepast om deze
specifieke functies te verrichten; hierbij is onderlinge interactie cruciaal.
Hepatocyten
Het parenchymale weefsel, dat 80% van het levervolume uitmaakt, wordt gevormd door de
hepatocyten. Dit zijn polyhedrale epitheliale cellen georganiseerd in anastomotische platen.
Ze verrichten het grootste deel van de functies geassocieerd met de lever (5). Vooreerst
produceren en secreteren ze gal dat dan wordt opgeslagen in de galblaas. Gal is een mengsel
van water, elektrolyten, galpigmenten, galzuren, cholesterol, fosfolipiden, albumine en
immunoglobulinen. De galzuren worden door de hepatocyten gevormd als een afbraakproduct
van cholesterol, waarna ze geconjugeerd worden tot galzouten. De samenstelling van gal
maakt dat het essentieel is in de vertering en de resorptie van vetten in de darm, de eliminatie
van afvalstoffen, het cholesterol metabolisme en de immunologische afweer. Daarnaast spelen
de hepatocyten een belangrijke rol in het eiwitmetabolisme. Ze zijn verantwoordelijk voor de
synthese van niet-essentiële aminozuren en plasma-eiwitten zoals albumine, glycoproteïnen,
lipoproteïnen en stollingsfactoren. Bovendien zijn ze betrokken bij de afbraak van deze
7
producten door deaminatie met vorming van ureum. Verder helpen de hepatocyten de
bloedglucosespiegel te handhaven door glucose op te slaan onder de vorm van glycogeen
(glycogenese) of door glycogeen af te breken met vrijstelling van glucose (glycogenolyse).
Glucose kan ook worden gesynthetiseerd uit eiwitten en vetten (gluconeogenese) en worden
afgebroken voor energievrijstelling (glycolyse). In het vet metabolisme zorgen de hepatocyten
voor aanmaak en katabolisatie van lipoproteïnen, synthese en eliminatie van cholesterol en
opname en oxidatie van vrije vetzuren. Verder nemen deze levercellen deel aan het hormoon
metabolisme en veronderstellen ze een centrale rol bij de instandhouding van de homeostase
van spoorelementen. Ze dienen daarbij als opslagplaats voor verschillende vitamines,
glycogeen en vet. Voorts zijn de hepatocyten van belang in de afbraak van rode bloedcellen.
Derhalve wordt hemoglobine geoxideerd met vorming van het galpigment bilirubine dat
geëxcreteerd wordt in de gal. Ten slotte verzorgen de enzymen van deze levercellen de
detoxificatie van alcohol, drugs, toxines, chemicaliën, metabole afvalstoffen en ammoniak in
meerdere fasen (5, 6). Deze essentiële functies verklaren het belang van de lever voor het
handhaven van het evenwicht in het menselijk lichaam. Zij worden gewaarborgd door het
enorme vermogen van de hepatocyten om te regenereren in reactie op leverschade. Reeds in
1931 werd door Higgins en Anderson aangetoond dat bij knaagdieren de lever zijn
oorspronkelijke volume na twee derde hepatectomie kan herstellen in ongeveer 5 tot 7 dagen
(7, 8). Ook bij gezonde personen kan de lever een acuut verlies van 70 tot 75% van de totale
massa compenseren (9). De regeneratieve respons is daarbij evenredig met de hoeveelheid
lever dat verwijderd werd (8).
Sinusoïdale cellen
De sinusoïdale cellen omvatten endotheliale cellen, hepatische stellaat cellen (HSCs), Kupffer
cellen en lever-specifieke lymfocyten. De sinusoïdale endotheliale cellen lijnen de sinusoïden
af en zijn voorzien van talrijke fenestrae die een gegradeerde barrière voorzien tussen de
sinusoïde en de ruimte van Disse. Deze ruimte tussen het sinusoïdaal endotheel en de
hepatocyten bevat HSCs, ook wel bekend als Ito cellen. Dit zijn multifunctionele cellen die
gekenmerkt worden door cytoplasmatische vetdruppels en betrokken zijn bij de opslag van
vitamine A en andere vetoplosbare vitaminen. Na activatie transformeren ze tot fibroblasten
die een belangrijke bron van extracellulaire matrixcomponenten, zoals collagenen, secreteren.
De Kupffer cellen verblijven in het lumen van de sinusoïden. Zij zijn lid van het
mononucleaire fagocyterende systeem en zijn verantwoordelijk voor de klaring van
beschadigde lichaamseigen cellen alsook toxische, infectieuze en vreemde stoffen. Kupffer
8
cellen vormen overigens de bron van verschillende gunstige, vasoactieve en toxische
mediatoren die bijdragen tot gastheer afweermechanismen, evenals enkele ziekteprocessen in
de lever. Pit cellen ter afsluiting zijn lever-specifieke lymfocyten die kunnen gerekruteerd
worden uit het perifere bloed naar de leversinusoïden waar ze volwassen worden en
kenmerken van naturalkillercellen verwerven (5, 6).
Cholangiocyten
Cholangiocyten zijn biliaire epitheliale cellen die de intrahepatische en extrahepatische
galwegen aflijnen. Ze modificeren de gal afkomstig van de galcanaliculi van de hepatocyten
via secretoire en reabsorptieve processen die onder controle staan van hormonen, peptiden,
groeifactoren en cholinerge innervatie. Ze nemen eveneens deel aan de detoxificatie (3). Net
zoals de hepatocyten zijn de cholangiocyten doorgaans in rusttoestand, maar kunnen ze in
geval van leverschade repliceren. Dit is in vivo voornamelijk aangetoond aan de hand van
experimenten waarbij de galwegen werden geligeerd, de lever gedeeltelijk werd gereseceerd
of na chemische inductie (10).
Leverprogenitorcellen
Ten slotte is er ook een progenitorcel compartiment in de lever aanwezig. Dit bevindt zich
voornamelijk in de kanalen van Hering, dewelke kleinere vertakkingen zijn van de
intrahepatische galwegen en de overgangszone vormen tussen hepatocyten en cholangiocyten
(11, 12). Leverprogenitorcellen (LPCs) zijn bipotentiële cellen die in staat zijn om te
differentiëren tot mature hepatocyten en cholangiocyten (11, 13). LPCs zijn feitelijk
facultatieve cellen met een lage proliferatiegraad die enkel geactiveerd worden bij ernstig
acuut of chronisch leverlijden, wanneer het regeneratievermogen van de hepatocyten en de
cholangiocyten ontoereikend is omwille van een te groot celverlies of replicatieve senescentie
(11, 13-17). Geactiveerde LPCs expanderen gradueel van periportaal naar de centrale vene en
leiden tot ductulaire reactie. Reactieve ductules zijn strengen van prolifererende LPCs en de
daaruit voorkomende transit-amplificerende cellen (15, 17-20). De differentiatie van LPCs
naar hepatocyten gebeurt via intermediaire hepatocyt gelijkende cellen, polygonale cellen met
een afmeting en fenotype intermediair tussen progenitorcellen en hepatocyten. Terwijl de
ontwikkeling naar de biliaire cellijn leidt tot de vorming van atypische reactieve ductuli,
anastomose-strengen van onrijpe biliaire cellen met een ovale kern die wordt omgeven door
een kleine rand van cytoplasma (11, 15, 18, 19). LPCs zijn dus een heterogene populatie die
zowel eigenschappen van stamcellen (zoals prominine 1 (PROM1) en epitheliale cel adhesie
9
molecule (EPCAM)) als cholangiocyt (cytokeratine 7 (CK7), cytokeratine 19 (CK19)) en
vroege hepatocyt (alfa foetoproteïne (AFP)) merkers dragen (11, 21). Er is echter nog geen
consensus tussen verschillende onderzoeksgroepen over een specifieke merkerset dat LPCs
karakteriseert. De meest onderzochte merkers staan in tabel 1 in bijlage opgelijst (13, 15, 21-
23).
De verschillende signaalmoleculen die worden vrijgegeven door de verschillende celtypes
werken in zowel autocriene als paracriene wijze in op het progenitorcel compartiment (14, 15,
24). Zo zijn de inflammatoire cellen verantwoordelijk voor de productie van diverse cytokines
die de LPC respons beïnvloeden (15, 16, 23-26). Dit verklaart waarom de progenitorcel
activatie gecorreleerd is met de mate van inflammatie. Daarnaast zijn HSCs een belangrijke
bron van groeifactoren voor LPCs, en op hun beurt kunnen LPCs bijdragen tot HSC activatie
en de ontwikkeling van fibrose. Er bestaat dus een nauwe correlatie tussen de graad van
leverschade, LPC expansie en fibrose in leverziekten (13, 15, 21, 24, 26, 27). Ook
morfogenen zoals Wnt en Notch, dewelke belangrijke factoren zijn tijdens de embryonale
ontwikkeling, zijn belangrijke drijfveren van de LPC respons als regulatoren van stamcel
proliferatie en lotsbepaling. De Notch signaaltransductieweg wordt getriggerd door binding
van ligand Jagged 1, geëxpresseerd door myofibroblasten, op de Notch receptoren van LPCs
en drijft de differentiatie naar cholangiocyten, terwijl de expressie van Wnt3 door macrofagen
na opname van hepatocyt debris de Wnt signaaltransductieweg in de LPCs zou activeren en
zo differentiatie in hepatocyten moduleert (14, 17, 24, 28-32). Interacties die LPC proliferatie
en differentiatie regelen zijn echter nog niet volledig opgehelderd (15).
1.2. Primaire levertumoren
Hepatocellulair carcinoom en cholangiocarcinoom zijn de belangrijkste primaire lever
tumoren en kunnen samen voorkomen in een gemengd hepatocellulair-cholangiocarcinoom.
1.2.1. Hepatocellulair carcinoom
De meest voorkomende primaire leverkanker is hepatocellulair carcinoom (HCC), goed voor
meer dan 80% van de gevallen (33). Met een jaarlijks toenemende incidentie is HCC
uitgegroeid tot de vijfde meest voorkomende kanker, en de tweede belangrijkste oorzaak van
kanker gerelateerde sterfgevallen wereldwijd (33-35). HCCs zijn tumoren die zich vaak
ontwikkelen in een achtergrond van chronische leverziekten die gekenmerkt worden door
fibrose (32, 36). Microscopisch wordt HCC gekenmerkt door brede platen van hepatocyten
10
met een eosinofiel of helder cytoplasma. Maligne hepatocyten zijn cytologische atypisch en
pleomorf, en kunnen mitotische activiteit vertonen. Verder zijn de tumoren goed
gevasculariseerd en gaat het hepatocellulair fenotype gepaard met verlies van reticuline
secretie (37, 38). De klinische kenmerken van HCC kunnen niet specifiek en moeilijk te
diagnosticeren zijn en omvatten onder andere gewichtsverlies en een verslechterende
leverfunctie. In latere stadia kan de tumor leiden tot buikklachten in het rechter bovenste
kwadrant en in zeldzame, ongelukkige gevallen kan een intra-abdominale bloeding als gevolg
van een ruptuur van de levertumor optreden.
De keuze voor de behandeling van leverkanker is sterk afhankelijk van het tumorstadium en
de onderliggende leverziekte (33). Wanneer HCC in vroege stadia wordt gediagnosticeerd
zijn er verschillende curatieve therapieën zoals resectie, levertransplantatie en radiofrequentie
ablatie mogelijk (32). Niettemin is de kans op herval hoog waardoor de gemiddelde 5-jaars
overleving 40 tot 70% bedraagt (34, 39, 40). HCC wordt echter meestal gedetecteerd in latere
stadia (32, 33); de behandelingsmogelijkheden zijn dan beperkt tot transarteriële chemo-
embolisatie (TACE) en tyrosine kinase inhibitoren, zoals sorafenib (32). TACE wordt
aangewend om de overleving van patiënten met intermediaire tumoren te verbeteren door de
doorbloeding van de tumor te blokkeren en zodoende tumor necrose te induceren. Deze
therapie verlengt de mediane overleving tot ongeveer 20 maanden (41). Sorafenib anderdeels
is vrijwel de enige erkende systemische therapie voor patiënten met vergevorderd HCC. Door
de proliferatie van de kankercellen en de aanmaak van nieuwe bloedvaten naar de tumor te
remmen wordt tumorgroei vertraagd en de mediane overleving verlengd tot ongeveer 10
maanden (41). Helaas gaan deze behandelingsstrategieën gepaard met verschillende ernstige
bijwerkingen en blijven therapieresistentie, terugval en metastase een reële bedreiging (32).
Aldus zal een beter begrip van de mechanismen verantwoordelijk voor leverkanker initiatie en
progressie de detectie van meer betrouwbare tumormerkers en de ontwikkeling van nieuwe
behandelingsmodaliteiten van leverkanker vergemakkelijken (33).
1.2.2. Cholangiocarcinoom
Cholangiocarcinoom (CC) is de tweede meest voorkomende primaire leverkanker en is goed
voor ongeveer 10 tot 15% van de primaire levertumoren wereldwijd (42, 43). In de afgelopen
twee decennia zijn de incidentie en het sterftecijfer van CC universeel toegenomen (42). CCs
zijn kwaadaardige heterogene adenocarcinomen die kunnen voortkomen uit het ductaal
epitheel, hetzij in de lever (intrahepatisch CC) hetzij in de extrahepatische galwegen
(extrahepatisch CC) (37, 42). Deze masterproef legt zich verder toe op intrahepatische CCs.
11
Intrahepatisch CC ontwikkelt zich op een achtergrond van chronische biliaire ontsteking en
beschadiging, veroorzaakt door risicofactoren die ook bij HCC worden teruggevonden, zoals
virale hepatitis en chronisch alcoholgebruik (42, 44). Daarnaast worden ook primair
scleroserende cholangitis, leverbot infecties en hepatolithiasis beschreven als vermoedelijke
risicofactoren (44). Hoewel deze tumoren geen specifieke morfologie hebben, worden ze
gewoonlijk herkend als maligne buisvormige structuren ingebed in fibreus stroma. Deze
tumoren ontbreken een karakteristiek immunohistochemisch profiel, maar zijn typisch positief
voor cytokeratines, zoals CK7 en CK19 (37). Symptomen zijn pijn in de bovenbuik en de rug
ten gevolge van hepatomegalie, en in gevorderde gevallen hebben patiënten icterus en ascites
(45). Deze tumoren zijn echter vaak subklinisch en worden pas gediagnosticeerd in een laat
stadium (42, 44, 45), bovendien zijn ze resistent tegen conventionele chemotherapie (42).
Derhalve zijn de therapeutische opties beperkt tot chirurgische resectie, TACE of palliatieve
zorg (42, 44). Bij 70% van de patiënten zijn de tumoren inoperabel, geavanceerd en
metastatisch, dusdanig is de 5-jaars overleving voor deze patiënten somber met 0 tot 10% (42,
43), en dus slechter dan de overlevingskansen en de prognose van HCC (46).
1.2.3. Hepatocellulair-cholangiocarcinoom
Het gemende hepatocellulair-cholangiocarcinoom (HCC-CC) is een ongewone vorm van
primaire leverkanker dat componenten van zowel HCC als CC vertoont en goed is voor 0,4
tot 14,2% van alle primaire leverkanker gevallen (32, 33, 37, 47). Volgens de
Wereldgezondheidsorganisatie worden HCC-CCs geclassificeerd in klassieke types en types
met stamcel kenmerken. De klassieke HCC-CC heeft typische HCC en CC componenten met
mucineproductie in het CC-component. Het stamcel type wordt verder onderverdeeld in drie
subtypes: cholangiocellulair of typisch, intermediair en cholangiolocellular subtype. Het
cholangiocellulair subtype wordt gekenmerkt door nesten van volwassen hepatocyten met
perifere clusters van kleine cellen die een immunohistochemisch profiel van
stam/progenitorcellen vertonen. Het intermediaire subtype heeft kenmerken intermediair
tussen hepatocyten en cholangiocyten, en wordt tevens gekenmerkt door cellen met LPC
kenmerken in trabeculae, nesten of strengen met fibreus stroma. Het cholangiolocellulaire
subtype tenslotte wordt hoofdzakelijk gekenmerkt door kleine cellen met een hoge nucleaire-
cytoplasmatische verhouding, groeiend in een buisvormige, koordachtige, anastomose-
architectuur in fibreus stroma (37).
12
Figuur 3. Histopathologie van primaire levertumoren (haematoxyline-eosine kleuring). A: normale lever; B:
HCC; C: intrahepatisch CC (48); D: HCC-CC (49).
De diagnose van HCC-CC is afhankelijk van het aantonen van hepatocellulaire en gal
epitheliale kenmerken in dezelfde tumor aan de hand van histologische en
immunohistochemische analyse op biopten (47). Aanwijzingen voor de ziekte, ongeacht het
subtype, omvatten een combinatie van symptomen en merkers voor HCC en CC (37). Over
het algemeen heeft HCC-CC een slechtere prognose dan HCC en CC, mede doordat de
tumoren snel therapieresistentie vertonen (32, 37). In tegenstelling tot de klassieke HCC en
CC waarvan wordt gedacht dat ze ontwikkelen uit respectievelijk volwassen hepatocyten en
cholangiocyten in een meerstaps carcinogenese, suggereren recente studies dat HCC-CC zou
voortkomen uit de bipotentiële leverprogenitorcellen (32, 36, 38, 50).
1.3. Hypoxie
Hypoxie is een conditie van verminderde zuurstofconcentratie in weefsel, dat onvoldoende is
om de metabole vraag van het weefsel te beantwoorden. In de context van dit onderzoek, kan
zuurstof depletie veroorzaakt worden door leverschade waarbij de bloedtoevoer
gecomprimeerd is. Hypoxie fungeert dan niet alleen als een verergerende factor van
13
celbeschadiging en ontsteking, maar inhibeert ook leverregeneratie, stimuleert angiogenese en
fibrogenese en bevordert hepatocarcinogense (51, 52). Er bestaan verschillende adaptieve
mechanismen om zuurstof homeostase en dus celoverleving te handhaven (53-55). De best
gekarakteriseerde regulerende signalisatieweg geactiveerd in reactie op weefselhypoxie wordt
gemedieerd door de transcriptiefactor hypoxie-induceerbare factor 1 (HIF1) (51, 56-59).
1.3.1. Hypoxie-induceerbare factor 1
HIF1 is een heterodimeer eiwit dat bestaat uit twee subeenheden, met name de O2-
gereguleerde HIF1α en de constitutief geëxpresseerde HIF1β (51, 56, 58-62). Onder
normoxische omstandigheden wordt HIF1α gehydroxyleerd ter hoogte van de prolineresiduen
402 en 564 door prolyl hydroxylase domein eiwitten (PHD1, PHD2 en PHD3), waarvan
PHD2 de belangrijkste zuurstofsensor van de levercel is (36). Het gehydroxyleerde HIF1α
interageert dan met het von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor eiwit dat deel uitmaakt
van een E3 ubiquitine ligase complex en HIF1α merkt voor proteasomale degradatie Bij
hypoxie echter wordt HIF1α gestabiliseerd in afwezigheid van O2. HIF1α zal bijgevolg
accumuleren en migreren naar de kern waar het dimeriseert met HIF1β. De functionele
transcriptiefactor bindt vervolgens, samen met de cofactoren CBP en p300, aan het hypoxie
responselement 5’-RCGTG-3’ wat leidt tot de opregulatie van tal van genen betrokken bij
processen die celoverleving ondersteunen (32, 51, 56-62). Zo stimuleert HIF1 angiogenese
door de expressie van genen betrokken in weefselperfusie zoals de vasculaire endotheliale
groeifactor (VEGF) wat leidt tot verhoogde zuurstof levering (59, 60, 62, 63). Daarnaast
verhoogt HIF1 de mogelijkheid om zuurstof deprivatie te overleven door de metabole
herprogrammering van cellen van de oxidatieve citroenzuurcyclus naar het glycolytisch
metabolisme. Dit wordt bereikt door het gecoördineerd opreguleren van genen die coderen
voor glycolytische enzymen en glucose transporters, zoals glucose transporter 1 (GLUT1) en
fosfofructokinase (PFK) (59, 63). Verder reguleert HIF-1 het gen dat codeert voor
erytropoëtine, het hormoon dat rode celproductie controleert, waardoor de capaciteit om
zuurstof te vervoeren naar de weefsels verhoogt (59, 63). Verder induceert HIF1 groeifactoren
die signaaltransductiewegen activeren die leiden tot celproliferatie en overleving (60, 63).
1.3.2. Hypoxie in hepatocellulair carcinoom
De ontwikkeling van solide tumoren gaat vaak gepaard met het optreden van hypoxie. Door
de hoge metabole activiteit en de excessieve celproliferatie van kankercellen wordt de
bestaande vasculatuur al gauw ontoereikend om de cellen te voorzien van een adequate
14
aanvoer van zuurstof en nutriënten (32, 36, 56, 60). Daarenboven ontwikkelt HCC zich vaak
in een achtergrond van chronische leverziekten die gekenmerkt worden door fibrose (36).
Door de vorming van fibrotische septa, alsmede sinusoïdale capillarisatie, neemt de weerstand
in de bloedvaten toe. Deze zaken zorgen ervoor dat er in de tumoromgeving zuurstof tekort
ontstaat, waardoor de tumoren hypoxisch worden (36, 64). Ook kankercellen hebben
mechanismen ontwikkeld om te gedijen in dergelijke omstandigheden. Dientengevolge
induceert het gestabiliseerde HIF1α diverse genen die een kritieke rol bekleden in de
biologische aspecten van HCC, zoals angiogenese, invasie en metastase, celdifferentiatie en
therapieresistentie (61). De overexpressie van HIF1α wordt dan ook geassocieerd met een
meer agressief fenotype en een verhoogde mortaliteit (56, 59, 60).
Naast intrinsieke oorzaken berusten ook verscheidene therapieën in de behandeling van HCC,
zoals sorafenib en TACE, op het induceren van hypoxische condities in de tumor teneinde de
tumor van nutriënten te depriveren en zo de groei te reduceren (65, 66). Verhoogde HIF1α
stabilisatie echter zou in een aantal gevallen gecorreleerd zijn met een progressie naar een
meer invasief fenotype, een verhoogd metastase potentiaal en zelfs het ontwikkelen van het
meer agressieve gemengde HCC-CC fenotype (32, 56, 65). Zo blijkt uit de studie van Zen et
al. dat humane levers met HCC na lokale ablatie therapie door middel van TACE vaker het
gecombineerde HCC-CC fenotype vertonen dan de onbehandelde HCC levers (66).
Eerder al werd in de studie van Heindryckx F. et al het effect van PHD2 haplodeficiëntie op
de ontwikkeling en progressie van primaire levertumoren onderzocht. Derhalve werd gebruik
gemaakt van een diethylnitrosamine (DEN) geïnduceerd muismodel, waarbij primaire
levertumoren zich ontwikkelen in een achtergrond van fibrose. PHD2 heterozygote knock-out
muizen (PHD2+/-) werden dan vergeleken met hun wild type (WT) tegenhangers, daarbij
focuserend op de expressie van angiogene factoren, tumorontwikkeling en tumor fenotype.
Deze studie toont aan dat verhoogde stabilisatie van HIF1α de hepatocarcinogenese verhoogt
en de ontwikkeling van cholangiocarcinoom stimuleert. Bovendien selecteerden PHD2
deficiëntie en de begeleidende continue HIF1 activatie voor een hogere expressie van
metastase merkers (36). Het effect van PHD2 deficiëntie op de hepatocarcinogenese bezit een
groot potentieel voor therapeutische interventie, aangezien hypoxie en de selectie voor een
meer agressief cholangiocarcinoom fenotype ook een weerslag zouden kunnen hebben op
patiënten die een langdurige behandeling met anti-angiogene verbindingen krijgen (36).
15
1.4. Probleemstelling
In dit onderzoek wordt verondersteld dat een verhoogde activatie van de hypoxische
signaaltransductieweg het gedrag van de bipotentiële LPCs in de omgeving van de tumor
beïnvloedt en de differentiatie richting cholangiocyten stimuleert. Het resulterende HCC-CC
fenotype concordeert met een slechtere prognose.
In een vorige studie werden progenitorcel kenmerken van HCC in WT en PHD2
haplodeficiënte muizen reeds onderzocht na 20, 25 en 30 weken DEN gemedieerde HCC
inductie (67). Nu willen we het effect van overactivatie van de hypoxische
signaaltransductieweg in de tijd gedurende de vroege hepatocarcinogenese nagaan. De WT en
PHD2+/- muizen zullen derhalve worden geëuthanaseerd na 5, 10, 15, 17,5 en 20 weken HCC
inductie, waarna stalen van de lever zullen worden afgenomen ter analyse van verschillende
LPC en hypoxie merkers op RNA en eiwitniveau teneinde temporele veranderingen in LPC
activatie en differentiatie tijdens de ontwikkeling van HCC in kaart te brengen en het effect
van een continue overexpressie van HIF1α op deze evolutie na te gaan.
Het doel van de studie bestaat erin te beproeven of de verhoging in LPC kenmerken en de
fenotypische shift naar het gemengde HCC-CC fenotype na DEN gemedieerde HCC inductie
in PHD2+/- muizen reeds vroeg tijdens de hepatocarcinogenese plaatsvindt, dan wel het om
een late gebeurtenis gaat.
16
2. Materialen en methoden
2.1. Muismodel
Vijf weken oude mannelijke sv129 muizen kregen wekelijks een intraperitoneale injectie met
DEN (35 mg/kg lichaamsgewicht) (Sigma-Aldrich, België) verdund in een fysiologische
zoutoplossing; dit leidt tot HCC vanaf 20 weken na eerste inductie. De controlegroep werd
geïnjecteerd met een gelijk volume fysiologische zoutoplossing.
Om het effect van activatie van de HIF signalisatieweg na te gaan werd de
hepatocarcinogenese in wild type (WT) muizen vergeleken met PHD2 haplodeficiënte
muizen. Door inactivatie van het PHD2 gen treedt een verlaagde hydroxylatie van HIF onder
normoxische condities op. Een koppel heterozygote PHD2 knock-out muizen werd verkregen
via Prof. Carmeliet (VIB, België). De offspring bestaat uit 2/3 heterozygote PHD2 muizen en
1/3 wild types, de homozygote PHD2 mutatie is niet levensvatbaar. De muizen werden
gegenotypeerd via polymerase ketting reactie (PCR) en gelelektroforese met de volgende
primers: ACCTATGATCTCAGCATTTGGGAG, AAATTCTAATCGTAGCTGATGTGAGC en
TCAGGACAGTGAAGCCTAGAAACTCT.
De populatiegrootte der proefdieren werd bepaald naar analogie met voorgaand onderzoek
waarbij 8 muizen per groep voldoende bleek om significante resultaten te verkrijgen. Voor
zover het tijdsbestek en de muizenkweek het toelieten, werd getracht om dit aantal te behalen.
Om de WT groep te vervolledigen werden stalen uit een vroegere studie van de
onderzoeksgroep Hepatologie (Universiteit Gent, België) (68) toegevoegd aan bepaalde
groepen (Tabel 1).
Tabel 1. Populatiegrootte en behandelingsgroepen.
DEN Controle Totaal
5 weken 10 weken 15 weken 17,5 weken 20 weken 20 weken
WT 7 5 7 8 8 7 42
WT nestgenoten
3 4 5 8 0 7 27
WT
additioneel 4 1 2 0 8 0 15
PHD2+/- 9 8 8 8 9 11 53
De muizen werden gekweekt en gehuisvest in het animalarium van de Faculteit Geneeskunde
en Gezondheidswetenschappen, Universiteit Gent, België. Dit gebeurde bij kamertemperatuur
17
en een constante luchtvochtigheidsgraad in een 12 uurs gecontroleerde donker/licht cyclus. Er
was ad libitum toegang tot een standaard pellet dieet en drinkwater. De Ethische Commissie
Dierproeven van de Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen, Universiteit Gent,
België, keurde het protocol goed (ECD13/61).
2.2. Staalname
Op de vooropgestelde tijdspunten werden de muizen gesacrifieerd. Daartoe werden de muizen
geanestheseerd met ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg). De muizen werden
gewogen en bloed werd afgenomen via de Vena ophtalamica. Na stolling werd het bloed 15
minuten gecentrifugeerd en werd het serum bewaard bij -80°C voor mogelijke opvolgende
studies. De muizen werden dan door cervicale dislocatie geëuthanaseerd. Vervolgens werden
de lever en de milt gepreleveerd, gewogen en macroscopisch geëvalueerd. De lever werd
verdeeld voor verschillende analyses; een deel van het leverweefsel werd gecollecteerd in
RNA-later (Ambion, Life Technologies, België), ingevroren met behulp van vloeibare stikstof
en verder bewaard bij -80°C voor RNA analyse. De stalen voor eiwitanalyse werden eveneens
snel bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80°C. Leverweefsel voor histologie werd
gecollecteerd in cassettes en gefixeerd in een 4% fosfaat gebufferde formaldehyde oplossing
(Klinipath, België).
2.3. Histologie
2.3.1. Inbedden en coupes snijden
Na 24 uren fixatie werden de histologiecassettes overgebracht in een fosfaatgebufferde
zoutoplossing (PBS) (Gibco, Verenigd Koninkrijk) en routinematig door de dienst Pathologie
verwerkt in stijgende ethanolbaden om te dehydrateren. De stalen werden daarna ingebed in
paraffine.
Vervolgens werden met behulp van een microtoom (Leica, België) coupes met een dikte van
5 µm gesneden. Deze coupes werden dan 24 uren gedroogd in een incubator bij 37°C.
2.3.2. Haematoxyline-eosine kleuring
De haematoxyline-eosine (HE) kleuring wordt uitgevoerd om morfologische veranderingen
veroorzaakt door DEN inductie vast te stellen en (pre-)neoplastische laesies te identificeren.
Haematoxyline kleurt selectief de negatief geladen celmembraan en het nucleair chromatine
blauw, eosine kleurt het positief geladen cytoplasma en bindweefsel roze. Vooreerst werden
18
de coupes gedeparaffineerd in xyleen, gerehydrateerd in aflopende ethanolbaden en gespoeld
in gedestilleerd water. Vervolgens werden de coupes in een haematoxyline oplossing (Mayer,
Sigma-Aldrich, België) gebracht en gespoeld met achtereenvolgens kraanwater, gedestilleerd
water en ethanol om dan te worden gekleurd in Eosine Y. Verder werden de coupes
gedehydrateerd in oplopende ethanolbaden en gespoeld met xyleen. Ten slotte werden de
coupes permanent gemonteerd met DPX (Klinipath, België). Analyse van de stalen gebeurde
met behulp van de lichtmicroscoop (Olympus BX41, België).
2.3.3. Sirius Red kleuring
De Sirius Red kleuring wordt uitgevoerd om fibrotisch weefsel aan te kleuren. Na het
deparaffineren, rehydrateren en spoelen van de coupes zoals hierboven vermeld werden de
coupes 30 minuten in een Sirius Red oplossing gedompeld. Deze oplossing bestond uit 0,1%
Sirius Red in picrinezuur. Daarna werden de coupes gespoeld met gedestilleerd water en
gedehydrateerd zoals eerder beschreven. Hier kleuren de collageen type I en III vezels rood
aan. Ook bij dezen gebeurde analyse van de stalen met behulp van de lichtmicroscoop.
2.3.4. Reticuline kleuring
De reticuline kleuring werd routinematig uitgevoerd door de dienst pathologie. Reticuline is
voornamelijk samengesteld uit type III collageen en dient als raamwerk voor de
levercelplaten. Reticuline wordt aangemaakt door normale hepatocyten, maar niet door
tumorcellen, waardoor reticuline vrije zones als HCC leasies kunnen worden geïdentificeerd.
Voor kwantificatie in grootte kon worden gebruik gemaakt van de lichtmicroscoop en het
softwareprogramma Cell D (Olympus, Duitsland). Op basis van de gegevens verkregen via
bovenstaande routinekleuringen werd bepaald welke stalen dienden te worden aangekleurd.
2.3.5. Immunohistochemie
Immunohistochemische kleuringen voor CK19 en EPCAM werden uitgevoerd voor de
evaluatie van de LPC niche. Het aankleuren van F4/80 aanwezig op het celoppervlak van
macrofagen is een maat voor inflammatie.
Na het deparaffineren, rehydrateren en spoelen van de coupes zoals hierboven vermeld volgde
antigen retrieval om modificatie van antigenen ten gevolge van formolfixatie ongedaan te
maken. Vervolgens werden endogene peroxidase activiteit en aspecifieke bindingsplaatsen
geblokkeerd met respectievelijk H2O2 en bovine serum albumine (BSA). Daarna werden de
stalen geïncubeerd met het primaire antilichaam, gevolgd door een gebiotinyleerd secundair
19
antilichaam. Daarop werd horseraddish peroxidase (HRP) geconjugeerd streptavidine
toegevoegd om het signaal te versterken. Visualisatie gebeurde door interactie van HRP met
het chromogeen substraat 3,3'-diaminobenzidine (DAB, Dako, België), waardoor een bruine
neerslag werd gevormd. Als laatste werd een tegenkleuring met haematoxyline (Sigma
Aldrich, België) uitgevoerd om de celstructuren te visualiseren waarna coupes gedehydrateerd
en gemonteerd werden. Analyse van de stalen gebeurde met behulp van de lichtmicroscoop en
de Cell D software.
Tabel 2. Protocollen van de immunohistochemische kleuringen.
Antigen
retrieval Blokkeren Primair antilichaam
Secundair
antilichaam Buffer
CK19
20’
citraatbuffer,
95°C
10’ 3%
H2O2
30’ 1%
BSA,
37°C
1u konijn monoclonaal anti-
CK19, ab133496 (Abcam),
37°C, 1/200
LSAB kit,
K0690 Dako TBS
EPCAM 30’
citraatbuffer,
95°C
10’ 3%
H2O2
30’ 1% BSA,
37°C
15u geit polyclonaal anti-EPCAM, sc-23788 (Santa
Cruz), 4°C, 1/300
konijn
polyclonaal
anti-geit,
E0466 Dako
PBS + 0,1%
BSA
F4/80
20’
citraatbuffer,
95°C
10’ 3%
H2O2
45’
0,5%
BSA,
KT
15u rat monoclonaal anti-
F4/80, MCA-497G (Serotec
Abd), 4°C, 1/300
LSAB kit,
K0690 Dako TBS
2.4. Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie
2.4.1. RNA-isolatie en cDNA synthese
RNA werd geëxtraheerd uit 20 mg leverweefsel volgens de richtlijnen van de fabrikant
(Qiagen RNAeasy Mini Kit, Nederland). De zuiverheid en concentratie van RNA werden
geëvalueerd met behulp van spectrofotometrie (Biofotometer, Eppendorf, Duitsland).
Vervolgens werd cDNA gesynthetiseerd uitgaande van 1000 ng RNA met de SensiFAST
cDNA Synthesis Kit (Bioline, Frankrijk) overeenkomstig het protocol van de producent.
2.4.2. Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie
Genexpressie werd dan gemeten via real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-
qPCR). Hierbij werd cDNA toegevoegd aan een microtiterplaat met een mastermix die
bestaat uit de forward primer, de reverse primer en de 2x Sensimix SYBR No-ROX
Mastermix (Bioline, VK). De reactie werd automatisch met Lightcycler 480 II (Roche,
20
België) uitgevoerd volgens het protocol van de producent. Genen en overeenkomstige primers
worden in tabel 3 opgelijst. De efficiëntie van de primerparen werd berekend aan de hand van
volgende formule: 10-1/helling. Alle reacties werden in duplo uitgevoerd en genormaliseerd aan
de hand van een set van huishoudgenen die een stabiele expressie toonden in alle stalen, dit
zijn SDHA, HPRT en HMBS. Het aantal transcripten werd vervolgens bepaald aan de hand
van de Cp-waarden.
Tabel 3. Genen en overeenkomstige primers.
Gen
(afkorting)
Gen
(volledige naam) Forward primer Reverse primer Merker
Gapdh Glyceraldehyde-3-
fosfaat dehydrogenase CATGGCCTTCCGTGTTCCTA GCGGCACGTCAGATCCA Huishoudgen
Hmbs Hydroxymethylbilaan
synthase AAGGGCTTTTCTGAGGCACC AGTTGCCCATCTTTCATCACTG Huishoudgen
Hprt
Hypoxanthine
guanine fosforibosyl
transferase
GTTAAGCAGTACAGCCCCAAA AGGGCATATCCAACAACAAACTT Huishoudgen
Sdha
Succinaat
dehydrogenase
complex, subunit A
CTTGAATGAGGCTGACTGTG ATCACATAAGCTGGTCCTGT Huishoudgen
Glut1 Glucose transporter 1 GCTTATGGGCTTCTCCAAACT GTGACACCTCTCCCACATAC Hypoxie
Pfkm Fosfofructokinase,
spier GCCGGCTCAGTGAGACAAG TGGCACCTTCAGCAACAATG Hypoxie
Vegfa
Vasculaire
endotheliale
groeifactor A
ACTCGGATGCCGACACGGGA CCTGGCCTTGCTTGCTCCCC Hypoxie
Afp Alfa foetoproteïne AGCTTCCACGTTAGATTCCTCC ACAAACTGGGTAAAGGTGATGG LPC
Cd44 CD44 antigen TCGATTTGAATGTAACCTGCCG CAGTCCGGGAGATACTGTAGC LPC
Krt7 Keratine 7 AGGAGATCAACCGACGCAC CACCTTGTTCGTGTAGGCG LPC
Krt19 Keratine 19 GTTCAGTACGCATTGGGTCAG GAGGACGAGGTCACGAAGC LPC
Epcam Epitheliale cel adhesie
molecule GCGGCTCAGAGAGACTGTG CCAAGCATTTAGACGCCAGTTT LPC
Prom1 Prominine 1 CTCCCATCAGTGGATAGAGAACT ATACCCCCTTTTGACGAGGCT LPC
Ncam1 Neurale cel adhesie
molecule 1 GACAGAACCCGAAAAGGGC GTTGGGGACCGTCTTGACTT LPC
Acta2 Actine, alfa 2, gladde
spier, aorta CCAGCACCATGAAGATCAAG TGGAAGGTAGACAGCGAAGC Fibrose
Itga5 Integrine alfa 5 CAATTGCTGCTCCCTATGGT GATTTGAGATGGCACCGAAT Metastase
Mmp9 Matrix
metallopeptidase 9 GAGACGGGTATCCCTTCGAC TGACATGGGGCACCATTTGAG Metastase
Icam1 Intercellulair adhesie GCCTTGGTAGAGGTGACTGAG GACCGGAGCTGAAAAGTTGTA Metastase
21
molecule 1
Abcb1b
ATP-bindende
cassette, subfamilie B
(MDR/TAP), lid 1B
AGCCGTAAGAGGCTGAGGCCG TCACGTGCCACCTCCGGGTT Resistentie
Abcg2
ATP-bindende
cassette, subfamilie G
(WHITE), lid 2
GCCAGCACAGAAGGCCTTGGA TCCGCAGGGTTGTTGTAGGGCT Resistentie
2.5. Statistische analyse
Data werden statistisch geanalyseerd met SPSS 21. software (IBM, België). Om de datasets te
testen voor normaliteit werd de Kolmogorov-Smirnov toets gebruikt. Parametrische data
werden onderworpen aan een one-way ANOVA analyse, gegevens die geen normale
distributie vertoonden werden getest met de Mann-Whitney U toets. Daarnaast werden
bivariate correlaties berekend aan de hand van de Pearsons correlatie test. Een p-waarde van <
0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Grafische verwerking van de data gebeurde met het softwareprogramma GraphPad Prism
(GraphPad Software, Inc., VSA.).
22
3. Resultaten
3.1. Algemene parameters
Er worden geen significante verschillen gevonden tussen PHD2+/- en WT groepen wat betreft
het lichaamsgewicht. De lichaamsgewichten van de muizen die met DEN werden behandeld,
ongeacht het fenotype, zijn wel significant lager dan de gewichten van de muizen die
gedurende 20 weken fysiologische oplossing kregen (Ctrl). In beide genotypegroepen wordt
een trend van toenemende lichaamsgewichten vanaf 5 tot 17,5 weken DEN inductie
waargenomen. Dit komt overeen met de natuurlijke gewichtsevolutie bij ouder wordende
muizen (Figuur 4A).
De relatieve levergewichten worden weergegeven als maat voor leverschade; een verhoogde
afzetting van extracellulaire matrix en de vorming van nodules zullen het levergewicht doen
stijgen ten opzichte van het lichaamsgewicht. Bij de WT muizen zijn de relatieve
levergewichten het grootst gedurende de eerste 10 weken van de behandeling met DEN.
Daarna dalen de relatieve levergewichten tot het niveau van die in de controlegroep. Bij de
PHD2+/- muizen zijn de relatieve levergewichten significant hoger na 5 weken DEN inductie
vergeleken met alle andere PHD2+/- groepen. Na 10 weken zijn de relatieve levergewichten
significant gereduceerd tot het niveau van die in de controlegroep, en dus significant lager dan
de relatieve levergewichten van de WT muizen op dat moment (Figuur 4B).
Ten gevolge van leverschade en verhoogde weerstand in de lever zal de portale druk stijgen,
de milt kan hiervoor compenseren door de opslagcapaciteit voor portaal bloed te vergroten
waardoor het miltgewicht zal stijgen ten opzichte van het lichaamsgewicht. De relatieve
miltgewichten van de muizen die met DEN werden behandeld zijn inderdaad significant
hoger dan de respectievelijke controles. De relatieve miltgewichten in de PHD2+/- groep
lijken gedurende de behandeling constant te blijven. De relatieve miltgewichten van de WT
muizen daarentegen dalen na 15 weken, maar niet significant. Dit leidt echter wel tot een
significant verschil met de PHD2+/- groep, die op dat moment een hoger relatief miltgewicht
vertoont (Figuur 4C).
23
Figuur 4. Algemene parameters. A: lichaamsgewicht (g), B: relatief levergewicht en C: relatief miltgewicht.
Significanties weergegeven als *: p < 0,05, **: p < 0,01, °: p < 0,05 ten opzichte van de overeenkomstige
controlegroep en #: p < 0,05 ten opzichte van de overeenkomstige WT groep. Foutbalken: +/- SEM.
3.2. Algemene histologie
3.2.1. Haematoxyline-eosine kleuring
De haematoxyline-eosine kleuring laat toe om de algemene morfologie van de lever te
evalueren. Bij de controlegroepen wordt de normale leverstructuur waargenomen. De
hepatocyten zijn radiair geschikt rond de centrale venen, en de portale triaden met venule,
arteriool en galkanaaltje zijn duidelijk te onderscheiden (Figuur 5A). Vanaf 15 weken worden
bij de behandelde muizen histologische afwijkingen gezien. De radiaire structuur en de
regelmatige vorm van de hepatocyten zijn verstoord (Figuur 5B). Er worden kleine
tumorcellen met overvloedig cytoplasma en minimale nucleaire onregelmatigheden
gedetecteerd, maar ook cellen waarbij de kernen zeer groot of zelfs multipel zijn (Figuur 5C).
Daarnaast worden zogeheten klare cellen met een helder cytoplasma opgemerkt. Vanaf 17
weken DEN inductie worden in beperkte mate ook ductulaire proliferatie en geïnfiltreerde
inflammatoire cellen gezien (Figuur 5D, E). Deze neoplastische veranderingen worden
waargenomen bij zowel de wild type als de PHD2+/- groepen.
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
10
20
30
40
50 WT
PHD2+/-
°° °
° °
***
***
*
° °°
Lic
haam
sg
ew
ich
t (g
)
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
1
2
3
4
5
6
7 WT
PHD2+/-
°
*
***
*
#
Rela
tief
leverg
ew
ich
t
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9WT
PHD2+/-
°
°°
°°
°°°
#
Rela
tief
mil
tgew
ich
t
A
B C
24
Figuur 5. Algemene morfologie van de lever aan de hand van HE kleuring met A: Ctrl WT en B: 15 weken (w)
DEN PHD2+/- (LM: 100x). C: neoplastisch weefsel met tumorcellen en klare cellen na 15w DEN in een
PHD2+/- muis (LM: 400x). D: inflammatoire cellen na 17,5w DEN in een WT muis (LM: 400x). E: verhoogd
aantal ductulaire structuren in portaal veld na 17,5w DEN in een PHD2+/- muis (LM: 400x).
De stalen die werden gebruikt om enkele WT groepen te vervolledigen vertonen discrepanties
met de eigen stalen. Ook RT-qPCR analyse bevestigt deze verschillen (Bijlage 7.2). Om deze
reden worden deze stalen bij de verwerking van de data buiten beschouwing gelaten. Tabel 1
in de sectie Materialen en methoden geeft het resterende aantal muizen per groep weer. Daar
de volledige WT groep die 20 weken met DEN werd behandeld daardoor volledig uitvalt,
wordt ook de overeenkomstige PHD2+/- groep niet weergegeven in de resultaten.
3.2.2. Sirius Red kleuring
De aanwezigheid van fibrotisch weefsel wordt nagegaan met behulp van de Sirius Red
kleuring. Er wordt weinig verschil waargenomen in de collageenafzetting tijdens de vroege
hepatocarcinogenese (Figuur 6).
A
E D C
B
25
Figuur 6. Illustratie van de Sirius Red kleuring met A: Ctrl PHD2+/-, B: 5w DEN WT en C: 17,5w DEN WT
(LM: 100x).
3.2.3. Reticuline kleuring
De reticuline kleuring wordt aangewend om eventuele HCC laesies te onderscheiden van
normaal weefsel. Over het algemeen worden duidelijk omschreven hepatische trabeculae van
minder dan drie cellagen dik opgemerkt, wat wijst op gezond weefsel (Figuur 7A). Af en toe
worden, verspreid over het leverparenchym, kleine groepen cellen gevonden die gekenmerkt
worden door een verminderde reticuline kleuring of een abnormaal reticuline patroon (Figuur
7B-D); dit ondersteunt een diagnose van preneoplastische letsels. In overeenstemming met
eerdere studies (36, 68-70) werden na 17,5 weken DEN inductie geen echte HCC nodules
opgemerkt.
A B C
26
Figuur 7. Illustratie van de reticuline kleuring met A: Ctrl PHD2+/- en B: 17,5w DEN WT (LM: 100x). C:
reticuline vrije cellen na 17,5w DEN in een PHD2+/- muis (LM: 400x). D: nodule na 17,5w DEN in een WT
muis (LM: 200x).
3.3. Immunohistochemie
3.3.1. F4/80
Het eiwit F4/80 is een goed gekarakteriseerde macrofaagmerker en dient in deze studie om
macrofaaginfiltratie na te gaan als een maat voor inflammatie. Er is een niet-significante trend
tot hogere F4/80 expressie in de PHD2+/- muizen in de controlegroep en na 5 weken DEN
inductie die we niet in de WT groepen zien (Figuur 8A, E). Interessant is dat er na 10 weken
behandeling met DEN een significant hogere F4/80 expressie wordt waargenomen in de WT
groep vergeleken met de PHD2+/- groep (Figuur 8B, C, E). Er dient te worden opgemerkt dat
er een zeer grote variatie is.
A
C D
B
27
Figuur 8. Immunohistochemische kleuring van F4/80. Illustratie met A: Ctrl PHD2+/-, B: 10w DEN PHD2+/-,
C: 10w DEN WT en D: 17,5w DEN PHD2+/- (LM: 100x). E: gemiddeld percentage F4/80 kleuring.
Significanties: #: p < 0,05 ten opzichte van de overeenkomstige WT groep. Foutbalken: +/- SEM.
3.3.2. CK19
De aankleuring van CK19, dat geëxpresseerd wordt door cholangiocyten en LPCs, markeert
de LPC niche en belicht ductulaire reactie. Daar deze kleuring reeds goed gekarakteriseerd en
gekend is in onze onderzoeksgroep (36, 69), werd besloten om enkel DEN behandelde
groepen met elkaar te vergelijken. Het beeld dat wordt gezien na 5 en 10 weken DEN
inductie, in zowel de wild types als de PHD2+/- muizen, is gelijkaardig als dat van
controlegroepen uit eerdere studies, met een normaal galkanaal en één of twee LPCs rond de
portale vene (Figuur 9A, B). Na 15 weken wordt dan een significante stijging opgemerkt in de
PHD2+/- groep ten opzichte van eerdere PHD2+/- groepen (Figuur 9F). Hoewel er in de
PHD2+/- en WT groepen op dat moment geen verschil is in ductulaire structuren, worden in
beide groepen op dat tijdspunt meer CK19-positieve cellen opgemerkt (Figuur 9C, D); deze
cellen bevinden zich voornamelijk centrilobulair en zien eruit als grote, mature hepatocyten
met overvloedig cytoplasma eerder dan progenitorcellen (Figuur 9E). De toegenomen
eiwitexpressie die wordt beschreven na kwantificatie van de kleuring blijkt zodoende een
gevolg te zijn van een hoger aantal CK19-positieve hepatocyten in plaats van een verhoogd
aantal LPCs of biliaire epitheelcellen. Na 15 en 17,5 weken DEN inductie wordt geen verschil
waargenomen in eiwitexpressie tussen PHD2+/- en WT groepen. Vanaf 17,5 weken DEN
worden bovendien in beide groepen minder CK19-positieve hepatocyten opgemerkt. Ook hier
dient worden gewezen op de grote spreiding tussen de verschillende data.
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4 WT
PHD2+/-
#
Gem
. %
F4/8
0 k
leu
rin
g
A B C
D E
28
Figuur 9. Immunohistochemische kleuring van CK19. Illustratie met A: 5w DEN PHD2+/-, B: 5w DEN WT, C:
15w DEN PHD2+/- en D: 15w DEN WT (LM: 100x). E: meer CK19-positieve hepatocyten rond de centrale
venen na 17,5w DEN in een WT muis (LM: 200x). F: gemiddeld percentage CK19 kleuring. Significanties: *: p
< 0,05 en **: p < 0,01. Foutbalken: +/- SEM.
3.3.3. EPCAM
EPCAM is een transmembraan glycoproteïne dat wordt geëxpresseerd door vrijwel alle
epitheliale cellen, zo ook door hepatocyten, cholangiocyten, LPCs en tumorcellen. Het
fungeert daarbij als een signaal transducer; na klieving wendt het transcriptioneel actieve
intracellulaire domein van EPCAM componenten van de Wnt signaaltransductieweg aan om
celproliferatie te induceren. In de controlegroepen is het cytoplasma van de hepatocyten
voornamelijk rond de centrale vene aangekleurd (Figuur 10A), met een sterkere kleuring ter
hoogte van de membraan van de cellen. Na behandeling worden opvallende, meer donkere
immuunpositieve cellen gezien (Figuur 10B), mettertijd geraken deze cellen meer verspreid
(Figuur 10C). Kwantificatie van de bruinkleuring bevestigt een significant hogere expressie in
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5WT
PHD2+/-**
*
Gem
. %
CK
19 k
leu
rin
g
A B
C D
E F
29
de behandelde PHD2+/- muizen ten opzichte van de overeenkomstige controles (Figuur 10E),
en na 17,5 weken DEN inductie ten opzichte van de WT groep (Figuur 10C-E).
Figuur 10. Immunohistochemische kleuring van EPCAM. Illustratie met A: Ctrl WT, B: 5w DEN PHD2+/-, C:
17,5w DEN PHD2+/- en D: 17,5w DEN WT (LM: 100x). E: gemiddeld percentage EPCAM kleuring.
Significanties: °: p<0,05 ten opzichte van de overeenkomstige controlegroep, #: p<0,05 ten opzichte van de
overeenkomstige WT groep. Foutbalken: +/- SEM.
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
10
20
30WT
PHD2+/-°°
°
#
Gem
. %
EP
CA
M k
leu
rin
g
A
C
B
D
E
30
3.4. RT-qPCR
3.4.1. Hypoxie merkers
De RNA expressie van GLUT1 is reeds na 5 weken DEN inductie significant hoger in de
PHD2+/- groep ten opzichte van de respectievelijke controlegroep. In de WT muizen lijkt een
zelfde trend zich voor te doen. Dit is in overeenstemming met eerdere resultaten (69). Na 10
en 15 weken DEN inductie is de expressie gedaald ten opzichte van 5 weken DEN voor beide
genotypes. Na 17,5 weken DEN neemt de expressie in beide groepen opnieuw toe; deze
stijging is significant in de PHD2+/- muizen ten opzichte van 10 en 15 weken en in de WT
muizen ten opzichte van 10 weken. De RNA expressie in de PHD2+/- groep is daarenboven
significant hoger dan in de WT groep.
De RNA expressie van VEGF lijkt groter te zijn bij de PHD2+/- muizen dan bij de wild types,
met uitzondering van de groepen die na 5 weken werden gesacrifieerd, dit is echter niet
significant. De expressie in de PHD2+/- muizen vertoont een oscillerend verloop; na 5 weken
inductie is de expressie significant lager dan de overeenkomstige controlegroep om dan na 10
weken gestegen te zijn tot opnieuw een zelfde niveau als de controlegroep. Na 17,5 weken
DEN inductie bereikt de expressie vervolgens een maximum. De expressie in de WT levers
daarentegen blijft gedurende de eerste weken na inductie eerder constant, en stijgt dan na 17,5
weken zoals de PHD2+/- groep tot op een punt dat significant hoger is dan de controle en de
voorgaande weken.
De RNA expressie van Pfk in de WT muizen blijft tot 17,5 weken relatief constant en is
significant lager in DEN groepen vergeleken met de controle. In de PHD2+/- groep echter is
de expressie na 5 weken inductie hoger vergeleken met de controlegroep waardoor op dat
moment de expressie significant hoger is dan bij de WT muizen. Daarna daalt de expressie
zoals bij de wild types tot een niveau lager dan de controle en na 15 weken is de expressie in
de PHD2+/- groep zelfs significant lager dan bij de wild types. Na 17,5 weken stijgt de
expressie opnieuw significant ten opzichte van 10 en 15 weken, maar niet ten opzichte van 5
weken DEN inductie. Bovendien is de expressie dan significant hoger dan in de WT groep.
Opmerkelijk is dat de RNA expressies van de drie hypoxie merkers een piek vertonen na 17,5
weken DEN inductie, en dit meer uitgesproken in de PHD2+/- groep.
31
Figuur 8. Genormaliseerde RNA expressie van hypoxie merkers. A: Glut1, B: Vegfa en C: Pfk. Significanties: *:
p < 0,05, **: p < 0,01, °: p < 0,05 ten opzichte van de overeenkomstige controlegroep en #: p < 0,05 ten opzichte
van de overeenkomstige WT groep. Foutbalken: +/- SEM.
3.4.2. Leverprogenitorcel merkers
De expressie van Krt7 verschilt significant tussen de PHD2+/- en WT controlegroepen en na
17,5 weken DEN inductie, telkens met een lagere expressie in de PHD2+/- groep. Terwijl de
expressie in WT groepen vrijwel constant blijft, wordt bij de PHD2+/- groepen een stijging in
Krt7 expressie gezien na 5 weken, significant ten opzichte van de controle en 10 weken
inductie, en na 15 weken, significant ten opzichte van de controle.
De expressie van Krt19 is gelijk voor beide genotypes in controlegroepen en kent een
gelijkaardig verloop tot en met 15 weken na de start van DEN inductie. Na 17,5 weken DEN
inductie wordt echter een piek in Krt19 expressie gezien, significant ten opzichte van alle
andere groepen voor de PHD2+/- muizen en ten opzichte van controle en 5 weken DEN voor
de WT groep.
Glut1
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000WT
PHD2+/-
°
°°
°
*
*
*
****
**
#
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
nVegfa
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000 WT
PHD2+/-
°
°**
*
*
**
***
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
Pfk
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000 WT
PHD2+/-
° °
°°
°
°
**
***
**
*
#
#
#
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
C
B A
32
Figuur 9. Genormaliseerde RNA expressie van LPC merkers. A: Krt7 en B: Krt19. Significanties: *: p < 0,05,
**: p < 0,01, °: p < 0,05 ten opzichte van de overeenkomstige controlegroep en #: p < 0,05 en ##: p < 0,01 ten
opzichte van de overeenkomstige WT groep. Foutbalken: +/- SEM.
Met uitzondering van de WT groep na 5 weken DEN inductie is de expressie van Epcam
significant hoger na DEN behandeling vergeleken met de controlegroepen. Er is echter op
geen enkel tijdspunt een significant verschil in Epcam expressie tussen de PHD2+/- en WT
groepen.
De expressie van Prom1 is in de PHD2+/- groep na 5 weken DEN inductie significant lager
vergeleken met alle andere DEN behandelde PHD2+/- groepen. Vanaf 10 weken DEN
inductie in de WT groepen en vanaf 15 weken inductie in de PHD2+/- groepen is de expressie
significant hoger vergeleken met de respectievelijke controlegroepen. In overeenstemming
met de expressie van hypoxie merkers en Krt19 vertoont de Prom1 expressie een significante
stijging na 17,5 weken. De expressie van deze LPC merker is op geen enkel tijdspunt
significant verschillend tussen de PHD2+/- en WT groepen.
Figuur 10. Genormaliseerde RNA expressie van LPC merkers. A: Epcam en B: Prom1. Significanties: *: p <
0,05, **: p < 0,01 en °: p < 0,05 ten opzichte van de overeenkomstige controlegroep. Foutbalken: +/- SEM.
De expressie van Afp is, in overeenstemming met de Epcam expressie, significant hoger in de
DEN geïnduceerde groepen vergeleken met de controlegroepen. Tussen DEN behandelde
Krt7
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
50
100
150
200
250WT
PHD2+/-
°
°°*
#
##
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
nKrt19
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500 WT
PHD2+/-
°
**
****
*
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
Epcam
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
1000
2000WT
PHD2+/-
°°
°°
°
°
°
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
Prom1
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000 WT
PHD2+/-
°
°
°
°°
*
***
***
*
*
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
A B
A B
33
groepen zien we, in analogie met de Krt7 expressie, een significante verhoging in PHD2+/-
muizen na 5 en 15 weken DEN inductie vergeleken met 10 en 17,5 weken inductie, terwijl de
expressie in WT muizen geen significante verschillen vertoont tijdens de DEN behandeling.
Cd44 expressie toont een stijgende trend naarmate muizen zieker worden, waarbij de
verhoging significant is ten opzichte van de controlegroep vanaf 15 weken bij WT muizen en
vanaf 17,5 weken in de PHD2+/- groep.
Zoals bij Epcam en Afp is de expressie van Ncam1 significant verhoogd in de meerderheid
van de groepen die DEN kregen vergeleken met de controlegroepen. Op de verschillende
tijdspunten in de DEN behandeling blijft de expressie in de PHD2+/- groep nagenoeg gelijk,
terwijl in de WT groep een significante stijging wordt gezien na 17,5 weken ten opzichte van
de WT groep na 5 weken. Analoog met Krt7 is de expressie significant hoger in WT muizen
ten opzichte van PHD2+/- muizen in controlegroepen en na 17,5 weken DEN inductie.
Figuur 11. Genormaliseerde RNA expressie van LPC merkers. A: Cd44, B: Afp en C: Ncam1. Significanties: *: p < 0,05, **: p < 0,01, °: p < 0,05 ten opzichte van de overeenkomstige controlegroep en #: p < 0,05 ten opzichte
van de overeenkomstige WT groep. Foutbalken: +/- SEM.
3.4.3. Fibrose
De RNA expressie van Acta2 wordt nagegaan om een beeld te krijgen van de aanwezigheid
van geactiveerde HSCs, daar deze activatie gelinkt is aan leverschade en fibrose (71). De
Afp
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
100
200
300
400
500
600
700WT
PHD2+/-
°°
°
°
°
°
°°
**
****
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
Cd44
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000WT
PHD2+/-
°
°
°
*
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
Ncam1
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
100
200
300
400
500
600 WT
PHD2+/-
° ° °°
°
°
*
#
#
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
C
B A
34
expressie is, zoals verwacht, zeer laag in beide controlegroepen. Terwijl Acta2 expressie in
bijna alle DEN geïnduceerde groepen significant verhoogd is ten opzichte van de
respectievelijke controle, stijgt de expressie niet in de progressie van hepatocellulair
carcinoom, en waar het niveau nagenoeg constant blijft in de WT groep, is de expressie zelfs
significant lager na 15 en 17,5 weken DEN inductie ten opzichte van de 5 weken bij de
PHD2+/- muizen. Er wordt opnieuw geen significant verschil waargenomen tussen beide
genotypes.
Figuur 12. Genormaliseerde RNA expressie van fibrose merker Acta2. Significanties: *: p < 0,05, **: p < 0,01
en °: p < 0,05 ten opzichte van de overeenkomstige controlegroep. Foutbalken: +/- SEM.
3.4.4. Metastase en resistentiemerkers
Om de invloed van PHD2 haplodeficiëntie op het karakter van de ontwikkelende tumoren na
te gaan, werd de RNA expressie van de prometastatische merkers integrine alfa 5 (Itga5),
matrix metallopeptidase 9 (Mmp9) en intercellulair adhesie molecule 1 (Icam1) (36) en
therapie resistentie gerelateerde eiwitten ATP-bindend cassette, subfamilie B, lid 1B
(Abcb1b) en ATP-bindend cassette, subfamilie G, lid 2C (Abcg2) (72) nagegaan.
Gedurende de behandelingsperiode met DEN blijft de expressie van Itga5 voor beide
genotypes min of meer constant en lager dan bij de controlegroepen (significant na 10 en 15
weken DEN inductie). Na 17,5 weken wordt een significante stijging in Itga5 expressie in de
PHD2+/- groep opgemerkt. Bovendien is de RNA expressie van Itga5 in de controlegroepen
en gedurende de eerste 15 weken DEN inductie hoger in de WT groep ten opzichte van de
PHD2+/- groep.
De expressie van Mmp9 is na 5 weken DEN inductie lager dan op de andere tijdspunten voor
PHD2+/- en na 15 en 17,5 weken DEN voor de WT groep. Verder is er naar analogie met
LPC merkers Krt19 en Prom1 een vrij constante expressie, tot na 17,5 weken waar een
duidelijke stijging in expressie is op te merken. Deze toename is significant voor de PHD2+/-
Acta2
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500WT
PHD2+/-
°
°°
°
°°
**
*
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
35
Mmp9
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
500
1000
1500
2000
2500WT
PHD2+/-
°°
°
°
****
***
***
*
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
groep ten opzichte van alle andere PHD2+/- groepen en voor de WT groep ten opzichte van
de controlegroep en de eerste 5 weken DEN inductie. De Mmp9 expressie vertoont zoals bij
Krt19 en Prom1 op geen enkel tijdspunt een significant verschil tussen de PHD2+/- en WT
groepen.
De expressie van Icam1 daarentegen blijft gedurende de DEN behandeling nagenoeg
constant, na 10 en 15 weken zien we echter wel een stijgende trend in WT groepen,
significant ten opzichte van de controle en de overeenkomstige PHD2+/- groep na 15 weken.
Figuur 13. Genormaliseerde RNA expressie van metastase merkers. A: Itga5, B: Mmp9 en C: Icam1.
Significanties: *: p < 0,05, **: p < 0,01, °: p < 0,05 ten opzichte van de overeenkomstige controlegroep en #: p <
0,05 en ##: p < 0,01 ten opzichte van de overeenkomstige WT groep. Foutbalken: +/- SEM.
De multidrug resistentie genen Abcb1b en Abcg2 coderen voor membraan transporters die
behoren tot de ATP-binding cassette superfamilie en sterk geëxpresseerd worden door LPCs.
Deze genen zijn bovendien opgereguleerd in HCC waar ze geassocieerd zijn met resistentie
tegen meerdere chemotherapeutische middelen door het mediëren van de efflux van deze
drugs (72).
Vanaf 10 weken DEN inductie is de expressie van Abcb1b significant hoger in de behandelde
groepen ten opzichte van de respectievelijke controlegroepen. Na 17,5 weken wordt tevens
een significante stijging opgemerkt in de PHD2+/- muizen ten opzichte van alle andere
Itga5
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
2500
5000
7500
10000
12500WT
PHD2+/-
°
°
°
°
**
##
##
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
Icam1
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
500
1000
1500
2000
2500WT
PHD2+/-°
°#
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
C
B A
36
PHD2+/- groepen. De RNA expressie is op geen enkel moment significant verschillend tussen
de PHD2+/- en WT groepen.
Voor de expressie van Abcg2 wordt een gelijkaardig beeld gezien als bij Icam1, waarbij de
expressie in PHD2+/- groepen min of meer constant blijft, terwijl er voor de WT groepen een
trend tot gestegen waarden is na 10 en 15 weken DEN inductie, significant na 15 weken ten
opzichte van de controlegroep en de overeenkomstige PHD2+/- groep.
Figuur 14. Genormaliseerde RNA expressie van resistentie merkers. A: Abcb1b en B: Abcg2. Significanties: *: p
< 0,05, **: p < 0,01, °: p < 0,05 ten opzichte van de overeenkomstige controlegroep en #: p < 0,05 en ##: p <
0,01 ten opzichte van de overeenkomstige WT groep. Foutbalken: +/- SEM.
3.4.5. Correlaties
Correlaties met betrekking tot de LPC merkers worden in Tabel 4 weergegeven. Terwijl de
meeste LPC merkers positief gecorreleerd zijn met Epcam en Ncam1, wordt een sterke
correlatie gezien enerzijds tussen Krt19, Prom1 en Cd44 en anderzijds tussen Krt7 en Afp. In
tegenstelling tot Glut1 en Vegfα vertoont het meer stroomneerwaarts gereguleerde Pfk geen
enkele correlatie met de LPC merkers. Ten slotte kan een positieve correlatie van de
metastasemerkers Itga5 en Mmp9 en de resistentiemerker Abcb1b met de LPC merkers
Krt19, Prom1 en Cd44, die een piek in RNA expressie tonen na 17,5 weken DEN inductie,
worden bemerkt.
Abcb1b
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000 WT
PHD2+/-
°
°°°°
°
****
***
**
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
Abcg2
Ctrl
5w DEN
10w DEN
15w DEN
17,5w D
EN
0
10000
20000 WT
PHD2+/-°
#
Gem
. g
en
orm
ali
seerd
aan
tal
tran
scri
pte
n
A B
37
Tabel 4. Correlaties met LPC merkers uitgedrukt als Pearson correlatiefactoren met daaronder de bijhorende p-
waarden. Ns: niet-significant.
Krt7 Krt19 Afp Epcam Prom1 Cd44 Ncam1
Krt7 ns 0,528
(0,000)
0,359
(0,003) ns
0,337
(0,005)
0,539
(0,000)
Krt19 ns ns 0,290
(0,018)
0,941
(0,000)
0,783
(0,000)
0,387
(0,001)
Afp 0,528
(0,000) ns
0,334
(0,005) ns ns
0,350
(0,003)
Epcam 0,359
(0,003)
0,290
(0,018)
0,334
(0,005) ns
0,317
(0,010)
0,580
(0,000)
Prom1 ns 0,941
(0,000) ns ns
0,825
(0,000)
0,395
(0,001)
Cd44 0,337
(0,005)
0,783
(0,000) ns
0,317
(0,010)
0,825
(0,000)
0,374
(0,002)
Ncam1 0,539
(0,000)
0,387
(0,001)
0,350
(0,003)
0,580
(0,000)
0,395
(0,001)
0,374
(0,002)
Glut1 ns 0,525
(0,000) ns ns
0,838
(0,000)
0,324
(0,007)
0,432
(0,000)
Vegfa ns 0,438
(0,000)
-0,238
(0,046) ns
0,679
(0,000) ns
0,279
(0,020)
Pfk ns ns ns ns ns ns ns
Acta2 0,355
(0,003)
0,352
(0,004) ns
0,279
(0,025) ns
0,257
(0,038)
0,581
(0,000)
Itga5 ns 0,485
(0,000)
-0,299
(0,012) ns
0,729
(0,000)
0,376
(0,002) ns
Mmp9 ns 0,580
(0,000) ns ns
0,809
(0,000)
0,275
(0,034) ns
Icam1 ns ns ns 0,348
(0,004) ns ns ns
Abcb1b ns 0,593
(0,000) ns ns
0,763
(0,000)
0,537
(0,000)
0,360
(0,003)
Abcg2 ns ns ns 0,350
(0,004)
0,310
(0,013) ns ns
38
4. Bespreking
In deze studie werden temporele veranderingen in LPC activatie en differentiatie tijdens de
vroege ontwikkeling van HCC in kaart gebracht en werd het effect van een verhoogde
stabilisatie van HIF1α op deze evolutie nagegaan. Uit vorig onderzoek blijkt immers dat een
verhoogde activatie van de hypoxische signaaltransductieweg via PHD2 inhibitie het gedrag
en de expressie van de bipotentiële LPCs in de omgeving van de tumor beïnvloedt en de
differentiatie richting cholangiocyten stimuleert (36). Het resulterende HCC-CC fenotype
concordeert met een slechtere prognose (32, 37). Dit werd vervolgens verder onderzocht in de
masterproef van Aurélie Comhaire in 2013, waarbij progenitorcel kenmerken in WT en PHD2
haplodeficiënte muizen werden onderzocht na 20, 25 en 30 weken DEN gemedieerde HCC
inductie (67). Het PHD2+/- muismodel biedt hierbij een waarachtige weergave van tumoren
die zich vormen in een omgeving met een verhoogde HIF1 stabilisatie ten gevolge van
hypoxie, zoals gezien bij patiënten met HCC dat zich ontwikkelt in een achtergrond van
fibrose. Onder deze studie werd het effect van een PHD2 inhibitie op de LPC niche tijdens de
vroege hepatocarcinogenese nagegaan. De WT en PHD2+/- muizen werden derhalve
geëuthanaseerd na 5, 10, 15, 17,5 en 20 weken HCC inductie, waarna verschillende LPC en
hypoxie merkers werden geanalyseerd op RNA en eiwitniveau teneinde een beter inzicht te
krijgen in de rol van hypoxie tijdens de pathogenese van HCC.
In overeenstemming met eerdere studies werden na 17,5 weken DEN inductie nog geen HCC
nodules opgemerkt (36, 68-70). Er werden echter wel al vanaf 15 weken in de
hepatocarcinogenese histologische afwijkingen gezien, zoals een verstoorde leverarchitectuur,
afwijkende ductulaire structuren en preneoplastische letsels gekenmerkt door kleine
tumorcellen met overvloedig cytoplasma en minimale nucleaire onregelmatigheden enerzijds
en cellen waarbij de kernen zeer groot of multipel zijn anderzijds; dit ondersteunt dat er
mogelijks reeds vóór het ontstaan van nodules belangrijke moleculaire veranderingen
plaatsvinden. Er werden op basis van de routinekleuringen echter geen verschillen opgemerkt
wat betreft de levermorfologie of de aanwezigheid van preneoplastische letsels tussen de
PHD2+/- en WT groepen.
Om de activatie van de HIF1 signaaltransductieweg na te gaan, werden de expressies van
enkele welomschreven stroomafwaartse factoren, namelijk Glut1, Vegfα en Pfk, onderzocht
(59, 63). De RNA expressies van deze hypoxie merkers waren laag tot 15 weken DEN
inductie en vertoonden dan geen significante verschillen tussen de PHD2+/- en WT groepen.
39
In de studie van Heindryckx et al. werd overigens vastgesteld dat PHD2 inactivatie het
expressieniveau van VEGFα ook later in de hepatocarcinogenese niet wijzigt ten opzichte van
de WT groep (36). Na 17,5 weken DEN inductie vertoonden de expressies van de drie door
ons bepaalde hypoxie merkers een piek. Vanaf dan werden wel duidelijk hogere expressies
van Glut1 en Pfk in de PHD2+/- groep gezien vergeleken met de WT groep; dit suggereert dat
PHD2 haplodeficiëntie de neoplasie geïnduceerde hypoxische reactie versterkt, maar dit onder
normoxische omstandigheden in de gezonde lever weinig effect heeft.
Aangezien het doel van de studie erin bestaat om na te gaan of de verhoging in LPC
kenmerken en de fenotypische shift naar het gemengde HCC-CC fenotype na DEN
gemedieerde HCC inductie in PHD2+/- muizen reeds vroeg tijdens de hepatocarcinogenese
plaatsvindt dan wel het om een late gebeurtenis gaat, werden vervolgens de genexpressies van
bepaalde LPC merkers bestudeerd. Het optreden van veranderingen in de expressies van LPC
merkers kan helpen bij de diagnose en prognose van HCC; indien er een vroege LPC
signatuur is ten gevolge van hypoxie, zou hierop kunnen worden gesteund om patiënten at
risk te identificeren voor negatieve uitkomsten met betrekking tot de overleving, daar LPC
merker expressie de maligne aard van een tumor weerspiegelt. LPCs in HCC worden immers
gekenmerkt door metastatische en invasieve eigenschappen en zijn tevens betrokken bij
therapieresistentie en terugval (73).
De expressies van de LPC merkers Krt19, Prom1 en Cd44 tijdens de vroege
hepatocarcinogenese vallen duidelijk samen met de verhoogde expressies van de hypoxie
gevoelige genen in zowel de PHD2+/- als de WT muizen. De RNA expressies van Krt19 en
Prom1 vertonen eveneens een hoogtepunt na 17,5 weken DEN inductie, zonder significant
verschil tussen de PHD2+/- en WT groep. Voorgaand onderzoek toonde aan dat er na 20
weken DEN inductie wel significant hogere expressies van Krt19 en Prom1 in de PHD2+/-
groep vergeleken met de WT groep konden worden onderscheiden (67). Niettemin zou de
expressie van Prom1 in de wild types na 25 weken significant toenemen ten opzichte van 20
weken DEN inductie, met een significant hogere expressie dan de overeenkomstige PHD2+/-
groep tot gevolg (67). De opregulatie van Prom1 wijst op de aanwezigheid van
ongedifferentieerde LPCs (20). Daarnaast geldt Prom1 als merker van tumor-initiërende
cellen en is het verantwoordelijk voor tumorgroei (74). Krt19 daarentegen is een merker voor
biliaire weefseldifferentiatie en wordt geëxpresseerd door zowel LPCs als cholangiocyten
(11). De expressie van Krt19 in HCC is geassocieerd met een slechtere prognose en een hoger
40
recidiefpercentage na chirurgische behandeling (75). Cd44 is een adhesiemolecule dat
betrokken is bij celproliferatie, migratie en invasie, en dus een belangrijke rol speelt bij
tumorprogressie en metastasering. Overexpressie bevordert tevens tumor invasiviteit (74).
Samenvattend worden na 17,5 weken DEN inductie, congruent met de opregulatie van
hypoxie merkers, verhoogde expressies van de LPC kenmerken Krt19, Prom1 en Cd44
gezien. Daarbij wordt echter geen effect van PHD2 haplodeficiëntie waargenomen. In de
humane setting werd reeds aangetoond dat deze merkers verband houden met een slechte
prognose (74, 75), wat de beschreven effecten van hypoxische omstandigheden met
betrekking tot het ontwikkelen van een meer agressief fenotype ook in experimentele context
zou ondersteunen (36, 76). Het effect van een verhoogde stabilisatie van HIF1α blijkt echter
volgens onze data geen effect te hebben op prognostische merkers en tumor fenotype tijdens
de vroege hepatocarcinogenese.
In tegenstelling tot de RNA expressie rapporteert kwantificatie van de immunohistochemische
kleuring van CK19 na reeds 15 weken inductie in de PHD2+/- groep een significante stijging
in immuunpositiviteit ten opzichte van eerdere tijdspunten tijdens de DEN behandeling. Op
basis van de morfologie van de aangekleurde cellen wordt vermoed dat de verhoogde
eiwitexpressie hier mogelijks een gevolg zou kunnen zijn van een hoger aantal CK19-
positieve hepatocyten in plaats van een verhoogde ductulaire proliferatie. De expressie van
CK19 door hepatocyten kan gelden als merker voor een zeer vroege hepatocyt
gedifferentieerd uit een LPC teneinde het beschadigde parenchym te herstellen. Anderzijds is
het gekend dat het expressieprofiel van cytokeratines niet geconserveerd blijft tijdens
neoplastische transformatie; CK19 expressie werd reeds beschreven in HCC laesies en zou
gecorreleerd zijn met een meer agressief fenotype, metastase, vroeger herval, en dus een
slechtere prognose (75). Daarbij zouden kleinere HCC laesies of weinig gedifferentieerd HCC
een hogere CK19 expressie hebben in vergelijking met grotere HCC laesies of goed
gedifferentieerd HCC (77).
Vanwege hun rol in de ontwikkeling van kanker, is het niet verwonderlijk dat de expressies
van Krt19, Prom1 en Cd44 op RNA niveau een positieve correlatie vertonen met de RNA
expressies van de metastasemerkers Itga5 en Mmp9. Het integrine Itga5 interageert met
extracellulaire matrixeiwitten om celadhesie te mediëren en speelt op die manier een rol bij
celmigratie (78), terwijl matrix metalloproteïnasen bij celmigratie betrokken zijn door het
afbreken van componenten van de extracellulaire matrix (79, 80). Itga5 en Mmp9 bevorderen
41
aldus de invasie en metastase capaciteit van HCC, en dienen daarbij als voorspellende
merkers voor overleving (78, 79). Tevens is een verband tussen de expressies van
voorgenoemde LPC merkers en de expressie van de resistentiemerker Abcb1b aangetoond.
Het multidrug resistentie gen Abcb1b codeert voor membraan transporters die behoren tot de
ATP-binding cassette superfamilie en sterk geëxpresseerd worden door LPCs. Dit gen is
bovendien opgereguleerd in HCC waar het geassocieerd is met resistentie tegen meerdere
chemotherapeutische middelen door het mediëren van de efflux van deze drugs (72).
Inderdaad, in verschillende studies werd aangetoond dat Prom1 positieve cellen meer
therapieresistentie vertonen dan Prom1 negatieve cellen (81). De opregulatie van deze LPC
merkers na 17,5 weken DEN inductie gaat dus gepaard met een belangrijke progressie in
tumoractiviteit. Kortom, de positieve correlatie met metastase en resistentiemerkers betoont
de betrokkenheid van LPCs in het proces van hepatocarcinogenese.
De expressies van de andere LPC merkers, Krt7, Afp, Ncam1 en Epcam lijken tijdens de
vroege hepatocarcinogenese weinig te veranderen in de PHD2+/- muizen noch in de WT
groepen, maar zijn vaak hoger dan in de controlegroepen. Deze merkers vertonen onderling
bovendien een sterke correlatie. Aangezien Krt7 een merker is voor LPCs, cholangiocyten
alsook intermediaire hepatocyten, en Prom1 en Krt19 uitgerekend dan een verhoogde
expressie hadden, wijst de lagere Krt7 expressie in de PHD2+/- groep mogelijks op een
verlaagde populatie intermediaire hepatocyten. Dit is echter in strijd met wat werd
aangenomen op basis van de CK19 immunohistochemische kleuring; de verhoogde
eiwitexpressie werd daar toegekend aan een hoger aantal CK19-positieve hepatocyten.
Noemenswaardig is ook het gelijkaardig expressiepatroon van Krt7 en Afp daar beide
merkers zijn voor vroege hepatocyten. Krt7 en Afp zijn tevens gerapporteerd betrokken te zijn
bij het proces van dedifferentiatie tijdens de ontwikkeling van HCC (75, 82, 83). Daarnaast
zou Afp gerelateerd zijn aan de progressie en het metastatisch vermogen van tumoren, wat het
een belangrijke prognostische factor voor HCC na tumorresectie maakt (79). Het eiwit
gecodeerd door Ncam1 is vervolgens betrokken bij cel-cel interacties alsook cel-matrix
interacties, die belangrijk zijn bij het reguleren van LPC gedrag binnen de niche. Het speelt
een centrale rol in de overspraak tussen E-cadherine verlies en reciproque vorming van focale
adhesie complexen tijdens de epitheliale-mesenchymale transitie, een proces waarbij
epitheliale cellen hun celpolariteit en cel-cel adhesie verliezen, en de migrerende en invasieve
eigenschappen van mesenchymale cellen verwerven (84-87). Aldus is Ncam1 opregulatie
gecorreleerd met celmigratie en invasie. Daar epitheliale-mesenchymale transitie wordt
42
verondersteld een belangrijke functie te hebben bij de progressie van kanker, wordt Ncam1
tevens gelinkt aan tumoren en metastasering. Zo dient Ncam1 als een onafhankelijke
voorspellende factor voor lange termijn overleving bij patiënten met HCC (84-87). Kortom,
de expressies van LPC merkers die ook door intermediaire hepatocyten of in de context van
epitheliale-mesenchymale transitie worden geëxpresseerd veranderen weinig gedurende de
vroege hepatocarcinogenese in PHD2+/- en WT muizen.
Een verhoogde Epcam expressie in DEN geïnduceerde tumoren is onderhand al langer erkend
(69, 88) maar in tegenstelling tot de Epcam RNA expressie toont immunohistochemie vanaf
15 weken DEN inductie meer cytoplasmatische aankleuring van het intracellulaire domein
van EPCAM in de hepatocyten, wat overeenkomt met meer EPCAM activiteit. Deze functie
heeft voornamelijk betrekking tot de proliferatie en de instandhouding van de
ongedifferentieerde staat in stam/progenitorcellen en tumorcellen (80). EPCAM positiviteit is
dan ook geassocieerd met een slechte prognose (81). Na 17,5 weken DEN inductie is er een
significant hogere eiwit expressie in de PHD2+/- groep vergeleken met de WT tegenhangers.
In het onderzoek van Aurélie Comhaire werd echter een verminderde aankleuring van het
intracellulaire domein van EPCAM gezien na 25 weken DEN inductie, helaas missen we hier
de data na 20 weken inductie. Bovendien werd dan ook op RNA niveau een dalende trend in
Epcam expressie waargenomen vanaf 20 weken DEN inductie. Aangezien expressie van
EPCAM vooral voorkomt in ongedifferentieerde LPCs, werd toen gepostuleerd dat
ongedifferentieerde LPCs voornamelijk in premaligne weefsels tot expressie komen (67).
In de masterproef van Aurélie Comhaire tonen de RNA expressies van Epcam, Krt7 en
Ncam1 een piek na 20 weken DEN inductie in de PHD2+/- groepen. Bovendien werd op dat
moment in de hepatocarcinogenese een significant hogere expressie aangetoond ten opzichte
van WT groepen. Terwijl de expressies van Krt7 en Ncam1 in de PHD2+/- muizen een licht
dalende trend vertonen na 25 weken DEN inductie, lijken de expressies van deze merkers in
de WT groepen net toe te nemen. De RNA expressie van Epcam daarentegen schijnt bij zowel
de PHD2+/- groepen als de wild types te dalen na 25 weken (67). Het effect van een
verhoogde HIFα stabilisatie lijkt dus pas in latere stadia effect te hebben op deze LPC
merkers.
Ten slotte werd op RNA niveau de expressie van Acta2 nagegaan om een beeld te krijgen van
de aanwezigheid van geactiveerde HSCs daar hun activatie gelinkt is aan leverschade en
fibrose (71). Terwijl de expressie van Acta2, in analogie met het onderzoek van Aurélie
43
Comhaire (67), in bijna alle DEN geïnduceerde groepen significant verhoogd was ten
opzichte van de controle, toonde de expressie geen stijgende trend gedurende de progressie
van hepatocellulair carcinoom, noch werd een verschil waargenomen tussen de verschillende
genotypes, een patroon dat eerder aansluit bij dat van Epcam, Krt7, Ncam1 en Afp. In de
studie van Comhaire werd een weliswaar niet-significant hogere expressie in de PHD2
heterozygote groepen opgetekend ten opzichte van de wild types na 20 en 25 weken DEN
inductie (67).
In deze studie wordt aangetoond dat een verhoogde HIF1α stabilisatie in PHD2+/- muizen
geen effect lijkt te hebben op de expressies van de onderzochte LPC merkers tijdens de
vroege hepatocarcinogenese. Eerder onderzoek toonde echter wel een duidelijk effect vanaf
20 weken DEN inductie, waarbij er een duidelijk verhoogde expressie van verscheidene LPC
merkers ten opzichte van de wild types kon worden uitgemaakt. Een voorgaande studie
toonde bovendien aan dat er een tijdsafhankelijk effect van hypoxische stimuli in
hepatocarcinogenese bestaat, met een nadelig vertraagd effect van een vroege hypoxische
gebeurtenis op de ontwikkeling van tumoren (69).
Tevens blijkt er een verschil te bestaan tussen het moment waarop de verschillende LPC
merkers reageren op de ontwikkeling van HCC; zo vertonen de expressies van Krt19 en
Prom1 een hoogtepunt na 17,5 weken DEN inductie, gelijktijdig met een piek in de expressies
van hypoxie gevoelige genen, terwijl Krt7, Epcam, Afp en Ncam1 expressies gedurende de
vroege hepatocarcinogenese eerder gelijk blijven. LPC merkers die specifiek tot expressie
komen in de biliaire cellijn (Prom1 en Krt19) onderscheiden zich duidelijk van de merkers die
ook kenmerkend zijn voor intermediaire hepatocyten (Krt7 en Afp) en kankercellen (Epcam
en Ncam1). Dit komt overeen met het gegeven dat LPCs worden geactiveerd als antwoord op
de HCC inductie en daarna differentiëren tot hepatocyten om het leverparenchym te
herstellen. In voorgaand onderzoek werd mogelijk geacht dat de lotsbepaling van de LPCs in
primaire levertumoren reeds in vroege of zelfs premaligne stadia zou plaatsvinden (67), onze
resultaten tonen echter dat de verhoogde expressie van LPC kenmerken in de
hepatocarcinogenese gepaard gaat met neoplasticiteit en tumor geïnduceerde HIF1
stabilisatie. Verder onderzoek is nodig om te achterhalen hoe neoplasie, hypoxie en LPC
activatie elkaar in de tijd beïnvloeden.
Het voorkomen van biliaire merkers in HCC kan enerzijds worden toegekend aan de
hypothese dat LPCs een maligne transformatie kunnen ondergaan en zodoende zouden
bijdragen aan de ontwikkeling van HCC. Anderzijds is aan de hand van in vitro experimenten
44
gepostuleerd dat hepatocyten in staat zijn te dedifferentiëren tot cellen met een LPC fenotype,
of zelfs te transdifferentiëren in cholangiocyten, wat eveneens een verklaring zou kunnen zijn
voor de expressie van biliaire merkers in HCC (69, 75, 82, 89-91). De immunohistochemische
kleuring van CK19 ondersteunt overigens deze laatste veronderstelling; de verhoogde
eiwitexpressie na 15 weken DEN inductie is het gevolg van een verhoogd aantal CK19-
positieve cellen die een morfologie vertonen corresponderend met hepatocyten in plaats van
LPCs. De verhoogde expressies van merkers voor intermediaire hepatocyten zou het proces
van dedifferentiatie tijdens de ontwikkeling van HCC kunnen bijtreden. Ten slotte zou ook de
epitheliale-mesenchymale transitie, die gekenmerkt wordt door Ncam1 en Epcam expressie
kunnen bijdragen tot dedifferentiatie van hepatocyten tot een progenitorcel fenotype, zoals
blijkt uit in vitro experimenten (32, 89). Of het voorkomen van het gemengde HCC-CC
fenotype te wijten is aan een kwaadaardige transformatie van progenitorcellen dan wel aan
een dedifferentiatie/transdifferentiatie van HCC cellen vormt een belangrijk vraagstuk (91)
dat in deze studie niet kan worden beantwoord.
Er dient te worden opgemerkt dat verscheidene WT groepen in deze studie slechts een beperkt
aantal stalen omvatten. Dit is vooreerst te wijten aan het feit dat de eigen kweek minder WT
muizen opleverde binnen de vooropgestelde tijdspanne dan voorzien. Daarnaast vertoonden
de stalen die werden gebruikt om bepaalde WT groepen te vervolledigen discrepanties met de
eigen stalen. Vermits de volledige WT groep die 20 weken met DEN werd behandeld
daardoor uitviel, werd ook de overeenkomstige PHD2+/- groep niet verder geanalyseerd. Dit
heeft tot gevolg dat de overlap met het onderzoek van Aurélie Comhaire, waarin progenitorcel
kenmerken in WT en PHD2+/- muizen vanaf 20 weken DEN gemedieerde HCC inductie
werden onderzocht, enigszins wordt gemist. Daarnaast dient er door het beperkt aantal stalen
rekening gehouden te worden met de grote variatie die er heerst binnen bepaalde data; dit
betreft voornamelijk de resultaten verkregen via immunohistochemie, wat het gebrek aan
correlatie tussen gegevens op RNA niveau en gegevens op eiwit niveau ten dele zou
verklaren. Verder onderzoek met een groter aantal proefdieren is dus aangewezen.
Om de LPC niche op te volgen werd een zo representatief mogelijke set van merkers
uitgekozen. Er werd eerder vermeld dat er echter nog geen gestandaardiseerde selectie van
merkers die LPCs karakteriseert bestaat, bijgevolg kan er feitelijk geen causaal verband
worden gelegd tussen bijvoorbeeld de geziene opregulatie van bepaalde LPC merkers na 17,5
45
weken en de proliferatie van LPCs an sich, de differenties die in deze studie tussen
verscheidene merkers werden opgemerkt tonen dit nogmaals aan.
Om het gedrag van LPCs te bestuderen worden bijkomende experimenten aanbevolen. Zo zou
aan de hand van lineage tracing informatie kunnen worden verzameld over de locatie en
differentiatie van LPCs in vivo op elk tijdstip in de hepatocarcinogenese (92). Lineage tracing
heeft zijn waarde reeds bewezen in stamcelonderzoek betreffende de testis, huid en darmen en
wordt in toenemende mate toegepast in het modelleren van cellulaire heterogeniteit bij kanker
(92, 93). Er werden reeds verschillende modellen, gebaseerd op het Cre-lox systeem gebruikt
in onderzoek naar het bestaan en de rol van LPCs in leverziekten (94-96). Het struikelblok bij
gebruik van deze techniek is het vinden van een geschikte celspecifieke promoter om Cre te
controleren, aangezien er geen merkers gekend zijn die enkel door LPCs worden
geëxpresseerd. Voornamelijk de transcriptiefactor SRY (sex determining region Y) box 9
(SOX9) (94, 95, 97), forkhead box L1 (FOXL1) (96) en osteopontine (OPN) (95) werden in
experimenten als promoter aangewend. Naast het merken en volgen van LPCs tijdens de
pathogenese van HCC, zouden we aan de hand van deze techniek ook specifiek in deze cellijn
kunnen tussenkomen. Het effect van PHD2 gemedieerde HIF1 stabilisatie, of zelfs verlaagde
HIF1 expressie door ectopische PHD2 expressie, specifiek in LPCs zou hier verder de rol van
hypoxie op LPC differentiatie tijdens de pathogenese van HCC kunnen ophelderen.
46
5. Besluit
In deze studie werden temporele veranderingen in LPC activatie en differentiatie tijdens de
vroege ontwikkeling van HCC in kaart gebracht en werd het effect van een continue
overexpressie van HIF1α op deze evolutie nagegaan. Intratumorale hypoxie zou immers
gecorreleerd zijn met de progressie naar een meer invasief fenotype, een verhoogd metastase
potentiaal en zelfs het ontwikkelen van het meer agressieve gemengde HCC-CC fenotype. De
verhoogde HIF1α stabilisatie in PHD2+/- muizen heeft echter geen effect op de expressies
van de onderzochte LPC merkers tijdens de vroege hepatocarcinogenese. Pas in latere stadia,
met name na 20 weken DEN inductie, is er een duidelijk verhoogde opregulatie van
verscheidene LPC merkers ten opzichte van de wild types. Een tijdsafhankelijk effect van
hypoxische stimuli tijdens de hepatocarcinogenese met een nadelig vertraagd effect van een
vroege hypoxische gebeurtenis op de ontwikkeling van tumoren zou een verklaring kunnen
zijn. Daarnaast bestaat er een verschil tussen het moment waarop verschillende LPC merkers
tot expressie komen tijdens de ontwikkeling van HCC. De RNA expressies van de LPC
merkers Krt19, Prom1 en Cd44 vertonen een hoogtepunt na 17,5 weken DEN inductie in
zowel WT als PHD2+/- muizen. Deze sterke opregulatie van LPC merkers valt samen met de
verhoogde expressie van hypoxie gevoelige genen, en toont een positieve correlatie met de
RNA expressies van bepaalde metastase- en resistentie merkers. De expressies van de andere
LPC merkers, Krt7, Epcam en Ncam1, veranderen weinig tijdens de vroege
hepatocarcinogenese in de PHD2+/- en WT groepen. Deze merkers zouden volgens eerder
onderzoek echter na 20 weken DEN inductie wel sterk worden opgereguleerd. In tegenstelling
tot RNA expressie profilering, toont immunohistochemie na 15 weken DEN inductie een
verhoogde cytoplasmatische expressie van CK19 en EPCAM in hepatocyten. Vanaf dan
wordt ook neoplastische transformatie onder de vorm van reticuline vrije cellen gedetecteerd.
Er kan dus worden geconcludeerd dat het effect van een verhoogde stabilisatie van HIF1α op
de expressie van LPC kenmerken en tumor fenotype in de hepatocarcinogenese geen vroege
gebeurtenis is. In een volgende studie dient de betrokkenheid van processen als
dedifferentiatie van hepatocyten en maligne transformatie van LPCs in de ontwikkeling van
HCC nauwer te worden onderzocht.
47
6. Referenties
1. Kuntz EK, H. D. Hepatology : principles and practice. 2 ed. New York, VSA: Springer; 2005.
2. Zakim DB, T. D. Hepatology : a textbook of liver disease. 2 ed. Philadelphia, VSA: Saunders; 1990.
3. Dooley JSS, S. Sherlock's diseases of the liver and biliary system. 12 ed. Chichester, West Sussex, VK:
Wiley-Blackwell; 2011.
4. Hill MA. Gastrointestinal Tract - Liver Histology: UNSW Embryology; 2005. Available from:
https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Gastrointestinal_Tract_-_Liver_Histology.
5. Boyer TDW, T.L.; Manns, M.P. Zakim and Boyer's hepatology : a textbook of liver disease. 5 ed.
Philadelphia: Saunders; 2006.
6. Nash KG, I.N. Hepatology : clinical cases uncovered. Chichester, West Sussex: John Wiley & Sons; 2011.
7. Michalopoulos GK. Liver regeneration. Journal of cellular physiology. 2007;213(2):286-300.
8. Michalopoulos GK, DeFrances M. Liver regeneration. Advances in biochemical
engineering/biotechnology. 2005;93:101-34.
9. Fouraschen SM, Pan Q, de Ruiter PE, Farid WR, Kazemier G, Kwekkeboom J, et al. Secreted factors of
human liver-derived mesenchymal stem cells promote liver regeneration early after partial hepatectomy. Stem
cells and development. 2012;21(13):2410-9.
10. LeSage G, Glaser S, Alpini G. Regulation of cholangiocyte proliferation. Liver. 2001;21(2):73-80.
11. Libbrecht L, Roskams T. Hepatic progenitor cells in human liver diseases. Semin Cell Dev Biol.
2002;13(6):389-96.
12. Roskams TA, Theise ND, Balabaud C, Bhagat G, Bhathal PS, Bioulac-Sage P, et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology
(Baltimore, Md). 2004;39(6):1739-45.
13. Alison M. Liver stem cells: a two compartment system. Curr Opin Cell Biol. 1998;10(6):710-5.
14. Best J, Dolle L, Manka P, Coombes J, van Grunsven LA, Syn WK. Role of liver progenitors in acute
liver injury. Front Physiol. 2013;4:258.
15. Gaudio E, Carpino G, Cardinale V, Franchitto A, Onori P, Alvaro D. New insights into liver stem cells.
Dig Liver Dis. 2009;41(7):455-62.
16. Santoni-Rugiu E, Jelnes P, Thorgeirsson SS, Bisgaard HC. Progenitor cells in liver regeneration:
molecular responses controlling their activation and expansion. Apmis. 2005;113(11-12):876-902.
17. Carpino G, Renzi A, Onori P, Gaudio E. Role of hepatic progenitor cells in nonalcoholic fatty liver
disease development: cellular cross-talks and molecular networks. International journal of molecular sciences.
2013;14(10):20112-30. 18. Roskams T. Liver stem cells and their implication in hepatocellular and cholangiocarcinoma. Oncogene.
2006;25(27):3818-22.
19. Roskams T. Progenitor cell involvement in cirrhotic human liver diseases: from controversy to
consensus. J Hepatol. 2003;39(3):431-4.
20. Spee B, Carpino G, Schotanus BA, Katoonizadeh A, Vander Borght S, Gaudio E, et al. Characterisation
of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut.
2010;59(2):247-57.
21. Roskams TA, Libbrecht L, Desmet VJ. Progenitor cells in diseased human liver. Semin Liver Dis.
2003;23(4):385-96.
22. Sackett SD, Li Z, Hurtt R, Gao Y, Wells RG, Brondell K, et al. Foxl1 is a marker of bipotential hepatic
progenitor cells in mice. Hepatology (Baltimore, Md). 2009;49(3):920-9. 23. Alison MR, Islam S, Lim S. Stem cells in liver regeneration, fibrosis and cancer: the good, the bad and
the ugly. J Pathol. 2009;217(2):282-98.
24. Itoh T, Miyajima A. Liver regeneration by stem/progenitor cells. Hepatology (Baltimore, Md).
2014;59(4):1617-26.
25. Tanaka M, Itoh T, Tanimizu N, Miyajima A. Liver stem/progenitor cells: their characteristics and
regulatory mechanisms. J Biochem. 2011;149(3):231-9.
26. Rehman K, Iqbal MJ, Zahra N, Akash MS. Liver stem cells: from preface to advancements. Curr Stem
Cell Res Ther. 2014;9(1):10-21.
27. Roskams T. Different types of liver progenitor cells and their niches. J Hepatol. 2006;45(1):1-4.
28. Liu WH, Ren LN, Chen T, Liu LY, Tang LJ. Stages based molecular mechanisms for generating
cholangiocytes from liver stem/progenitor cells. World journal of gastroenterology : WJG. 2013;19(41):7032-41.
29. Greenbaum LE, Wells RG. The role of stem cells in liver repair and fibrosis. Int J Biochem Cell Biol. 2011;43(2):222-9.
48
30. Boulter L, Lu WY, Forbes SJ. Differentiation of progenitors in the liver: a matter of local choice. The
Journal of clinical investigation. 2013;123(5):1867-73.
31. Boulter L, Govaere O, Bird TG, Radulescu S, Ramachandran P, Pellicoro A, et al. Macrophage-derived
Wnt opposes Notch signaling to specify hepatic progenitor cell fate in chronic liver disease. Nat Med.
2012;18(4):572-9.
32. Bogaerts E, Heindryckx F, Vandewynckel YP, Van Grunsven LA, Van Vlierberghe H. The roles of
transforming growth factor-beta, Wnt, Notch and hypoxia on liver progenitor cells in primary liver tumours
(Review). International journal of oncology. 2014;44(4):1015-22.
33. Xu LB, Liu C. Role of liver stem cells in hepatocarcinogenesis. World J Stem Cells. 2014;6(5):579-90.
34. Oishi N, Yamashita T, Kaneko S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer.
2014;3(2):71-84. 35. Mittal S, El-Serag HB. Epidemiology of hepatocellular carcinoma: consider the population. J Clin
Gastroenterol. 2013;47 Suppl:S2-6.
36. Heindryckx F, Kuchnio A, Casteleyn C, Coulon S, Olievier K, Colle I, et al. Effect of prolyl
hydroxylase domain-2 haplodeficiency on the hepatocarcinogenesis in mice. J Hepatol. 2012;57(1):61-8.
37. Mitchell KA. Hepatocellular carcinoma: histologic considerations: pure, mixed, and motley. J Clin
Gastroenterol. 2013;47 Suppl:S20-6.
38. Schlageter M, Terracciano LM, D'Angelo S, Sorrentino P. Histopathology of hepatocellular carcinoma.
World journal of gastroenterology : WJG. 2014;20(43):15955-64.
39. Aravalli RN, Cressman EN, Steer CJ. Cellular and molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma:
an update. Archives of toxicology. 2013;87(2):227-47.
40. Niu ZS, Niu XJ, Wang M. Management of hepatocellular carcinoma: Predictive value of immunohistochemical markers for postoperative survival. World journal of hepatology. 2015;7(1):7-27.
41. Gomaa AI, Waked I. Recent advances in multidisciplinary management of hepatocellular carcinoma.
World journal of hepatology. 2015;7(4):673-87.
42. Andersen JB. Molecular pathogenesis of intrahepatic cholangiocarcinoma. Journal of hepato-biliary-
pancreatic sciences. 2015;22(2):101-13.
43. Rizvi S, Gores GJ. Pathogenesis, diagnosis, and management of cholangiocarcinoma. Gastroenterology.
2013;145(6):1215-29.
44. De Minicis S, Kisseleva T, Francis H, Baroni GS, Benedetti A, Brenner D, et al. Liver carcinogenesis:
rodent models of hepatocarcinoma and cholangiocarcinoma. Dig Liver Dis. 2013;45(6):450-9.
45. Pollock RE. Advanced Therapy in Surgical Oncology: BC Decker Incorporated; 2008.
46. Xue TC, Zhang BH, Ye SL, Ren ZG. Differentially expressed gene profiles of intrahepatic
cholangiocarcinoma, hepatocellular carcinoma, and combined hepatocellular-cholangiocarcinoma by integrated microarray analysis. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology
and Medicine. 2015.
47. Singh S, Chakraborty S, Bonthu N, Radio S, Hussain SM, Sasson A. Combined hepatocellular
cholangiocarcinoma: a case report and review of literature. Dig Dis Sci. 2013;58(7):2114-23.
48. Pantomics I. Tissue Arrays. Available from: http://www.pantomics.com/tissue-
arrays.aspx?species=Human&organ=Liver&pathology=Hepatocellular%20carcinoma.
49. Sciences NIoEH. Hyperplastic and Neoplastic Lesions of the Liver North Carolina, USA [updated
2014]. Available from: http://www.niehs.nih.gov/research/resources/liverpath/hyperplast/index.cfm.
50. Cai X, Zhai J, Kaplan DE, Zhang Y, Zhou L, Chen X, et al. Background progenitor activation is
associated with recurrence after hepatectomy of combined hepatocellular-cholangiocarcinoma. Hepatology
(Baltimore, Md). 2012;56(5):1804-16. 51. Rosmorduc O, Housset C. Hypoxia: a link between fibrogenesis, angiogenesis, and carcinogenesis in
liver disease. Semin Liver Dis. 2010;30(3):258-70.
52. Nauta TD, van Hinsbergh VW, Koolwijk P. Hypoxic signaling during tissue repair and regenerative
medicine. International journal of molecular sciences. 2014;15(11):19791-815.
53. Ortmann B, Druker J, Rocha S. Cell cycle progression in response to oxygen levels. Cellular and
molecular life sciences : CMLS. 2014;71(18):3569-82.
54. Aragones J, Fraisl P, Baes M, Carmeliet P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab.
2009;9(1):11-22.
55. Suzuki T, Shinjo S, Arai T, Kanai M, Goda N. Hypoxia and fatty liver. World journal of
gastroenterology : WJG. 2014;20(41):15087-97.
56. Tang CM, Yu J. Hypoxia-inducible factor-1 as a therapeutic target in cancer. J Gastroenterol Hepatol.
2013;28(3):401-5. 57. Thirlwell C, Schulz L, Dibra H, Beck S. Suffocating cancer: hypoxia-associated epimutations as targets
for cancer therapy. Clin Epigenetics. 2011;3:9.
49
58. Lu X, Kang Y. Hypoxia and hypoxia-inducible factors: master regulators of metastasis. Clin Cancer
Res. 2010;16(24):5928-35.
59. Semenza GL. Regulation of metabolism by hypoxia-inducible factor 1. Cold Spring Harbor symposia
on quantitative biology. 2011;76:347-53.
60. Semenza GL. HIF-1 mediates metabolic responses to intratumoral hypoxia and oncogenic mutations.
The Journal of clinical investigation. 2013;123(9):3664-71.
61. Kizaka-Kondoh S, Kuchimaru T, Kadonosono T. Pathophysiological response to hypoxia - from the
molecular mechanisms of malady to drug discovery:hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1)-active cells as a target
for cancer therapy. Journal of pharmacological sciences. 2011;115(4):440-5.
62. Isobe T, Aoyagi K, Koufuji K, Shirouzu K, Kawahara A, Taira T, et al. Clinicopathological significance
of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1alpha) expression in gastric cancer. International journal of clinical oncology. 2013;18(2):293-304.
63. Ke Q, Costa M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 2006;70(5):1469-80.
64. Wu XZ, Xie GR, Chen D. Hypoxia and hepatocellular carcinoma: The therapeutic target for
hepatocellular carcinoma. J Gastroenterol Hepatol. 2007;22(8):1178-82.
65. Heindryckx F, Coulon S, Terrie E, Casteleyn C, Stassen JM, Geerts A, et al. The placental growth
factor as a target against hepatocellular carcinoma in a diethylnitrosamine-induced mouse model. J Hepatol.
2013;58(2):319-28.
66. Zen C, Zen Y, Mitry RR, Corbeil D, Karbanova J, O'Grady J, et al. Mixed phenotype hepatocellular
carcinoma after transarterial chemoembolization and liver transplantation. Liver transplantation : official
publication of the American Association for the Study of Liver Diseases and the International Liver
Transplantation Society. 2011;17(8):943-54. 67. Comhaire A. De invloed van hypoxie op de differentiatie van progenitorcellen in de lever
[Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de biomedische wetenschappen]. Gent:
Universiteit Gent; 2013.
68. Vandewynckel YP, Laukens D, Bogaerts E, Paridaens A, Van den Bussche A, Verhelst X, et al.
Modulation of the unfolded protein response impedes tumor cell adaptation to proteotoxic stress: a PERK for
hepatocellular carcinoma therapy. Hepatology international. 2015;9(1):93-104.
69. Bogaerts E, Heindryckx F, Devisscher L, Paridaens A, Vandewynckel YP, Van den Bussche A, et al.
Time-dependent effect of hypoxia on tumor progression and liver progenitor cell markers in primary liver
tumors. PloS one. 2015;10(3):e0119555.
70. Heindryckx F, Mertens K, Charette N, Vandeghinste B, Casteleyn C, Van Steenkiste C, et al. Kinetics
of angiogenic changes in a new mouse model for hepatocellular carcinoma. Molecular cancer. 2010;9:219.
71. Elpek GO. Cellular and molecular mechanisms in the pathogenesis of liver fibrosis: An update. World journal of gastroenterology : WJG. 2014;20(23):7260-76.
72. Vander Borght S, Komuta M, Libbrecht L, Katoonizadeh A, Aerts R, Dymarkowski S, et al. Expression
of multidrug resistance-associated protein 1 in hepatocellular carcinoma is associated with a more aggressive
tumour phenotype and may reflect a progenitor cell origin. Liver international : official journal of the
International Association for the Study of the Liver. 2008;28(10):1370-80.
73. Yamashita T, Wang XW. Cancer stem cells in the development of liver cancer. The Journal of clinical
investigation. 2013;123(5):1911-8.
74. Hou Y, Zou Q, Ge R, Shen F, Wang Y. The critical role of CD133(+)CD44(+/high) tumor cells in
hematogenous metastasis of liver cancers. Cell research. 2012;22(1):259-72.
75. Durnez A, Verslype C, Nevens F, Fevery J, Aerts R, Pirenne J, et al. The clinicopathological and
prognostic relevance of cytokeratin 7 and 19 expression in hepatocellular carcinoma. A possible progenitor cell origin. Histopathology. 2006;49(2):138-51.
76. van Malenstein H, Verslype C, Windmolders P, van Eijsden R, Nevens F, van Pelt J. Characterization
of a cell culture model for clinically aggressive hepatocellular carcinoma induced by chronic hypoxia. Cancer
letters. 2012;315(2):178-88.
77. Uenishi T, Kubo S, Yamamoto T, Shuto T, Ogawa M, Tanaka H, et al. Cytokeratin 19 expression in
hepatocellular carcinoma predicts early postoperative recurrence. Cancer science. 2003;94(10):851-7.
78. Lee SK, Kim MH, Cheong JY, Cho SW, Yang SJ, Kwack K. Integrin alpha V polymorphisms and
haplotypes in a Korean population are associated with susceptibility to chronic hepatitis and hepatocellular
carcinoma. Liver international : official journal of the International Association for the Study of the Liver.
2009;29(2):187-95.
79. Nart D, Yaman B, Yilmaz F, Zeytunlu M, Karasu Z, Kilic M. Expression of matrix metalloproteinase-9
in predicting prognosis of hepatocellular carcinoma after liver transplantation. Liver transplantation : official publication of the American Association for the Study of Liver Diseases and the International Liver
Transplantation Society. 2010;16(5):621-30.
50
80. Thieringer FR, Maass T, Anthon B, Meyer E, Schirmacher P, Longerich T, et al. Liver-specific
overexpression of matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) in transgenic mice accelerates development of
hepatocellular carcinoma. Molecular carcinogenesis. 2012;51(6):439-48.
81. Ma S, Lee TK, Zheng BJ, Chan KW, Guan XY. CD133+ HCC cancer stem cells confer
chemoresistance by preferential expression of the Akt/PKB survival pathway. Oncogene. 2008;27(12):1749-58.
82. Santos NP, Oliveira PA, Arantes-Rodrigues R, Faustino-Rocha AI, Colaco A, Lopes C, et al.
Cytokeratin 7/19 expression in N-diethylnitrosamine-induced mouse hepatocellular lesions: implications for
histogenesis. International journal of experimental pathology. 2014;95(3):191-8.
83. Kuhlmann WD, Peschke P. Hepatic progenitor cells, stem cells, and AFP expression in models of liver
injury. International journal of experimental pathology. 2006;87(5):343-59.
84. Frame MC, Inman GJ. NCAM is at the heart of reciprocal regulation of E-cadherin- and integrin-mediated adhesions via signaling modulation. Developmental cell. 2008;15(4):494-6.
85. Lehembre F, Yilmaz M, Wicki A, Schomber T, Strittmatter K, Ziegler D, et al. NCAM-induced focal
adhesion assembly: a functional switch upon loss of E-cadherin. The EMBO journal. 2008;27(19):2603-15.
86. Tsuchiya A, Kamimura H, Tamura Y, Takamura M, Yamagiwa S, Suda T, et al. Hepatocellular
carcinoma with progenitor cell features distinguishable by the hepatic stem/progenitor cell marker NCAM.
Cancer letters. 2011;309(1):95-103.
87. Wendt MKA, T. M.; Schiemann, W. P. Mechanisms of Epithelial-Mesenchymal Transition by TGF-β.
Future Oncology. 2009;5(8):1145-68.
88. Kang JS, Kang HG, Park YI, Lee H, Park K, Lee YS, et al. Expression of epithelial cell adhesion
molecule and proliferating cell nuclear antigen in diethylnitrosamine-induced hepatocarcinogenesis in mice.
Experimental and therapeutic medicine. 2013;5(1):138-42. 89. Chen Y, Wong PP, Sjeklocha L, Steer CJ, Sahin MB. Mature hepatocytes exhibit unexpected plasticity
by direct dedifferentiation into liver progenitor cells in culture. Hepatology (Baltimore, Md). 2012;55(2):563-74.
90. Jabari S, Meissnitzer M, Quint K, Gahr S, Wissniowski T, Hahn EG, et al. Cellular plasticity of trans-
and dedifferentiation markers in human hepatoma cells in vitro and in vivo. International journal of oncology.
2009;35(1):69-80.
91. Shibuya M, Kondo F, Sano K, Takada T, Asano T. Immunohistochemical study of hepatocyte,
cholangiocyte and stem cell markers of hepatocellular carcinoma. Journal of hepato-biliary-pancreatic sciences.
2011;18(4):537-43.
92. Kretzschmar K, Watt FM. Lineage tracing. Cell. 2012;148(1-2):33-45.
93. Fox DT, Morris LX, Nystul T, Spradling AC. Lineage analysis of stem cells. StemBook. Cambridge
(MA): Harvard Stem Cell Institute
Copyright: (c) 2008 D.T. Fox, L.X. Morris, T. Nystul, and A.C. Spradling.; 2008. 94. Tarlow BD, Finegold MJ, Grompe M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell
injury. Hepatology (Baltimore, Md). 2014;60(1):278-89.
95. Verhulst SB, J.; van Grunsven, L. A.; Dollé, L. Advances in hepatic stem/progenitor cell biology.
EXCLI Journal. 2014;4:33-47.
96. Shin S, Upadhyay N, Greenbaum LE, Kaestner KH. Ablation of Foxl1-Cre-labeled hepatic progenitor
cells and their descendants impairs recovery of mice from liver injury. Gastroenterology. 2015;148(1):192-
202.e3.
97. Furuyama K, Kawaguchi Y, Akiyama H, Horiguchi M, Kodama S, Kuhara T, et al. Continuous cell
supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nature genetics.
2011;43(1):34-41.
51
7. Bijlagen
7.1. LPC merkers
AFP Alfa foetoproteïne Foetaal serumeiwit Merker voor aantal kankercellen
ALB Albumine Globulair eiwit Specifieke merker voor hepatocyten
CD34 CD34 antigen Celoppervlakte
glycoproteïne Cel-celadhesie
CD44 CD44 antigen Celoppervlakte proteïne Celinvasie en migratie
CK18 Cytokeratine 18 Cytoskeletaal structuureiwit
Celdifferentiatie
CK19 Cytokeratine 19 Cytoskeletaal
structuureiwit Celdifferentiatie: biliair
CK7 Cytokeratine 7 Cytoskeletaal
structuureiwit Celdifferentiatie
CK8 Cytokeratine 8 Cytoskeletaal
structuureiwit Celdifferentiatie
EPCAM Epitheliale cel adhesie
molecule
Transmembraan
glycoproteïne Cel-celadhesie
FOXL1 Forkhead box L1 Transcriptiefactor Celdifferentiatie
LIF Leukemie inhiberende factor Cytokine Celproliferatie en -differentiatie
NCAM1 Neurale cel adhesie molecule 1 Celoppervlakte
glycoproteïne Cel-celadhesie
OCT4 Octameer-bindend eiwit 4 Transcriptiefactor Embryonale ontwikkeling en
pluripotentie
OPN Osteopontine Structuureiwit Merker voor cholangiocyten
(embryonaal)
PROM1 Prominine 1 Transmembraan
glycoproteïne Celdifferentiatie
SCFR Mast/stamcel groeifactor
receptor kit Tyrosine kinase Celdifferentiatie
SOX9 Sex determining region Y –
box 9 Transcriptiefactor Celdifferentiatie: biliair
THY1 Thy-1 celoppervlakte antigen Celoppervlakte glycoproteïne
Celmigratie
VIM Vimentine Intermediair filament eiwit Celmigratie
52
7.2. Voorbeelden van RT-qPCR resultaten waarbij additionele WT
stalen duidelijke discrepanties met eigen stalen vertonen
Grafische voorstellingen van RNA expressies van Krt7 (boven) en Afp (onder) met (links) en zonder (rechts)
inclusie van de additionele WT die dienden ter vervollediging van bepaalde WT groepen.
7.3. Protocol haematoxyline-eosine kleuring
1. Voorbereiding
- haematoxyline: Mayer
- eosine: 0,5 g EosineY, 10 mL gedestilleerd water, 190 mL 96% EtOH, 1 mL ijsazijn
2. Deparaffineren en rehydrateren
- 5 minuten xyleen
- 5 minuten xyleen
53
- 5 minuten 100% alcohol
- 5 minuten 100% alcohol
- 5 minuten 96% alcohol
- 5 minuten 96% alcohol
- 5 minuten gedestilleerd water
3. Haematoxyline-eosine kleuring
- 3 minuten haematoxyline
- 5 à 10 minuten stromend water
- 5 minuten gedestilleerd water
- 1 minuut 96% ethanol
- 5 minuten 1% eosine
4. Dehydrateren
- 5 minuten 96% alcohol
- 5 minuten 96% alcohol
- 5 minuten 100% alcohol
- 5 minuten 100% alcohol
- 5 minuten xyleen
- 5 minuten xyleen
5. Monteren
- monteren met DpX, +/- 70 u op horizontaal oppervlak laten liggen
7.4. Protocol Sirius Red kleuring
1. Voorbereiding
- Sirius Red: 0,2 g Sirius Red, 200 mL picrinezuur
2. Deparaffineren en rehydrateren
- 5 minuten xyleen
- 5 minuten xyleen
- 5 minuten 100% alcohol
- 5 minuten 100% alcohol
- 5 minuten 96% alcohol
54
- 5 minuten 96% alcohol
- 5 minuten gedestilleerd water
3. Sirius Red kleuring
- 30 minuten Sirius Red
- 5 minuten gedestilleerd water
- 5 minuten gedestilleerd water
4. Dehydrateren
- 5 minuten 96% alcohol
- 5 minuten 96% alcohol
- 5 minuten 100% alcohol
- 5 minuten 100% alcohol
- 5 minuten xyleen
- 5 minuten xyleen
5. Monteren
- monteren met DpX, +/- 70 u op horizontaal oppervlak laten liggen
7.5. Protocol immunohistochemisch kleuring F4/80
1. Benodigdheden
- antigen retrieval (10x citraatbuffer)
- TBS
- 3% H2O2
- PIR (rabbit serum, Dako) opzoeken en eventueel bestellen
- TNB (diepvries)
- TNT (1 L TBS + 200 µL Tween)
- rode fles (LSAB kit)
- DAB
- haematoxyline (Mayer)
2. Voorbereiding
- Maak RaRat-B 1/300 + PIR (rabbit serum, Dako) 10% in TBS met 0,5% BSA
- Bereid een dag of minstens 2 uur voor gebruik!
55
3. Deparaffineren en rehydrateren
- 3 x 3 minuten xyleen
- 2 x 3 minuten 99% ethanol
- 2 x 3 minuten 96% ethanol
- 5 minuten gedestilleerd water
4. Antigen retrieval
- 20 minuten in citraatbuffer bij 95°C
- 20 minuten afkoelen in citraatbuffer
- 5 minuten TBS
5. Blokken endogeen peroxidase
- 10 minuten 3% H2O2
- 3 x 5 minuten TBS
6. Blokken
- 45 minuten PIR (rabbit serum, Dako) 1/5 in TBS met 0.5% BSA
7. Primair antilichaam
- Overnacht Rat a F4/80 (Serotec MCA 497 G) 1/300 in TBS met 0,5% BSA
8. Spoelen
- 3 x 5 min TNT
9. Secundair antilichaam
- 45 minuten RaRat-B 1/300 + PIR (rabbit serum, Dako) 10% in TNB
- 3 x 5 minuten spoelen met TNT
10. Streptavidine-HRP
- 10 minuten bedekken met rode fles uit LSAB kit
- 3 x 5 minuten TBS
11. DAB
56
- 1 druppel DAB per 1 mL buffer
- Coupes bedekken tot verkleuring (30 sec)
- Verkleuring stoppen met gedestilleerd water
- 5 min spoelen in gedestilleerd water
12. Kernkleuring
- 3 minuten heamatoxyline
- 5 minuten stromend water
13. Dehydrateren
- 2 x 3 minuten 96% ethanol
- 2 x 3 minuten 99% ethanol
- 3 x 3 minuten xyleen
14. Monteren
7.6. Protocol immunohistochemische kleuring CK19
1. Deparaffineren en rehydrateren
- 3 x 5 minuten xyleen
- 2 x 5 minuten 99% ethanol
- 2 x 5 minuten 96% ethanol
- 5 minuten gedestilleerd water
2. Antigen retrieval
- 20 minuten in citraatbuffer bij 95°C
- 15 minuten afkoelen in citraatbuffer
- 3 x 5 minuten TBS
4. Blokken
- 10 minuten 3% H2O2 in gedestilleerd water
- 3 x 5 minuten TBS
- 30 minuten 1% BSA in TBS (37°C)
5. Primair antilichaam
57
- Antilichaam 1/200 verdunnen in TBS
- Coupes bedekken met +/- 100-300 µl
- 1 uur bij 37°C
6. Spoelen
- 3 x 5 minuten TBS
7. Secundair antilichaam
- 10 minuten bedekken met gele fles uit LSAB kit
- 3 x 5 minuten spoelen met PBS
- 10 minuten bedekken met rode fles uit LSAB kit
- 3 x 5 minuten spoelen met PBS
8. DAB
- 1 druppel DAB per mL buffer
- Coupes bedekken tot verkleuring (30-50 sec)
- Verkleuring stoppen met gedestilleerd water
- 5 minuten spoelen in gedestilleerd water
9. Kernkleuring
- 3 minuten haematoxyline
- 3 minuten stromend water
10. Rehydrateren
- 5 minuten gedestilleerd water
- 2 x 5 minuten 96% ethanol
- 2x 5 minuten 99% ethanol
- 3x 5 minuten xyleen
11. Monteren
7.7. Protocol immunohistochemische kleuring EPCAM
1. Deparaffineren en rehydrateren
- 3 x 5 minuten xyleen
58
- 2 x 5 minuten 99% ethanol
- 2 x 5 minuten 96% ethanol
- 5 minuten gedestilleerd water
2. Antigen retrieval
- 30 minuten in citraatbuffer 95°C
- 15 minuten afkoelen in citraatbuffer
- 3 x 5 minuten spoelbuffer (PBS + 0,1% BSA)
3. Blokken
- 10 minuten 3% H2O2 in gedestilleerd water
- 3 x 5 minuten spoelen
- 30 minuten 1% BSA in PBS bij 37°C
4. Primair antilichaam
- Antilichaam 1/300 verdunnen in de spoelbuffer
- Coupes bedekken met +/- 200 µL
- Overnacht bij 4°C laten incuberen
5. Spoelen
- 3 x 5 minuten spoelbuffer
6. Secundair antilichaam
- 45 minuten bedekken met gebiotinyleerd konijn anti-geit Ab, 1/500 verdund in spoelbuffer
(KT)
- 3 x 5 minuten spoelen met PBS
- 10 minuten bedekken met rode fles uit LSAB2 kit
- 3 x 5 minuten spoelen met PBS
7. DAB
- 1 druppel DAB per mL buffer
- Coupes bedekken tot verkleuring (15 à 20 sec)
- Verkleuring stoppen met gedestilleerd water
- 5 minuten spoelen in gedestilleerd water
59
8. Kernkleuring
- 3 minuten haematoxyline
- 10 minuten stromend water
9. Dehydrateren
- 5 minuten gedestilleerd water
- 2 x 5 minuten 96% ethanol
- 2 x 5 minuten 99% ethanol
- 3 x 5 minuten xyleen
10. Monteren
7.8. Protocol RNA-isolatie (Qiagen RNeasy Mini Kit)
1. Voorbereiding
- Steeds RNase vrij water gebruiken
- Bench en pipetten reinigen met RNAse ZAP
- Stalen op ijs zetten
- Oplossingen bereiden
lyse buffer (RLT) + β-mercaptoethanol (10 µl β-ME per 1 ml RLT)
EtOH 70% (100% EtOH + RNase vrij H2O)
- Epjes, filters en kolommen klaarzetten en nummeren
epjes met RLT buffer (600 µl/epje)
doorzichtige filter en kolom
roze filter en kolom
nieuwe kolom
epje
- Spuiten klaarleggen met roze en blauwe naalden
- Centrifuge op 4°C klaarzetten
- RW1 en RPE uit kit klaarzetten
2. Staalname
- 20 à 30 mg weefsel in lyse buffer brengen
- Homogeniseren met naald en spuit, eerst roze dan blauwe
- 3 min afdraaien bij 4°C
60
3. gDNA verwijderen
- Lysaat overbrengen op gDNA eliminatiekolom
- 30 s afdraaien bij ≥ 10 000 rpm
- Kolom weggooien
- Vloeistof mengen met 600 µl EtOH
4. RNA isoleren
- 600 µl op kolom brengen en rest houden (KT)
- 20 sec centrifugeren (shortrun) bij ≥ 10 000 rpm
- Supernatans wegzuigen/ gieten
- vorige 3 stappen herhalen met rest
5. Alle mRNA zit op een kolom
- 700 µl RW1 buffer op kolom
- 15 sec centrifugeren ≥ 10 000 rpm
- Supernatans wegzuigen/ gieten
- 500 µl RPE buffer
- 15 sec centrifugeren bij ≥ 10 000 rpm
- Supernatans wegzuigen/ gieten
- 500 µl RPE buffer
- 2 min centrifugeren bij ≥ 10 000 rpm
- Kolom op nieuwe tube
- 1 min extra centrifugeren bij max speed (drogen filter)
6. mRNA elueren
- Kolom op epje
- 30 µl RNase vrij H20
- 1 min centrifugeren bij max 10 000 rpm
- Epje in frigo 4°C bij direct gebruik of -80°C bij stockage
7. RNA concentratie bepaling adhv OD-meter (stalen op ijs houden)
61
7.9. Protocol cDNA synthese (SensiFAST cDNA Synthesis Kit)
1. RNA op gelijke concentratie brengen
{(Gemeten concentratie x 28)/100} - 28
2. cDNA synthese
- Mastermix maken in epje
4 µL 5x TransAmp Buffer per staal
5 µL nuclease vrij water per staal
- 10 µL RNA per staal in 96 well plaat brengen
- 1 µL reverse transcriptase per staal toevoegen aan mastermix
- mastermix bij RNA in plaat voegen (10 µL per welletje)
3. Incubatie in thermal cycler
- Reactieprotocol
10 min 25°C
15 min 42°C
5 min 85°C
HOLD 4°C
7.10. Protocol RT-qPCR
1. cDNA plaat (eventueel eerst laten ontdooien en) afdraaien
2. Ondertussen per primer/welletje samenbrengen in epje
4 µL Sensimix Sybr geel
1µL forward + reverse primer
3. 5 µL bovenstaande mix in elk welletje van de qPCR plaat brengen met auto-pipet
4. Afgedraaide cDNA plaat uithalen en qPCR plaat met mix afdekken en afdraaien
5. Ondertussen
- In geval van nieuwe cDNA plaat: cDNA eerst verdunnen tot 200 µL met nuclease vrij H20
- Sensimix en forward + reverse primer terug in de diepvries steken en epjes klaarzetten
6. qPCR plaat uithalen en 3 µL cDNA in duplo (naast mekaar) in de welletjes brengen met
multichannel pipet
7. qPCR plaat met lightcycler sticker afdekken en afdraaien
8. Ondertussen
62
- cDNA plaat met aluminium sticker afdekken en in -20 plaatsen
- qPCR en PC aanleggen
9. plaat in qPCR machine stoppen
10. naar hoofdmenu gaan, kiezen voor “run from template”, Quantace cyber green Run
protocol