1

Daniela Silvestre

Evolução do genoma mitocondrial e

relações filogenéticas entre

abelhas da subfamília Apinae

São Paulo

2006

2

Daniela Silvestre

Evolução do genoma mitocondrial e

relações filogenéticas entre

abelhas da subfamília Apinae

Tese apresentada ao Instituto de

Biociências da Universidade de São Paulo, para

a obtenção de Título de Doutor em Ciências, na

Área de Genética e Biologia Evolutiva.

Orientador(a): Dra. Maria Cristina Arias

São Paulo

2006

3

Silvestre, Daniela Evolução do genoma mitocondrial e relações filogenéticas entre abelhas da subfamília Apinae 111p. Tese (Doutorado) - Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Departamento de Genética e Biologia Evolutiva. 1. DNA mitocondrial 2. ordem gênica 3. Subfamília Apinae I. Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Genética e Biologia Evolutiva.

Comissão Julgadora:

________________________ _____________________________

Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

_________________________ _____________________________

Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

_________________________

Prof(a). Dr(a). Maria Cristina Arias Orientadora

4

À minha mãe, em memória,

que redefiniu "dificuldades", "superação"

e, principalmente, "AMOR"

no dicionário da minha vida.

Dedico.

5

“Era um conceito extremamente simples, mas capaz de

explicar com naturalidade toda a infinita e desconcertante

complexidade da vida. A admiração reverencial que

experimentei fez com que o êxtase que as pessoas descrevem em

relação à experiência religiosa parecesse francamente simplório

em comparação. Eu escolhi o êxtase do conhecimento em vez

do deslumbramento da ignorância, quaisquer que fossem as

circunstâncias.”

Douglas Adams

6

Agradecimentos

À minha orientadora Cristina, por todos esses anos de orientação extremamente competente e

segura, seja para os experimentos, relatórios, artigos, prévias... E por estar sempre presente.

Aos mestres, especialmente à Dra. Lyria Mori, Dra. Eliana Dessen, Dra. Maria Elena Infante-

Malachias e Dr. Luís Netto, pelo conhecimento e pela amizade ao longo destes anos.

À maravilhosa Susy, por ótimas conversas! E pela enorme competência técnica também...

Aos alunos (atuais e “ex”) do Lab: Leila, Flávio, Dani Lambda, Rute, Geraldo, Christiana,

Dani “Zoo”, Lia, André, Alisson e os “filhos adotivos” que passaram mais rapidamente. A

cara do laboratório sempre foi mudando, ao longo dos vários anos em que eu estive por aqui!

A Elisângela, Sílvia e Luciana pelo apoio técnico no seqüenciamento das minhas muitas

amostras.

Aos funcionários do Departamento de Biologia, da Biblioteca e da Seção de Pós-Graduação,

pela dedicação e trabalho indispensáveis.

A todos os coletores dos exemplares utilizados neste projeto: não poderia ter sido realizado

sem vocês.

À FAPESP, pela bolsa concedida e pelo apoio financeiro. Ao assessor anônimo, que avaliou

meu projeto e relatórios e sempre me incentivou.

A todos os meus amigos, que já me ouviram falar tanto das mitocôndrias, da ordem gênica e

das minhas abelhinhas incomuns “que vivem solitárias no meio do mato”, e que finalmente

pararam de me censurar duramente quando eu explico que tenho que congelar os “pobres

bichinhos” pelo bem da ciência!

Eu continuo agradecendo ao meu ônibus fretado, que me trouxe até o Departamento nos

últimos onze anos...

De coração, à minha família, por ser tão unida e ter tanto amor. Especialmente, aos meus

irmãos-padrinhos, por serem tão fortes e me apoiarem tanto!

À minha segunda família, Alves: antes só no coração, hoje também no nome.

Ao meu Drigo, por ser um homem maravilhoso, um companheiro para todas as horas, por ser

meu esposo sem ter deixado de ser meu amigo. Com amor!

7

Índice

1. INTRODUÇÃO 11

1.1. O DNA MITOCONDRIAL ANIMAL 11

1.2. REARRANJOS E INFERÊNCIA FILOGENÉTICA – O PROBLEMA DAS ABELHAS 12

1.3. SISTEMÁTICA DE ABELHAS – ESTUDOS TRADICIONAIS E MOLECULARES 15

1.4. JUSTIFICATIVA 20

1.5. DESCRIÇÃO DOS TÁXONS ESTUDADOS 22

1.5.1. APINI 22

1.5.2. BOMBINI 22

1.5.3. CENTRIDINI 23

1.5.4. EMPHORINI 23

1.5.5. ERICROCIDINI 23

1.5.6. EUCERINI 23

1.5.7. EUGLOSSINI 24

1.5.8. MELIPONINI 24

1.5.9. TAPINOTASPIDINI 25

1.5.10. TETRAPEDIINI 25

1.5.11. XYLOCOPINAE: XYLOCOPINI 25

1.5.12. MEGACHILIDAE: MEGACHILINAE: ANTHIDIINI 25

1.5.13. HALICTIDAE: HALICTINAE: AUGOCHLORINI 26

1.6. GRAUS DE COMPLEXIDADE E ROTAS DE EVOLUÇÃO DO COMPORTAMENTO

SOCIAL 26

1.6.1. COMPORTAMENTO SOLITÁRIO 26

8

1.6.2. COMPORTAMENTO SUBSOCIAL 27

1.6.3. COMPORTAMENTO COMUNAL 27

1.6.4. COMPORTAMENTO QUASISSOCIAL 27

1.6.5. COMPORTAMENTO SEMISSOCIAL 27

1.6.6. COMPORTAMENTO EUSSOCIAL “PRIMITIVO” OU SIMPLES 27

1.6.6. COMPORTAMENTO EUSSOCIAL “AVANÇADO” OU COMPLEXO 28

1.7. COMPORTAMENTO SOLITÁRIO E ESTRATÉGIA DE COLETA 29

2. OBJETIVO 31

3. MATERIAIS E MÉTODOS 32

3.1. MATERIAL BIOLÓGICO 32

3.2. METODOLOGIA 34

3.2.1. COLETA POR NINHOS-ARMADILHA 34

3.2.2. EXTRAÇÃO DE DNA 37

3.2.3. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 37

3.2.4. CLONAGEM DOS PRODUTOS DE PCR 40

3.2.5. SEQÜENCIAMENTO AUTOMÁTICO 41

3.2.6. ANÁLISES COMPARATIVAS/FILOGENÉTICAS 42

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO I: SEQÜENCIAMENTO PARCIAL DE

GENES MITOCONDRIAIS 44

4.1. SUBUNIDADE MAIOR DO RNA RIBOSSÔMICO (16S) 44

4.2. CITOCROMO C OXIDASE SUBUNIDADE I 51

9

4.3. CITOCROMO B 58

4.4. “EVIDÊNCIA TOTAL” 64

4.5. ANÁLISES MOLECULARES – CONTEÚDO DE A+T 68

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO II: SEQÜENCIAMENTO DE REGIÕES

MITOCONDRIAIS COM GENES PARA RNAT E ORDEM GÊNICA 72

5.1. ORDENS GÊNICAS MITOCONDRIAIS 73

5.2. DESENHO E ANÁLISE DAS ESTRUTURAS SECUNDÁRIAS DOS RNAT 77

5.2.1. RNAT-ALA (A) 78

5.2.2. RNAT-LYS (K) 78

5.2.3. RNAT-MET (M) 81

5.2.4. RNAT-VAL (V) 81

5.3. A ORDEM GÊNICA NA ÁRVORE DE MICHENER (2000) 82

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO III: ANÁLISES DA TRIBO MELIPONINI

85

6.1. SEQÜÊNCIAS PARCIAIS DO GENE COI 85

6.2. ORDEM GÊNICA DO CLUSTER 4 90

7. CONCLUSÕES 93

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS 95

RESUMO 98

10

ABSTRACT 99

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 100

11

1. Introdução

1.1. O DNA mitocondrial animal

O DNAmt animal possui genes codificadores para 2 subunidades

ribossômicas (12S e 16S), 22 RNA transportador (RNAt), 3 subunidades da enzima

citocromo c oxidase (COI, COII e COIII), citocromo B (cytB), subunidades 6 e 8 da

ATPase e sete subunidades da NADH desidrogenase (ND1, ND2, ND3, ND4, ND5,

ND6 E ND6L), além de uma região rica em A+T (em vertebrados, é chamada D-

loop) não codificadora e que parece conter o controle da replicação e transcrição do

DNAmt. A região rica em A+T é muito variável entre os organismos, em relação à

sua seqüência de bases e tamanho. Ao contrário dessa região, os genes apresentam-se

similares em tamanho em uma ampla gama de espécies, entre invertebrados e

vertebrados (Brown, 1983; Moritz et al., 1987). Quanto à seqüência de nucleotídeos,

o grau de variabilidade depende muito do gene em questão (Simon et al., 1994).

As seqüências completas ou de regiões dos genomas mitocondriais dos

metazoários têm sido muito utilizadas para a inferência de relações filogenéticas

(Avise, 1994; Sunnucks, 2000). Apesar de sua ampla aplicação, essa metodologia

apresenta problemas que precisam ser melhor equacionados, como: evolução

convergente dos nucleotídeos, taxas diferenciais de substituição entre os sítios,

saturação de mutações em sítios altamente variáveis, substituições não-independentes

por seleção na estrutura secundária, e restrições funcionais em termos moleculares

(Rokas e Holland, 2000). Além disso, alguns grupos de organismos apresentam

evolução muito rápida em sua seqüência de nucleotídeos, o que pode levar a

12

ambigüidades quando as seqüências são alinhadas, levando a uma falsa associação

entre grupos não-monofiléticos (Boore e Brown, 1998).

O advento da era genômica trouxe a oportunidade de evidenciar e comparar

caracteres mais raros, como alterações na ordem gênica, em estudos evolutivos e

filogenéticos. Tais marcadores parecem evitar os equívocos acima mencionados. Da

mesma forma que o conteúdo gênico, a ordem dos genes nos genomas mitocondriais

é notavelmente conservada entre os animais, principalmente quando consideramos

táxons superiores (Moritz et al., 1987). Rearranjos têm sido descritos entre ordens

taxonômicas diferentes, porém são eventos raros, e normalmente apenas os genes

para RNAt estão envolvidos (Gray, 1989). Estes são considerados mais móveis por

sua similaridade estrutural com os elementos de controle da replicação (Cantatore et

al., 1987; Jacobs et al., 1988).

A ocorrência dos eventos de translocação varia muito conforme o grupo

estudado. Como exemplo, temos o primeiro rearranjo detectado entre ordens de

insetos: a comparação da ordem gênica de Drosophila yakuba (Diptera) e Locusta

migratoria (Orthoptera), onde apenas uma troca na ordem de dois genes para RNAt é

observada (Haucke e Gellissen, 1988). Dentro da Ordem Diptera, por outro lado,

apenas três alterações foram detectadas quando as espécies são comparadas.

Esses resultados demonstram que, embora os genes para RNAt sejam mais

susceptíveis a sofrerem transposições, esses eventos não são muito comuns. A ordem

dos demais genes (codificadores de proteínas e RNAr) é conservada entre

praticamente todos os invertebrados (Moritz et al., 1987).

1.2. Rearranjos e inferência filogenética – o problema das abelhas

13

A constatação desses eventos raros de translocação abriu uma nova

perspectiva em estudos filogenéticos, onde seqüências completas de DNAmt podem

ser comparadas entre grupos distantes enfocando a ordem gênica mitocondrial (Boore

et al., 1995). O grande número de rearranjos potenciais faz com que a convergência

seja raríssima; é um caráter seletivamente neutro e a homologia é quase sempre

assegurada (Boore e Brown, 1998). Raros casos de homoplasia são descritos, como

por exemplo uma translocação dentro da Ordem Orthoptera. Nesse caso, há trocas de

posição entre os RNAt para os aminoácidos lisina e ácido aspártico. Essas alterações

parecem ter ocorrido muitas vezes de maneira independente dentro dessa Ordem

(Flook et al., 1995).

Numerosos trabalhos têm obtido resultados relevantes empregando a análise

da ordem gênica. O aumento do número de organismos cuja ordem gênica é

conhecida provavelmente ajudará a estabelecer caracteres robustos e diagnósticos

para ordens, famílias e até mesmo gêneros (Rawlings et al., 2001).

A importância dessas evidências moleculares no entendimento da evolução do

genoma mitocondrial, e também da evolução dos táxons animais, nos incitou a

utilizá-las em uma tentativa de resolver questões controversas quanto à classificação

e filogenia das abelhas (Família Apidae). Esses insetos, pertencentes à ordem

Hymenoptera, têm importância fundamental na polinização da vegetação natural e

das plantas cultivadas. Além disso, ainda fornecem produtos bastante valorizados

pelo homem, como cera, própolis, geléia real e principalmente mel, um dos poucos

alimentos impossíveis de serem sintetizados (Grimaldi e Engel, 2005). Em muitos

países, as populações apícolas naturais têm sido destruídas pela atividade humana,

muitas vezes antes de serem estudadas e conhecidas (Michener, 2000).

14

Adotaremos nesse trabalho a classificação publicada recentemente por

Charles D. Michener (2000), pela qual a Família Apidae fui subdividida em três

subfamílias: Xylocopinae, Nomadinae e Apinae. O enfoque deste projeto será a

Subfamília Apinae, composta atualmente por 19 tribos (Tabela I).

Tabela I – Tribos pertencentes à subfamília Apinae segundo Michener (2000) e indicação se presentes ( ) ou não (-) na região neotropical. As quatro tribos em destaque são as “Apidae corbiculadas”.

Tribos Região neotropical

01- Isepeolini 02- Osirini 03- Protepeolini 04- Exomalopsini 05- Ancylini - 06-Tapinotaspidini 07- Tetrapediini 08- Ctenoplectrini - 09- Emphorini 10- Eucerini 11- Anthophorini 12- Centridini 13- Rhathymini 14- Ericrocidini 15- Melectini - 16- Euglossini 17- Bombini 18- Meliponini 19- Apini (introduzida)

Dentre estas, encontram-se as quatro tribos (Apini, Bombini, Euglossini e

Meliponini) chamadas de “Apidae corbiculadas”, as quais definiam a subfamília antes

de Michener (2000), e que têm especial importância nesse trabalho por serem as

únicas que apresentam espécies com diferentes níveis de comportamento social.

Fazem parte também dessa subfamília as tribos que antigamente compunham a

Família Anthophoridae. Das 19 tribos de Apinae, 16 estão presentes na região

Neotropical, sendo 15 tribos nativas e uma tribo introduzida, Apini (representada pela

espécie Apis mellifera).

15

A classificação das abelhas e as relações filogenéticas entre elas sempre foram

questões muito controversas, sofrendo alterações freqüentes conforme o autor e os

métodos adotados. As análises comparativas do genoma mitocondrial (por seqüências

e através da ordem gênica) podem constituir fontes de caracteres para a inferência de

uma filogenia entre as tribos acima apresentadas, que pode ou não confirmar as

relações sugeridas por Michener (2000). Por exemplo, uma questão a ser analisada é

a polêmica inclusão das tribos da antiga família Anthophoridae no mesmo grupo

tradicionalmente restrito às “Apidae corbiculadas” (Apini, Bombini, Euglossini e

Meliponini).

1.3. Sistemática de abelhas – estudos tradicionais e moleculares

As “Apidae corbiculadas” são um grupo tropical de abelhas com quase 1000

espécies (Roubik, 1989) que formam um clado dentro de Apinae (Roig-Alsina e

Michener, 1993). Este é sustentado por vários caracteres, mas o mais conspícuo é a

modificação da escopa (conjunto de pelos na perna posterior, responsável pela coleta

de pólen e óleos) em uma reentrância com estrutura diferenciada, a corbícula (Figura

1), o que dá o nome ao grupo. Conforme comentado acima, esse grupo recebe

especial atenção dos pesquisadores, porque duas tribos (Apini e Meliponini)

apresentam um dos mais intrigantes comportamentos animais, a eussocialidade. Uma

filogenia robusta entre essas tribos é de suma importância para resolver a dúvida

sobre a origem e a evolução desse comportamento.

16

Figura 1 - Escopa (A) e corbícula (B), onde a seta aponta a reentrância que é preenchida de pólen ou óleos. (retiradas de http://www.ib.usp.br/beetaxon/imagens/escopas.htm)

Assim, a reconstrução da filogenia dessas abelhas tem sido motivo de vários

estudos. Apesar de ser característica exclusiva de poucos grupos, a eussocialidade

pode ter oferecido enormes vantagens competitivas às abelhas que a apresentam

(Michener, 2000). Porém, há controvérsias até nesse ponto: Engel (2001) e Grimaldi

e Engel (2005) afirmam que a eussocialidade não seria responsável pela irradiação

das abelhas, pois não seria uma característica suficiente para dominância ecológica.

Os estudos de sistemática clássica de abelhas baseiam-se primordialmente em

caracteres morfológicos e também comportamentais. Quando procuram esclarecer a

questão da evolução do comportamento social no grupo, geralmente os resultados

desses trabalhos apontam para uma origem única do comportamento eussocial, pois

consideram que as duas tribos eussociais (Apini e Meliponini) compartilham um

ancestral comum exclusivo. Darwin, na sua “Origem das Espécies”, afirma que

Meliponini seria intermediário ente Bombini e Apini, ressaltando portanto a origem

única do comportamento eussocial no grupo. Essa visão tradicional foi mantida por

muito tempo, baseada principalmente nas seguintes características comuns às duas

tribos: formação de colônias grandes e perenes; castas morfologicamente

(A) (B)

17

diferenciadas; e sistemas elaborados de comunicação entre os indivíduos (Koulianos

et al., 1999).

Em 1977 foi publicado o trabalho de Winston e Michener, baseado em

morfologia externa e caracteres comportamentais, que foi inovador em concluir que a

eussocialidade surgiu duas vezes independentemente nesses grupos. O argumento

central era que Meliponini tinha caracteres que sugeriam uma diferenciação antiga,

muito divergente das demais tribos. Bombini e Euglossini foram considerados

grupos-irmãos, e Apini seria irmão desse clado. O trabalho de Kimsey (1984)

corroborou essa árvore com base em outros caracteres de morfologia externa e

também interna.

Na década de 90, outros trabalhos (Prentice, 1991; Roig-Alsina e Michener,

1993) com caracteres morfológicos diferentes voltaram a considerar a origem única

da eussocialidade, sugerindo que seria um comportamento muito complexo para

surgir paralelamente em dois grupos.

Ao mesmo tempo, na década de 90, diversos trabalhos foram feitos baseados

em caracteres moleculares. Foram seqüenciados fragmentos dos genes 16S, 18S e

28S (Cameron, 1991 e 1993; Sheppard e McPheron, 1991) e todas essas análises

chegaram à conclusão de que o advento da eussocialidade ocorreu duas vezes, pois

Apini e Meliponini não são posicionados como grupos irmãos. Bombini aparece

consistentemente como irmão de Meliponini, mas a relação entre Apini e Euglossini

não é bem definida.

Nos trabalhos citados, foram utilizados vários marcadores moleculares

diferentes, como o gene mitocondrial para a subunidade maior do RNA ribossômico -

16S (Cameron, 1993). Porém, a própria autora cita que o 16S tem algumas

desvantagens, como: (1) dificuldade no alinhamento por apresentar grandes indels;

18

(2) saturação de substituições; (3) estrutura secundária do produto gênico, que

prejudica a independência entre os caracteres; e (4) um alto grau de polimorfismo

ancestral.

Para superar essas dificuldades, foram feitos estudos com outros genes.

Koulianos et al. (1999) utilizaram seqüências do gene mitocondrial para o citocromo

B. Genes nucleares também foram seqüenciados, como o 28S e o gene para a opsina

(Mardulyn e Cameron, 1999). Há também tentativas de unir dados moleculares de

todos esses genes em busca de árvores mais consistentes (Cameron e Mardulyn,

2001). Todos esses trabalhos associam Meliponini com Bombini, separadamente de

Apini, indicando que o comportamento eussocial dos dois grupos evoluiu

independentemente. Cameron e Mardulyn (2001) acreditam que essas análises seriam

mais precisas do que as análises morfológicas, visto que as características de

morfologia que são analisadas podem estar convergindo devido ao comportamento

comum aos dois grupos, levando assim a acreditar que Apini e Meliponini são grupos

irmãos. Além disso, os dados moleculares apresentam um volume maior de caracteres

do que os morfológicos e comportamentais, a homologia é mais facilmente

assegurada e a evolução dos caracteres segue modelos relativamente simples

(Koulianos et al., 1999).

Alguns autores procuram compilar dados morfológicos com moleculares,

dando a eles novos tratamentos e interpretações, em uma abordagem chamada de

“evidência total”. No caso das abelhas, as árvores filogenéticas obtidas dessa maneira

sempre combinaram com as árvores originais dos trabalhos de morfologia. Dois

desses trabalhos (Chavarría e Carpenter, 1994; Schultz et al., 1999) afirmam que os

dados moleculares somente acrescentam ruído às análises conjuntas, portanto os

19

dados conclusivos seriam os morfológicos, já que a árvore de genes nem sempre

equivale à filogenia das espécies.

As árvores que ilustram as relações filogenéticas dentro das “Apidae

corbiculadas” sugeridas em cada um dos trabalhos citados acima estão representadas

na Figura 2.

E B M AE B M A M A B EM A B E

E B M AE B M A A E M BA E M B

E B M AE B M A

(A) (B)

(C) (D)

(E)

Figura 2 – Relações entre as “Apidae corbiculadas” resultantes de cada um dos trabalhos citados no texto. Os táxons nos terminais estão representados por letras (A = Apini; B = Bombini; E = Euglossini e M = Meliponini) Os ramos pontilhados são relações que os trabalhos correspondentes não conseguiram resolver. (A) Árvore baseada em morfologia, chamada de “visão tradicional” (Michener, 1944 e 1974); (B) Dados morfológicos e comportamentais (Winston e Michener, 1977 e Kimsey, 1984); (C) Novos dados morfológicos (Prentice, 1991 e Roig-Alsina e Michener, 1993); (D) Dados moleculares (Cameron, 1993 e Sheppard e McPheron, 1991); e (E) “Evidência total” (Chavarría e Carpenter, 1994).

Não há, portanto, um consenso sobre o assunto, e nenhum marcador se

mostrou suficientemente conclusivo, principalmente devido à alta variabilidade e

20

homoplasias. Dentro desse contexto problemático, todas as tentativas de resolver o

clássico problema da sistemática das abelhas podem ser consideradas válidas.

1.4. Justificativa

Dentro desse panorama complexo sobre a evolução das abelhas e do

comportamento eussocial dentro do grupo, insere-se este trabalho. Um fato

importante que nos levou a propor esse projeto foi a verificação, em produtos de PCR

e posterior seqüenciamento, de alterações na ordem gênica quando regiões

específicas do genoma mitocondrial de Melipona bicolor (tribo Meliponini) foram

comparadas com Apis mellifera (Tribo Apini).

Durante o mestrado, 77% do genoma mitocondrial de M. bicolor, contendo

todos os 13 genes mitocondriais codificadores para proteínas, 18 dos 22 genes para

RNAt e os dois genes para RNAr (sendo um integral e o outro parcialmente

seqüenciado). O viés para o uso de bases A+T, bastante evidente em A. mellifera,

mostrou-se ainda mais acentuado em M. bicolor. Foram encontradas diferenças no

tamanho e composição dos genes. As diferenças mais significativas foram aquelas

encontradas nas comparações da ordem gênica: pelo menos nove rearranjos na ordem

gênica mitocondrial foram observados entre as duas espécies de abelhas, um

fenômeno raro entre organismos tão próximos (Silvestre, 2002).

A raridade de tais mudanças em outros grupos de organismos foi instigadora a

estudos mais aprofundados do genoma mitocondrial das abelhas. Considerando que

as duas tribos, Apini e Meliponini, são justamente aquelas que compartilham um

comportamento intrigante, a eussocialidade, foi levantada a hipótese de que esses

rearranjos poderiam servir como um excelente marcador para estudar a origem e a

21

evolução desse comportamento no grupo. Para tanto, foram estudados representantes

das outras tribos de Apinae, em uma tentativa de reconstruir a história filogenética e o

padrão de evolução de algumas características do DNAmt dentro do grupo.

Este trabalho consistiu, portanto, de uma análise da evolução do genoma

mitocondrial entre as abelhas da subfamília Apinae, visto as evidências de

translocações de genes para RNAt, tidas na literatura como eventos raros, e, a partir

desses resultados e de seqüenciamento de regiões desse genoma, uma tentativa de

estabelecer as relações filogenéticas desse grupo. Como conseqüência, esses dados

têm o potencial de fornecer maiores informações sobre o surgimento (único ou duplo)

do comportamento social.

A baixa ocorrência dos eventos de translocações dentro de grupos próximos

aumenta sua importância evolutiva, podendo servir como um excelente marcador

molecular. Além disso, seqüenciar parcialmente um gene mitocondrial pode ter alto

valor filogenético, contanto que a região seja bem escolhida e apresente uma variação

mais adequada do que aquelas que foram verificadas nos trabalhos citados acima.

A ordem gênica mitocondrial é citada por diversos autores como um marcador

molecular promissor para estudos de filogenia entre grupos distantes (Boore et al.,

1995). Ainda não foram realizados trabalhos nesse sentido com a subfamília Apinae,

mas existem alguns estudos promissores com ordens de insetos. Dowton e Austin

(1999) encontraram um hot spot de translocações de genes para RNAt no genoma

mitocondrial de diversos Hymenoptera, porém essencialmente vespas. No entanto,

utilizar somente essa região poderia ser um problema devido à alta variabilidade e,

portanto, alto grau de homoplasia (Dowton et al., 2002). Outro grupo que parece ter

uma alta taxa de translocações e inversões no DNAmt são os “hemipteróides” (Shao

et al., 2001a), e os autores indicam que pretendem ampliar esse estudo a fim de

22

estudar a filogenia das famílias. A experiência obtida com base nesses trabalhos será

certamente de grande ajuda para tentar estudar a evolução dentro da subfamília

Apinae.

1.5. Descrição dos táxons estudados

Serão apresentadas pequenas descrições das tribos e gêneros dos exemplares

estudados neste projeto. Todas as informações abaixo foram retiradas de Michener

(2000) e de Silveira et al. (2002):

1.5.1. Apini

Esta tribo apresenta apenas um gênero, Apis, originário do Velho Mundo e

posteriormente introduzido em todos os continentes para a produção de mel. Todas as

espécies são eussociais e fazem ninhos em cavidades pré-existentes. O genoma

mitocondrial da espécie A. mellifera foi completamente seqüenciado em 1993

(Crozier e Crozier, 1993), e foi utilizado neste trabalho.

1.5.2. Bombini

São as mamangabas sociais (bumble bees), pertencentes a um único gênero

muito diversificado e rico em espécies, Bombus; sua distribuição é quase

cosmopolita, excetuando-se a Austrália, porém são mais bem adaptadas ao clima frio.

Tem espécies “primitivamente” sociais, além de algumas parasitas (que não ocorrem

no Brasil). A espécie coletada, Bombus morio, ocorre no Brasil desde o Rio Grande

do Sul até a Bahia.

23

1.5.3. Centridini

Sua distribuição restringe-se à região Neotropical, com alguns grupos nas

regiões subtropicais e temperadas da América. São abelhas médias a grandes,

coloridas, solitárias, que nidificam plesiomorficamente no solo, freqüentemente em

grandes agregações. Inclui dois gêneros, Centris e Epicharis, ambos presentes no

Brasil. O gênero coletado, Centris, reúne muitas espécies, mais abundantes nas

regiões tropicais úmidas.

1.5.4. Emphorini

Espécies robustas, muitas especialistas em pólen de algumas espécies de

plantas, sendo todas solitárias. Esta é uma tribo exclusiva das Américas (do Chile e

Argentina até o Canadá, mas sendo mais diversificada nas regiões temperadas da

América do Sul). O exemplar, da espécie Melitoma segmentaria, foi coletado em

Santa Catarina, que não fazia parte dos locais de coleta desta espécie descritos na lista

de Silveira et al. (2002).

1.5.5. Ericrocidini

Tribo que ocorre somente nas Américas, sendo que no Brasil estão

representadas por nove gêneros. São abelhas médias ou grandes, todas cleptoparasitas

de espécies da tribo Centridini. O gênero coletado, Mesocheira, distribui-se por toda

a região neotropical.

1.5.6. Eucerini

São abelhas médias a grandes, pilosas, sendo que os machos de muitas

espécies são facilmente reconhecidos pelas longas antenas. Quase todas as espécies

24

são solitárias e constroem ninhos no solo. Distribui-se por todo o mundo, exceto

Austrália, sendo mais abundantes na América do Sul; no Brasil ocorrem 19 gêneros.

O gênero do exemplar que foi coletado, Thygater, é exclusivo da região neotropical.

1.5.7. Euglossini

São chamadas abelhas das orquídeas (orchid bees), com cinco gêneros

amplamente distribuídos na região neotropical, principalmente nas florestas úmidas.

Os machos são polinizadores de muitas espécies de orquídeas, que visitam em busca

de substâncias aromáticas. São solitárias, geralmente grandes e de colorido metálico e

vistoso. Geralmente, fazem ninhos em cavidades pré-existentes em barrancos ou

árvores. O gênero coletado foi Eufriesea, que tem diversas espécies que ocorrem no

Brasil, relativamente raras e freqüentemente sazonais.

1.5.8. Meliponini

São as abelhas “indígenas sem ferrão”, representadas por muitas espécies em

toda a região tropical e também na região subtropical do hemisfério sul. Além de

Apini, é o único grupo que exibe comportamento eussocial, que pode ser observado

em todas as espécies (apesar de algumas delas sobreviverem à custa de alimento

roubado de outras colônias). Os ninhos são geralmente instalados em cavidades pré-

existentes. A espécie Melipona bicolor já tem seu genoma mitocondrial quase

totalmente seqüenciado, e esses dados foram utilizados neste trabalho. Além disso,

foram incluídas outras espécies da tribo para comparação de uma região específica do

genoma mitocondrial.

25

1.5.9. Tapinotaspidini

Tribo exclusivamente neotropical, composta por espécies solitárias, coletoras

de óleo, que antes eram consideradas parte de Exomalopsini. A maioria das espécies

nidifica no solo, como o gênero estudado, Lanthanomelissa. A exceção é o outro

gênero que foi coletado, Paratetrapedia, que utiliza orifícios pré-existentes na

madeira.

1.5.10. Tetrapediini

São abelhas pequenas e esguias, ocorrendo nas regiões tropicais das

Américas. A tribo inclui apenas dois gêneros, sendo Coelioxoides cleptoparasita dos

ninhos do outro gênero, Tetrapedia.

1.5.11. Xylocopinae: Xylocopini

Abundantes nas regiões mais quentes, são chamadas de abelhas

carpinteiras porque, à exceção de um subgênero paleártico, costumam nidificar em

madeira. O gênero estudado, Xylocopa, é solitário e compõe-se de abelhas grandes e

robustas.

1.5.12. Megachilidae: Megachilinae: Anthidiini

A subfamília possui duas características distintivas: as fêmeas

carregam pólen apenas em uma escopa ventral, e utilizam-se de material coletado

para construção de ninhos (folhas e resinas vegetais). Solitárias, estão representadas

aqui pelo gênero Dianthidium.

26

1.5.13. Halictidae: Halictinae: Augochlorini

Abelhas pequenas a médias, de coloração metálica, geralmente com

ninhos no solo ou em madeira podre. Há diversos graus de comportamento social, que

evoluíram independentemente dentro do grupo por diversas vezes, inclusive com a

ocorrência de reversão da socialidade para comportamento solitário. A tribo é

predominantemente neotropical e certamente monofilética. Foram estudadas duas

espécies: Augochlora sp. e Neocorynura sp.

1.6. Graus de complexidade e rotas de evolução do comportamento social

As abelhas são um grupo muito diverso quando observamos o grau de

socialidade de suas espécies. O comportamento social dos animais apresenta diversos

graus de complexidade, que podem ser classificados em uma escala que vai do

comportamento solitário até o eussocial avançado, conforme a presença de certas

características etológicas e morfológicas. Será apresentada aqui uma classificação

desse comportamento (Michener, 1969), para facilitar o entendimento posterior dos

termos relacionados com esse assunto.

1.6.1. Comportamento solitário

Os membros da espécie não interagem, exceto para corte e

acasalamento.

27

1.6.2. Comportamento subsocial

Os adultos cuidam da própria prole por algum tempo, de forma a

aumentar sua sobrevivência. É amplamente encontrada nos artrópodes: crustáceos,

aranhas, ácaros, escorpiões, centopéias, baratas, grilos, besouros e hemípteros, além

de várias espécies de Hymenoptera.

1.6.3. Comportamento comunal

Membros da mesma espécie coabitam (mesmo ninho ou próximos),

mas não têm cuidado cooperativo das proles. Além de muitas abelhas, também ocorre

em aranhas.

1.6.4. Comportamento quasissocial

Membros da mesma espécie coabitam (mesmo ninho ou próximos),

com cuidado cooperativo das proles. Ocorre em abelhas e aranhas.

1.6.5. Comportamento semissocial

Membros da mesma espécie coabitam (mesmo ninho ou próximos),

com cuidado cooperativo da prole, mas nesse caso há diferenciação de castas

(operárias estéreis e rainha fértil). Não há, porém, sobreposição entre as gerações,

pois a colônia não é perene, desfazendo-se após a reprodução. Muitas abelhas e

vespas apresentam esse comportamento.

1.6.6. Comportamento eussocial “primitivo” ou simples

Cuidado cooperativo da prole, diferenciação de castas e sobreposição

de gerações, com baixo grau de diferenciação (e, portanto, maior flexibilidade no

28

papel de cada indivíduo). Também ocorre em muitas abelhas e vespas. Há um caso

descrito em mamíferos: o rato-toupeira sem pelos (Heterocephalus glaber), o único

eussocial não-pertencente ao Filo Arthropoda (Grimaldi e Engel, 2005).

1.6.6. Comportamento eussocial “avançado” ou complexo

Há cuidado cooperativo da prole, diferenciação de castas e

sobreposição de gerações, com um altíssimo grau de diferenciação. Isso faz com que

o papel de cada indivíduo seja considerado irreversível. Ocorre em todas as espécies

de cupins (Ordem Isoptera), que compartilham um ancestral comum eussocial que

surgiu há 140 milhões de anos (Grimaldi e Engel, 2005). Dentro de Hymenoptera,

muitas formigas, abelhas (Apinae e Meliponinae) e vespas (Vespinae) apresentam

esse grau de comportamento. Assim, em insetos a eussocialidade é restrita a essas

duas ordens, além de um único caso em Coleoptera, o besouro eussocial

Austroplatypus incompertus (Kent e Simpson, 1992).

A partir da observação desses comportamentos na natureza, foram idealizadas

duas hipóteses a respeito da rota que a socialidade teria tomado ao longo da evolução.

A primeira é a rota “subsocial”, em que um adulto solitário teria começado a cuidar

de sua prole (apresentando comportamento subsocial), fenômeno que seria seguido de

sobreposição de gerações e posteriormente culminaria com o desenvolvimento de

uma casta estéril, até o nível eussocial avançado.

A rota “parassocial” inclui mais passos evolutivos para a formação do

comportamento eussocial avançado: haveria uma agregação de irmãs da mesma

geração (comportamento comunal), em seguida haveria cuidado cooperativo da prole

(quasissocial), com posterior diferenciação de castas (semissocial) e por último, a

29

sobreposição de gerações e a total perda da capacidade reprodutiva das operárias,

gerando o comportamento eussocial avançado.

Não há provas concretas de qual seria a rota “verdadeira”, mesmo porque

ambas podem ter ocorrido em diferentes grupos animais.

1.7. Comportamento solitário e estratégia de coleta

Apesar de as abelhas apresentarem todos os graus de comportamento social

existentes, conforme explicação acima, o comportamento solitário é o mais comum

entre elas: 85% das cerca de 20000 espécies são solitárias. Essas abelhas são muito

importantes na polinização de plantas cultivadas e principalmente das plantas

selvagens, e estão ameaçadas pelas monoculturas, já que nesse caso o alimento só

está disponível (em grande quantidade) em uma pequena época do ano, durante a

floração daquela planta específica (Batra, 1984).

Cada fêmea dessas espécies solitárias se acasala, faz seu ninho, procria e

estoca alimento independentemente, sendo portanto de difícil coleta em campo. Para

minimizar essa dificuldade em encontrar e capturar as abelhas diretamente com a rede

entomológica, podem ser utilizados ninhos-armadilha para tentar atraí-las, baseando-

se no fato de que muitas espécies utilizam cavidades pré-existentes para nidificar,

como buracos de besouros. Essa técnica foi popularizada por Karl V. Krombein, na

década de 50, e desde então são utilizados ninhos de diversos tipos de materiais,

como bambu, papel e madeira (http:/www.ufv.br/dbg/bee/Narmadil.htm).

No entanto, com toda sua experiência no estudo das abelhas, Michener (2000)

afirma ter se impressionado com a escassez de abelhas não-eussociais em coletas nas

regiões tropicais. Há diversas explicações possíveis para esse fato: a maioria das

30

espécies solitárias faz ninhos no solo, onde a alta umidade dos trópicos seria

catastrófica para a comida e para a larva, tanto por liquefazer a comida quanto pela

quantidade de fungos que podem atacá-la. Além disso, a predação por formigas é

muito mais intensa; e por fim, a competição com as abundantes Apini e Meliponini

seria muito difícil, já que estas forrageiam o ano todo e são muito mais ativas. Há,

inclusive, um exemplo prático desse fato na Guiana Francesa: no continente, há

muitos meliponíneos, e pouquíssimas abelhas de espécies solitárias; nas ilhas, para

onde os meliponíneos não conseguem se dispersar, há somente solitárias, muito

abundantes (Michener, 2000). Esses fatos podem dificultar a coleta de exemplares

solitários pertencentes a todas as tribos.

31

2. Objetivo

O objetivo deste trabalho foi procurar estabelecer relações filogenéticas entre

as espécies pertencentes a tribos da Subfamília Apinae que habitam a região

neotropical. Considerando que a Subfamília Apinae inclui quatro tribos com

diferentes graus de comportamento social, essa filogenia poderia ajudar a

compreender melhor a origem e evolução desse comportamento no grupo.

Na busca desse objetivo, foram escolhidas duas categorias de dados

moleculares para a obtenção de caracteres filogenéticos:

1. seqüências parciais de genes mitocondriais;

2. seqüências das regiões mitocondriais onde há genes para RNAt,

buscando comparar as variações na ordem gênica mitocondrial;

32

3. Materiais e Métodos

3.1. Material biológico

Os dados de duas tribos, Apini e Meliponini, já haviam sido obtidos

previamente: o genoma mitocondrial de Apis mellifera está seqüenciado totalmente

(Crozier e Crozier, 1993) e o de Melipona bicolor foi seqüenciado quase

integralmente no mestrado (Silvestre, 2002; Silvestre e Arias, in prep). Para a

realização deste projeto, foram coletados e analisados os dados de dez tribos

diferentes dentro da subfamília Apinae. Além disso, diversos táxons de subfamílias e

famílias diferentes de abelhas foram analisados, para possibilitar o uso de grupos-

externos (Tabela II). Foram utilizados indivíduos criados em cativeiro e também

espécimes coletados diretamente do ambiente natural, por meio de rede entomológica

ou ninhos-armadilha. Em qualquer um dos casos, as amostras obtidas foram

imediatamente armazenadas a -80°C até a extração do DNA. Todas as abelhas foram

identificadas por uma especialista (Dra. Isabel Alves dos Santos ou Dra. Favízia

Freitas de Oliveira) antes de serem analisadas com as técnicas moleculares.

33

Tabela II - Dados dos exemplares de abelhas estudados. Os asteriscos (*) indicam as espécies cujos dados foram retirados da literatura.

Ordem Família Subfamília Tribo Espécie(s) Coletor Cidade de coleta Data de coleta Hymenoptera Apidae Apinae Apini Apis mellifera * * * Bombini Bombus morio Isabel Alves dos Santos São Paulo, SP 01/10/2001 Centridini Centris sp. Rute Magalhães Brito Sinop, MT 22/06/2001 Centris tarsata Christiana Klingenberg Boracéia, SP 25/01/2003 Emphorini Melitoma segmentaria Thiago de Souza Criciúma, SC 01/03/2005 Ericrocidini Mesocheira sp. Rute Magalhães Brito Cuiabá, MT 25/08/2002 Eucerini Thygater sp. Maria Cristina Arias São Roque, SP 29/05/2001 Euglossini Eufriesea sp. Marilda Cortopassi-Laurino e Márcia F. Ribeiro Mogi das Cruzes, SP 27/11/2001 Meliponini Melipona bicolor * * * Tapinotaspidini Lanthanomelissa sp. Isabel Alves dos Santos Içara, SC 20/10/2004 Tetrapediini Coelioxoides sp. Isabel Alves dos Santos São Paulo, SP 17/03/2001 Tetrapedia sp. Christiana Klingenberg Boracéia, SP 09/02/2003 Xylocopinae Xylocopini Xylocopa sp. Flávio de Oliveira Francisco São Paulo, SP 10/10/2001 Halictidae Halictinae Augochlorini Augochlora sp. Favízia Freitas de Oliveira São Paulo, SP 27/05/2004 Neocorynura sp. Daniela Silvestre São Paulo, SP 27/05/2004 Megachilidae Megachilinae Anthidiini Dianthidium sp. Daniela Silvestre São Paulo, SP 27/05/2004

34

No decorrer do projeto, foram amostradas outras espécies da tribo Meliponini

de diversas regiões de sua área de distribuição para verificar a possibilidade de

generalização dos resultados obtidos com Melipona bicolor. Assim, foram coletadas

mais espécies de meliponíneos brasileiros, principalmente de gêneros considerados

distantes de Melipona, antes considerados outra tribo (Trigonini). Além disso, foram

obtidos exemplares de um meliponíneo proveniente da Índia e de duas espécies da

Tailândia. Espécies australianas foram analisadas pelo Dr. Mark Dowton, da

Wollongong University, colaborador dessa parte do projeto. A Tabela III apresenta as

espécies analisadas e suas regiões de origem dentro da região neotropical.

Tabela III - Espécies de Meliponini coletadas.

Espécie Origem do ninho Coletor Data Lestrimellita limao São Sebastião, SP, Brasil Rute Magalhães Brito 14/03/01 Plebeia remota Prudentópolis, PR, Brasil Flávio de Oliveira Francisco 31/03/98 Scaptotrigona xantotricha Viçosa, MG, Brasil Patrícia Drummond 28/09/99 Schwarziana quadripunctata Cunha, SP, Brasil Maria Cristina Arias 12/07/99 Tetragonisca angustula Sinop, MT, Brasil Rute Magalhães Brito 23/06/01 Heterotrigona iridipennis Índia Meiyappan Muthuraman 01/09/04 Austroplebeia australis Austrália Patrícia Drummond Austroplebeia symei Austrália Patrícia Drummond Tailândia sp1. Tailândia Tailândia sp2. Tailândia Trigona carbonaria Austrália Patrícia Drummond Trigona hockingsi Austrália Patrícia Drummond

3.2. Metodologia

3.2.1. Coleta por ninhos-armadilha

Foram instalados ninhos-armadilha para a coleta das tribos solitárias. Para

aumentar as chances de obter abelhas de diferentes ambientes, foram colocados

conjuntos de armadilhas em diversas cidades do estado de São Paulo: São Paulo

(Jardim do Departamento de Botânica do IBUSP), São Roque, Jaguariúna, Suzano e

35

São Pedro. Cada um desses pontos de coleta recebeu um conjunto de ninhos-

armadilha, de dois tipos:

Ninhos de madeira: pequenas caixas de madeira com orifícios de diferentes

tamanhos, que são fechadas com fita crepe e podem ser abertas longitudinalmente

(Figura 3). Os ninhos foram emprestados pelo Prof. Dr. Carlos Brandão, do Museu de

Zoologia da USP. Foram pendurados em maços, cada um com diversos tamanhos de

orifícios (profundidade x diâmetro, em cm): 16 x 1,2; 16 x 1,0; 16 x 0,8; 16 x 0,4; e 8

x 0,2. Essa variedade é importante para tentar atrair o maior número de espécies

possível.

Ninhos de cartolina em tronco: tubos confeccionados com cartolina preta,

medindo 8 x 0,5 cm (profundidade x diâmetro). Foram coletados troncos de árvores

velhos na Composteira da USP, cada tronco foi perfurado com furadeira elétrica em

cerca de 12 pontos de sua lateral, e os canudos de cartolina foram inseridos nesses

furos (Figura 4).

As armadilhas foram deixadas nos locais por períodos longos, maiores do que

um ano, para abranger todas as possíveis épocas de nidificação. Contudo, eram

verificadas mensalmente em busca de amostras. Quando um dos orifícios se

encontrava fechado por algum material (cera, argila, terra etc.), o tubo (de madeira ou

cartolina) era trazido para o laboratório e aguardava-se o surgimento dos adultos para

identificação e posterior congelamento do espécime. Para tanto, foram montadas

incubadoras, com segmentos de 20 cm de mangueira de plástico (5 cm de diâmetro),

cujas extremidades foram fechadas com tela de arame (malha de 2 mm) amarrada

com barbante (Figura 5). As armadilhas foram mantidas dentro dessas incubadoras,

em local iluminado e à temperatura ambiente, e vistoriadas diariamente.

36

(A)2 cm2 cm

(B)

Figura 3 - Ninhos-armadilha de madeira. Em (A) a armadilha está aberta, com a seta mostrando um resto de cera de uma nidificação. Em (B), pode-se observar um maço de armadilhas de diversos tamanhos, tais como foram colocadas nos locais de coleta.

(A)2 cm

2 cm2 cm

2 cm

(B)

Figura 4 - Tronco-armadilha, com tubos de cartolina. Em (A), um tronco com diversos tubos encaixados e um tubo (indicado pela seta) em detalhe. Em (B), um tronco e um maço de ninhos de madeira.

(A)

2 cm2 cm

(B)

Figura 5 - Incubadoras para ninhos-armadilha. Em (A), uma incubadora aberta, durante a colocação de um ninho-armadilha. Em (B), a incubadora já fechada com tela de arame e barbante, aguardando a emersão dos adultos.

37

3.2.2. Extração de DNA

Foram adotados dois métodos de extração de DNA, conforme a

disponibilidade de indivíduos de cada espécie. Para espécies com mais de um

indivíduo coletado, o método escolhido foi o descrito por Sheppard e McPheron

(1991). Esse método, em estudos prévios com diversas espécies de abelhas, se

mostrou o mais eficiente em termos de rendimento de ácidos nucléicos por tórax

macerado e qualidade do DNA obtido, e nos forneceu resultados positivos em reações

de PCR e RFLP (Francisco et al., 2001). Não foi possível preservar os espécimes

após a extração, visto que esta foi feita a partir do tórax do indivíduo, mas os

abdomens e cabeças foram guardados a -80°C para o caso de necessitarmos de mais

DNA do mesmo indivíduo na finalização das análises.

No caso das espécies com apenas um indivíduo coletado, foi realizada uma

extração através do método Chelex (Walsh et al., 1991), a partir de uma perna de um

indivíduo. Apesar do DNA resultante ser menos purificado e concentrado, o método

foi escolhido porque rende um volume final maior, pois essas abelhas foram coletadas

na natureza e não haveria mais indivíduos disponíveis para realizar outras extrações.

3.2.3. Polymerase chain reaction (PCR)

Para amplificar diversas regiões do DNAmt, foram testados primers derivados

de Apis mellifera, Melipona bicolor e outros considerados universais para o genoma

mitocondrial dos insetos (Hall e Smith, 1991; Simon et al., 1994; Arias et al., 1998,

Castro et al., 2002). Para cada espécie estudada, procurou-se amplificar quatro

fragmentos de genes mitocondriais: subunidade maior do RNA ribossômico (16S),

38

citocromo B (cytB), citocromo c oxidase subunidade I (COI) e NADH desidrogenase

subunidade 2 (ND2). Todos esses genes já foram utilizados com sucesso em diversos

trabalhos com insetos, sendo que os dois primeiros genes apresentam seqüência mais

conservada e o último é mais variável (Simon et al., 1994). Os genes escolhidos serão

testados individualmente, pois é necessário se determinar qual deles apresenta um

grau de variação adequado para resolver as relações dentro da subfamília.

Além disso, foram feitas amplificações de regiões entre os genes maiores

(codificadores de proteínas e RNAr), procurando determinar a ordem dos genes de

RNAt nos genomas. Esse tipo de amplificação é um pouco mais difícil, já que é

necessário, em muitos casos, combinar primers derivados de organismos diferentes

para se chegar a uma combinação eficaz para amplificar essas regiões variáveis.

Roehrdanz et al. (2002) afirma que, em insetos, é impossível prever se um par de

primers funciona de uma espécie para outra, o que leva a um enorme número de

testes. Todos os primers que geraram amplificação em pelo menos uma das espécies

testadas estão na Tabela IV.

39

Tabela IV - Primers utilizados para a amplificação de regiões do genoma mitocondrial das abelhas estudadas.

Primer Seqüência Referência 16SF CACCTGTTTATCAAAAACATGTCC Hall e Smith, 1991 16SR CGTCGATTTGAACTCAAATCATG Hall e Smith, 1991 5612R GAAATTAATATAACATGACCACC Arias et al., 1998 8321R TTATATATCTAATTCTAT (desenhado no laboratório) AMB 01 TGATAAAAGAAATATTTTGA Arias et al., 1998 AMB 03 TTTAAAAACTATTAATCTTC Arias et al., 1998 AMB 04 GAAAGTTAGATTTACTCC Arias et al., 1998 ATP8 CTTATAGGTACTATTTGWGG Castro et al., 2002 COX2 ATTGGACATCAATGATATTGA Castro et al., 2002 Mel 2 TGGAAAAATAATAATTG (desenhado no laboratório) mtD 07 GGATCACCTGATATAGCATTCCC Simon et al., 1994 mtD 08 CAACATTTATTTTGATTTTTTGG Simon et al., 1994 mtD 09 CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC Simon et al., 1994 mtD 10 TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT Simon et al., 1994 mtD 12 TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA Simon et al., 1994 mtD 19 GAAATTTGTGGAGCAAATCATAG Simon et al., 1994 mtD 22 TCAACAAAGTGTCAGTATCA Simon et al., 1994 mtD 26 TATGTACTACCATGAGGACAAATATC Simon et al., 1994 mtD29 GGTCCCTTAGGAATTTGAATATATCCT Simon et al., 1994 NAD3 ATNTTTTTAATTTTTGAYGT Castro et al., 2002 NAD5a GYTGGNTWTTATTCWAARGA Castro et al., 2002 ND4F ATAAATTATGAACTTGGTCATCA (desenhado no laboratório) Seq 07 GGAATAAGTCGTAACATAG (desenhado no laboratório) Seq 13 CCCTGATACAAAAGGTAC (desenhado no laboratório) Seq 18 GAACTATCAATTTGATATTG (desenhado no laboratório) Seq 19 TGGGATTGAATCCATATTC (desenhado no laboratório) Seq 21 CTATTAAAACAATTGGTCATC (desenhado no laboratório) Seq 30 TCGAGTTCCATTTGATTT (desenhado no laboratório) Seq 32 AATGCAGTTGCTATTGATA (desenhado no laboratório) Seq 33 TTTTGATGGACCCAAATTC (desenhado no laboratório) Seq 34 TCTACATTAAGACAATTAGG (desenhado no laboratório) Seq 48 ATTACATTTAATTTCCAA (desenhado no laboratório) Seq 50 TAGAATATTAATAATTTGAAA (desenhado no laboratório) Seq 51 AATCCTCCAATTAAAAATGG (desenhado no laboratório) Seq 52 ATTGGACATCAATGATATTG (desenhado no laboratório) Seq 53 CTTATAGGTACTATTTGWG (desenhado no laboratório) Seq 56 TATGTACTACCATGAGGACAAATAT (desenhado no laboratório) Seq 57 GTAGCATTTTTAACTTTATTAGAAC (desenhado no laboratório) Seq 58 TTGAGGAGCAACAGTTATTAC (desenhado no laboratório) Seq 59 AAATATCATTCAGGTTTAATRTG (desenhado no laboratório) Seq 60 GAAATATTTTGATAAAATATT (desenhado no laboratório) Seq 61 GGTTCATACCCTGTCGATAAAT (desenhado no laboratório) Seq 63 TGCATGACTAGTAACAATTG (desenhado no laboratório) Seq 65 ATAGGTACTATTTGWGGAAT (desenhado no laboratório) Seq 66 TAATTTTTGAYGTTGAAATT (desenhado no laboratório) TpheF GCGTAATATTGAAAATATTAATGA (desenhado no laboratório)

Para as reações de PCR foram utilizados 1 µl do DNA extraído por um dos

métodos acima; 5 µl de tampão de PCR; 1,5 µl de MgCl2 100mM; 1,5 µl de cada

primer 20 µM; 5 µl de dNTPs 2 mM cada e 2,5 U de Taq DNA polimerase

40

(Invitrogen), em um volume final de 50 µl. As condições de amplificação

inicialmente utilizadas foram: desnaturação inicial por 5 min. a 94°C, seguida por 35

ciclos (desnaturação a 94°C/1 min.; anelamento a 42°C/1min. e 20 seg. e elongação a

64°C/2 min) e de um passo extra de extensão a 64°C por 10 min.

Os produtos amplificados foram analisados eletroforeticamente em gel de

agarose 0,8%, corado com brometo de etídeo e os fragmentos visualizados através de

luz ultravioleta (UV). Nos casos em que a amplificação não ocorreu, foram realizadas

tentativas posteriores, aumentando a concentração de MgCl2 em até 10% ou

diminuindo a temperatura de anelamento em até 4°C, a fim de diminuir a estringência

das condições e aumentar a chance de amplificação. Nos casos de amplificação com

baixo rendimento, uma estratégia utilizada foi a adição de Betaína (USB), à

concentração final de 1M (Hengen, 1997). Por outro lado, se a amplificação dava

origem a bandas extras, a banda correta foi excisada do gel e purificada com o

Purelink Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) conforme instruções do fabricante,

para poder ser submetida à clonagem sem problemas.

3.2.4. Clonagem dos produtos de PCR

Os fragmentos resultantes da reação de PCR foram ligados em plasmídeos

específicos para essa finalidade, utilizando o kit pGEM-T Easy (Promega) ou o T.A.

Cloning Kit (Invitrogen), conforme as instruções dos fabricantes.

Células competentes de Escherichia coli foram preparadas de acordo com o

método descrito por Sambrook et al. (1989) e transformadas com os plasmídeos

recombinantes de acordo com o seguinte protocolo: 100 µl de células foram

incubados com 2 µl de plasmídeo recombinante por 15 minutos no gelo, em seguida a

41

37°C por 5 minutos e por mais 15 minutos no gelo. À temperatura ambiente, 250 µl

de meio LB foram acrescentados, seguindo-se uma incubação a 37°C sob agitação

por uma hora. As células transformadas foram plaqueadas em meio LB-ágar com

ampicilina e X-Gal e incubadas pela noite a 37°C. Colônias brancas (contendo

plasmídeos recombinantes) foram inoculadas em meio LB e incubadas pela noite a

37°C.

Os plasmídeos recombinantes foram extraídos pelo método para miniprep

descrito no manual “Automated DNA Sequencing Chemistry Guide” da Perkin Elmer

Corporation, o qual pode ser encontrado no site da empresa

(http://www.appliedbiosystems.com). Para verificar se realmente continha o inserto

de tamanho esperado, uma alíquota de 10% de cada miniprep foi digerida com 5U de

Eco RI. Esta enzima possui dois sítios de restrição que flanqueiam o inserto, de modo

que, quando ocorre a digestão, este é isolado do plasmídeo. Ao final de uma hora, as

digestões foram interrompidas e submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8%.

Os géis foram corados com brometo de etídeo e os fragmentos visualizados através de

luz UV. Os clones foram considerados positivos quando o inserto excisado do

plasmídeo apresentou um tamanho compatível com o produto de PCR

correspondente.

3.2.5. Seqüenciamento automático

Os clones positivos foram seqüenciados utilizando-se o kit para

seqüenciamento automático “Big Dye Terminator” (Applied Biosystems), seguindo o

protocolo do fabricante. As amostras foram analisadas em seqüenciadores

automáticos modelo ABI-PRISMA 310 (Applied Biosystems), do Departamento de

42

Biologia do IB-USP ou modelo ABI-PRISMA 3100 (Applied Biosystems), do

Departamento de Botânica do IB-USP. No período de manutenção desses aparelhos,

foram utilizados os serviços de seqüenciamento da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia – USP, também em um ABI-PRISMA 3100 (Applied

Biosystems). Primers complementares a regiões do plasmídeo (M13forward:

GTTTTCCCAGTCACGAC e M13reverse: CAGGAAACAGCTATGAC), foram

utilizados nas reações de cycle sequencing.

Para cada região, foram seqüenciadas e alinhadas as duas fitas de DNA de no

mínimo dois clones, para garantir a exatidão da seqüência final.

3.2.6. Análises comparativas/filogenéticas

Dois tipos de análise molecular foram realizados neste projeto: comparação de

seqüências parciais de genes mitocondriais e da ordem gênica mitocondrial.

As seqüências nucleotídicas parciais de genes mitocondriais foram alinhadas

entre as espécies utilizando o algoritmo CLUSTALW dentro do programa DAMBE

(Xia, 2000), com os parâmetros sugeridos por Schneider (2003). Apenas para a

apresentação dos resultados, por motivos estéticos, os alinhamentos foram importados

para o software BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, 1999).

As relações filogenéticas foram inferidas através do programa MEGA (Kumar

et al., 2001). Foram empregados quatro métodos para construção das árvores

disponíveis no programa, sendo três baseados em distância (Neighbor-Joining,

UPGMA e Evolução Mínima) e um baseado em homologia (Máxima Parcimônia).

Para todos os métodos, foi realizado o teste de bootstrap com 1000 replicações para

que cada nó interno recebesse um número, que representa sua confiabilidade.

43

Para a busca e análise dos genes para RNA transportadores, foi utilizado

tRNA-Scan, um sistema que pode ser utilizado diretamente na Internet

(http://www.genetics.wustl.edu/eddy/tRNAscan-SE; Lowe e Eddy, 1997), além da

busca manual por alinhamento ente seqüências.

44

4. Resultados e Discussão I:

Seqüenciamento parcial de genes mitocondriais

Os resultados serão apresentados por gene analisado. As árvores foram

comparadas quanto à topologia, sendo apresentadas nesta tese a árvore de consenso

baseada em parcimônia e apenas uma das três árvores baseadas em distância, já que

todas elas apresentaram topologias iguais. Assim, escolhemos Neighbor-Joining para

a apresentação dos resultados, por ser a mais utilizada e a menos criticada na

literatura consultada. Esse é um método baseado diretamente nos caracteres. Já pelo

método de Máxima Parcimônia, é considerada a árvore mais provável aquela que

requer o menor número de mudanças para explicar toda a variação da matriz de

caracteres. É, portanto, baseado na homologia: se dois táxons compartilham o mesmo

estado de caráter, assume-se que herdaram do ancestral comum (Schneider, 2003).

4.1. Subunidade maior do RNA ribossômico (16S)

Foram obtidas seqüências para 12 espécies, além das seqüências já publicadas

de A. mellifera e M. bicolor. A Figura 6 representa o alinhamento entre as 14

seqüências parciais do gene 16S, totalizando 547 sítios alinhados a partir da posição

13415 do genoma de A. mellifera. A Tabela V apresenta o número de diferenças e as

distâncias genéticas simples calculadas com base no alinhamento.

45

Figura 6 -Alinhamento das seqüências parciais do gene 16S obtidas para 13 espécies, utilizando-se o programa CLUSTALW. Os nomes das espécies estão na coluna da esquerda. Os pontos representam posições em que as bases são idênticas às da primeira espécie, A. mellifera.

(continua na próx. página)

46

Figura 6 (cont.)

47

Tabela V - Número absoluto de diferenças de bases entre as seqüências do gene 16S das 14 espécies analisadas (abaixo da diagonal) e distâncias genéticas simples calculadas com base nessas diferenças (acima da diagonal). [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [1] Apis mellifera 0,20

8 0,167

0,232

0,149

0,188

0,143

0,171

0,171

0,165

0,180

0,232

0,199

0,186

[2] Augochlora sp. 96 0,206

0,247

0,216

0,221

0,232

0,210

0,219

0,210

0,214

0,160

0,210

0,234

[3] Bombus morio 77 95 0,203

0,143

0,165

0,128

0,145

0,123

0,117

0,169

0,221

0,175

0,167

[4] Centris sp. 107

114 94 0,203

0,184

0,216

0,197

0,203

0,197

0,219

0,260

0,186

0,201

[5] Coelioxoides sp. 69 100 66 94 0,199

0,136

0,156

0,169

0,162

0,165

0,208

0,182

0,177

[6] Centris tarsata 87 102 76 85 92 0,162

0,154

0,165

0,156

0,195

0,210

0,201

0,188

[7] Eufriesea sp. 66 107 59 100 63 75 0,145

0,160

0,154

0,158

0,201

0,160

0,156

[8] Lanthanomelissa sp. 79 97 67 91 72 71 67 0,158

0,152

0,173

0,199

0,141

0,154

[9] Melipona bicolor 79 101 57 94 78 76 74 73 0,013

0,165

0,232

0,173

0,167

[10] Melitoma segmentaria

76 97 54 91 75 72 71 70 6 0,158

0,223

0,171

0,162

[11] Mesocheira sp. 83 99 78 101 76 90 73 80 76 73 0,236

0,184

0,169

[12] Neocorynura sp. 107

74 102 120 96 97 93 92 107 103 109 0,206

0,219

[13] Tetrapedia sp. 92 97 81 86 84 93 74 65 80 79 85 95 0,152

[14] Thygater sp. 86 108 77 93 82 87 72 71 77 75 78 101 70

Figura 6 (cont.)

48

A Figura 7 apresenta a árvore de consenso (acima de 50%) de três árvores

mais parcimoniosas, utilizando a Máxima Parcimônia e a Figura 8 representa a árvore

obtida pelo método de Neighbor-Joining (NJ).

Figura 7 - Árvore de consenso (acima de 50%) entre duas árvores mais parcimoniosas, obtidas pelo método de Máxima Parcimônia, a partir de 547pb do gene 16S das 14 espécies, com 1000 replicações de bootstrap (o número de cada nó significa a porcentagem de bootstrap obtida). Os triângulos destacam as espécies de “Apidae corbiculadas”, os demais símbolos foram utilizados para representar espécies de mesma tribo e as chaves à direita separam as famílias estudadas.

Halictidae

Apidae

Apidae

Halictidae

49

Figura 8 -Árvore obtida pelo método de Neighbor-Joining, a partir de 547pb do gene 16S das 14 espécies, com 1000 replicações de bootstrap (o número de cada nó significa a porcentagem de bootstrap obtida). Os triângulos destacam as espécies de “Apidae corbiculadas”, os demais símbolos foram utilizados para representar espécies de mesma tribo e as chaves à direita separam as famílias estudadas.

Há diferenças na topologia das duas árvores, nas posições de Tetrapedia sp.,

Thygater sp. e Lanthanomelissa sp. As duas espécies de Centris estão corretamente

agrupadas em ambas. No entanto, nenhuma delas reúne as espécies de Tetrapediini

(Coelioxoides sp. e Tetrapedia sp.).

Os dados de 16S não reúnem as “Apidae corbiculadas”, o que é incompatível

com todas as fortes evidências de que o grupo é monofilético (Michener, 2000). As

árvores não resolvem as relações entre as tribos, por conterem as incompatibilidades

citadas no parágrafo acima.

O gene 16S foi utilizado por outros autores para tentar resolver as relações

entre as “Apidae corbiculadas” (Cameron, 1993; revisão dos dados em Cameron e

Mardulyn, 2001). A árvore resultante dos trabalhos citados acima tem sua topologia

apresentada na Figura 9.

Figura 9 – Única árvore mais parcimoniosa obtida a partir de 16S, retirada de Cameron e Mardulyn (2001). Os valores acima dos nós são os de bootstrap.

Para comparação direta com o trabalho de Cameron e Mardulyn (2001),

inferiu-se então uma árvore filogenética utilizando apenas os dados referentes às

“Apidae corbiculadas” e algumas espécies como outgroup (Figura 10). Para essa

finalidade, foram escolhidas Centris sp. por fazer parte da tribo Centridini, que é

50

considerada a mais aparentada com as corbiculadas por Michener (2000), e duas

espécies de Halictidae (Augochlora sp. e Neocorynura sp.), por serem bastante

distantes.

Figura 10 – Árvore obtida pelo método de Neighbor-Joining, a partir de 547pb do gene 16S das espécies de “Apidae corbiculadas” e três outgroups.

Essa árvore reúne Bombini e Meliponini como grupos-irmãos, assim como

Apini e Euglossini, repetindo a topologia do trabalho de Cameron e Mardulyn (2001).

Fica claro que o acréscimo de mais espécies de Apinae trazido por este trabalho não

ajudou a inferir a filogenia do grupo, além de demonstrar que o marcador não oferece

resolução dentro da subfamília. Isso pode ser causado por problemas no alinhamento

das seqüências, pois os genes não-codificadores para proteínas sempre apresentam

esse tipo de dificuldade.

A variação nas árvores obtidas a partir do mesmo gene parece ser indicativa

da baixa resolução desse gene para separar o grupo em questão. Além disso, a árvore

que inclui apenas as corbiculadas perde sua confiabilidade ao observarmos que o

grupo torna-se parafilético quando a análise inclui as outras espécies de Apinae.

51

Provavelmente, dados mais consistentes gerariam resultados mais semelhantes, não

dependendo tanto da análise escolhida ou dos grupos acrescentados.

4.2. Citocromo c oxidase subunidade I

Foram seqüenciados e alinhados 439pb a partir da posição 2072 do genoma

mitocondrial de A. mellifera, para 14 espécies, além das seqüências de A. mellifera e

M. bicolor. A Erro! A origem da referência não foi encontrada. representa o

alinhamento entre as dezesseis seqüências parciais da citocromo c oxidase

subunidade I. A Tabela VI apresenta o número de diferenças e as distâncias genéticas

simples calculadas com base no alinhamento.

52

Figura 11 - Alinhamento das seqüências parciais do gene COI obtidas para 16 espécies, utilizando-se o programa CLUSTALW. Os nomes das espécies estão na coluna da esquerda. Os pontos representam posições em que as bases são idênticas às da primeira espécie, A. mellifera.

(continua na próx. página)

53

Figura 11 (cont.)

54

Tabela VI - Número absoluto de diferenças de bases entre as seqüências do gene COI das 16 espécies analisadas (abaixo da diagonal) e distâncias genéticas simples calculadas com base nessas diferenças (acima da diagonal). [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [1] Apis mellifera 0,305 0,151 0,179 0,194 0,191 0,179 0,202 0,171 0,134 0,177 0,154 0,248 0,191 0,182 0,174 [2] Augochlora sp. 107 0,328 0,293 0,319 0,305 0,288 0,328 0,293 0,291 0,293 0,288 0,182 0,293 0,316 0,288 [3] Bombus morio 53 115 0,188 0,194 0,191 0,208 0,194 0,148 0,120 0,202 0,137 0,271 0,197 0,197 0,160 [4] Centris sp. 63 103 66 0,134 0,179 0,211 0,199 0,145 0,182 0,185 0,165 0,259 0,199 0,151 0,177 [5] Centris tarsata 68 112 68 47 0,174 0,234 0,197 0,171 0,194 0,214 0,168 0,282 0,225 0,188 0,191 [6] Coelioxoides sp. 67 107 67 63 61 0,225 0,165 0,157 0,168 0,191 0,134 0,265 0,205 0,137 0,168 [7] Dianthidium sp. 63 101 73 74 82 79 0,222 0,222 0,208 0,197 0,208 0,239 0,222 0,211 0,211 [8] Eufriesea sp. 71 115 68 70 69 58 78 0,174 0,188 0,199 0,165 0,276 0,219 0,185 0,185 [9] Lanthanomelissa sp. 60 103 52 51 60 55 78 61 0,168 0,171 0,137 0,245 0,188 0,148 0,154 [10] Melipona bicolor 47 102 42 64 68 59 73 66 59 0,182 0,154 0,254 0,211 0,165 0,162 [11] Melitoma segmentaria 62 103 71 65 75 67 69 70 60 64 0,154 0,256 0,211 0,194 0,191 [12] Mesocheira sp. 54 101 48 58 59 47 73 58 48 54 54 0,245 0,171 0,145 0,123 [13] Neocorynura sp. 87 64 95 91 99 93 84 97 86 89 90 86 0,242 0,279 0,242 [14] Tetrapedia sp. 67 103 69 70 79 72 78 77 66 74 74 60 85 0,197 0,199 [15] Thygater sp. 64 111 69 53 66 48 74 65 52 58 68 51 98 69 0,174 [16] Xylocopa sp. 61 101 56 62 67 59 74 65 54 57 67 43 85 70 61

A Figura 12 apresenta a árvore de consenso (acima de 50%) de dez árvores

mais parcimoniosas, utilizando a Máxima Parcimônia. A árvore obtida por Neighbor-

Joining apresentou a mesma topologia e valores de bootstrap.

Figura 11(cont.)

55

Figura 12 - Árvore de consenso (acima de 50%) entre quatro árvores mais parcimoniosas, obtidas pelo método de Máxima Parcimônia, a partir de 439pb do gene COI das 16 espécies (dos quais 173 eram informativos para o método), com 1000 replicações de bootstrap (o número de cada nó significa a porcentagem de bootstrap obtida). Os triângulos destacam as espécies de “Apidae corbiculadas”, os demais símbolos foram utilizados para representar espécies de mesma tribo e as chaves à direita separam as famílias estudadas.

Há ramos bastante incompatíveis com a visão tradicional da filogenia das

abelhas. Por exemplo, a árvore separa a tribo Euglossini das demais “Apidae

corbiculadas” (Apini, Bombini e Meliponini), sendo que o grupo é bastante coeso

morfologicamente por compartilhar um caráter importante, a corbícula (escopa

modificada). Além disso, as duas espécies de Tetrapediini (Coelioxoides sp. e

Tetrapedia sp.) estão muito distantes, ao contrário do esperado, e formam um grupo

parafilético.

Os dados de COI, por outro lado, agruparam corretamente e com altos valores

de bootstrap as espécies de Centridini (Centris sp. e Centris tarsata) e as espécies da

família Halictidae, tribo Augochlorini (Augochlora sp. e Neocorynura sp.), separando

estas últimas de Megachilidae (Dianthidium sp.) e de Apidae (as demais). Além

Apidae

Halictidae

Megachilidae

56

disso, sugerem uma relação forte entre Bombini (Bombus morio) e Meliponini

(Melipona bicolor), em detrimento à união dos ramos Apini e Meliponini que aparece

nos trabalhos de morfologia. O fato de Apini não compartilhar um ancestral comum

exclusivo com Meliponini, tanto nesta árvore quanto em muitos trabalhos com dados

moleculares (Cameron, 1993; Koulianos et al., 1999; Schultz et al., 1999), parece

indicar uma origem dupla para a eussocialidade em Apinae.

Outra hipótese seria o surgimento da eussocialidade no ancestral comum a

Apini, Bombini e Meliponini com reversão para socialidade menos avançada em

Bombini. Se por um lado a maioria dos trabalhos sobre Apinae rejeitam essa

possibilidade como um evento complexo demais para sofrer reversão, por outro o

fenômeno da reversão da socialidade para comportamentos solitários já foi descrito

em diversas tribos de Halictidae (Wcislo e Danforth, 1997; Danforth, 2002). Nessa

família, existem até espécies com variação intraespecífica do comportamento social.

Com base nesse panorama, não há como concluir qual das duas hipóteses (dupla

origem ou origem única com reversão) teria ocorrido apenas com base em árvores

filogenéticas.

É possível observar que os valores de bootstrap são bastante baixos em

diversos nós da árvore. Se condensarmos todos os ramos abaixo de 50% de bootstrap,

obteremos a árvore da Figura 13.

57

Figura 13 - Árvore de consenso da Figura 12, condensada acima de 50% de bootstrap. Os triângulos destacam as espécies de “Apidae corbiculadas”, os demais símbolos foram utilizados para representar espécies de mesma tribo e as chaves à direita separam as famílias estudadas.

Essa árvore demonstra claramente que os dados reproduziram apenas as

relações entre alguns pares de espécies muito próximos (Augochlora

sp.+Neocorynura sp.; Bombus morio+Melipona bicolor; e Centris sp.+Centris

tarsata) e dividiu corretamente as famílias. Não há resolução para esclarecer

nenhuma outra relação na árvore, o que explica os “erros” nos demais agrupamentos.

Foi realizada uma tentativa de utilização das seqüências de aminoácidos de

COI, inferidas a partir da tradução das seqüências de DNA pelo código genético

mitocondrial dos insetos. O resultado do método de Máxima Parcimônia está na

Figura 14.

Hali

Megachi

lidae

Ap

idae

58

Figura 14 - Árvore de consenso a partir de sete árvores mais parcimoniosas obtidas a partir das seqüências de aminoácidos inferidos para o gene COI. Os triângulos destacam as espécies de “Apidae corbiculadas”, os demais símbolos foram utilizados para representar espécies da mesma tribo e as chaves à direita separam as famílias estudadas.

Os valores de bootstrap foram mais consistentes do que a árvore obtida com a

seqüência de nucleotídeos, as relações corretas permanecem, mas continua havendo

problemas em relações importantes como as das “Apidae corbiculadas”. O método,

portanto, não colabora para melhorar a resolução das árvores.

4.3. Citocromo B

Foram obtidas seqüências para 13 espécies, além das seqüências já publicadas de A. mellifera e M. bicolor. A Figura 15 representa o alinhamento entre as 15 seqüências parciais do gene cytB, totalizando 395pb alinhados a partir da posição 11427 do genoma de A. mellifera. A

apresenta o número de diferenças e as distâncias genéticas simples calculadas

com base no alinhamento.

Halictidae

Megachilidae

Apidae

59

Figura 15 - Alinhamento das seqüências parciais do gene cytB obtidas para 15 espécies, utilizando-se o programa CLUSTALW. Os nomes das espécies estão na coluna da esquerda. Os pontos representam posições em que as bases são idênticas às da primeira espécie, A. mellifera.

(continua na próx. página)

60

Figura 15 (cont.)

61

Tabela VII - Número absoluto de diferenças de bases entre as seqüências do gene cytB das 15 espécies analisadas (abaixo da diagonal) e distâncias genéticas simples calculadas com base nessas diferenças (acima da diagonal).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 [1] Apis mellifera 0,240 0,181 0,231 0,223 0,262 0,259 0,206 0,195 0,212 0,192 0,267 0,231 0,209 0,231 [2] Bombus morio 86 0,265 0,265 0,262 0,248 0,267 0,256 0,162 0,242 0,248 0,284 0,265 0,220 0,265 [3] Centris sp. 65 95 0,212 0,181 0,228 0,240 0,175 0,212 0,173 0,173 0,270 0,212 0,170 0,212 [4] Centris tarsata 83 95 76 0,234 0,234 0,262 0,217 0,240 0,198 0,226 0,245 0,000 0,195 0,000 [5] Coelioxoides sp. 80 94 65 84 0,251 0,253 0,184 0,226 0,198 0,159 0,273 0,234 0,164 0,234 [6] Dianthidium sp. 94 89 82 84 90 0,273 0,226 0,248 0,220 0,237 0,248 0,234 0,228 0,234 [7] Eufriesea sp. 93 96 86 94 91 98 0,248 0,214 0,242 0,253 0,320 0,262 0,228 0,262 [8] Lanthanomelissa sp. 74 92 63 78 66 81 89 0,226 0,170 0,189 0,273 0,217 0,159 0,217 [9] Melipona bicolor 70 58 76 86 81 89 77 81 0,214 0,203 0,262 0,240 0,181 0,240 [10] Melitoma segmentaria 76 87 62 71 71 79 87 61 77 0,167 0,276 0,198 0,162 0,198 [11] Mesocheira sp. 69 89 62 81 57 85 91 68 73 60 0,256 0,226 0,159 0,226 [12] Neocorynura sp. 96 102 97 88 98 89 115 98 94 99 92 0,245 0,284 0,245 [13] Tetrapedia sp. 83 95 76 0 84 84 94 78 86 71 81 88 0,195 0,000 [14] Thygater sp. 75 79 61 70 59 82 82 57 65 58 57 102 70 0,195 [15] Xylocopa sp. 83 95 76 0 84 84 94 78 86 71 81 88 0 70

A Figura 16 apresenta a árvore de consenso (acima de 50%) de seis árvores

mais parcimoniosas, utilizando a Máxima Parcimônia e a Figura 17 representa a

árvore obtida pelo método de Neighbor-Joining (NJ).

Figura 16 - Árvore de consenso (acima de 50%) entre cinco árvores mais parcimoniosas, obtidas pelo método de Máxima Parcimônia, a partir de 395pb do gene cytB das 15 espécies (dos quais 176 são informativos para o método), com 1000 replicações de bootstrap (o número de cada nó significa a porcentagem de bootstrap obtida). Os triângulos destacam as espécies de “Apidae corbiculadas”, os demais símbolos foram utilizados para representar espécies da mesma tribo e as chaves à direita separam as famílias estudadas.

Halictidae

Megachilidae

Apidae

62

Figura 17 - Árvore obtida pelo método de Neighbor-Joining, a partir de 368pb do gene cytB das 15 espécies, com 1000 replicações de bootstrap (o número de cada nó significa a porcentagem de bootstrap obtida). Os triângulos destacam as espécies de “Apidae corbiculadas”, os demais símbolos foram utilizados para representar espécies da mesma tribo e as chaves à direita separam as famílias estudadas.

As árvores obtidas também apresentam a incongruência das árvores de COI e

de 16S quanto às espécies da tribo Tetrapediini, que não são agrupadas. O grupo das

“Apidae corbiculadas” não é monofilético como seria o esperado. Assim como os

dados dos outros genes aqui analisados, estas árvores indicam para as hipóteses de

dupla origem da eussocialidade ou origem no ancestral e reversão, se considerarmos

que Bombini e Meliponini são grupos-irmãos com altíssimo valor de bootstrap.

No trabalho de Koulianos et al. (1999) foram realizadas análises filogenéticas

das “Apidae corbiculadas” com o gene cytB, gerando a árvore simplificada da Figura

18.

Halictidae Megachilidae

Apidae

63

Figura 18 - Árvore obtida a partir do gene cytB, tanto por máxima verossimilhança quanto por parcimônia. Retirada de Koulianos et al. (1991).

Neste caso, a topologia é similar à das árvores deste trabalho, agrupando

Meliponini com Bombini. A diferença entre elas se deve provavelmente à ausência de

outros grupos nas análises do trabalho de Koulianos et al.. Para uma comparação

direta, foi novamente inferida uma árvore somente com as corbiculadas e outgroups,

apresentada na Figura 19.

Figura 19 - Árvore obtida pelo método de Neighbor-Joining, a partir de 395pb do gene cytB das espécies de “Apidae corbiculadas” e um outgroup da família Halictidae.

O posicionamento relativo entre Eufriesea sp. e A. mellifera difere nas árvores

de Koulianos et al. (Figura 18) e na obtida neste trabalho (Figura 19). De qualquer

maneira, as hipóteses levantadas para explicar as árvores são necessariamente as

mesmas, indicando “origem dupla” ou “origem única + reversão” para a

eussocialidade no grupo.

64

4.4. “Evidência total”

Na literatura, encontram-se trabalhos nos quais a “evidência total” é sugerida

como o melhor conjunto de dados para inferência filogenética (Chavarría e Carpenter,

1994; Cameron e Mardulyn, 2001). Esse tipo de análise consiste em utilizar todos os

dados disponíveis em uma matriz única para tentar construir árvores com o máximo

de dados possível. Há controvérsias sobre quando os dados devem ser analisados

conjuntamente ou em separado (revisão em Huelsenbeck et al., 1996), principalmente

quando os conjuntos de dados têm taxas de evolução distintas. Kumazawa e Nishida

(1993) acreditam que combinar dados que não geraram boas árvores provavelmente

não fornecerá bons resultados, mas a técnica foi utilizada com sucesso em outros

trabalhos, como a filogenia de artrópodes de Black e Roehrdanz (1998).

Para avaliar o impacto da união dos caracteres sobre as árvores filogenéticas

das abelhas analisadas neste trabalho, os genes foram alinhados em separado e depois

colocados em tandem, como se fossem uma única seqüência. Essa seqüência, de

1415pb, foi obtida para as 13 espécies que tiveram os três fragmentos gênicos

seqüenciados. A Figura 20 apresenta a árvore de consenso entre as três árvores mais

parcimoniosas que resultou do método de Máxima Parcimônia e a Figura 21

representa a árvore obtida pelo método de Neighbor-Joining.

65

Figura 20 - Árvore de consenso entre as três mais parcimoniosas, obtida pelo método de Máxima Parcimônia, a partir dos dados conjuntos dos três fragmentos gênicos, com 1000 replicações de bootstrap (o número de cada nó significa a porcentagem de bootstrap obtida). Os triângulos destacam as espécies de “Apidae corbiculadas”, os demais símbolos foram utilizados para representar espécies da mesma tribo e as chaves à direita separam as famílias estudadas.

Figura 21 - Árvore obtida pelo método de Neighbor-Joining, a partir dos dados conjuntos dos três fragmentos gênicos, com 1000 replicações de bootstrap (o número de cada nó significa a porcentagem de bootstrap obtida). Os triângulos destacam as espécies de “Apidae corbiculadas”, os demais símbolos foram utilizados para representar espécies da mesma tribo e as chaves à direita separam as famílias estudadas.

Halictidae

Apidae

Apidae

Halictidae

66

As topologias são idênticas entre si, e refletem as mesmas incompatibilidades

das árvores obtidas pelos dados separados de cada gene, a respeito das Centridini e

Tetrapediini. As relações entre as “Apidae corbiculadas” são as mesmas das árvores

de cytB, ou seja, Meliponini agrupa fortemente com Bombini e não com Apini, o que

refuta a origem única da eussocialidade no grupo (exceto se houve reversão em

Euglossini e Bombini).

A maioria dos trabalhos de filogenia entre as tribos de abelhas inclui apenas

representantes das quatro tribos corbiculadas. Este trabalho procurou incluir

representantes de todas as tribos da subfamília. Não foi possível coletar espécimes de

algumas tribos (Isepeolini, Osirini, Protepeolini, Exomalopsini, Anthophorini e

Rhatymini), mas Michener (2000) afirma que as quatro primeiras tribos dessa lista

pertencem a uma linhagem muito distante das corbiculadas, chamada “eucerine line”,

em contraste com a “apine line”. Provavelmente a inclusão dessas tribos não

melhoraria a resolução das árvores, justamente pela grande distância genética entre

elas e as demais. Uma característica que pode ser observada na árvore é que as

espécies da antiga família Anthophoridae (as atuais tribos de Apinae que não são

corbiculadas) não formam um ramo monofilético dentro da subfamília. Portanto ,

apesar da pouca resolução das árvores, elas concordam com a idéia de Michener

(2000) que “Anthophoridae” não deve ser mantida com status de família separada, e

sim incluídas em um grupo mais amplo, no caso a subfamília Apinae.

Com a mesma estratégia utilizada para os genes 16S e cytB, foi inferida uma

árvore sem as tribos não-corbiculadas (Figura 22).

67

Figura 22 - Árvore obtida pelo método de Neighbor-Joining, a partir das seqüências dos três genes em conjunto das espécies de “Apidae corbiculadas” e dois outgroups da família Halictidae.

Novamente, Bombini e Meliponini são grupos-irmãos. A partir deste conjunto

de resultados e dos trabalhos existentes na literatura, as seqüências de DNA

geralmente indicam que o comportamento eussocial de Apini e Meliponini evoluiu

independentemente. Cameron e Mardulyn (2001) acreditam que essas análises seriam

mais precisas do que as análises morfológicas, visto que as características de

morfologia que são analisadas podem estar convergindo devido ao comportamento

comum aos dois grupos, levando assim a acreditar que Apini e Meliponini são

grupos-irmãos.

Porém, quando alguns autores procuram compilar dados morfológicos com

moleculares, dando a eles novos tratamentos e interpretações, as árvores filogenéticas

obtidas sempre concordam com as árvores originais dos trabalhos de morfologia.

Dois desses trabalhos (Chavarría e Carpenter, 1994; Schultz et al., 1999) afirmam que

os dados moleculares somente acrescentam ruído às análises conjuntas, portanto os

dados conclusivos seriam os morfológicos, já que a árvore de genes nem sempre

equivale à filogenia das espécies.

Lockhart e Cameron (2001) revisaram diversos desses trabalhos em busca dos

motivos que causam a incongruência entre morfologia e DNA. Um dos motivos

68

apontados pelos autores é o erro intrínseco de se utilizar a “evidência total”, pois os

caracteres não são equivalentes e é difícil atribuir pesos às suas contribuições. O caso

das abelhas é considerado um problema clássico dos estudos filogenéticos, em que os

ramos internos são muito curtos, altamente aparentados, e os externos são longos

(caso chamado de Zona de Felsenstein, ver revisão em Huelsenbeck et al, 1996). Isso

dificultaria a escolha e a utilização do grupo-externo, em qualquer tipo de trabalho de

sistemática do grupo.

A revisão de Lockhart e Cameron (2001) ainda aponta problemas tanto das

análises morfológicas (muita homoplasia e falta de um padrão temporal na evolução

dos caracteres, ao contrário dos estudos de DNA), quanto das análises moleculares

(heterogeneidade das substituições conforme a posição do sítio, problemas com

estrutura secundária e, no caso do DNA nuclear, recombinação entre as cromátides).

A solução apresentada é o aumento significativo dos dados morfológicos,

comportamentais e também mais seqüências de genes mitocondriais e nucleares,

inclusive de genomas completos.

4.5. Análises moleculares – conteúdo de A+T

Com os dados coletados, foi possível realizar análises moleculares dos trechos

de genes seqüenciados. Um aspecto que se mostrou atípico quando apenas os dados

de A. mellifera e M. bicolor eram disponíveis foi o elevado conteúdo de bases

adenina e timina. Essa proporção foi analisada para cada um dos genes, e o resultado

está na Figura 23.

69

������������������

����������������������������

���������������������

������������������������

���������������������

������������������������

���������������������

��������������������������������

���������������������

������������������������

���������������������

����������������������������

���������������60,0

70,0

80,0

90,0

Apis m

ellife

ra

Bombu

s mor

io

Centri

s sp

.

Centri

s ta

rsat

a

Coelio

xoide

s sp

.

Eufri

esea

sp.

Lant

hano

meliss

a sp

.

Melipo

na b

icolor

Melito

ma se

gmen

taria

Mesoc

heira

sp.

Tetra

pedia

sp.

Thyg

ater

sp.

Xyloco

pa s

p.

Augoc

hlora

sp.

Dianth

idium

sp.

Neoco

rynu

ra s

p.

16s

COI�������� cytB

Figura 23 - Porcentagem de bases adenina+timina (A+T) em cada seqüência parcial de gene de cada espécie analisada. O gene para 16S não foi seqüenciado para Xylocopa sp. e Dianthidium sp. e o gene cytB não foi seqüenciado para Melitoma segmentaria, Augochlora sp. e Dianthidium sp..

Todas as espécies apresentam altas taxas de bases A+T, acima de 60%.

Porém, observa-se que as espécies que não pertencem à família Apidae (Augochlora

sp., Dianthidium sp. e Neocorynura sp.) apresentam as menores taxas obtidas,

seguindo uma tendência a um viés menos pronunciado. Portanto, o uso preferencial

de bases A+T parece ter crescido dentro da família Apidae. Em longo prazo, esse viés

excessivo poderia ter efeitos até na composição do genoma mitocondrial: existem

trabalhos que indicam que, em uma escala de tempo geológico, os genes codificantes

para proteínas “fugiriam” para o núcleo se o ambiente do DNAmt fosse muito

enviesado para o uso de bases A+T, antes que as mutações os fizessem perder suas

funções (Howe et al., 2000).

Collins et al. (1994) realizaram um trabalho teórico sobre os chamados

“efeitos composicionais” na comparação de seqüência. Os efeitos composicionais são

divididos em “viés composicional” e “desvio do modelo estacionário”. O viés para a

70

excessiva utilização de bases A+T é um tipo de viés composicional comum em

insetos, e já foi citado como um fator influente em filogenias e em análises de taxas

de substituição e saturação de sítios (Collins et al., 1994; Foster et al., 1997). Essa

influência é ainda mais crítica se a taxa de substituição é alta, como é o caso

observado nas abelhas. Já o outro efeito composicional, o desvio do modelo

estacionário, seria a ocorrência de diferenças no viés entre os táxons estudados. Esse

não parece ser um problema no caso das abelhas, pois todas as espécies estudadas

apresentam o viés acentuado para A+T, apesar das pequenas diferenças entre Apidae

e as demais famílias.

Mesmo utilizando as seqüências de aminoácidos para inferir as filogenias,

elas são influenciadas pelo viés para A+T, conforme verificado em Foster et al.

(1997). Ainda que estejamos comparando grupos muito diferentes e incluindo todos

os genes codificadores para proteínas, como no trabalho de Black e Roehrdanz

(1998), há problemas. Nesse trabalho, foram analisados os genomas dos artrópodes

disponíveis à época, e Apis mellifera fica fora do ramo dos insetos, agrupando-se com

os carrapatos. A causa apontada é justamente o viés para o uso de códons ricos em

A+T, comum aos carrapatos e às abelhas (Dowton e Austin, 1995). O viés

composicional leva a um viés dos códons, que leva a um viés dos aminoácidos e, no

caso, à convergência entre grupos. Provavelmente, as árvores obtidas nesta tese

apresentaram seus problemas justamente por esse altíssimo viés.

Apis mellifera também não apresentou bons resultados no posicionamento de

Hymenoptera entre os insetos na comparação de seqüências de aminoácidos do

trabalho de Flook et al. (1995), quando se posicionou fora do grupo dos

Holometabola, que é considerado bastante consistente. Posteriormente, imaginou-se

que um himenóptero mais basal provavelmente teria mais chance de representar a

71

ordem na árvore dos insetos e posicioná-la corretamente, pois A. mellifera é muito

divergente e apresenta um alto viés para A+T, assim como M. bicolor, cujo genoma

foi o segundo da ordem a ser seqüenciado. Foi seqüenciado, recentemente, o genoma

de Perga condei (Castro e Dowton, 2005), uma vespa menos derivada. O viés para o

uso de A+T também é muito alto, 78% da porção seqüenciada do genoma, que não

inclui a região controle (rica em A+T, portanto o valor deve aumentar com a

finalização dos dados). Apesar disso, a filogenia dos insetos incluindo P. condei

apresentou-se condizente com os grupos estabelecidos, o que mostra que realmente A.

mellifera e M. bicolor são muito divergentes e por isso geram dados incompatíveis.

72

5. Resultados e Discussão II:

Seqüenciamento de regiões mitocondriais com genes

para RNAt e ordem gênica

Neste tópico, serão apresentados os resultados do seqüenciamento das regiões

mitocondriais que contêm genes para RNAt. A ordem gênica mitocondrial é citada

por diversos autores como um marcador molecular promissor para estudos de

filogenia entre grupos distantes (Boore et al., 1995). Ainda não foram realizados

trabalhos nesse sentido com a subfamília Apinae, mas existem alguns estudos

promissores com ordens de insetos. O aumento do número de marcadores disponíveis

para tentar inferir a evolução desse grupo possivelmente ampliará as discussões sobre

as filogenias existentes, além de ampliar o conhecimento molecular sobre essas

espécies.

Tais resultados são mais difíceis de se obter do que o seqüenciamento parcial

de genes apresentado anteriormente, visto que há um número menor de primers

desenhados para a amplificação dessas regiões e que elas são mais variáveis do que

os genes em si.

Recentemente, em uma revisão sobre o assunto (Dowton et al., 2002), foi

sugerido que a utilização da ordem gênica como marcador seria uma análise

“morfológica” do genoma mitocondrial. Assim como as inovações morfológicas

complexas (como o holometabolismo), as chances de terem surgido mais de uma vez

independentemente seriam muito baixas. E as mudanças seriam mais raras do que no

DNA nuclear porque há poucas regiões não-codificadoras, assim a maioria das

quebras e rearranjos ocorreria dentro de genes e seria letal. A mesma revisão sugere

73

que linhagens com taxa acelerada de translocações de genes, como parece ser o caso

de Hymenoptera, seriam úteis para analisar os mecanismos que levam a esses

eventos.

5.1. Ordens gênicas mitocondriais

A Figura 24 representa os mapas genômicos simplificados das espécies em

estudo, sem a posição dos genes maiores (codificadores para proteínas e RNAr), pois

estes geralmente não variam de posição entre grupos próximos, mostrando portanto

apenas os agrupamentos (clusters) de genes para RNAt. Nem todos os agrupamentos

foram obtidos para todas as espécies, devido às dificuldades de amplificação com

primers heteroespecíficos já descritas em insetos (Roehrdanz et al., 2002). Foram

incluídas a ordem gênica de Drosophila, considerada igual à ordem ancestral dos

insetos, e também a ordem obtida para a vespa basal Perga condei (Castro e Dowton,

2005), idêntica à ancestral em toda a sua porção seqüenciada. Falta apenas o primeiro

agrupamento, vizinho à região controle, que não foi obtido.

74

Bombus

Centris

Thygater

Eufriesea

Coelioxoides

Tetrapedia

Xylocopa

D K G R E F H T P

S1

L1

VL2

L2 D K N E F

Y MW

W L2 D K V

L2 R N S

1

L2 D K E F V

C Y W D K V

Apis

Melipona

D K G R N F H T P L1 V

RL2W Y

Drosophila K D G S2 E F H T P L

1 VL2W C Y

L2C Y WE S

2 M Q A I

I A K M D G E FN H T P L1 VS

1

S1

I Q M A R N S1

S1

S1

Dianthidium

Augochlora

T P

S1

D K

D K

W?

?

?

?

D K

Mesocheira L2 D K VW

Neocorynura D K

Lanthanomelissa D K

T P

V

V

L1 V

A E F

N E F V

I Q E F

Y? E FN

L1

Melitoma

R

L2

C W L2 D K G V

L1

R E FN

ML2

V

NR

T P

I QM

R

Centris tarsata T F L1N ER

Perga K D G S2 E F H T P L

1 VL2W C Y A R N S

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

?

?

I K ?

Figura 24 – Esquematização sem escala dos agrupamentos de genes para RNAt das espécies estudadas. Drosophila foi colocada para fins de comparação, visto que sua ordem gênica é considerada ancestral para os insetos. Legenda: as letras são os códigos internacionais para os aminoácidos correspondentes aos RNAt. Amarelo: dados retirados da literatura; rosa: dados coletados durante o mestrado; azul e verde: dados coletados neste projeto de doutorado, sendo verdes os RNAt seqüenciados completamente (para os quais foram desenhadas as estruturas secundárias) e azuis, aqueles inferidos por similaridade de seqüências parciais. Os pontos de interrogação significam que o agrupamento não foi totalmente seqüenciado (geralmente por ter utilizado um primer interno ao cluster, portanto ainda não há como saber se existem mais genes para RNAt naquela posição).

75

O agrupamento com o menor número de resultados obtidos é o primeiro, que

em A. mellifera apresenta os genes E-S2-M-Q-A-I. Isso ocorre porque um de seus

flanqueadores é a região controle, extremamente variável, sendo portanto pouco

provável que primers possam ser utilizados em espécies diferentes daquela para a

qual foram desenhados. Porém, esse agrupamento é considerado um dos dois “hot

spots” de alterações na ordem gênica do DNAmt (Boore, 1999; Boore e Brown,

1998) , portanto foram realizadas muitas tentativas para seqüenciá-lo. A amplificação

não foi possível, provavelmente por alterações na seqüência ou no sentido desses

genes.

Apesar dos rearranjos serem considerados neutros por não afetarem o

funcionamento do genoma mitocondrial, os mecanismos que levam a eles terminam

criando os hot spots, por haver mais chance de ocorrerem próximo às origens de

replicação e transcrição do DNAmt. Por esse motivo, o agrupamento 6 (em A.

mellifera: R-N-F) é considerado outro “hot spot” do DNAmt dos insetos, já que uma

segunda origem de replicação foi detectada muito próxima a esse cluster,

possivelmente para a cadeia leve (Boore, 1999). O agrupamento foi completamente

seqüenciado para sete espécies, apresentando diversas ordens gênicas. Todas incluem

menos genes do que o agrupamento considerado ancestral. Apesar de não termos

dados sobre as novas localizações de alguns dos genes que saíram desse

agrupamento, podemos ver na Figura 25 uma hipótese de como essas novas ordens

gênicas teriam surgido durante a evolução do grupo.

76

Drosophila S2 E FA R N

Neocorynura A E FNR

Dianthidium N E FR

Melipona, Xylocopa, Thygater...

R E FN

Apis R FN Bombus R FE

ou

Drosophila S2 E FA R N

Neocorynura A E FNR

Dianthidium N E FR

Melipona, Xylocopa, Thygater...

R E FN

Apis R FN Bombus R FE

ou

Figura 25 – Ordens gênicas encontradas no cluster 6 de diversas abelhas. As setas diagonais indicam os genes que são translocados para originar a próxima ordem apresentada no desenho. A seta com ponta dupla indica uma inversão entre genes. No caso de Apis e Bombus, as duas ordens provavelmente vieram de um ancestral com a ordem acima, translocando alternativamente os genes N ou E para fora do agrupamento.

Com a ordem de Perga condei sendo idêntica à ancestral, é possível afirmar

que o alto grau de rearranjos dos outros Hymenoptera estudados é um fenômeno mais

recente do que o surgimento do grupo. Dowton e Campbell (2001), estudando o alto

número de rearranjos nas vespas parasitas, afirmaram que esse fenômeno seria devido

ao ataque sofrido por elas pelo sistema imune de seu hospedeiro, que aumentaria a

quantidade de radicais livres de oxigênio para tentar eliminar os ovos parasitas. Os

ovos sobreviventes teriam então sua taxa de mutações e rearranjos aumentados. A

explicação parece válida para o caso dos parasitas, mas não contribui para justificar o

77

alto grau de rearranjos nas abelhas. A sugestão dos mesmos autores seria identificar o

“limite” das linhagens que apresentam as altas taxas de rearranjos para poder levantar

hipóteses sobre as causas. Esta tese é um passo a mais na identificação desse limite

dentro de Hymenoptera, amostrando diversas espécies de abelhas de diferentes tribos

e famílias.

5.2. Desenho e análise das estruturas secundárias dos RNAt

Quando genomas mitocondriais apresentam diferenças marcantes entre

suas ordens gênicas, surge a dúvida se realmente houve translocação entre pontos

distantes do genoma, já que esse evento é mais raro do que a simples troca de posição

entre genes vizinhos (Boore e Brown, 1998; Dowton e Austin, 1999). Há a

possibilidade de que não tenha havido translocação, e sim a “transformação” de um

gene para RNAt em outro. Nesse caso, um gene para RNAt teria sofrido mutação

justamente nas bases que transcrevem o anticódon, alterando o aminoácido

transportado. Essa hipótese pode ser refutada quando as estruturas secundárias são

comparadas e apresentam grande similaridade nas demais regiões, além do anticódon.

Essa similaridade é geralmente interpretada como um forte indicativo de homologia

entre esses genes, confirmando que houve translocação.

Para analisar esse tipo de questão, as estruturas secundárias de 81

RNAt cujas seqüências foram obtidas integralmente foram desenhadas. Essas

estruturas farão parte do anexo desta tese, e serão incluídas as estruturas de Apis

mellifera e Melipona bicolor para comparação. A seguir, serão discutidos alguns

casos peculiares que surgiram desse tipo de análise estrutural dos RNAt.

78

5.2.1. RNAt-Ala (A)

Em relação às demais espécies, o gene para o RNAtAla ocupa uma

posição completamente diferente no genoma de Neocorynura sp., no agrupamento 6 e

não no 1. Apesar disso, é possível observar a grande similaridade das estruturas e

seqüências, principalmente nos braços do Aceptor e Anticódon, tradicionalmente

mais conservados (Clary e Wolstenholme, 1985). As diferenças se concentram no

braço TΨC e também nas alças, que são regiões sem emparelhamento de bases e

portanto sem conservação de estrutura nem de seqüência. A exceção é a alça do

anticódon, que, por sua função específica de emparelhamento com o RNA

mensageiro, tem as bases muito conservadas. A semelhança estrutural encontrada

indica que o gene sofreu translocação e não apenas mudança de anticódon.

Observando a ordem gênica de Drosophila, representada na figura 5 e considerada a

ordem ancestral dos insetos, podemos ver que o gene para o RNAtAla ocupa posição

equivalente à de Neocorynura, o que significaria uma mudança dentro de Apidae,

enquanto esta espécie da família Halictidae apresenta o posicionamento plesiomórfico

desse gene.

5.2.2. RNAt-Lys (K)

Uma característica importante que se observa nesse grupo de RNAt é a

variação do anticódon: onze espécies apresentam UUU e quatro, CUU. Dowton e

Austin (1999) afirmam que CUU deve ser o anticódon plesiomórfico para

Hymenoptera, mas em vespas também há vários casos de UUU, que surgiram

independentemente. Essa diferença deve se refletir no uso de códons pelos genes

codificantes para proteínas dessas espécies, pois a eficiência da tradução na

79

mitocôndria parece depender da relação entre o anticódon do RNAt e o códon mais

utilizado na codificação das proteínas.

O RNAtLys de Centris sp. ocupa uma posição diferente no genoma, no

agrupamento 6, enquanto em M. bicolor ele está no agrupamento 1 e, em todas as

outras abelhas, no agrupamento 4. A seqüência de bases dos braços do RNAtLys de

Centris sp. é completamente diferente das demais, tendo seqüências alteradas em

todos os braços, inclusive os que são teoricamente mais conservados. Somente o

anticódon é equivalente ao de Lys. Isso poderia ser explicado por duas hipóteses: um

erro de seqüência; ou uma mutação no anticódon de outro gene para RNAt, que gerou

um RNAtLys a partir de outro RNAt. Entre as duas hipóteses, a segunda é mais

provável, já que erros de seqüência foram evitados por meio do alinhamento de

leituras das duas fitas de três clones diferentes para obter um consenso. A ocorrência

de transmutação de genes para RNAt por meio da troca do anticódon já foi reportada

por Rawlings et al. (2003), que ressalta a importância desse tipo de comparação da

estrutura secundária.

Um caso surpreendente é o de Bombus morio, cujo RNAtLys,

localizado no cluster 4, apresenta uma deformação na alça geralmente mais

conservada, a do anticódon. Apesar da estrutura aparentemente comprometida, o

programa tRNA-Scan localizou o gene sem margem para dúvidas. Porém, não há

como se ter certeza se esse RNA é funcional somente pela análise da estrutura, mas

esse tipo de alteração dá fortes indícios de perda de função.

Uma maneira elegante de testar se uma seqüência é um pseudogene de RNAt

é aquela apresentada em Beagley et al. (1999): o RNA total é extraído, e

oligonucleotídeos complementares à seqüência em questão são utilizados como sonda

em um Northern Blot. Se ela é um gene funcional, a sonda deve evidenciar um

80

fragmento de RNA no tamanho funcional, de cerca de 70 nucleotídeos. Se for um

pseudogene, a sonda deve encontrar a seqüência não-excisada, ligada ao RNAm do

gene vizinho, com um alto tamanho. Não foi possível realizar esse teste durante este

trabalho, mas outro tipo de comprovação da perda de função do gene poderia ser

obtida se outra cópia fosse encontrada em alguma região desse genoma, o que

indicaria um caso de duplicação gênica seguida de perda de função de uma das cópias

e posterior deleção do gene no genoma. Com a continuidade do seqüenciamento,

outra cópia do RNAt-Lys foi então localizada no genoma de B. morio, esta no cluster

1. O gene apresenta um braço D sem emparelhamento, mas essa característica não é

considerada determinante para uma perda de função, portanto o gene deve ser

funcional. Casos de duplicação gênica no DNAmt são muito raros (Campbell e

Barker, 1999; Lessinger et al., 2004).

Essa peculiaridade se faz ainda mais importante quando comparamos a

posição desse gene nos genomas das abelhas corbiculadas Apis mellifera, Bombus

morio e Melipona bicolor. Na primeira, o gene ocupa a segunda posição do

agrupamento 4. Em M. bicolor, ele sofreu translocação para o agrupamento 1, e

talvez o pseudogene encontrado em B. morio seja um resquício do caso intermediário

nessa translocação, refletindo como ela teria ocorrido em um genoma ancestral a B.

morio e M. bicolor. Nesse caso, haveria uma evidência forte de que, conforme as

árvores filogenéticas baseadas em COI e cytB, as duas tribos (Bombini e Meliponini)

teriam um ancestral comum exclusivo. Essa afirmação confirmaria a hipótese de

origem dupla do comportamento social avançado em Apini e Meliponini, ou origem

no ancestral com reversão em Bombini.

81

5.2.3. RNAt-Met (M)

Apesar do gene para o RNAtMet de Centris sp. ocupar posição

diferente no genoma em relação a M. bicolor (agrupamento 2 e 1, respectivamente),

os braços apresentam exatamente as mesmas seqüências, exceto um par de bases no

braço TΨC, que é normalmente menos conservado. Portanto, fica comprovada a

translocação observada entre as duas espécies.

5.2.4. RNAt-Val (V)

O cluster 11 foi seqüenciado para todas as espécies exceto

Coelioxoides sp., e apresentou em quase todas elas apenas o gene para RNAtVal. Essa

configuração é bastante conservada nas espécies de Arthropoda, e chegou a ser

considerada imprescindível para o funcionamento correto da excisão dos genes para

os RNAr (12S e 16S), que são separados por esse RNAt (Simon et al., 1994). Porém,

confirmando a alta taxa de translocações encontrada nas abelhas, até esse cluster

apresentou um caso de alteração: a espécie Thygater sp. não tem nenhum gene nessa

posição, portanto os genes para RNAr são transcritos seqüencialmente, conforme

pode ser visto no alinhamento da Figura 26.

10 20 30 40 50 60 ----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|--

A. mellifera GGAAUAAGUCGUAACAUAGUAAGAGUACCGGAAGGUGUUUUUAGAUUAAAAUUUUAGUUUAA Thygater sp. GGAAUAAGUCGUAACAUAGUAAUUGUAUCGGAAGAUGUAAUUAGAUUAAAAUUUU-------

********************** *** ****** *** ***************

70 80 90 100 110 120 --|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----

A. mellifera AGUAAAAUAUUUCUUUUACAGUGAAAAGAUUAAAAAAUUAGUUUUUAAAAUUUUAUAAUUAAThygater sp. --------------------------------------------------------------

130 140 150 160 170 180 |----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|-

A. mellifera AAUUAUUAAUAAAAUUAUUUGGUUAUAUUUAUAUAUAUAUAUAUAUAUAUAUAUAUAUAUAU Thygater sp. AAUUUUAAAUAUUUUUAUUUUAUAAAAAUUAAAUAUGUUUAU-----UAAAUUUAUAAAUAA

**** * **** ****** * * * *** **** * *** ** ** **** ***

82

Figura 26 – Alinhamento da região do cluster 11 entre as espécies Apis mellifera e Thygater sp., demonstrando a ausência do gene para o RNAtVal nessa região do genoma de Thygater sp.. O final do gene para 16S está em preto, até a posição 52; o gene para o RNAtVal de A. mellifera está destacado em cores, da posição 53 até a 117; o começo do gene 12S está em preto, a partir da posição 118.

É possível observar que há oito bases idênticas ao início do gene para RNAtVal

em Thygater sp., o que deve constituir em bases remanescentes de um evento de

excisão do gene no momento da translocação. Esse não é o primeiro caso de ausência

do gene RNAtVal entre os genes 16S e 12S dos insetos, pois o mesmo já foi descrito

para outras espécies: o piolho Heterodoxus macropus (Shao et al., 2001b) e um

hemíptero, Tetraleurodes acaciae (Thao et al., 2004). No entanto, é o primeiro caso

citado entre os himenópteros, apesar da alta taxa de rearranjos do grupo.

5.3. A ordem gênica na árvore de Michener (2000)

Quando as alterações na ordem gênica não oferecem um número de

dados suficiente para a obtenção de uma árvore filogenética, é um procedimento

comum utilizar uma árvore já tradicional como base para “aplicar” os rearranjos e

tentar obter mais dados sobre eles (exemplo em Boore et al., 1995).

Michener (2000) desenha uma árvore que estabelece relações entre as

subfamílias e famílias de abelhas, dividindo-as em abelhas de língua comprida e de

língua curta. Sobre essa árvore, na Figura 27 foram aplicados os dados dos clusters 4

e 6 obtidos nesta tese, para visualizar uma possível hipótese sobre a evolução desses

arranjos.

83

Língua CompridaLíngua Curta

?

Apinae

XylocopinaeMegachilidaeHalictidaeSymphyta

(= ordem ancestral)

ARNSEF RANEF RNEF RNEF

Apidae

KD DK DK DK

REFRNEFRNEF

BombiniMeliponiniEuceriniCentridini

RTNEF

D ψKDDKDK

RNF

Apini

DKCluster 4

Cluster 6

Figura 27 – Adaptação da árvore de Michener (2000) incluindo apenas táxons analisados nesta tese, com as ordens dos clusters 4 e 6. As relações tracejadas, entre as abelhas de língua curta (Halictidae) e as de língua comprida (Apidae e Megachilidae) são incertas, assim como a relação das abelhas com a vespa basal de Symphyta, acrescentada aqui como representante da ordem gênica ancestral do grupo. Dentro de Apinae, foram representadas algumas das tribos estudadas em uma polifilia, sem resolver as relações entre elas.

Para o cluster 4, a relação citada anteriormente fica bem clara: o arranjo DK é

típico de todas as famílias de abelhas estudadas, diferente da ordem ancestral KD e da

ampla ocorrência de homoplasia das vespas (Dowton e Austin, 1999). As exceções

são os casos de Bombini (com o provável pseudogene ψK) e Meliponini (sem o gene

K), que talvez possam ser explicados pela hipótese descrita acima, de que as tribos

seriam irmãs. No caso, após duplicação do gene no cluster 1, o processo de

transformação desse gene K em um pseudogene estaria em curso em Bombini, e teria

sido concluído em Meliponini com a exclusão dessa seqüência no cluster 4.

Já o cluster 6 parece seguir a hipótese de rearranjos da Figura 25, sendo que

dentro da subfamília Apinae ele apresenta diversas variações, demonstrando a alta

taxa de rearranjos encontrada. Fora dessa subfamília, os rearranjos parecem seguir

uma seqüência em que os genes vão progressivamente sendo transferidos desse

agrupamento para outros: primeiramente o gene S, com troca da ordem entre A e R

84

em Halictidae; depois a saída de A, evento comum a todas as abelhas de língua

comprida; e depois os diversos tipos de arranjos dentro de Apinae, em que o

marcador não oferece uma variação adequada para estabelecimento de relações entre

as tribos, com exceções como o caso do RNAtLys de Bombini + Meliponini.

85

6. Resultados e Discussão III:

Análises da tribo Meliponini

As abelhas da tribo Meliponini têm grande importância ecológica nos

ecossistemas do Brasil, sendo as principais polinizadoras de muitas espécies vegetais

da Mata Atlântica, por exemplo. Além disso, o fóssil de abelha mais antigo

encontrado é um meliponíneo de um gênero moderno, Cretotrigona prisca, datado do

final do Cretáceo (Michener e Grimaldi, 1985). Isso é surpreendente por ser uma

tribo com caracteres altamente derivados.

Muitos estudos têm sido realizados com espécies dessa tribo. O centro de

origem é certamente a América do Sul, no final do Cretáceo (cerca de 80 milhões de

anos atrás), de onde o grupo teria atingido a América do Norte e depois a Ásia e a

África, quando o clima era mais quente e os continentes ainda tinham ligação pela

região holártica, ainda não-congelada (Michener, 2000). A ocupação da Austrália é

uma questão polêmica, como será discutido a seguir.

No decorrer deste período, tivemos oportunidade de obter uma amostra de

meliponíneo proveniente da Índia, da espécie Heterotrigona iridipennis. Além disso,

foi estabelecido contato com um especialista em estudos moleculares de

Hymenoptera da Wollongong University (Austrália), Dr. Mark Dowton. Foram

comparadas seqüências parciais do gene COI e também a ordem gênica do cluster 4,

e os resultados serão apresentados separadamente a seguir.

6.1. Seqüências parciais do gene COI

86

A Figura 28 representa o alinhamento entre as seqüências parciais de COI de

seis espécies de Meliponini de quatro origens geográficas: América do Sul, Índia,

Tailândia e Austrália, além da seqüência de Bombus morio (Bombini).

Figura 28 –Alinhamento por CLUSTALW das seqüências parciais de nucleotídeos do gene COI para as seis espécies de meliponíneos e uma espécie de Bombini, Bombus morio. Os pontos são bases idênticas à primeira seqüência.

(continua na próx. página)

87

O alinhamento apresenta alguns indels que não constituem códons inteiros

(nas posições 84, 253 e 385 da espécie T. carbonaria), o que não é esperado para

seqüências codificadoras de proteínas. Deleções (ou inserções) de múltiplos de três

bases não alteram a leitura dos códons, apenas retiram (ou acrescentam) um

aminoácido na seqüência. Porém, no caso de T. carbonaria, há deleções (e inserções)

de bases em algumas posições, sem formar múltiplos de três. Se a tradução é inferida

diretamente da seqüência de nucleotídeos obtida, o quadro de leitura do gene fica

interrompido por diversos códons de parada, como pode ser observado na Figura 29

(seqüência nomeada T. carbonaria B). Porém, se assumirmos que os indels não são

considerados pela maquinaria celular no momento da tradução, constituindo

frameshifts na leitura, a seqüência de aminoácidos é bastante similar à das outras

espécies, conforme se observa na mesma figura (seqüência nomeada T. carbonaria

A).

Figura 28 (cont.)

88

Figura 29 - Alinhamento por CLUSTALW das seqüências parciais de aminoácidos do gene COI para as quatro espécies de meliponíneos australianos. As letras que constituem as seqüências são os códigos universais de uma letra para os aminoácidos, os pontos são aminoácidos idênticos aos da primeira seqüência e o asterisco representa códons de parada. Para T. carbonaria, a seqüência “A” considera os “frameshifts”, ou seja, alterações no quadro de leitura para reconstituir a seqüência de aminoácidos, apesar de indels na seqüência de nucleotídeos. A seqüência “B” é a tradução nominal da seqüência de nucleotídeos, sem considerar essas alterações.

Esse fenômeno já foi descrito no gene cytB de formigas (Beckenbach et al.,

2005). Além disso, a edição de RNA em genomas mitocondriais já foi descrita

também para genes de RNAt, como em Lithobius forficatus, uma centopéia cujas

seqüências primárias dos genes para RNAt são muito defeituosas, inclusive no braço

do aceptor, vital para o funcionamento (Lavrov et al., 2000). Seqüenciando o RNA,

os autores detectaram edição e sugerem uma polimerase de RNA dependente de

RNA, de origem viral. Esse tipo de polimerase pode ser a responsável pelos

fenômenos de frameshift descritos em Hymenoptera, e também pode ter sido inserida

na mitocôndria por infecção viral, por exemplo.

Com os dados acima, foram inferidas árvores filogenéticas. As topologias não

variaram conforme o método utilizado, portanto só serão apresentados os resultados

89

da máxima parcimônia. A árvore da Figura 30 representa a árvore de consenso entre

quatro árvores mais parcimoniosas construídas a partir das seqüências nucleotídicas

de COI para essas espécies de Meliponini.

Figura 30 - Árvore mais parcimoniosa contruída a partir de 409 pb de COI, com 1000 replicações de bootstrap. Bombus morio (Bombini) foi incluída como outgroup, e as outras oito espécies são meliponíneos de diferentes origens geográficas, conforme a legenda: América do Sul ( ), Índia ( ), Tailândia (◊) e Austrália ( para o gênero Trigona e para o gênero Austroplebeia).

A topologia acima coincide com as idéias de Michener (2000) sobre a

biogeografia dos Meliponini. Melipona bicolor, a espécie neotropical, aparece

próxima à base da árvore, em concordância com a evidência de que o grupo tem

origem na América do Sul. As abelhas da Austrália (assinaladas com quadrados) não

formam um grupo monofilético: as abelhas do gênero Trigona agrupam com a

espécie da Índia e com as da Tailândia, concordando com os dados morfológicos que

indicam que Trigona surgiu na Austrália a partir de ancestrais indo-malaios. O gênero

Austroplebeia, por outro lado, não está agrupado nesse ramo. Essa árvore não

soluciona a questão intrigante sobre a origem de Austroplebeia na Austrália, mas

concorda plenamente com a idéia de Michener de que o gênero não tem origem

90

comum com o ramo indo-malaio, e sim uma origem anterior, a partir de outro

ancestral.

6.2. Ordem gênica do cluster 4

O cluster 4 é apontado como um hotspot de rearranjos no genoma

mitocondrial das espécies pertencentes à Ordem Hymenoptera, pois as vespas têm

inúmeras alterações em sua ordem e composição (Dowton e Austin, 1999).

Analisando a Figura 24 com especial atenção para esse cluster, percebe-se que

Melipona bicolor é uma exceção entre todas as espécies para as quais foram obtidas

as seqüências desse agrupamento. Todas as demais abelhas apresentam ali dois genes,

para o RNAtAsp (D) e para o RNAtLys (K), enquanto somente este último está presente

na mesma localização no genoma de M. bicolor.

Essa singularidade levou-nos a investigar se o evento de translocação teria

ocorrido no ancestral comum dos Meliponini, ou se seria um evento mais recente

dentro da tribo. Em uma tentativa de resolver essa questão, procuramos obter mais

dados dentro da tribo, analisando mais cinco espécies de gêneros distintos:

Lestrimellita limao, Plebeia remota, Scaptotrigona xantotricha, Schwarziana

quadripunctata e Tetragonisca angustula.

Pôde-se verificar que esse arranjo diferencial é conservado nessas espécies de

meliponíneos brasileiros. Além disso, a espécie de meliponíneo proveniente da Índia

(Heterotrigona iridipennis), as espécies tailandesas e duas espécies australianas cujos

dados foram obtidos pelo Dr. Mark Dowton (Austroplebeia symei e A. australis)

também têm a ordem desse cluster idêntica à encontrada nos meliponíneos

brasileiros, ou seja, apenas o gene para o RNAtAsp(D) está presente.

91

Esse fato ajuda a corroborar a hipótese de que esse arranjo está fixado nos

meliponíneos, sendo possivelmente originado de uma translocação ocorrida no

ancestral comum ou, ao menos, no início da diversificação da tribo. Apesar de não ser

um marcador útil para agrupar tribos em uma análise filogenética, por ser um caráter

exclusivo, esse arranjo fixo pode ser considerado como uma contribuição valiosa para

a caracterização molecular do genoma mitocondrial da tribo Meliponini.

Além disso, o seqüenciamento de exemplares de outras famílias de abelhas

(Halictidae e Megachilidae) resultou na confirmação da ordem RNAtAsp (D) -

RNAtLys (K), o que parece aumentar a importância do rearranjo fixado em Meliponini

dentro do amplo grupo de abelhas estudadas. A extrema fixação que parece haver

nesse agrupamento, tanto do arranjo D dentro de Meliponini quanto do arranjo D-K

em todas as demais abelhas, parece indicar que o evento de translocação teria

ocorrido há mais de 80 milhões de anos, no período Cretáceo, que corresponde ao

início da diversificação de Meliponini (Michener, 2000). Além disso, esse rearranjo

seria algo muito singular nesse grupo, pois outras mudanças nesse agrupamento

nunca mais teriam se repetido (e perpetuado) dentro das abelhas.

É interessante comparar esses arranjos bem fixados encontrados nas abelhas

com a enorme quantidade de rearranjos na mesma região que foram observados em

outros himenópteros, as vespas (Dowton e Austin, 1999). Os arranjos observados em

uma ampla amostragem de espécies de vespas demonstraram que houve pelo menos

cinco eventos de translocação dentro do grupo, com um alto grau de homoplasia.

Seria difícil avaliar objetivamente os mecanismos que levam à diferença da taxa de

evolução para cada região mitocondrial em grupos de espécies aparentadas (no caso,

da mesma ordem). Porém, o aumento do número de estudos sobre a ordem gênica

mitocondrial e sua importância evolutiva pode esclarecer essa e outras questões que

92

surgem quando analisamos esse tipo de característica, e provavelmente ajudará a

estabelecer caracteres robustos e diagnósticos para ordens, famílias e até mesmo

gêneros (Rawlings et al., 2001).

93

7. Conclusões

1. Os dados de seqüenciamento parcial de genes não ofereceram resolução para

recuperar árvores filogenéticas consistentes, que expliquem a história

evolutiva das abelhas. O elevado tempo de divergência entre as tribos, somado

à alta taxa de substituição encontrada nos genomas mitocondriais desse grupo,

levam à conclusão de que não é possível melhorar esse quadro com esse tipo

de dado molecular. Apesar disso, alguns grupos se mantêm em todas as

árvores, indicando uma alta probabilidade de serem agrupamentos

verdadeiros.

2. Uma das relações consistentes é a falta de monofiletismo entre as tribos que

antes constituíam a família Anthophoridae. Corroboramos, portanto, a idéia de

Michener (2000) de que elas fazem parte de um grupo com as “Apidae

corbiculadas”, classificado pelo autor como a subfamília Apinae.

3. O outro agrupamento fortemente indicado pelos dados é a associação de

Bombini + Meliponini. Além de ter o mais alto bootstrap das árvores

baseadas em seqüências, essa topologia tem um marcador muito robusto: a

ocorrência do pseudogene do RNAt para lisina (K) em Bombini. Esse

marcador seria, então, um resquício de um evento de duplicação do gene no

ancestral comum de Bombini + Meliponini, com posterior deleção em

Meliponini. Essa é uma forte evidência da existência desse ancestral comum

exclusivo, já que as reversões de translocações desse tipo são muito

incomuns.

94

4. Estudando espécies dentro da distribuição geográfica da tribo Meliponini, foi

possível obter dados consistentes com o gene COI, o que é mais uma

indicação de que os genes mitocondriais têm uma divergência muito alta para

comparar espécies de tribos diferentes, mas podem ajudar a resolver

problemas dentro de grupos. No caso, a árvore posicionou as abelhas da

Austrália em dois ramos separados, Austroplebeia e Trigona, sendo que a

última parece ter origem no ramo indo-malaio e Austroplebeia não. Essa idéia

também está de acordo com Michener (2000).

5. A ordem gênica do cluster 4 contendo apenas o gene para o RNAtAsp (D) é

bastante fixada dentro de Meliponini em todas as regiões geográficas,

enquanto todas as outras tribos e famílias de abelhas apresentam a ordem DK.

Em vespas, ao contrário, esse agrupamento é muito propício a rearranjos,

apresentando homoplasia entre os grupos.

6. Mais do que a raridade dos eventos de translocação, sugerida por diversos

autores, acreditamos em uma alta variabilidade na taxa em que esse fenômeno

ocorre, conforme o grupo estudado. Fica claro que as abelhas têm uma

evolução do genoma mitocondrial muito rápida, tanto em substituição de

bases quanto em termos de rearranjos gênicos. Os dados são congruentes com

os estudos de outro grupo de Hymenoptera, as vespas, com algumas

particularidades em clusters específicos. Com mais estudos desse tipo em

outras famílias da ordem, poderão ser estabelecidas as causas que levam a

essa aceleração da evolução mitocondrial dentro de Hymenoptera.

95

8. Considerações finais

As abelhas são um grupo de insetos que surgiu no começo do Cretáceo, e

sofreu uma enorme radiação adaptativa há cerca de 90 milhões de anos,

concomitantemente com a radiação das angiospermas. Segundo Grimaldi e Engel

(2005), muitas famílias, subfamílias e até mesmo tribos das abelhas já estavam

diferenciadas no final do Cretáceo, o que significa muito tempo até os dias de hoje,

mesmo em escala geológica. Isso implica em uma grande divergência molecular entre

esses grupos.

Além disso, as abelhas apresentam uma alta taxa de substituição de bases

(Crozier e Crozier, 1993; Black e Roehrdanz, 1998). As causas dessa aceleração no

genomas mitocondriais dos animais podem ser diversas: eficiência do reparo, taxa de

divisão celular, tempo de geração ou taxa metabólica (Martin e Palumbi, 1993).

Assim, o seqüenciamento de fragmentos gênicos não ofereceu resultados

consistentes neste trabalho, pois apenas alguns grupos foram mantidos com alta

fidelidade. Como nos trabalhos anteriores de seqüenciamento de DNA das abelhas, as

árvores não têm resolução. Apesar de alguns trabalhos sugerirem que o aumento dos

dados sobre esses organismos seria útil para obter relações mais consistentes

(Lockhart e Cameron, 2001), há evidências de que ocorreria exatamente o contrário:

segundo Huelsenbeck et al. (1996), quando há atração entre os ramos longos de uma

determinada árvore, o aumento de dados leva ao aumento da inconsistência da árvore.

Já em 1993, Kumazawa e Nishida afirmaram que as seqüências de DNAmt

podem não ter sucesso para obter filogenias em grupos com tempo de divergência

igual ou maior do que 100 milhões de anos. A morfologia, por outro lado, pode ser

96

influenciada por uma forte evolução paralela devido aos hábitos comuns a todos os

grupos, principalmente a alimentação à base de pólen. Alguns trabalhos afirmam que

os problemas se resumem a utilizar bons métodos de recuperação de filogenia. Não

acredito que o método escolhido deveria fazer diferença se os dados fossem

realmente consistentes, pois nesse caso qualquer método simples deveria reconstruir

com fidelidade uma árvore correta. É possível que a utilização de critérios escolhidos

de forma mais específica consiga corrigir pequenos defeitos ou aumentar os valores

de bootstrap de uma árvore, mas dificilmente seria capaz de sobrepujar os problemas

encontrados com os dados deste e de outros trabalhos moleculares. O problema é,

certamente, intrínseco à alta divergência entre as abelhas.Como a questão não é

metodológica, e sim diretamente derivada da extrema diferenciação dos grupos, o

problema parece não ter solução: acredito que a filogenia das abelhas dificilmente

será resolvida.

Os rearranjos dos genes parecem ser os novos alvos das análises moleculares

do genoma mitocondrial, pelos motivos discutidos aqui. Os resultados podem variar

desde uma extrema conservação, como em mamíferos ou insetos de diversas ordens

(Diptera, Coleoptera, Orthoptera e Lepidoptera) (Dowton, 2004), até grupos com uma

taxa tão elevada de rearranjos que eles podem não oferecer informações filogenéticas

relevantes, devido à ocorrência de homoplasia. Alguns grupos desse tipo são os

crocodilos (Kumazawa e Nishida, 1995), aves (Mindell et al., 1998), insetos

hemipteróides (Shao et al., 2001a; Shao et al., 2003) e Hymenoptera (Dowton e

Austin, 1999; Dowton et al., 2002).

Estudos desse tipo são muito raros, principalmente devido ao seu alto custo

operacional. Quando se quer seqüenciar um trecho de um gene para comparação,

97

geralmente são analisados cerca de 500pb de cada espécie. Para analisar ordens

gênicas, são necessárias muito mais bases seqüenciadas, às vezes até o genoma

mitocondrial completo (cerca de 16000pb). No Brasil, foram reportados

pouquíssimos trabalhos com esse tipo de marcador em Arthropoda, do grupo de

mitogenômica de moscas (Calliphoridae) do CBMEG-UNICAMP (Lessinger et al.,

2004) e de nosso laboratório com as abelhas.

Em Hymenoptera, a taxa de rearranjos é tão elevada que a homoplasia torna-

se muito comum (Dowton e Austin, 1999; Dowton et al., 2002). É necessário muito

cuidado para evitar os problemas trazidos por esse fator: por exemplo, o cluster 4

apresenta a ordem dos genes KD em abelhas e em um gafanhoto, e DK na maioria

dos outros insetos. Porém, considerá-los como monofiléticos separaria os

Holometabola, um grupo sólido dentro dos insetos.

Portanto, em concordância com Dowton et al. (2002), acreditamos que os

estudos da ordem gênica mitocondrial estão em sua infância. Em sua revisão sobre a

mitogenômica, Rand (2001) afirmou que se faz necessária uma amostragem criativa

de espécies e populações com diferentes histórias naturais para permitir o aumento do

conhecimento da área. Assim, há muito a ser aprendido sobre esse tipo de

informação, que sem dúvida mostrará seu valor conforme os dados aumentarem e

representarem o maior número possível de espécies; esta tese é uma contribuição em

direção a esse objetivo.

98

Resumo

As seqüências do DNA mitocondrial (DNAmt) e, mais recentemente, a ordem

dos genes desse genoma têm sido amplamente utilizadas como fontes de caracteres

para estabelecer relações filogenéticas entre organismos. A inferência da filogenia

dentro do grupo das abelhas, e em especial da subfamília Apinae, sempre apresentou

muitas dificuldades, tanto com as metodologias tradicionais quanto com análises

moleculares. A subfamília Apinae destaca-se das demais pelo fato de compreender

espécies que apresentam diferentes graus de comportamento social; a origem e

evolução desse comportamento são assuntos extremamente controversos e

merecedores de estudo. Entre as abelhas, somente Apis mellifera teve seu genoma

mitocondrial publicado. Recentemente, o genoma mitocondrial de Melipona bicolor

foi parcialmente seqüenciado e analisado em nosso laboratório, e várias diferenças na

ordem gênica mitocondrial foram então verificadas entre essas duas espécies de

abelhas. Em um estudo preliminar, outras espécies de abelhas foram coletadas para

comparação da ordem gênica, apresentando também variação. Esses resultados nos

estimularam a idealizar este projeto, no qual pretendemos estudar o genoma

mitocondrial e as relações filogenéticas entre as abelhas da subfamília Apinae

empregando duas metodologias: seqüenciamento parcial de um gene mitocondrial e

análise da ordem gênica do DNAmt. Os dados gerados poderão ser de extrema

importância não só para o entendimento da evolução do genoma mitocondrial e das

abelhas da subfamília Apinae, como também do comportamento social presente em

apenas algumas tribos.

99

Abstract

Mitochondrial DNA (mtDNA) sequences, and more recently, its genomic

order, have been extensively used as character resources to establish phylogenetic

relationships among organisms. Phylogenetic inference among bees, particularly

inside the subfamily Apinae, always produced many difficulties, as with the

traditional methods as using molecular analyses. The subfamily Apinae is distinct

from the rest of the bees by including species with several degrees of social behavior;

origin and evolution of that behavior are extremely conflicting and deserve more

studies. Among bees, only Apis mellifera had its genome completely sequenced.

Recently, the Melipona bicolor mtDNA was partially sequenced and analyzed in our

laboratory, and several differences were verified in the gene order between those two

bees. In a preliminary work, other bees species were collected to compare the gene

order, also presenting variation. These results had stimulated us to idealize this

project, in which we intend to study the mitochondrial genome and the phylogenetic

relationships among the subfamily Apinae using two methods: partial sequencing of

mitochondrial genes and analyses of the mitochondrial gene order. These data can be

of massive importance not only to the understanding of mtDNA and bees evolution,

but also to enhance the comprehension about the evolution of their social behavior.

100

Referências Bibliográficas

ARIAS, M.C.; FRANCISCO, F.O.; SILVESTRE, D.; WEINLICH, R. E SHEPPARD W.S.

(1998) Utilização de pares de primers específicos para a amplificação integral

do genoma mitocondrial de abelhas Apis mellifera, in: Anais do III Encontro

sobre Abelhas, Ribeirão Preto, Brasil, pp. 271.

AVISE, J.C. (1994). “Molecular markers, natural history and evolution”. Chapman &

Hall, New York.

BATRA, S. (1984). Solitary bees. Scientific American 250: 120-127.

BEAGLEY, C. T.; OKIMOTO, R. E WOLSTENHOLME, D.R. (1999). Mytilus

mitochondrial DNA contains a functional gene for a tRNA Ser(UCN) with a

dihydrouridine arm-replacement loop and a pseudo-tRNA Ser (UCN) gene.

Genetics 152: 641-652.

BECKENBACH, AT; ROBSON, SKA E CROZIER, RH. (2005). Single nucleotide+1

frameshifts in an apparently functional mitochondrial cytochrome b gene in

ants of the genus Polyrhachis, J. Mol. Evol. 60: 141-152.

101

BLACK, W.C. E ROEHRDANZ, R.L. (1998). Mitochondrial gene order is not

conserved in arthropods: prostriate and metastriate tick mitochondrial

genomes. Mol. Biol. Evol., 15:1772-1785.

BOORE, J.L. (1999). Animal mitochondrial genomes. Nuc. Acids Res., 27:1767-

1780.

BOORE, J.L. E BROWN, W.M. (1998). Big trees from little genomes: mitochondrial

gene order as a phylogenetic tool. Curr. Opin. Genet. Dev., 8:668-674.

BOORE, J.L.; COLLINS, T.M.; STANTON, D.; DAEHLER, L.L. E BROWN, W.M. (1995).

Deducing the pattern of arthropod phylogeny from mitochondrial DNA

rearrangements. Nature, 376:163-165.

BROWN, W.M. (1983). Evolution of animal mitochondrial DNA. In “Evolution of

Genes and Proteins” (M. Nei e R.K. Koehn, Eds.), pp. 62-88, Sinauer

Associates Inc., Massachusetts.

CAMERON, S. A. (1991). A new tribal phylogeny of the Apidae inferred from

mitochondrial DNA sequences. In Diversity in the genus Apis (Smith, D.R.

ed). Westview Press, Oxford; pp 89-102.

102

CAMERON, S.A. (1993). Multiple origins of advanced eusociality in bees inferred

from mitochondrial DNA sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8687-

8691.

CAMERON, S.A. E MARDULYN, P. (2001). Multiple molecular data sets suggest

independent origins of highly eusocial behavior in bees

(Hymenoptera:Apinae). Syst. Biol. 50:194-214.

CAMPBELL, N.J.H. E BARKER, S.C. (1999). The novel mitochondrial gene

arrangement of the cattle tick, Boophilus microplus: fivefold tandem repetition

of a coding region. Mol. Biol. Evol. 16: 732-740.

CANTATORE, P.; GADALETA, M.N.; ROBERTI, M.; SACCONE, C. E WILSON, A.C.

(1987). Duplication and remoulding of tRNA genes during the evolutionary

rearrangement of mitochondrial genomes. Nature, 29:853-855.

CASTRO, L.R. E DOWTON, M. (2005). The position of the Hymenoptera within the

Holometabola as inferred from the mitochondrial genome of Perga condei

(Hymenoptera: Symphyta: Pergidae). Mol. Phyl. Evol. 34: 469-479.

CASTRO, L.R.; AUSTIN, A.D. E DOWTON, M. (2002). Contrasting rates of

mitochondrial molecular evolution in parasitic Diptera and Hymenoptera.

Mol. Biol. Evol. 19:1100-1113.

103

CHAVARRÍA, G E CARPENTER, J.M. (1994). “Total evidence” and the evolution of

highly social bees. Cladistics 10: 229-258.

CLARY, D.O. E WOLSTENHOLME, D.R. (1985). The mitochondrial DNA molecule of

Drosophila yakuba: nucleotide sequence, gene organisation, and genetic code.

J. Mol. Evol., 22:252-271.

COLLINS, T.M.; WIMBERGER, P.H. E NAYLOR, G.J.P. (1994). Compositional bias,

character-state bias, and character-state reconstruction using parsimony. Syst.

Biol. 43: 482-486.

CROZIER, R.H. E CROZIER, Y.C. (1993). The mitochondrial genome of the honeybee

Apis mellifera: complete sequence and the genome organization. Genetics,

133:97-117.

DANFORTH, B.N. (2002). Evolution of sociality in a primitively eusocial lineage of

bees. PNAS 99: 286-290.

DOWTON, M. (2004). Assessing the Relative Rate of (Mitochondrial) Genomic

Change. Genetics 167: 1027-1030.

DOWTON, M. E AUSTIN, A.D. (1999). Evolutionary dinamics of a mitochondrial

rearrangement “hot spot” in the Hymenoptera. Mol. Biol. Evol., 16:298-309.

104

DOWTON, M. E CAMPBELL, N.J.H. (2001). Intramitochondrial recombination: is it

why some mitochondrial genes sleep around? TREE, 16:269-271.

DOWTON, M.; BELSHAW, R.; AUSTIN, A.D. E QUICKE, D.L.J. (2002). Simultaneous

molecular and morphological analysis of braconid relationships (Insecta:

Hymenoptera: Braconidae) indicates independent mt-tRNA gene inversions

within a single wasp family. J. Mol. Evol. 54: 210-226.

ENGEL, M.S. (2001). Monophyly and extensive extinction of advanced eusocial

bees: Insights from an unexpected Eocene diversity. Proc. Natl. Acad. Sci.

4:1661-1664.

FLOOK, P.; ROWELL, H. E GELLISSEN, G. (1995). Homoplastic rearrangements of

insect mitochondrial transfer-rna genes. Naturwissenschaften, 82:336-337.

FOSTER, P.G.; JERMIIN, L.S. E HICKEY, D.A. (1997). Nucleotide composition bias

affects amino acid content in proteins coded by animal mitochondria. J. Mol.

Evol., 44:282-288.

FRANCISCO, F.O.; SILVESTRE, D. E ARIAS, M.C. (2001). Mitochondrial DNA

characterization of five species of Plebeia (Apidae: Meliponini): RFLP and

restriction maps. Apidologie, 32: 323-332.

105

GRAY, M.W. (1989). Origin and evolution of mitochondrial DNA. Ann. Rev. Cell.

Biol., 5:25-50.

GRIMALDI, D. E ENGEL, M.S. (2005). “Evolution of the insects”. Cambridge

University Press; Cambridge, UK.

HALL, T.A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor

and analysis. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41: 95-98.

HALL, H.G. E SMITH, D.R. (1991). Distinguishing African and European honeybee

matrilines using amplified mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sci.,

88:4248-4552.

HAUCKE, H.-R. E GELLISSEN, G. (1988). Different mitochondrial gene orders among

insects: exchanged tRNA gene positions in the COII/COIII region between an

orthopteran and a dipteran species. Curr. Genet. 14: 471-476.

HENGEN, P.N. (1997). Optimizing multiplex and LA-PCR with betaine. Trends in

Biochemical Sciences, 22:225-226.

HOWE, C.J.; BARBROOK, A.C. E LOCKHART, P.J. (2000). Organelle genes – do they

jump or are they pushed? TIG 16: 65-66.

HUELSENBECK, J.P.; BULL, J.J. E CUNNINGHAM, C.W. (1996). Combining data in

phylogenetic analysis. TREE 11: 152-158.

106

JACOBS, H.T.; ELLIOTT, D.J.; MATH, V.B. E FARQUHARSON, A. (1988). Nucleotide

sequence and gene organization of sea urchin mitochondrial DNA. J. Mol.

Biol. 202: 185-217.

KENT, DS E SIMPSON, JA (1992). Eusociality in the beetle Austroplatypus

incompertus (Coleoptera: Curculionidae). Naturwissenschaften 79: 86-87.

KIMSEY, L. (1984). A re-evaluation of the phylogenetic relationships in the Apidae

(Hymenoptera). Syst. Entomol. 9: 435-441.

KOULIANOS, S.; SCHMID-HEMPEL, R.; ROUBIK, D.W. E SCHMID-HEMPEL, P. (1999).

Phylogenetic relationships within the corbiculate Apinae (Hymenoptera) and

the evolution of eusociality. J. Evol. Biol. 12:380-384.

KUMAR, S.; TAMURA, K.; JAKOBSEN, I.B. E NEI, M. (2001). “MEGA2: Molecular

Evolutionary Genetics Analysis software”. Arizona State University, USA.

KUMAZAWA, Y. E NISHIDA, M. (1993). Sequence evolution of mitochondrial tRNA

genes and deep-branch animal phylogenetics. J. Mol. Evol. 37: 380-398.

KUMAZAWA, Y. E NISHIDA, M. (1995). Variations in mitochondrial tRNA gene

organization of reptiles as phylogenetic markers. Mol. Biol. Evol. 12: 759-

722.

107

LAVROV, D.V.; BROWN, W.M. E BOORE, J.L. (2000). A novel type of RNA editing

occurs in the mitochondrial tRNAs of the centipede Lithobius forficatus.

PNAS 97: 13738-13742.

LESSINGER, A.C.; JUNQUEIRA, A.C.M.; CONTE, F.F. E AZEREDO-ESPIN, A.M.L.

(2004). Analysis of a conserved duplicated tRNA gene in the mitochondrial

genome of blowflies. Gene 339: 1-6.

LOCKHART, P.J. E CAMERON, S.A. (2001). Trees for bees. TREE 16:84-88.

LOWE, T.M. E EDDY, S.R. (1997). tRNAscan-SE: A program for improved detection

of transfer RNA genes in genomic sequence. Nuc. Acids Res., 25:955-964.

MARDULYN, P. E CAMERON, S.A. (1999). The major opsin in bees (Insecta:

Hymenoptera): a promising nuclear gene for higher level phylogenetics. Mol.

Phyl. Evol. 12:168-176.

MARTIN, A.P. E PALUMBI, S.R. (1993). Body size, metabolic rate, generation time,

and the molecular clock. PNAS 90: 4087-4091.

MICHENER, C.D. (2000). “The Bees of the World”. The Johns Hopkins University

Press, Baltimore, USA.

108

MICHENER, CD (1969). Comparative social behavior of bees. Ann. Rev. Entomol.

14: 299-342.

MICHENER CD E GRIMALDI DA (1988). The Oldest Fossil Bee: Apoid History,

Evolutionary Stasis, and Antiquity of Social Behavior. PNAS 85: 6424-6426.

MINDELL, D.P.; SORENSON, M.D. E DIMCHEFF, D.E. (1998). Multiple independent

origins of mitochondrial gene order in birds. PNAS 95: 10693-10697.

MORITZ, C.; DOWLING, T.E. E BROWN, W.M. (1987). Evolution of animal

mitochondrial DNA. Relevance for population biology and systematics. Ann.

Rev. Ecol. Syst., 18:269-292.

PRENTICE, M. (1991). Morphological analysis of the tribes of Apidae . In Diversity

in the genus Apis (Smith, D.R. ed). Westview Press, Oxford; pp 89-102.

RAND, D. (2001). Mitochondrial genomics flies high. TREE, 16:2-4.

RAWLINGS, T.A.; COLLINS, T.M. E BIELER, R. (2001). A major mitochondrial gene

rearrangement among closely related species. Mol. Biol. Evol. 18:1604-1609.

RAWLINGS, T.A.; COLLINS, T.M. E BIELER, R. (2003). Changing identities: tRNA

duplication and remolding within animal genomes. PNAS 100: 15700-15705.

109

ROEHRDANZ, R.; DEGRUGILLIER, M. E BLACK, W. (2002). Novel rearrangements of

arthropod mitochondrial DNA detected with long-pcr: implications for

arthropod phylogeny and evolution. Mol. Biol. Evol. 19: 841 - 849.

ROIG-ALSINA, A. E MICHENER, C.D. (1993). Studies of the phylogeny and

classification of long-tongued bees (Hymenoptera: Apoidea). Univ. Kansas

Sci. Bull. 55: 124-162.

ROKAS, A. E HOLLAND, P.W.H. (2000). Rare genomics changes as a tool for

phylogenetics. TREE 15:454-459.

ROUBIK, D.W. (1989). “Ecology and natural history of tropical bees”. Cambridge

Univ. Press, Cambridge, UK.

SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F. E MANIATIS, T. (1989). “Molecular Cloning: a

Laboratory Manual”. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA.

SHAO, R.; CAMPBELL, N.J.H.; SCHMIDT, E.R. E BARKER, S.C. (2001a). Increased

rate of gene rearrangement in the mitochondrial genomes of three orders of

hemipteroid insects. Mol. Biol. Evol. 18: 1828-1832.

SHAO, R.; CAMPBELL, N.J.H. E BARKER, S.C. (2001b). Numerous gene

rearrangements in the mitochondrial genome of the wallaby louse,

Heterodoxus macropus (Phthiraptera). Mol. Biol. Evol. 18: 858-865.

110

SHAO, R.; DOWTON, M.; MURRELL, A. E BARKER, S.C. (2003). Rates of gene

rearrangement and nucleotide substitution are correlated in the mitochondrial

genomes of insects. Mol. Biol. Evol. 20: 1612-1619.

SHEPPARD, W.S. E MCPHERON, B. (1991). Ribosomal DNA diversity in Apidae. In

Diversity in the genus Apis (Smith, D.R. ed). Westview Press, Oxford; pp 89-

102.

SCHNEIDER, H. (2003). “Métodos de análise filogenética – um guia prático”. Holos

Editora e Sociedade Brasileira de Genética, Ribeirão Preto.

SCHULTZ, T.R.; ENGEL, M.S. E PRENTICE, M (1999). Resolving conflict between

morphological and molecular evidence for the origin of eusociality in the

“corbiculate” bees (Hymenoptera: Apidae): a hypothesis-testing approach.

University of Kansas Natural History Museum Special Publication 24: 125-

138.

SILVEIRA, F.A.; MELO, G.A.R E ALMEIDA, E.A.B. (2002). “Abelhas brasileiras –

Sistemática e Identificação”. Ministério do Meio Ambiente e Fundação

Araucária, Belo Horizonte.

SILVESTRE, D. (2002). “Seqüenciamento e análise do genoma mitocondrial de

Melipona bicolor (Hymenoptera, Apidae, Meliponini)”. Dissertação de

Mestrado, IBUSP, São Paulo.

111

SIMON, C.; FRATI, F.; BECKNBACH, A.; CRESPI, B.; LIU, H. E FLOOK, P. (1994).

Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene

sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers.

Ann. Entomol. Soc. Am., 87:651-701.

SUNNUCKS, P. (2000). Efficient genetic markers for population biology. TREE

15:199-203.

THAO, M.L.; BAUMANN, L. E BAUMANN, P. (2004). Organizations of the

mitochondrial genomes of whiteflies, aphids, and psyllids. BMC Evolutionary

Biology 4: 25.

WALSH, P.S.; METZEGER, D.A. E HIGUCHI, R. (1991). Chelex 100 as a medium for

simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.

Biotechniques, 10:506-513.

WCISLO, W.T. E DANFORTH, B. (1997). Secondarily solitary: The evolutionary loss

of social behavior. TREE, 12: 468-474.

WINSTON, M.L. E MICHENER, C.D. (1977). Dual origin of highly social behavior

among bees. Proc. Natl. Acad. Sci. 74:1135-1137.

XIA, X. (2000). “Data analysis in molecular biology and evolution”. Kluwer

Academic Publishers, Boston/Dordrecht/London.

Legenda:Ap: Apis melliferaAugo: Augochlora sp.Bm: Bombus morioCentris: Centris sp.Cx: Coelioxoides sp.Dianthi: Dianthidium sp.Eufri: Eufriesea sp.Lantha: Lanthanomelissa sp.Mb: Melipona bicolorMelit: Melitoma segmentariaMesoch: Mesocheira sp.Neocory: Neocorynura sp.Tetra: Tetrapedia sp.Thyg: Thygater sp.Xyloc: Xylocopa sp.

RNAt: siglas internacionais para os aminoácidos transportados por cada um delesLetras em vermelho: anticódon

Anexo

Estruturas secundárias RNAt

Prancha 1/10

Prancha 2/10

Prancha 3/10

Prancha 4/10

Prancha 5/10

Prancha 6/10

Prancha 7/10

Prancha 8/10

Prancha 9/10

Prancha 10/10