daniela ardila durango

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS DE LAS PLANTAS Annona muricata, Annona cherimola y Physalis peruviana EN LA LINEA CÉLULAR MCF-7 DE

ADENOCARCINOMA DE SENO

DANIELA ARDILA DURANGO

Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C. JUNIO, 2014

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS EXTRACTOS DE LAS PLANTAS Annona muricata, Annona cherimola y Physalis peruviana EN LA LINEA CÉLULAR MCF-7 DE



PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C.

JUNIO, 2014

______________________ DRA. CONCEPCION PUERTA BULA

DECANA ACADEMICA FACULTAD DE CIENCIAS

_____________________ DRA. JANETH DEL CARMEN ARIAS PALACIOS DIRECTORA CARRERAS DE MICROBIOLOGIA

FACULTAD DE CIENCIAS

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS DE LAS PLANTAS Annona muricata, Annona cherimola y Physalis peruviana EN LA LINEA CÉLULAR MCF-7 DE



_____________________________

DIRECTOR RICARDO VERA BRAVO. PhD

DOCENTE DEPARTAMENTO DE QUÍMICA GRUPO DE INVESTIGACIÓN FITOQUÍMICA

UNIVERSIDAD JAVERIANA

_______________________________

CODIRECTORA GINA MARCELA MENDEZ. PhD, MSc

DOCENTE UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES (UDCA)- GRUPO DE INVESTIGACIÓN

PRONAUDCA Y GIBGA

__________________________

CODIRECTOR JORGE ELIECER ROBLES CAMARGO, PhD. MSc

DOCENTE DEPARTAMENTO DE QUÍMICA GRUPO DE INVESTIGACIÓN FITOQUÍMICA

UNIVERSIDAD JAVERIANA

__________________________

EVALUADOR/JURADO JHON JAIRO SUTACHAN RUBIO, PhD. MSc.

DOCENTE DEPARTAMENTO DE NUTRICIÓN Y BIOQUÍMICA-LINEA DE INVESTIGACIÓN DE CANALES

IONICOS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

BOGOTÁ, D.C. JUNIO, 2014

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la resolución N°13 de julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por qué no se publique contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar verdad y justicia”

AGRADECIMIENTOS

A mi familia y especialmente a mi madre y a mi hermana por creer en mí, apoyarme durante todo este duro proceso, y hacer lo posible por ayudarme a cumplir mis metas, porque sin sus esfuerzos esto no hubiera sido posible.

A mi director de tesis el profesor Ricardo Vera, por aceptarme en el grupo de investigación fitoquímica, por llevar un seguimiento continuo, por su paciencia y acompañamiento a lo largo de este proyecto y por creer en mis habilidades y siempre darme fuerza para seguir adelante.

A la profesora Gina Méndez profesora de la Universidad de Ciencias aplicadas y ambientales, por brindarme su conocimiento y guiarme en el aprendizaje respecto a las células, cultivos celulares y todos sus afines, para poder realizar esa parte experimental exitosamente.

Al profesor Jorge Robles por su acompañamiento, por sus enseñanzas y aporte en el conocimiento en el campo de la fitoquímica.

Agradezco de igual forma a todos los integrantes del grupo de investigación en fitoquímica por guiarme y brindarme ayuda cuando lo requerí, para llevar a cabo un experimento.

Agradezco al profesor Jhon J. Sutachan, por su colaboración para hacer posible la metodología experimental de este trabajo de grado.

Tabla de contenido RESUMEN ......................................................................................................................................... 10

1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1

2. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................. 3

2.1. Pregunta de investigación ....................................................................................................... 3

2.2. Planteamiento del problema y justificación ........................................................................... 3

3. MARCO TEORICO-REFERENTES CONCEPTUALES ......................................................................... 4

3.1. Productos naturales bioactivos y metabolitos secundarios .................................................... 4

3.2. Descripción, Clasificación y distribución geográfica del género Annona y Physalis ............... 4

3.2.1. Genero Annona ........................................................................................................... 4

3.2.2. Genero Physalis ........................................................................................................... 8

3.3. Uso y antecedentes fitoquímicos del género Annona y Physalis ........................................ 9

3.3.1. Género Annona ........................................................................................................... 9

3.3.2. Género Physalis ........................................................................................................... 9

3.4. División celular y el origen del cáncer ................................................................................. 9

3.5. Anatomía del seno y cáncer de seno .................................................................................. 9

3.6. Incidencia y mortalidad. .................................................................................................... 10

3.7. Tratamientos para el cáncer ............................................................................................. 12

3.8. Clasificación de medicamentos quimioterapéuticos. ....................................................... 12

3.8.1. Agentes alquilantes ................................................................................................... 12

3.8.2. Antimetabolitos ......................................................................................................... 12

3.8.3. Antibióticos contra el cáncer ..................................................................................... 12

3.8.4. Inhibidores de la topoisomerasa ............................................................................... 13

3.8.5. Inhibidores de la mitosis ........................................................................................... 13

3.8.6. Terapia hormonal ...................................................................................................... 13

3.8.7. Otros medicamentos quimioterapéuticos ................................................................ 13

3.8.8. Terapias dirigidas....................................................................................................... 13

3.8.9. Agentes de diferenciación ......................................................................................... 13

3.8.10. Inmunoterapia ........................................................................................................... 14

4. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 15

4.1. Objetivo general ................................................................................................................ 15

4.2. Objetivos específicos ......................................................................................................... 15

5. METODOLOGIA .......................................................................................................................... 16

5.1. Diseño de la investigación ................................................................................................. 16

5.2. Recolección y clasificación del material vegetal ............................................................... 16

5.3. Obtención de extractos ..................................................................................................... 16

5.4. Pruebas químicas preliminares ......................................................................................... 17

5.5. Cultivo y tratamiento de las células .................................................................................. 20

5.6. Evaluación de la actividad citotóxica de los extractos ...................................................... 21

5.7. Análisis estadístico ............................................................................................................ 21

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................................ 22

6.1. Extracción .......................................................................................................................... 22

6.2. Identificación cualitativa de metabolitos secundarios. ..................................................... 22

6.3. Cultivo celular .................................................................................................................... 27

6.4. Ensayo citotóxico............................................................................................................... 28

7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................................................... 38

8. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 39

9. Anexos ....................................................................................................................................... 43

INDICE DE FIGURAS

FIGURA 1. PARTES Y CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA ANNONA CHERIMOLA. IMAGEN TOMADA DE (PINTO, 2005).. 6 FIGURA 2. PARTES Y CARACTERÍSTICAS DE LA PLANTA ANNONA CHERIMOLA. IMAGEN TOMADA DE PINTO, 2005. ... 7

FIGURA 3. INCIDENCIA Y MORTALIDAD SEGÚN EL TIPO DE CÁNCER, ESTANDARIZADA POR EDADES DE HOMBRES Y

MUJERES. IMAGEN TOMADA DE OMS (2012). GLOBOCAN.IARC.FR. ...................................................... 10 FIGURA 4. INCIDENCIA Y MORTALIDAD DE CÁNCER DE SENO EN EL MUNDO. IMAGEN TOMADA DE OMS (2012).

GLOBOCAN.IARC.FR........................................................................................................................ 11 FIGURA 5. REACCIÓN DE LA PRUEBA DE SHINODA. IMAGEN TOMADA DE

HTTP://UPLOAD.WIKIMEDIA.ORG/WIKIPEDIA/COMMONS/9/90/SHINODA_TEST.PNG .............................. 18 FIGURA 6. REACCIÓN DE LA PRUEBA DE CLORURO FÉRRICO. IMAGEN TOMADA DE HTTP://LH5.GGPHT.COM .......... 18 FIGURA 7. REACCIÓN DE LA PRUEBA DE ANTRONA. IMAGEN TOMADA DE HTTP://INTRANET.TDMU.EDU.UA .......... 18 FIGURA 8. REACCIÓN DE LA PRUEBA DE DRAGENDORFF. IMAGEN TOMADA DE

HTTP://ES.SCRIBD.COM/DOC/38898384/LA-REACCION-DE-VITALI ...................................................... 19 FIGURA 9. REACCIÓN DE LA PRUEBA DE LIERBERMAN-BURCHARD. IMAGEN TOMADA DE

HTTP://UPLOAD.WIKIMEDIA.ORG ..................................................................................................... 19 FIGURA 10. REACCIÓN DE LA PRUEBA DE BALJET. IMAGEN TOMADA DE HTTP://INTRANET.TDMU.EDU.UA ............ 20 FIGURA 11. REACCIÓN QUÍMICA DE LA PRUEBA DE HIDROXAMATO FÉRRICO. IMAGEN TOMADA DE

HTTP://1.BP.BLOGSPOT.COM .......................................................................................................... 20 FIGURA 12. RESULTADOS DE PRUEBAS QUÍMICAS PRELIMINARES PARA EL EXTRACTO DE SEMILLAS DE ANNONA

MURICATA [A] EXTRACTOS REFERENTES, [B] PRUEBAS PARA EXTRACTOS ETANÓLICOS: (1) PRUEBA DE SHINODA, (2) PRUEBA DE FECL3, (3) PRUEBA DE ANTRONA, (4) PRUEBA DE DRAGENDORFF Y (5) PRUEBA DE LA ESPUMA. [C] PRUEBAS PARA FRACCIONES EN ÉTER DE PETRÓLEO: (1) PRUEBA DE HIDROXAMATO FÉRRICO, (2) PRUEBA

DE BALJET, (3) PRUEBA DE SALKOWSKI Y (4) PRUEBA DE LIERBERMANN-BURCHARD. ................................ 24

FIGURA 13. RESULTADOS DE PRUEBAS QUÍMICAS PRELIMINARES PARA EL EXTRACTO DE HOJAS DE ANNONA

CHERIMOLA. [A] EXTRACTOS REFERENTES, [B] PRUEBAS PARA EXTRACTOS ETANÓLICOS: (1) PRUEBA DE

SHINODA, (2) PRUEBA DE FECL3, (3) PRUEBA DE ANTRONA, (4) PRUEBA DE DRAGENDORFF Y (5) PRUEBA DE

LA ESPUMA. [C] PRUEBAS PARA FRACCIONES EN ÉTER DE PETRÓLEO: (1) PRUEBA DE HIDROXAMATO FÉRRICO, (2) PRUEBA DE BALJET, (3) PRUEBA DE SALKOWSKI Y (4) PRUEBA DE LIERBERMANN-BURCHARD. ................ 25

FIGURA 14. RESULTADOS DE PRUEBAS QUÍMICAS PRELIMINARES PARA EL EXTRACTO DE SEMILLAS DE ANNONA

CHERIMOLA. [A] EXTRACTOS REFERENTES, [B] PRUEBAS PARA EXTRACTOS ETANÓLICOS: (1) PRUEBA DE



FIGURA 15. RESULTADOS DE PRUEBAS QUÍMICAS PRELIMINARES PARA EL EXTRACTO HOJAS Y TALLOS DE P.

PERUVIANA. [A] EXTRACTOS REFERENTES, [B] PRUEBAS PARA EXTRACTOS ETANÓLICOS: (1) PRUEBA DE



FIGURA 16. FOTOGRAFÍA ENSAYO DE MTT DE CRISTALES DE FORMAZAN SIN DILUIR .......................................... 29 FIGURA 17. GRÁFICO COMPARACIÓN DEL EFECTO CITOTÓXICO DE LOS EXTRACTOS DE A. MURICATA (GES), A.

CHERIMOLA (CEH Y CES) Y PHYSALIS PERUVIANA (UHT) EN LA LÍNEA CELULAR MCF-7. [A] GRÁFICO DE

DISPERSIÓN Y [B] GRÁFICO BARRAS EN 3D. ........................................................................................ 30 FIGURA 18. GRÁFICO COMPARACIÓN DEL EFECTO CITOTÓXICO DE LOS EXTRACTOS DE A. MURICATA (GES), A.

CHERIMOLA (CEH Y CES) Y PHYSALIS PERUVIANA (UHT) EN LA LÍNEA CELULAR HEK-293.......................... 31 FIGURA 19. GRAFICAS EFECTO CITOTÓXICO DEL EXTRACTO DE SEMILLA DE ANNONA MURICATA EN LAS LÍNEAS

CÉLULARES MCF-7 Y HEK-293. ....................................................................................................... 33 FIGURA 20. GRÁFICO EFECTO CITOTÓXICO DEL EXTRACTO DE HOJAS DE ANNONA CHERIMOLA EN LAS LÍNEAS

CÉLULARES MCF-7 Y HEK-293. ....................................................................................................... 34 FIGURA 21. GRÁFICO EFECTO CITOTÓXICO DEL EXTRACTO DE SEMILLAS DE ANNONA CHERIMOLA EN LAS LÍNEAS

CÉLULARES MCF-7 Y HEK-293. ....................................................................................................... 35 FIGURA 22. GRÁFICO EFECTO CITOTÓXICO DEL EXTRACTO DE HOJAS Y TALLOS DE PHYSALIS PERUVIANA EN LAS LÍNEAS

CÉLULARES MCF-7 Y HEK-293. ....................................................................................................... 37 FIGURA 23. GRÁFICO DE RESIDUALES PARA PRUEBA DE HOMOGENEIDAD. ......... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO. FIGURA 24. GRÁFICO DE QQPLOT PARA PRUEBA DE NORMALIDAD Y PRUEBA DE SHAPIRO-WILK. ................ ¡ERROR!

MARCADOR NO DEFINIDO. FIGURA 25. GRÁFICO INTEGRADO DEL EFECTO CITOTÓXICO DE LOS EXTRACTOS DE PHYSALIS PERUVIANA (1), A.

CHERIMOLA (2 Y 3) Y A. MURICATA (4) EN LA LÍNEA CÉLULAR MCF-7 ....... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

INDICE DE TABLAS

TABLA 1. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LA ESPECIE ANNONA MURICATA Y ANNONA CHERIMOLA ...................... 5 TABLA 2. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LA ESPECIE PHYSALIS PERUVIANA. ..................................................... 8 TABLA 3. PESOS DEL MATERIAL SECO-MACERADO Y CANTIDAD DE SOLVENTE UTILIZADO. .................................... 17 TABLA 4. PESO DE 10 ML DE EXTRACTOS TOTALES CONCENTRADOS. .............................................................. 17 TABLA 5. PESOS Y RENDIMIENTO DE LOS EXTRACTOS. ................................................................................... 22 TABLA 6. METABOLITOS IDENTIFICADOS CUALITATIVAMENTE PRESENTES EN LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS Y

FRACCIONES DE ÉTER DE PETRÓLEO. .................................................................................................. 23

RESUMEN

Colombia se conoce como el segundo país con mayor riqueza en flora del mundo con aproximadamente 49.000 especies, las cuales han sido poco estudiadas, por ende no se tiene un conocimiento de su composición química o de una posible actividad farmacológica. Los bosques Colombianos poseen un gran potencial de bioprospección, puesto que cerca del 50-60% de compuestos naturales o sus derivados poseen importantes moléculas bioactivas con acción antitumoral. Algunos estudios han demostrado que algunas plantas del género Annona y Physalis poseen propiedades anticancerosas, de los cuales se conocen importantes compuesto como el annonancin y los withanolidos respectivamente, de ambos géneros se tiene un previo conocimiento sobre su actividad antifúngica, antitumoral, antimicrobiano y antiinflamatorio, por ende la importancia de evaluar su actividad citotóxica. En el presente estudio se evaluó la actividad citotóxica de los extractos crudos obtenidos a partir de las plantas Annona cherimola, Annona muricata y Physalis peruviana frente a la línea célular tumoral MCF-7 de adenocarcinoma de seno, mediante el ensayo de MTT. Mediante este método se evaluaron concentraciones desde 2 µg/mL hasta 200µg/mL durante 48 h de los extractos etanólicos de las plantas Annona muricata, Annona cherimola y Physalis peruviana y se comparo con el efecto de la vincristina a una concentración 120 nM. Los resultados mostraron que a una concentración de 120nM de vincristina las celulas MCF-7 tienen un porcentaje de viabilidad del 28%, y se encontró que a una concentración de 75 μg/mL las células MCF-7 presentaron un bajo porcentaje de viabilidad para los extractos de semillas de Annona muricata, semillas de Annona cherimola, hojas de Annona cherimola y hojas y tallos de Physalis peruviana con un IC50 = 9 μg/mL, IC50 = 34 μg/mL, IC50 = 11 μg/mL, IC50 = 8 μg/mL respectivamente, obteniendo en esta concentración un tratamiento adecuado para los extractos de P. peruviana y hojas de A. cherimola , dado que no se observa menos de un 86% de viabilidad celular para las células HEK-293. Mientras que para los extractos de semillas de Annona muricata, Annona cherimola se escogió una concentración del 25 µg/mL. En conclusión el extracto de hojas y tallos de Physalis peruviana fue el mejor tratamiento, seguido por el de semillas de Annona muricata y de Annona cherimola sin encontrase diferencias estadísticamente significativas (P<0,05).

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1. INTRODUCCIÓN

La organización mundial de la salud (OMS) ha clasificado al cáncer como el responsable del 63% de muertes en todo el mundo (Sawadogo W et al. 2012), por ende su relevancia en la búsqueda de nuevos medicamentos con actividad anticancerígena.

El cáncer causa alrededor de 3,2 millones de muertes al año, por lo que el índice de mortalidad según la sociedad americana de cáncer constituye el 2% al 3% de las muertes anuales registradas a nivel mundial (Unnati S, et al. 2013). Dentro de los cánceres con mayor importancia se encuentra el cáncer de seno, puesto que es el más común entre las mujeres a nivel mundial (OMS 2013) y la primera causa de muerte en el mundo y la tercera en Colombia (Liga colombiana contra el cáncer, 2013).

El cáncer de seno exhibe una notable heterogeneidad, debido a la alteración en los receptores hormonales (estrógeno, progesterona), el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2/neu), tamaño del tumor, grado y estado ganglionar; por lo tanto, se plantean diferentes necesidades de tratamiento y esto lleva a la búsqueda de nuevos fármacos para el tratamiento y control de esta enfermedad (Carvalho A, et al.2012).

Las sustancias derivadas de plantas han sido durante siglos el pilar de la medicina tradicional antes de la llegada de la medicina alopática (Dhanamani et al. 2011). La búsqueda de organismos y microorganismos con actividad antitumoral se inicio en la década de los 50’s, en los cuales se encontraron principalmente flavonoides con características anticancerosas (Cragg and Newman, 2005) y desde entonces se ha incrementado el uso de productos naturales en los tratamientos de cáncer.

Según Cragg y Newman (2000), más del 50 % de los fármacos en ensayos clínicos para la actividad contra el cáncer fueron aislados de fuentes naturales o se relacionan con ellas. Se puede incluir los alcaloides de la Vinca, vinblastina y vincristina, aislados a partir de Catharanthus roseus (Apocynaceae), los derivados semisintéticos de epipodofilotoxina, aislados de las especies del género Podophyllum (Berberidaceae), así como los taxanos aislado de especies del género Taxus (Taxaceae), los derivados semi sintéticos de camptotecina, irinotecan y topotecan, aislado de Camptotheca acuminata (Nyssaceae), entre otros (De Mesquita M, et.al., 2009).

Las Acetogeninas annonaceous son un grupo de agentes antineoplásicos, los cuales han sido aislados de las plantas Annonaceae (Hwan D, et.al., 2001). Algunos de estos compuestos han sido aislados de las plantas Annona muricata y Annona cherimola, y basados en el estudio químico taxonómico en plantas que tienen un parentesco cercano se ha centrado la búsqueda en estas plantas, las cuales contienen un alto potencial antineoplásico (Torres M, et. al., 2012).

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Adicionalmente, otra planta con alto potencial como antineoplásico es Physalis peruviana, la cual contiene compuestos bioactivos que exhiben efectos anti-inflamatorios, antimicrobianos, antifúngicos y antitumorales, en los cuales se incluyen los withanolidos (Fang, S et al. 2012)

El objetivo de esta investigación es obtener extractos crudos de las plantas Annona muricata, Annona cherimola y Physalis peruviana, posteriormente realizar una marcha fitoquímica para evaluar cualitativamente los metabolitos secundarios presentes en los extractos y evaluar su actividad citotóxica observando el efecto de los extractos sobre las líneas celulares MCF-7 de adenocarcinoma de seno y la línea celular sana HEK293 mediante el ensayo de viabilidad celular MTT.

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2. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

2.1. Pregunta de investigación ¿Los extractos etanólicos de las plantas Annona muricata, Annona cherimola y Physalis peruviana, poseen actividad citotóxica frente a células MCF-7 de adenocarcinoma de seno?

2.2. Planteamiento del problema y justificación El cáncer de seno es un gran problema de salud en Colombia, el cual tiene un alto impacto psicológico, social y económico en la comunidad. Su detección es primordial para saber el tipo de tratamiento que se va a suministrar al paciente, puesto que según el avance del cáncer se puede realizar quimioterapia, radioterapia, hormonoterapia, cirugía o terapias dirigidas (Cragg and Newman, 2005).

La falta de control en la proliferación celular, la diferenciación y la muerte celular programada, son las principales características del cáncer, por las cuales su tratamiento es de mayor dificultad, puesto que existe una alta frecuencia de resistencia a los medicamentos, hay baja especificidad y los tratamientos se vuelven tóxicos para las células no tumorales, lo cual afecta la salud del paciente (De Mesquita, 2009), esto ocasiona la disminución de la calidad de vida del paciente, además tiene efectos psicológicos, sociales y económicos, por ende son factores que se deben combatir para poder contrarrestar la morbilidad y la mortalidad del cáncer de seno.

En Colombia la respuesta social en relación con actividades de detección temprana para el cáncer de seno muestra serias dificultades en el acceso a un diagnóstico definitivo a partir de una prueba de tamización sospechosa, así como dificultades en el acceso y la oportunidad de la atención (INC, 2012).

Adicionalmente, estos tratamientos son muy costosos, por lo que se vuelve poco asequible para la población de países en vía de desarrollo como es el caso de Colombia, por lo cual se plantea la necesidad de buscar un tratamiento adyuvante fitoquímico preventivo y post detección, el cual sea menos costoso, eficiente y especifico, y se obtenga a partir de productos naturales, no genere un efecto negativo y brinde mayor esperanza con calidad de vida a los pacientes.

De igual forma aprovechando que Colombia es un país mega diverso y rico en flora, el cual ha sido poco estudiado como potencial medicinal, se busca a partir de una investigación en plantas promisorias, extractos crudos totales que presenten actividad citotóxica frente a células cancerosas de seno y no presenten una actividad citotóxica frente a células sanas.

Actualmente los estudios en busca de componentes bioactivos es estas especies no se ha realizado a fondo, puesto que pocas investigaciones se han enfocado en buscar la actividad antitumoral, específicamente para las células cancerosas de seno.

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3. MARCO TEORICO-REFERENTES CONCEPTUALES

3.1. Productos naturales bioactivos y metabolitos secundarios Hay cerca de 500.000 especies de plantas que crecen en la tierra, y se estima que al menos 5.000 compuestos químicos diferentes de metabolitos secundarios están presentes en una sola especie de planta (Tringali C, 2001).

Desde la antigüedad los productos naturales han sido fuente importante de medicamentos, y actualmente cerca de la mitad de los fármacos útiles son derivados de estos, esto debido a la quimio diversidad de la naturaleza. Sin embargo, el problema radica en la identificación de los compuestos bioactivos presentes en los productos naturales (Tringali C, 2001).

Los compuestos bioactivos naturales están constituidos por una alta variedad de estructuras con múltiples funcionalidades, las cuales proporcionan un conjunto de moléculas potenciales para la producción de productos farmacéuticos (Gil JG, et al. 2013), por ende surge la importancia de evaluar su efecto citotóxico como extracto crudo, para posteriormente realizar una búsqueda mas especifica hasta llegar a la molécula o compuesto de interés.

Estos compuestos naturales de las plantas se dividen en metabolitos primarios y metabolitos secundarios. Los metabolitos primarios son aquellos que son esenciales para las necesidades metabólicas de las plantas, en los cuales encontramos los azucares, aminoácidos, ácidos grasos y ácidos nucleicos, y otros compuesto que esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta, es decir son los vitales (Gil JG, et al. 2013). Por otra parte se encuentran los metabolitos secundarios, los cuales son productos de rutas bioquímicas secundarias que les permite sintetizar productos químicos, a menudo en respuesta a los estímulos ambientales específicos. Estos metabolitos secundarios pueden ser exclusivos de especies o géneros específicos y no desempeñan ningún papel en las necesidades metabólicas primarias de las plantas. Estos metabolitos secundarios le proporcionan la planta su capacidad general para sobrevivir y superar los desafíos locales, lo que les permite interactuar con su medio ambiente (Kennedy DO y Wightman EL, 2011).

Debido a la amplia gama de funciones que los metabolitos secundarios de las plantas tienen en las células vegetales, estos compuestos son de especial interés para los investigadores que centran sus estudios sobre su bioactividad para aplicaciones útiles. Sobre la base de sus orígenes biosintéticos, los metabolitos secundarios de plantas se pueden dividir en 5 grupos: Policétidos, terpenos, compuestos fenólicos, glicósidos y alcaloides (Gil et al. 2013).

3.2. Descripción, Clasificación y distribución geográfica del género Annona y Physalis

3.2.1. Genero Annona El número de géneros y especies en la familias de las Annonaceae todavía se discute, puesto que Bailey afirmo que existen 46 géneros y entre 500 y 600 especies, mientras que Fries afirmo que

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contiene 119 géneros y más de 2000 especies; por otra parte Popenoe describe que la familia Annonacea contiene 40 a 50 géneros y más de 500 especies (Pinto, 2005); por ende este dato aun es ambiguo.

Después de la llegada de los españoles en el continente americano, la especie Annona se distribuyó en todo el trópico. Arboles de este género son comunes en los trópicos y subtrópicos, se encuentran en las indias occidentales, el norte y sur de América, las tierras bajas de África, islas del pacifico y el sudeste asiático (Badrie N et al. 2010). Un número limitado de especies produce frutos comestibles, los cuales se encuentran silvestres y otros han sido domesticados. (Pinto, 2005).

El género corresponde a arbustos o arboles pequeños con estatura de 5 a 11 m, esto depende de factores como la especie, el clima, el suelo y el manejo del cultivo. Su corteza y tallo posee un color gris-café, una textura áspera y ondulada. Son caducifolios, es decir, en ciertas épocas los arboles se encuentran desprovistos de hojas (Pinto, 2005). Poseen abundantes raíces finas laterales y una raíz principal que generalmente no se pronuncia, cuando el árbol se encuentra en estado adulto la raíz puede alcanzar una profundidad de 1,5 a 1,8m, todo depende de las características del suelo (Pinto, 2005).

Las flores son hermafroditas, se encuentran solitarias o en fascículos con 2 a 4 flores, con tres sépalos de color verde y seis pétalos dispuestos en dos verticilos. El verticilo externo tiene tres pétalos de color amarillo-verdoso y el interno tiene tres pétalos amarillentos. Posee varios estambres conglomerados y dispuestas en espiral por debajo y alrededor de la parte superior, formando una cúpula de numerosos carpelos unidos, que tienen un ovulo cada uno. Después de la fertilización, los carpelos unidos formaran un sincarpo o fruta compuesta (Pinto, 2005).

Las especies a estudiar son de especial interés por su comercio y la reciente investigación en la producción de fármacos encontrados a partir de extractos de hojas y semillas de los frutos comúnmente conocidas en Colombia como guanábana (Annona muricata) y chirimoya (Annona cherimola) pertenecientes a la familia Annonaceae (tabla 1).

Tabla 1. Clasificación taxonómica de la especie Annona muricata y Annona cherimola

Filo Clase Orden Familia Genero Especie

Angiospermophyta Magnoliophyta

Magnoliopsida magnoliales Annonaceae Annona Annona muricata

Angiospermophyta Magnoliophyta

Magnoliopsida magnoliales Annonaceae Annona Annona cherimola

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3.2.1.1. Annona muricata

Conocido comúnmente en Colombia como guanábana, es un árbol delgado de altura baja que llega a medir entre 4 a 8 m de altura, de hoja perenne. En Suramérica se domestico como planta de jardín. Los tallos son redondos, ásperos y no pubescentes, poseen un color café oscuro. Las hojas tienen peciolos cortos y son ovaladas a cilíndrica con un largo de 14 a 16 cm y un ancho de 5 a 7 cm (Pinto, 2005).

El árbol de Annona muricata produce frutas de forma oblonga, elíptica o en forma de corazón, las cuales poseen un color verde, esta fruta es la comúnmente llamada en Colombia como guanábana. La corteza de la fruta posee en su madurez numerosas prolongaciones puntiagudas, parecidas a “espinas”. La fruta puede contener de 127 a 170 semillas, repartidos por toda la pulpa, y su tamaño varia de 1 a 2 cm de longitud con un peso de 0,33 a 0,59 g, poseen un color negro que con el tiempo se torna café oscuro (Fig. 1) (Pinto, 2005).

Figura 1. Partes y características de la planta Annona cherimola. Imagen tomada de (Pinto, 2005).

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3.2.1.2. Annona cherimola

Conocida comúnmente en Colombia como chirimoya, es una árbol pequeño de hoja caduca, que rara vez alcanza más de 15 m. posee hojas simples y alternas, con una forma ovada-lanceoladas elípticas, con una longitud de 10 a 25 cm. Su aspecto brillante es debido a las glabras en la superficie ventral y dorsal (Pinto, 2005). La floración comienza cuando el árbol tiene una edad de 3 a 4 años, la flor emerge de las axilas de las hojas y posee un pedúnculo corto de 2,4 cm, la floración depende del ambiente (Pinto, 2005).

La fruta es normalmente en forma de corazón, cónica, ovalada o algunas veces de forma irregular debido a la polinización irregular. El fruto puede medir de 7,5 a 12,5 cm de largo y tener un peso de 200 a 700g. La superficie de la fruta depende de la variedad, pero la comúnmente conocida y trabajada posee una superficie suave y fina, con un color verde-amarillo dependiendo de su estado de madurez. Adicionalmente la fruta puede contener de 21 a 41 semillas, con una longitud de 1,5 a 2,0 cm y un ancho de 1,0 cm (Fig. 2) (Pinto, 2005).

Figura 2. Partes y características de la planta Annona Cherimola. Imagen tomada de Pinto, 2005.

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3.2.2. Genero Physalis Comprende entre 75 y 90 especies, es una de los géneros más grandes de la familia Solanaceae. Se encuentran en las zonas cálidas ya sea como cultivo o en forma de maleza. Es un género característico debido a cáliz que se desarrollo durante el periodo de fructificación, rodeando la baya/fruto completamente, debido a esta importante característica Physalis es el género más fácil de reconocer dentro de la familia de las Solanaceae (Dostert, 2011).

Las especies de Physalis son anuales o perennes, con flores solitarias y exiliares de color amarillo con un centro negro difuso. La corola es normalmente indivisa, campanulada, frecuentemente presenta puntos oscuros en la base (Dostert, 2011).

La especie de mayor relevancia en Colombia debido a su comercio y consumo es la especie Physalis peruviana, en la cual Colombia ocupa el primer puesto en exportación (Mazorra et al. 2006). Su clasificación botánica o taxonómica se observa en la tabla 2.

Tabla 2. Clasificación taxonómica de la especie Physalis peruviana.

Filo Clase Orden Familia Genero Especie

Magnoliophyta Magnoliopsida Solanales solanaceae Physalis Physalis peruviana

3.2.2.1. Physalis peruviana

Es originaria de los Andes del norte de Suramérica y actualmente es cultivada en todos los Andes Suramericanos. P. peruviana está hoy documentada en varios países, como por ejemplo, Perú, Colombia, Ecuador, Chile, Venezuela, Hungría, India, Australia, China, Macronesia y Sudáfrica (Dostert, 2011).

Es una hierba perenne, mide aproximadamente desde 45 a 9 cm de alto, posee un tallo erecto poco ramificado, cilíndrico y densamente pubescente. La raíz principal alcanza una profundidad de 50 a 80 cm. La mayoría de las raíces son fibrosas y se desarrollan a una profundidad de 10 a 15 cm (Dostert, 2011). El peciolo tiene una longitud aproximada de 2 a 6 cm, y la lamina foliar es anchamente aovada, con una longitud de 0,9 a 13,5 cm y un ancho de 1,4 a 10 cm. Las hojas son alternas, densamente pubescentes, con base sub-cordadas, enteras o con pocos dientes inconspicuos, y cortamente apiculadas (Dostert, 2011). El pedículo floral es de 10 a 13mm de largo; el cáliz es anchamente campanulado, en floración mide de 15 a 18 cm de largo y pubescente en la cara exterior, en fructificación es acrescente, de color verde a beige, ovoide, con 5 a 10 nervios sobresaliente y algo rojizos con 8-10 cm de largo y 3 mm de ancho, laxamente pubescente en la cara exterior (Dostert, 2011).

La corola es amarilla, con cinco máculas púrpuras, en la garganta de tubo de la corola, 1—1,8 cm de largo y 1,2—2 cm de ancho, con un anillo denso de tricomas debajo de las máculas. Los

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filamentos y anteras son (azul-) púrpuras y las anteras de 2.5—3 mm de largo. El ovario es verde con un anillo o disco en base, estilo púrpura con estigma claviforme. Las bayas maduras son amarillas a anaranjadas, 1—2 cm de longitud y 1-1.5 cm ancho (diámetro) y pesan 4—10 gr. Los frutos contienen 100—200(—300) semillas amarillas, de 1,25—2,5 mm de diámetro (Dostert, 2011).

3.3. Uso y antecedentes fitoquímicos del género Annona y Physalis

3.3.1. Género Annona Se han obtenido compuestos bioactivos encontrados en las raíces, hojas, cortezas, semillas y frutas, principalmente compuestos como las acetogeninas, flavonoides y alcaloides. Teniendo en cuenta su efecto citotóxico, se ha descrito como potencial agente anti-cancerígeno. También se ha descrito que su uso como cardiotónico, insecticida, antiparasitario, anticonvulsivos y actividad de tipo ansiolítico (Carballo et al. 2010, Ferreira et al. 2013).

Adicionalmente en la Annona cherimola se han identificado compuestos que promueven la salud, como cherimoline, cherinonaine, kauranes, ligananos, amidas, purinas, amida lactamicos, esteroides, ρ-quinona, benzenoides y poliaminas (Barreca et al. 2011)

3.3.2. Género Physalis Las bayas han demostrado proporcionar beneficios para la salud debido a su alto contenido de antioxidantes, vitaminas, minerales y fribras (Radam, 2011).

Se han reportado compuestos bioactivos presentes en Physalis peruviana tales como los withanolidos y compuestos fenólicos, los cuales tienen propiedades antioxidantes, anti-inflamatoria, antihepatotoxica, anti-hepatoma, y aportan alto contenido de vitaminas (Radam, 2011).

3.4. División celular y el origen del cáncer Las células crecen y se multiplican a través de un proceso que se conoce como división celular, el cual es controlado en el núcleo de cada célula, puesto que da la información correspondiente sobre donde deben crecer y como deben funcionar correctamente. Cuando las células se replican, forman dos células hijas idénticas, ciertas proteínas hacen parte de esta división celular y algunas de ellas dan la información a la célula de cuando dividirse o no dividirse o son responsables de que el ADN se copie con precisión (Cragg and Newman, 2005).

Los genes que promueven el crecimiento y la división celular se denominan oncogenes, y aquellos encargado de desacelerar la división celular o responsables de hacer que las celular mueran en el momento indicado se denominan genes supresores de tumores. El cáncer generalmente es causado por mutaciones en el ADN, las cuales pueden activar los oncogenes y/o desactivar los genes supresores de tumores (Tan et al. 2005, cáncer 2014)

3.5. Anatomía del seno y cáncer de seno El seno femenino está compuesto principalmente por lobulillos, conductos y estroma (breast cáncer, 2013). Todas las células del seno realizan la división celular mencionada anteriormente.

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El cáncer se genera cuando las células se dividen sin control y demasiado rápido, formando una masa de tejido anormal llamado tumor, lo cual es debido a una anormalidad genética (Cragg and Newman, 2005). El cáncer de seno es la proliferación descontrolada de las células mamarias, estas células cancerosas pueden invadir el tejido sano circundante dándose paso a los ganglios linfáticos, por ende podrán tener acceso a todo el cuerpo y generar una metástasis invadiendo los demás órganos.

3.6. Incidencia y mortalidad. El cáncer de seno es el segundo cáncer más común en el mundo (figura 3), y el mas frecuente entre las mujeres con un estimado de 1,67 millones de nuevos de cáncer diagnosticados en el 2012, lo cual corresponde al 25% de todos los canceres (OMS, 2012).

Figura 3. Incidencia y mortalidad según el tipo de cáncer, estandarizada por edades de hombres y mujeres. Imagen tomada de OMS (2012). Globocan.iarc.fr.

Ocasiona 522.000 muertes, lo cual lo posiciona como la quinta causa de muerte por cáncer en general, y es la causa más frecuente de muerte en mujeres en los países en vía de desarrollo, puesto que causa 324.000 defunciones correspondientes al 14,3% del total. Actualmente es la

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segunda muerte por cáncer en los países desarrollados (198.000 muertes, 15,4%) después del cáncer de pulmón (figura 4) (OMS, 2012).

Figura 4. Incidencia y mortalidad de cáncer de seno en el mundo. Imagen tomada de OMS (2012). Globocan.iarc.fr.

Anualmente se diagnostican cerca de 1.38 millones de casos de cáncer de seno y ocurren 458 mil muertes (Baena A, et al. 2011). La incidencia de morbilidad y mortalidad aumenta drásticamente en países en desarrollo, como lo es Colombia y esto es debido al sistema de salud, puesto que los tratamientos llegan a las mujeres 6 meses e incluso 1 año después de su diagnostico por lo cual esto repercute en un problema mayor en la salud de la mujer, mientras que las mujeres que tienen una atención privada recibe un tratamiento luego de confirmar el diagnostico de la enfermedad.

Las muertes a causa del cáncer representan cerca del 15% del total de las defunciones en Colombia, posicionándolo en el tercer lugar de la mortalidad general y el segundo lugar en mujeres para el 2008, por cual ubica a esta enfermedad como un problema de salud pública (INC, 2012).

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3.7. Tratamientos para el cáncer Los tratamientos difieren según los estadios del cáncer (breast cáncer, 2013). Los tratamientos existentes son: Cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia dirigida, inmunoterapia, la hipertermia, trasplante de células madre, terapia fotodinámica, laser, donación de sangre del producto y transfusión, terapia molecular dirigida (American Cáncer Society, 2013).

3.8. Clasificación de medicamentos quimioterapéuticos. Los medicamentos quimioterapéuticos se dividen en carios grupos basándose en su mecanismo de acción, estructura química y su relación con otros medicamentos. Es importante conocer el mecanismo de acción de un medicamente, puesto que dependiendo de este factor se puede predecir sus efectos secundarios (American Cáncer Society, 2013).

Se clasifican en:

3.8.1. Agentes alquilantes Dañan directamente el ADN evitando la reproducción de las células tumorales. Estos agentes no son específicos de la fase, es decir pueden actuar en todas las fases del ciclo celular. Se utilizan para tratar la leucemia, linfomas, la enfermedad de Hodgkin, melanoma múltiple y el sarcoma, al igual que canceres de pulmón, seno y de ovarios (American Cáncer Society, 2013).

Estos medicamentos al actuar directamente en el ADN celular, pueden causar daños a largo plazo en la medula ósea, teniendo como riego padecer de leucemia luego de 5 a 10 años de tratamiento (American Cáncer Society, 2013).

Los tipos de alquilantes son:

• Mostazas nitrogenadas • Nitroso ureas • Alquil sulfonatos • Triazinas • Etilenimas • Algunos medicamentos con platino

(American Cáncer Society, 2013).

3.8.2. Antimetabolitos Se encargan de sustituís elementos fundamentales del ADN y el ARN, causando un daño en las células en la fase S. se utilizan normalmente para tratar leucemias, canceres de seno, ovario y tracto intestinal, etc (American Cáncer Society, 2013).

3.8.3. Antibióticos contra el cáncer • Antraciclinas: interfieren con las enzimas involucradas en la replicación de

ADN, actuando durante todas las fases del ciclo celular y se usan ampliamente para tratar varios tipos de cáncer. Pueden causar daños cardiovasculares si se suministran altas dosis (American Cáncer Society, 2013).

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• No antraciclinas: actúan de igual manera que las antraciclinas. Se encuentran antibióticos como actinomicina D, Bleomicina y la mitocina-C (American Cáncer Society, 2013).

3.8.4. Inhibidores de la topoisomerasa Estos medicamentos interfieren con las enzimas llamadas topoisomeras, las cuales están encargadas de mantener la estructura terciaria del ADN, siendo la encargada del enrollamiento o desenrrollamiento, durante la síntesis, replicación, condensación y descondensación del ADN (American Cáncer Society, 2013).

Los tratamientos inhibidores de la topoisomerasa II pueden causar leucemia secundaria después de un tratamiento de 2 a 3 años (American Cáncer Society, 2013).

3.8.5. Inhibidores de la mitosis Generalmente son alcaloides de origen vegetal y otros compuestos derivados de productos naturales. Actúan deteniendo la mitosis o evitando que las enzimas implicadas en este proceso sinteticen las proteínas necesarias para la reproducción celular (American Cáncer Society, 2013).

Estos medicamentos ejercen su acción durante la fase M del ciclo celular, pero pueden causar daño en todas las fases. A largo plazo puede causar daño en los nervios periféricos (American Cáncer Society, 2013).

Dentro de este grupo se encuentran los taxenos, epotilones, los alcaloides de la vinca y la estramustina (American Cáncer Society, 2013).

3.8.6. Terapia hormonal Se utilizan hormonas sexuales o medicamentos que actúan inhibiendo la producción de hormonas o cambian la acción de las hormonas implicadas en el desarrollo de las células cancerígenas, es decir, esta terapia evita que la célula tumoral use la hormona necesaria para su crecimiento y su reproducción, o evita que el cuerpo produzca esta hormona (American Cáncer Society, 2013).

3.8.7. Otros medicamentos quimioterapéuticos En este grupo se encuentran aquello que tienen un mecanismo de acción diferente y no se pueden clasificar en ninguna categoría. Dentro de este grupo se encuentran la L-asparaginasa (enzima) y el bortezomib (inhibidor de la proteosoma) (American Cáncer Society, 2013).

3.8.8. Terapias dirigidas Son tratamientos que se desarrollaron a partir del funcionamiento interno de las células tumorales, es decir, se han creado nuevos medicamentos más específicos utilizando genes mutados o células que sobre expresen un gen de interés (American Cáncer Society, 2013).

3.8.9. Agentes de diferenciación Estos medicamentos actúan sobre las células cancerosas haciéndolas madurar como las celulas sanas (American Cáncer Society, 2013).

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3.8.10. Inmunoterapia Es el uso de medicamentos que estimulan el sistema inmune, de tal forma que puede reconocer y atacar las células tumorales. Dentro de este grupo se encuentran las vacunas contra el cáncer, la terapia con anticuerpos monoclonales y los inmunodulantes (American Cáncer Society, 2013).

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4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general Evaluar el potencial de actividad citotóxica de diferentes extractos crudos frente a células cancerosas MCF-7 de seno, obtenidos a partir de las plantas Annona cherimola (chirimoya), Annona muricata (guanabana) y Physalis peruviana (uchuva).

4.2. Objetivos específicos 4.2.1 Obtener extractos polares de las plantas seleccionadas. 4.2.2 Evaluar la actividad citotóxica de los extractos crudos de las plantas Annona

cherimola, Annona muricata y Physalis peruviana frente a la línea celular carcinogénica MCF-7 de cáncer de seno (adenocarcinoma) y la línea celular sana HEK-293.

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5. METODOLOGIA

5.1. Diseño de la investigación Finalidad : Analítico Secuencia temporal: longitudinal Control de asignación de los factores de estudio: experimental Direccionalidad contexto tiempo: prospectivo Niveles del factor de diseño

a) Extracto etanólico de hojas de Annona cherimola b) Extracto etanólico de semillas de Annona cherimola c) Extracto etanólico de semillas de Annona muricata d) Extracto etanólico de hojas y tallos de Physalis peruviana

Variable respuesta

Porcentaje (%) de viabilidad celular Unidad de muestreo

Células/ mL de medio RPMI Población de estudio y muestra

La población de estudio corresponde a 7x103 células/ 100μL correspondientes a las líneas celulares MCF-7 y HEK-293, adquiridas de la ATCC

Variables de estudio

a) Variable independiente: concentraciones de los extractos b) Variable dependiente: porcentaje (%) de viabilidad celular

5.2. Recolección y clasificación del material vegetal Se realizó la recolección de las plantas respetando las directrices de la Organización mundial de la salud sobre buenas prácticas agrícolas y de recolección (BPAR) de plantas medicinales (OMS, 2003). Una planta completa de cada especie de Annona cherimola, Annona muricata y Physalis peruviana se recolectaron en la finca “La reina del Caribe” ubicada en Urabá, Antioquia. Se procedió a separar la estructura de interés. Todo el material fue conservado en cadena de frio durante el transporte de tal forma que no se contamirá o se marchitaran.

5.3. Obtención de extractos El material vegetal utilizado correspondiente a hojas y semillas de Annona cherimola, las semillas de Annona muricata y las hojas y tallos de Physalis peruviana, se secaron a temperatura ambiente sin exposición directa a la luz solar durante 4 días.

El material seco se macero en un mortero con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino de las diferentes muestras, el cual fue pesado para realizar posteriormente una relación del solvente a

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utilizar según lo reportado en la literatura (tabla 3). Una vez macerado el material vegetal se realizo una extracción con etanol durante 4 días.

Tabla 3. Pesos del material seco-macerado y cantidad de solvente utilizado.

Planta Peso (g) Etanol (mL)

Annona cherimola (hojas) 118 236

Annona cherimola (semillas) 27 60

Annona muricata (semillas) 63,4 130

Physalis peruviana (hojas y tallos) 138 1380

Los extractos etanólicos fueron filtrados y centrifugados a 7000 rpm por 20 minutos y se recupero el sobrenadante. Posteriormente los extractos filtrados y centrifugados fueron concentrados por rotaevaporación con vacio a una temperatura de 45°C, dejando un volumen de 80 mL aproximadamente para cada uno, y posteriormente se concentraron en una campana de vacío obteniéndose los pesos totales de los extractos a evaluar (tabla 4).

Tabla 4. Peso de 10 mL de extractos totales concentrados.

Planta Peso (g)

Annona cherimola (hojas) 0,9879

Annona cherimola (semillas) 0,6629

Annona muricata (semillas) 1,016

Physalis peruviana (hojas y tallos) 1,8461

5.4. Pruebas químicas preliminares Se realizaron pruebas fitoquímicas preliminares o las comúnmente llamadas “marcha fitoquímica” con el fin de caracterizar los metabolitos secundarios contenidos en los diferentes extractos. Es una detección rápida colorimétrica, es decir, se produce una reacción química que altera rápidamente la estructura molecular del compuesto.

Como los extractos son etanólicos, se realizaron pruebas rápidas para detectar flavonoides, fenoles, saponinas, glicósidos y alcaloides utilizando el método descrito por Wall. Todos los extractos fueron diluidos en etanol y se pasaron 5 mL de extracto diluido a un tubo de hemolisis para cada prueba. Adicionalmente se realizo un fraccionamiento en éter de petróleo de cada muestra con el fin de detectar esteroides, esteroles, terpenos y sesquiterpenlactonas.

Las pruebas para los extractos etanólicos fueron las siguientes:

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• Prueba de Shinoda: esta prueba determina los fenoles y flavonoides presentes en los extractos a través de la formación de un compuesto de color naranja-rojizo (Fig. 5). Para realizar este ensayo se tomo un tubo de hemolisis con el extracto y se le adiciono 1 cm de Mg y 4 gotas de HCl 2N.

Figura 5. Reacción de la prueba de Shinoda. Imagen tomada de http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/90/Shinoda_test.png

• Prueba de cloruro férrico FeCl3: esta prueba determina los flavonoides y fenoles presentes en los extractos a través de la formación de un compuesto de color verde fuerte o verde oliva (Fig. 6). Para realizar este ensayo se tomo un tubo de hemolisis con el extracto y se le adicionaron 4 gotas de FeCl3 al 1%.

Figura 6. Reacción de la prueba de cloruro férrico. Imagen tomada de http://lh5.ggpht.com

• prueba de antrona: esta prueba determina los glucósidos de flavonoides o de terpenos presentes en los extractos a través de la formación de un anillo verde en la interfase (Fig. 7). Para realizar este ensayo se tomo un tubo de hemolisis con el extracto y se le adiciono 1 mL de antrona diluido en H2SO4 concentrado.

Figura 7. Reacción de la prueba de Antrona. Imagen tomada de http://intranet.tdmu.edu.ua

• Prueba de Dragendorff: esta prueba se realiza para determinar los alcaloides presentes en

los extracto a través de la formación de un precipitado naranja (Fig. 8). Para realizar este

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ensayo se tomo un tubo de hemolisis con el extracto y se le adicionaron 4 gotas de HCl y 4 gotas del reactivo de Dragendorff (yoduro de bismuto).

Figura 8. Reacción de la prueba de Dragendorff. Imagen tomada de http://es.scribd.com/doc/38898384/La-reaccion-de-Vitali

• Prueba de la espuma: esta prueba se realiza para determinar las saponinas presentes en los extractos a través de la formación de una espuma constante durante 15 min o más. Para realizar este ensayo se tomo un tubo de hemolisis con el extracto y se le adicionó 1 mL de agua y se agito fuerte.

Las pruebas para las fracciones de éter de petróleo con cloroformo fueron las siguientes:

• Prueba de Liebermann-Burchard: esta prueba se realiza para determinar esteroides y esteroles presentes en los extracto a través de la formación de coloraciones rosa, violeta, azul o verde (Fig. 9). Para realizar este ensayo se tomo un tubo de hemolisis con el extracto y se le adicionaron 4 gotas de del reactivo de Lierberman-Burchard (Anhídrido acético con acido sulfúrico).

Figura 9. Reacción de la prueba de Lierberman-Burchard. Imagen tomada de http://upload.wikimedia.org

• Prueba de Salkowski: esta prueba se realiza para determinar terpenos presentes en los extracto a través de la formación de un complejo de coloración amarillo-rojiza. Para realizar este ensayo se tomo un tubo de hemolisis con el extracto y se le adicionaron 4 gotas acido sulfúrico (H2SO4). Su reacción es similar a la prueba de Lieberman-Burchard.

• Prueba de Baljet: esta prueba se realiza para determinar terpenos y esteroles presentes en los extracto a través de la formación de un complejo de coloración amarillo (Fig. 10).

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Para realizar este ensayo se tomo un tubo de hemolisis con el extracto y se le adicionaron la solución A (acido pícrico) y la solución B (NaOH).

Figura 10. Reacción de la prueba de Baljet. Imagen tomada de http://intranet.tdmu.edu.ua

• Prueba de Hidroxamato férrico: esta prueba se realiza para determinar sequiterpenlactonas presentes en los extracto a través de la formación de un complejo de coloración café o violeta (Fig. 11). Para realizar este ensayo se tomo un tubo de hemolisis con el extracto y se le adicionaron 2 gotas de MeOH 2N de Clorhidrato de hidroxilamina, 2 gotas de MeOH 2N de KOH, HCl 0,5 N y FeCl3, y se llevo a baño maría hasta observar cambio o dilución de compuestos.

Figura 11. Reacción química de la prueba de hidroxamato férrico. Imagen tomada de http://1.bp.blogspot.com

5.5. Cultivo y tratamiento de las células La línea celular MCF-7 de adenocarcinoma de seno y la línea celular HEK-293 fueron adquiridas en la ATCC. Las células fueron criopreservadas en el laboratorio de Biología Celular de la Universidad de ciencias aplicada y ambientales (UDCA) en nitrógeno líquido luego de ser enfriadas y congeladas gradualmente a -20 y -86°C.

Para su uso las células se descongelaron y se cultivaron en medio DMEM y RPMI-1640 con 1% L-glutamina, 1% de antibiótico (streptomicina/penicilina) y al 10% de suero fetal bovino y se incubaron al 5% CO2 y 37 °C hasta que alcanzaran el 70 % de confluencia, en este punto se despegaron para realizar el ensayo de actividad citotóxica.

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5.6. Evaluación de la actividad citotóxica de los extractos Mediante el ensayo del MTT modificado por Denizot y Lang (1986) se determinará la citotoxicidad de los extractos aislados sobre células cancerosas de seno. Este ensayo se basa en la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) realizada por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa en un compuesto coloreado de tonalidad azul-morado (formazán), permitiendo determinar la funcionabilidad mitocondrial de las células tratadas. Se emplearon placas de 96 pozos a las que se adhieren las células sembradas (7x104 células/mL). Posteriormente se incubaron a 37 ºC y 5 % de CO2 de 24 h. posteriormente se trataron con los extractos en concentraciones crecientes de 2 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 75 μg/mL, 100 μg/mL y 200 μg/mL, y nuevamente se incubaron a 37 ºC y 5 % de CO2 durante 48 h. pasadas las 48 h de tratamiento se procede a retirar el medio con el extracto y se añaden 100 μL de RPMI-1640 sin rojo fenol y 10 μL reactivo MTT (5mg/mL) y se procederá a incubar las placas células por 4 horas a 37 ºC a 5 % CO2 para permitir la formación de cristales de formazán. Se eliminara el sobrenadante y se añadirán 100μl de DMSO, incubando a temperatura ambiente hasta que los cristales de formazán sean disueltos. Se leerá la absorbancia en un lector de multiplacas a 540nm. La cantidad de células vivas será proporcional a la cantidad de formazán producido (Ecuación 1). De esta manera se obtendrán los datos de concentración efectiva requerida para disminuir el 50% de la viabilidad celular (EC50).

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6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La ciencia ha reconocido desde la antigüedad el valor y la utilidad de los compuesto bioactivos naturales y actualmente el interés por encontrar productos naturales con potencial medicinal ha resurgido.

Realizando experimentos en líneas celulares y en animales se ha demostrado el efecto anticancerígeno de productos naturales para inducir apoptosis y diferenciación celular, mejora el sistema inmune, inhibición de angiogénesis y revertir la resistencia a múltiples fármacos

6.1. Extracción Después de pulverizar el material vegetal, se procedió a pesar y se obtuvo 118 g, 27 g, 63,4 g y 138 g peso seco de semillas de A. muricata, semillas de A. cherimola, hojas de A. cherimola y hojas y tallos de P. peruviana respectivamente. Posterior a la extracción en etanol y a la rotaevaporación se obtuvo un volumen final de 80 mL de cada extracto, a partir de los cuales se tomaron 10 mL del extracto y se secaron utilizando la campana de vacío y se obtuvo un peso de 1,016 g, 0,6629 g, 0,9879 g y 1,8461 g de semillas de A. muricata, semillas de A. cherimola, hojas de A. cherimola y hojas y tallos de P. peruviana respectivamente, y se hizo una relación para hallar la cantidad en 80 mL del extracto, y a partir de este se obtuvo el rendimiento en porcentaje (%) de los extractos etanólicos (tabla 5), obteniendo que el extracto con mejor rendimiento es el extracto de semillas de A. cherimola con un valor de 19,6%, seguido de un 12,5% de rendimiento de las hojas de A. cherimola y el menor valor corresponde al extracto de semillas de A. muricata con un rendimiento del 6,8%.

Tabla 5. Pesos y rendimiento de los extractos.

Planta partes Peso seco (g) Peso total (g) Rendimiento (%)

Annona muricata Semillas 118 8,128 6,8

Annona cherimola Semillas 27 5,3032 19,6

Annona cherimola Hojas 63,4 7,9032 12,5

Physalis peruviana Hojas y tallos 138 14,7680 10,7

6.2. Identificación cualitativa de metabolitos secundarios. A partir de las pruebas químicas preliminares realizadas a los extractos etanólicos y de éter de petróleo de semillas de A. muricata, semillas de A. cherimola, hojas de A. cherimola y hojas y tallos de P. peruviana, fue posible determinar de manera cualitativa la presencia de metabolitos secundarios, tales como flavonoides, fenoles, taninos, glicósidos de flavonoides o de terpenos, alcaloides, saponinas, esteroides, esteroles, terpenos y sequiterpenlactonas (Tabla 6).

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Tabla 6. Metabolitos identificados cualitativamente presentes en los extractos etanólicos y fracciones de éter de petróleo.

*característica de la reacción es débil.

Se puede observar que el extracto de semillas de Annona muricata presenta metabolitos secundarios tales como fenoles, taninos, alcaloides, terpenos y esteroles puesto que dio positivo para las pruebas de cloruro férrico, Dragendorff, Baljet (Fig. 12), lo cual es coherente con el estudio realizado por Arroyo et al (2005) en el cual encontraron una gran cantidad de flavonoides, taninos, alcaloides y terpenos, encontrando en los extractos con terpenos una actividad citotóxica.

Metabolitos secundarios

Prueba reveladora

Característica de reacción

positiva

Resultado obtenido Extractos evaluados

A. muricata

A. cherimolia

(hojas)

A. cherimolia (semillas)

P. peruviana

Flavonoides y fenoles

Prueba de Shinoda

Coloración naranja-rojizo (formación de

gas)

(-) (-) (+)* (-)

Fenoles y taninos

Prueba de FeCl3

Coloración verde oscura

(+) (+) (+) (+)

Glicósidos de flavonoides

Prueba de Antrona

Anillo verde en la interfase

(-) (+)* (+) (+)

Alcaloides Prueba de Dragendorf

Precipitado naranja ladrillo

(+) (+) (+) (-)

Saponinas Prueba de la espuma

Espumas estable

durante 15 min

(-) (-) (-) (+)

Esteroides y esteroles

Prueba de Lierbermann

-Buchard

Coloraciones rosa, violeta, azul o verde

(-) (-) (-) (-)

Terpenos Prueba de Salkowski

Coloración amarillo-rojiza

(-) (-) (-) (-)

Terpenos y esteroles

Prueba de Baljet

Coloración amarilla

(+) (+) (+) (+)

Sequiterpenlactonas

Prueba de hidroxamato

férrico

Coloración café o violeta

(-) (-) (-) (-)

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Figura 12. Resultados de pruebas químicas preliminares para el extracto de semillas de Annona muricata [A] extractos referentes, [B] pruebas para extractos etanólicos: (1) prueba de Shinoda, (2) prueba de FeCl3, (3) prueba de antrona, (4) prueba de Dragendorff y (5) prueba de la espuma. [C] pruebas para fracciones en éter de petróleo: (1) prueba de

hidroxamato férrico, (2) prueba de Baljet, (3) prueba de Salkowski y (4) prueba de Lierbermann-Burchard.

El extracto de hojas de Annona cherimola presenta metabolitos secundarios tales como fenoles, taninos, glicósidos de flavonoides y alcaloides, puesto que dio positivo para las pruebas de Cloruro férrico, antrona y Dragendorff (Fig. 13)

1 2 3 4 5

1 2 3 4

A B

C

25

Figura 13. Resultados de pruebas químicas preliminares para el extracto de hojas de Annona cherimola. [A] extractos referentes, [B] pruebas para extractos etanólicos: (1) prueba de Shinoda, (2) prueba de FeCl3, (3)

prueba de antrona, (4) prueba de Dragendorff y (5) prueba de la espuma. [C] pruebas para fracciones en éter de petróleo: (1) prueba de hidroxamato férrico, (2) prueba de Baljet, (3) prueba de Salkowski y (4) prueba de

Lierbermann-Burchard.

El extracto de semillas de Annona cherimola difirió en el resultado a las metabolitos encontrados en las hojas de esta planta, puesto que presenta flavonoides, fenoles, taninos, glicósidos de flavonoides, alcaloides y terpenos, observando de este modo que dio positivo para un mayor número de pruebas, las cuales fueron la prueba de Shinoda, cloruro férrico, antrona, Dragendorrf y Baljet (Fig. 14).

A B

C

1 2 3 4 5

1 2 3 4

26

Figura 14. Resultados de pruebas químicas preliminares para el extracto de semillas de Annona cherimola. [A]

extractos referentes, [B] pruebas para extractos etanólicos: (1) prueba de Shinoda, (2) prueba de FeCl3, (3) prueba de antrona, (4) prueba de Dragendorff y (5) prueba de la espuma. [C] pruebas para fracciones en éter de petróleo: (1) prueba de hidroxamato férrico, (2) prueba de Baljet, (3) prueba de Salkowski y (4) prueba de Lierbermann-Burchard.

El extracto de hojas y tallos de Physalis peruviana presenta metabolitos secundarios como fenoles, taninos, glicósidos de flavonoides o de terpenos, saponinas y terpenos y esteroles, dando respectivamente positivo para las pruebas de cloruro ferrico, antrona, espuma y Baljet (Fig. 15).

1 2 3 4 5

1 2 3 4

C

A B

27

Figura 15. Resultados de pruebas químicas preliminares para el extracto hojas y tallos de P. peruviana. [A] extractos

referentes, [B] pruebas para extractos etanólicos: (1) prueba de Shinoda, (2) prueba de FeCl3, (3) prueba de antrona, (4) prueba de Dragendorff y (5) prueba de la espuma. [C] pruebas para fracciones en éter de petróleo: (1) prueba de

hidroxamato férrico, (2) prueba de Baljet, (3) prueba de Salkowski y (4) prueba de Lierbermann-Burchard.

El valor medicinal de estas plantas radica en sus constituyentes fitoquímicos bioactivos, los cuales producen acciones fisiológicas definidas en el cuerpo humano. Se ha descrito que flavonoides,

fenoles, taninos, esteroles, terpenos y saponinas naturales forman la base de los medicamentos. Se le ha otorgado a las saponina un efecto como limpiador de la sangre, los taninos ayudan a la

cicatrización de las heridas (Wahua and Sam, 2013). Adicionalmente poseen diversos mecanismos de acción, por ende estas plantas tienen un alto potencial como fuente de nuevos fármacos.

6.3. Cultivo celular El cultivo celular se ha convertido en una de las principales técnicas en investigación, y se asocia a la extracción de células, tejidos u órganos de un animal o una planta, para su posterior adaptación a un ambiente artificial propicio para su desarrollo y proliferación (Arrora, 2013). Para el crecimiento óptimo de las células fue necesario tener los requisitos básicos como temperatura a 37°C, 5% CO2, pH y sustrato.

1 2 3 4

1 2 3 4 5

C

A B

28

Se observo una diferenciación en el crecimiento de las líneas celulares MCF-7 y HEK-293 debido al medio utilizado, puesto que el medio DMEM suplementado con 1% de estreptomicina/penicilina, 10% suero fetal bovino, 1% de L-glutamina y 4,5g/L de glucosa se observo un crecimiento lento y un alto índice de muerte celular, mientras que el medio RPMI-1640 suplementado con 1% de estreptomicina/penicilina, 10% suero fetal bovino, 1% de L-glutamina sin glucosa se observo una fácil adaptación y rápida proliferación. Lo cual fue referenciado en diversos estudios, en los cuales se discute sobre los componentes de cada medio y la inducción o inhibición de enzimas según las cantidades y disponibilidad de un sustrato (Diawpanich et al. 2008, Wu et al. 2009). El medio DMEM y RPMI 1640 son los medios comúnmente utilizados para el cultivo de diferentes tipos de células. Sin embargo, existen diferencias significativas en su composición, lo cual podría afectar la proliferación, viabilidad y diferenciación celular. (Wu et al. 2009)

El medio DMEM utilizado tiene una concentración de 4,5g/L de glucosa, la cual puede afectar las células adherentes, por ende este puede ser el factor de baja proliferación y viabilidad celular, puesto que altas concentraciones de glucosa alteran las funciones celulares e inducen apoptosis (Li et al. 2007) mientras que el RPMI-1640 utilizado no contiene glucosa, por ende la adaptación de las células adherentes fue mejor, por lo cual se decidió trabajar con el medio RPMI-1640

6.4. Ensayo citotóxico Para la evaluación de productos naturales con actividad biológica es necesario implementar ensayos que utilicen un programa de cribado a gran escala, por lo cual se realizó el ensayo de MTT en microcultivo para evaluar el efecto citotóxico, el cual se fundamenta en la reducción metabólica de la sal de tetrazolio a formazan realizada por las células viables. Esta técnica permite evaluar la variable tratamiento-efecto por medio del análisis de regresión lineal.

Los extractos obtenidos a partir de las plantas Annona muricata, Annona cherimola, y Physalis peruviana se probaron frente a la línea célular tumoral MCF-7 de cáncer y la línea celular sana humana embrionaria de riñón HEK-293. Con el fin de evaluar el efecto citotóxico selectivo sobre las células tumorales.

Para realizar el ensayo de MTT se sembraron un total de 7x103celulas/mL, de tal forma que a partir del 80% de confluencia para obtener una población significativa capaz de resistir las 48h de tratamiento. Pasadas las 4 horas luego de agregar el reactivo MTT se observó la formación de los cristales de violeta, los cuales quedan adheridos a la superficie de la placa, puesto que las células son adherentes (Fig. 16).

29

Figura 16. Fotografía ensayo de MTT de cristales de formazan sin diluir en las líneas celulares MCF-7 y HEK293

Se observo que la citotoxicidad se incrementó en todos los extractos en forma dependiente a la concentración, es decir, la actividad citotóxica fue mayor a medida que se aumentó la dosis desde 2 µg/mL hasta 200 µg/mL para la línea celular MCF-7 (Fig. 17).

30

En los extractos de semillas de Annona muricata se obtuvo un IC50= 9 μg/mL, en los extractos de semillas de Annona cherimola se obtuvo un IC50= 11μg/mL, mientras que para el extracto de hojas se encontró un IC50= 34 μg/mL y en el de hojas y tallos de Physalis peruviana se encontró un IC50=8 μg/mL.

Figura 17. Gráfico comparación del efecto citotóxico de los extractos de A. muricata (GES), A. cherimola (CEH y CES) y

Physalis peruviana (UHT) en la línea celular MCF-7. [A] Gráfico de dispersión y [B] Gráfico barras en 3D.

Adicionalmente, se observó que los extractos con mayor efecto citotóxico fueron los de hojas y tallos de Physalis peruviana, semillas de Annona muricata y de Annona cherimola, obteniendo en los extractos un porcentaje de viabilidad entre 4% y 0% a unas concentraciones de 100 µg/mL y 200 µg/mL.

0102030405060708090

100

-5 5 15 25 35 45 55 65 75 85 95 105 115 125 135 145 155 165 175 185 195 205

Viab

ilida

d ce

lula

r %

Concentración (μg/mL)

UHT

CEH

CES

GES

UHT

CEH

CES

GES

0

50

100

2 10 25 50 75 100 200

Viab

ilida

d ce

lula

r %


31

A partir de una concentración de 75 µg/mL en todos los extractos, se observa que la viabilidad celular disminuyo en un 90% aproximadamente, con excepción al extracto de hojas de Annona cherimola que a esta concentración tiene un porcentaje del citotoxicidad del 25%(Fig. 17), indicando que todos los extractos evaluados tiene un efecto citotóxico sobre las células cancerosas MCF-7 a concentraciones medias.

Se valuaron estos mismos extractos en iguales concentraciones frente a las células no cancerosas HEK293, con el fin de determinar la selectividad de los extractos (Fig.18).

Figura 18. Gráfico comparación del efecto citotóxico de los extractos de A. muricata (GES), A. cherimola (CEH y CES) y Physalis peruviana (UHT) en la línea celular HEK-293.

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210

Viab

ilida

d ce

lula

r %


UHT

CEH

CES

GES

UHT

CEH

CES

GES

0

50

100

2 10 25 50 75 100 200

Viab

ilida

d ce

lula

r %


32

Se observa que los extractos presentan bajo efecto citotóxico en las células no cancerosas HEK293, es decir, los porcentajes de viabilidad no son menores al 50% en la concentración más alta, correspondiente a 200 μg/mL.

La figura 19 presenta el comportamiento del efecto citotóxico para el extracto de semillas de Annona muricata (GES) frente a las células MCF-7 de cáncer de seno y las células control HEK293. Se observó a partir de la concentración de 2 µg/mL un efecto citotóxico con un porcentaje de viabilidad del 70,3%, y fue disminuyendo dependiendo de la concentración, de tal forma que en una concentración de 25 µg/mL se obtuvo un porcentaje de viabilidad del 5,7% y a la mayor concentración de 200 µg/mL se alcanza el mayor efecto citotóxico con un porcentaje de viabilidad del 0,5% (Fig. 19), con un IC50 9 µg/mL. Adicionalmente, se evidencia un efecto selectivo sobre las células tumorales, puesto que el porcentaje de viabilidad de la línea celular HEK293 no disminuye al 50% a una concentración de 200 µg/mL. Sin embargo, este fue el extracto con mayor actividad citotóxica sobre esta línea celular. Las concentraciones de 75 µg/mL, 100 µg/mL y 200 µg/mL no tienen una mayor variabilidad, los porcentajes de viabilidad son muy próximos.

100 90,0 86,6

81,0 82,5 75,9

55,0

100

70,3

47,9

5,7 2,9 3,5 0,7 0,5 0102030405060708090

100110

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

Viab

ilida

d ce

lula

r %


HEK293MCF-7

33

Figura 19. Graficas efecto citotóxico del extracto de semilla de Annona muricata en las líneas célulares MCF-7 y HEK-293.

A una concentración de 25 µg/mL para el extracto de GES, se contempla un tratamiento favorable, debido a que se observa un efecto citotóxico frente a las celular MCF-7 con una viabilidad menor al 10% y un efecto selectivo frente a las células HEK293 con una viabilidad mayor al 90%.

El resultado obtenido en este estudio fue mejor que el realizado en un extracto de hojas por Nur et al. (2012) en el cual encontraron un IC50= 17,19 μg/mL para las celulas T47D de cáncer de seno.

Este efecto citotóxico puede ser debido a las acetogeninas presentes en las semillas y en las hojas de la Annona muricata, debido a que se ha reporta su actividad citotóxica contra células cancerosas pancreáticas, de próstata, de pulmón y de hepatoma (Ragasa et al. 2012). Las acetogeninas son metabolitos secundarios considerados como el grupo más potente de inhibidores del complejo I mitocondrial afectando la cadena respiratoria mitocondrial, esta acción agota el ATP e induciendo la apoptosis celular, por ende muestran un efecto antiproliferativo sobre las líneas celulares cancerosas (Schlie et al. 2009), lo que posiciona a este extracto revelante para el desarrollo de nuevos fármacos antineoplásicos.

El extracto de hojas de Annona cherimola (CEH) no mostro un efecto citotóxico representativo entre las concentraciones de 2 μg/mL hasta 50 μg/mL, con porcentajes de viabilidad muy cercarnos, entre 74,6% y 40,8%. Un mejor efecto de citotoxicidad se alcanza en la concentración de 200 μg/mL, el cual muestra un 0,9% de viabilidad celular, con un IC50=34 μg/mL. Adicionalmente. Se evidencia un efecto citotóxico selectivo, teniendo en cuenta que el porcentaje de viabilidad de las células HEK-293 disminuye aproximadamente un 15% para una concentración de 200 μg/mL (Fig. 20).

Un estudio realizado por Elhawary et al. (2013) muestra que el extracto etanólico de hojas de A. cherimola presento valores de IC50=3,43 μg/mL, por ende el valor obtenido sobrepasa este valor IC50, esto puede ser debido a que el extracto no se encuentra totalmente purificado.

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

100,0

2 10 25 50 75 100 200

Viab

ilida

d ce

lula

r %


HEK293

MCF-7

34

Figura 20. Gráfico efecto citotóxico del extracto de hojas de Annona cherimola en las líneas célulares MCF-7 y HEK-293.

A una concentración de 75 µg/mL para el extracto de CEH, se contempla un tratamiento propicio, debido a que se observa un efecto citotóxico frente a las celular MCF-7 con un porcentaje de viabilidad menor al 25% y un efecto selectivo frente a las células HEK293 con una viabilidad mayor al 85%.

En comparación al extracto de hojas de Annona cherimola, el extracto de semillas (CES) de esta especie manifiesta una mayor actividad. A una concentración de 2 μg/mL el porcentaje de viabilidad fue del 59,5%, lo cual indicia que a esta concentración presenta una actividad citotóxica del 40% con un IC50=11 μg/mL y las diferencias son pequeñas hasta una concentración de 10 μg/mL. Se observo que a concentraciones mayores de 25 μg/mL tiene un porcentaje de

100 92,6

87,4 82,5 84,5 86,1

74,6 68,8

54,2

40,8

26,2 24,6

0,9 0102030405060708090

100110

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

Viab

ilida

d ce

lula

r %


HEK293MCF-7

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

100,0

2 10 25 50 75 100 200

Viab

ilida

d ce

lula

r %


HEK293

MCF-7

35

citotoxicidad del 96%, y mantiene una viabilidad celular inferior al 5% hasta la concentración de 200 μg/mL (Fig. 21).

Los resultados concuerdan con el estudio realizado por Quispe et al. (2009) en los cuales se encontró un IC50=9,4 µg/mL para línea celular MCF-7.

En la línea celular HEK-293 se observa baja actividad citotóxica, presentando porcentajes de viabilidad desde 93,9% hasta 72,3% para las concentraciones desde 2 hasta 200 μg/mL, lo cual indica que tiene un porcentaje de citotoxicidad del 20% en las células sanas (Fig. 21).

Figura 21. Gráfico efecto citotóxico del extracto de semillas de Annona cherimola en las líneas célulares MCF-7 y HEK-293.

92,0 93,9 93,0

75,2 73,9 72,9 72,3

100

59,5 52,7

4,0 3,6 1,4 1,0 1,0 0102030405060708090

100110

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

Viab

ilida

d ce

lula

r %


HEK293

MCF-7

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

100,0

2 10 25 50 75 100 200

Viab

ilida

d ce

lula

r %


HEK293

MCF-7

36

A una concentración de 25 µg/mL para el extracto de CES, se contempla un tratamiento favorable, debido a que se observa un efecto citotóxico frente a las células MCF-7 con un porcentaje de viabilidad menor al 10% y un efecto selectivo frente a las células HEK293 con una viabilidad mayor al 93%.

De igual forma los extractos de Annona cherimola poseen acetogeninas, puesto que estos metabolitos son comúnes en la familia Annonanceae.y los resultados alcanzados corresponderian a este tipo de moleculas y solo dependerian de la cantidad producida por cada especie.

El extracto de Physalis peruviana (UHT) mostro un mayor efecto citotoxico a una menor concentracion en comparacion con los demas extractos, esto se ve reflejado en el valor de IC50= 8 µg/mL. En las concentraciones de 2 μg/mL y 10 μg/mL presentó un porcentaje de viabilidad del 40%, esto puede corresponder probablemente a un error humano con respecto a la preparación de la muestra/tratamiento en la concentración de 2 μg/mL. Se obtuvo un 0% de viabilidad en las concentraciones de 100 y 200 μg/mL. Mientras que para los ensayos con la línea celular HEK293 a concentraciones de 100 y 200 μg/mL, presento un porcentaje de viabilidad del 70%.

Zavala et al (2006) reportaron un efecto toxico en la línea celular colo-205 con un IC50=1,93 µg/mL y la liena celular K562 con un IC50= 2 µg/mL. Los resultados varian de acuardo con la linea celular utilizada.

Teniendo en cuenta la figura 22, se seleccionó la concentración de 75 µg/mL para el extracto de UHT, debido a que el tratamiento con las células MCF-7 presentó un porcentaje de viabilidad menor al 3%, y no mostro actividad citotóxica frente a las células HEK-293, demostrando de esta forma la selectividad del extracto frente a la células cancerosas .

37

Figura 22. Gráfico efecto citotóxico del extracto de hojas y tallos de Physalis peruviana en las líneas célulares MCF-7 y HEK-293.

El efecto citotóxico de este extracto se puede deber a que Physalis peruviana posee un conjunto de compuestos fitoquímicos bioactivos, dentro de los cuales se encuentran los withanolidos, los cuales pertenecen a un grupo de lactonas. Diversos estudios han demostrado importantes propiedades farmacológicas, tales como insecticida, hepaprotector, inmunomodulador, antibacterial, anti-inflamatorio y actividad citotóxica para estos compuesto (Ramadan, 2011).

Debido a que la vincristina se evaluó a una concentración (120nM), no se puede realizar una comparación directa en la cual se muestra viabilidad sobre concentración con los resultados obtenidos en los extractos de las plantas, pero si se puede evaluar el posible uso de estos extractos para el control de las células cancerosas.

100 100,0 100,0 100,0

71,7 71,2

100

40,6 41,2

16,9 8,1

2,8 0,0 0,0 0102030405060708090

100110

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

Viab

ilida

d ce

lula

r %


HEK293MCF-7

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

100,0

2 10 25 50 75 100 200

Viab

ilida

d ce

lula

r %


HEK293

MCF-7

38

7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Los extractos evaluados contienen alta cantidad de metabolitos secundarios, los cuales pueden variar de una parte de la planta a otra o entre plantas. En el extracto de A. muricata se encontraron fenoles, terpenos, alcaloides, terpenos y esteroles; para el extracto de hojas de A. cherimola se encontraron fenoles, taninos, glicósidos de flavonoides, alcaloides, terpenos y esteroles; para el extracto de semillas de A. cherimola se encontraron flavonoides, fenoles, taninos, glicósidos, alcaloides, terpenos y esteroles; y para el extracto de hojas y tallos de P. peruviana se encontraron fenoles, terpenos, taninos, glicósidos de flavonoides, saponinas y esteroles. Se encontró una diferencia en las características de crecimiento de los cultivos celulares MCF-7 y HEK-293 en los medios de cultivo DMEM y RPMI-1640, debido a que existen diferencias significativas en su composición, lo cual podría afectar la proliferación, viabilidad y diferenciación celular. Para el extracto de hojas y tallos de P. peruviana se obtuvieron valores de IC50= 8 µg/mL con un mejor tratamiento a una concentración de 75 µg/mL, observándose a esta concentración selectividad del extracto sobre las células MCF-7 de cáncer seno. Para el extracto de semillas de A. muricata se obtuvieron valores de IC50= 9 µg/mL con un mejor tratamiento a una concentración de 25 µg/mL, observándose a esta concentración selectividad del extracto sobre las células MCF-7 de cáncer seno. Para el extracto de hojas de A. cherimola se obtuvieron valores de IC50= 34 µg/mL con un mejor tratamiento a una concentración de 75 µg/mL, observándose a esta concentración selectividad del extracto sobre las células MCF-7 de cáncer seno. Para el extracto de semillas A. cherimola se obtuvieron valores de IC50= 11 µg/mL con un mejor tratamiento a una concentración de 25 µg/mL, observándose a esta concentración selectividad del extracto sobre las células MCF-7 de cáncer seno Se obtuvo un mejor efecto citotóxico en el extracto de Physalis peruviana para una concentración de 75 μg/mL de acuerdo con los resultados del análisis estadístico. Adicionalmente no se encontró diferencia significativa en el porcentaje de viabilidad con los extractos de semillas de Annona muricata y Annona cherimola. Este estudio proporciona información etnobotánica sobre plantas con actividad anticancerígena de origen Colombiano, las cuales son de consumo mundial, aunque no se conoce específicamente el mecanismo de acción sobre las células cancerosas.

Este trabajo plantea las bases para seguir desarrollando investigaciones en plantas promisorias en la búsqueda de actividad citotóxica en diferentes líneas tumorales, entre los grupos de investigación GIFUJ de la PUJ y GIBGA de la UDCA.

Se recomienda realizar más pruebas químicas para determinar la composición química de los extractos y si en estos se encuentran compuestos de mayor interés como acetogeninas o withanolidos. Adicionalmente pruebas ampliar el espectro de las concentraciones utilizadas con el fin de observar detalladamente el comportamiento del compuesto sobre la fisiología celular y

39

realizar pruebas específicas para detectar apoptosis y necrosis, y la si el extracto es especifico de una fase en el ciclo celular.

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43

9. Anexos Anexo1. Análisis estadístico

Los datos obtenidos a partir del ensayo de viabilidad MTT, se analizaron utilizando el software Statistix 10 para realizar las pruebas estadísticas correspondientes de acuerdo con el diseño experimental.

Para determinar si cumple con el primer supuesto de homogeneidad, en los cuales se observa la distribución homogénea de los resultados obtenidos, se realizó la prueba de homogeneidad usando un gráfico de residuales (Fig. 23) en el cual se observa una distribución uniforme de los valores obtenidos, confirmando que se cumple dicho supuesto.

Figura 23. Gráfico de residuales para prueba de homogeneidad.

El otro supuesto con el que debe cumplir el análisis, es con el de normalidad (p>0,05) el cual plantea la distribución normal, para esto se realizo una prueba de Shapiro-wilk y se utilizó un gráfico QQ-plot (Fig. 24), a fin de determinar si los datos se distribuían conforme a la campana de gauss (Distribución normal estándar), conforme a esto, la prueba estadística determino que no existe normalidad (p<0,05), dado que se rechaza la hipótesis nula, es decir, los errores de las medias de la totalidad de los datos no se distribuyen conforme a un modelo de campana de Gauss, es decir con distribución normal estándar. Las hipótesis planteadas fueron:

• H0 = eij se distribuyen normalmente • Hi = eij no se distribuyen normalmente

Residuals by Fitted Values Plot for RtaViab

-10 10 30 50 70 90

-40

-20

0

20

40

Res

idua

ls

Fitted values

44

Figura 24. Gráfico de QQplot para prueba de normalidad y prueba de Shapiro-Wilk.

Se realizó un análisis de varianza ANOVA (P<0,005) y una prueba post hoc de TUKEY, Partiendo de: • Ho= todos las medias de los extractos son iguales • HI = al menos una de las medias de los extractos es diferentes

Se obtuvieron los siguientes resultados: Analysis of Variance Table for RtaViab

Source DF SS MS F P Planta 3 8090,0 2696,67 27,54 0,0000 ConcPPM 6 35090,1 5848,36 59,72 0,0000 Error 55 5385,8 97,92 Total 64 El análisis de varianza ANOVA arrojo un valor de p<0,005, por lo cual se procedió a descartar la hipótesis nula (H0), y se aceptó la hipótesis alterna, la cual nos indica que al menos una de las medias de los extractos es diferente, por ende se procede a realizar una prueba de TUKEY, para comparar las variables independientes en relación con la dependiente y encontrar el extracto y la concentración de mejor actividad citotóxica. Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test of RtaViab for Planta Planta Mean Homogeneous Groups CEH 43,872 A CES 18,150 B GES 17,762 B UHT 16,319 B Alpha 0,05 Standard Error for Comparison 3,3290 TO 3,6825. Critical Q Value 3,747 Critical Value for Comparison 8,8206 TO 9,7572. There are 2 groups (A and B) in which the means are not significantly different from one another. Se observa que los extractos con mejor respuesta se encuentran dentro del grupo B en los cuales estan los extractos de Semillas de A. muricata (GES), semillas de A. cherimola (CES), y hojas y tallos de P. peruviana (UHT), puesto que no existen diferencias significativas entre las medias. Se escogió

Normal Probability Plot

-3 -2 -1 0 1 2 3

-40

-20

0

20

40R

esid

uals

of R

taV

iab

RankitsShapiro-Wilk W 0,9474 P(W) 0,0079 65 cases

45

el de menor media, el cual corresponde al extracto de P. peruviana y se procedió a realizar una comparación entre la concentración y porcentaje de viabilidad. Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test of RtaViab for ConcPPM ConcPPM Mean Homogeneous Groups 2 64,242 A 10 53,179 A 25 23,177 B 50 12,089 BC 100 7,139 C 75 7,014 C 200 1,339 C Alpha 0,05 Standard Error for Comparison 4,4391 TO 4,6795. Critical Q Value 4,327 Critical Value for Comparison 13,581 TO 14,316. There are 3 groups (A, B, etc.) in which the means are not significantly different from one another. Se observa que no existen diferencias significativas entre las concentraciones de 50, 75, 100 y 200 μg/mL, puesto que todas se encuentran dentro del grupo C, aunque la concentración de 50 μg/mL también es parecido a los datos del grupo B, en el cual se encuentra la concentración de 25 μg/mL. Por ende se deduce que la mejor concentración para el tratamiento sería el de 75 μg/mL para el extracto etanólico de hojas y tallos de P. peruviana Finalmente se realizo un Gráfico integrado de las plantas en relación de la variable independiente concentración y la variable dependiente porcentaje de viabilidad (Fig. 25)

Figura 25. Gráfico integrado del efecto citotóxico de los extractos de Physalis peruviana (1), A. cherimola (2 y 3) y A. muricata (4) en la línea célular MCF-7

Means of RtaViab for Planta*ConcPPM

2 10 25 50 75 100 200-10

10

30

50

70

90

Rta

Via

b

ConcPPM

Planta

1

2

3

4

46

Anexo 2. Efecto citotóxico de los extractos de plantas de A. muricata (GES), A. cherimola (CEH y CES) y Physalis peruviana (UHT) en la línea celular HEK-293.

0 2 10 25 50 75 100 200 UHT 100 100 100 100 100 100 71,73 71,23 CEH 100 100 100 92,56 87,42 82,46 84,5 86,06 CES 100,0 91,95 93,9 93,04 75,15 73,92 72,86 72,31 GES 100 100 90 86,62 80,99 82,48 75,88 55,02

Anexo 3. . Efecto citotóxico de los extractos de plantas de A. muricata (GES), A. cherimola (CEH y CES) y Physalis peruviana (UHT) en la línea celular MCF-7.

0 2 10 25 50 75 100 200 UHT 100 40,63 41,19 16,90 8,13 2,76 0,00 0,00 CEH 100 74,60 68,83 54,23 40,84 26,17 24,64 0,94 CES 100,0 59,5 52,7 4,0 3,6 1,4 1,0 1,0 GES 100 70,29 47,90 5,69 2,87 3,52 0,69 0,49

PUJ– BG Normas para la entrega de Tesis y Trabajos de grado a la Biblioteca General – Junio de 2013

1

ANEXO 2

CARTA DE AUTORIZACIÓN DE LOS AUTORES (Licencia de uso)

Bogotá, D.C., 12 de Diciembre del 2014

Señores Biblioteca Alfonso Borrero Cabal S.J. Pontificia Universidad Javeriana Cuidad Los suscritos:

Daniela Ardila Durango , con C.C. No 1018453500

En mi (nuestra) calidad de autor (es) exclusivo (s) de la obra titulada: EVALUACION DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS DE LAS PLANTAS

Annona muricata, Annona cherimolaY Physalis peruviana EN LA LÍNEA CELULAR MCF-7 DE

ADENOCARCINOMA DE SENO (por favor señale con una “x” las opciones que apliquen)

Tesis doctoral Trabajo de grado x Premio o distinción: Si x No

cual: Tesis honorifica

presentado y aprobado en el año 2014 , por medio del presente escrito autorizo

(autorizamos) a la Pontificia Universidad Javeriana para que, en desarrollo de la presente licencia de uso parcial, pueda ejercer sobre mi (nuestra) obra las atribuciones que se indican a continuación, teniendo en cuenta que en cualquier caso, la finalidad perseguida será facilitar, difundir y promover el aprendizaje, la enseñanza y la investigación. En consecuencia, las atribuciones de usos temporales y parciales que por virtud de la presente licencia se autorizan a la Pontificia Universidad Javeriana, a los usuarios de la Biblioteca Alfonso Borrero Cabal S.J., así como a los usuarios de las redes, bases de datos y demás sitios web con los que la Universidad tenga perfeccionado un convenio, son:

AUTORIZO (AUTORIZAMOS) SI NO

1. La conservación de los ejemplares necesarios en la sala de tesis y trabajos de grado de la Biblioteca.

X

2. La consulta física (sólo en las instalaciones de la Biblioteca) X

3. La consulta electrónica – on line (a través del catálogo Biblos y el Repositorio Institucional)

X

4. La reproducción por cualquier formato conocido o por conocer X

5. La comunicación pública por cualquier procedimiento o medio físico o electrónico, así como su puesta a disposición en Internet

X

6. La inclusión en bases de datos y en sitios web sean éstos onerosos o gratuitos, existiendo con ellos previo convenio perfeccionado con la Pontificia Universidad Javeriana para efectos de satisfacer los fines previstos. En este evento, tales sitios y sus usuarios tendrán las mismas facultades que las aquí concedidas con las mismas limitaciones y condiciones

X

De acuerdo con la naturaleza del uso concedido, la presente licencia parcial se otorga a título gratuito por el máximo tiempo legal colombiano, con el propósito de que en dicho lapso mi (nuestra) obra sea explotada en las condiciones aquí estipuladas y para los fines indicados, respetando siempre la titularidad de los derechos patrimoniales y morales correspondientes, de acuerdo con los usos honrados, de manera proporcional y justificada a la finalidad perseguida, sin ánimo de lucro ni de comercialización.


1

ANEXO 3 BIBLIOTECA ALFONSO BORRERO CABAL, S.J.

DESCRIPCIÓN DE LA TESIS O DEL TRABAJO DE GRADO FORMULARIO

TÍTULO COMPLETO DE LA TESIS DOCTORAL O TRABAJO DE GRADO

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS EXTRACTOS ETANÓLICOS DE LAS PLANTAS Annona muricata, Annona cherimola y Physalis peruviana EN LA LINEA CÉLULAR MCF-7 DE ADENOCARCINOMA DE SENO

SUBTÍTULO, SI LO TIENE -

AUTOR O AUTORES

Apellidos Completos Nombres Completos Ardila Durango Daniela

DIRECTOR (ES) TESIS O DEL TRABAJO DE GRADO Apellidos Completos Nombres Completos

Vera Bravo Ricardo FACULTAD Ciencias

PROGRAMA ACADÉMICO Tipo de programa ( seleccione con “x” )

Pregrado Especialización Maestría Doctorado x

Nombre del programa académico Microbiología industrial

Nombres y apellidos del director del programa académico Janeth del Carmen Arias Palacios

TRABAJO PARA OPTAR AL TÍTULO DE:

Microbióloga industrial PREMIO O DISTINCIÓN (En caso de ser LAUREADAS o tener una mención especial):

Tesis meritoria

CIUDAD AÑO DE PRESENTACIÓN DE LA TESIS O DEL TRABAJO DE GRADO

NÚMERO DE PÁGINAS

Bogotá 2014 58 TIPO DE ILUSTRACIONES ( seleccione con “x” )

Dibujos Pinturas Tablas, gráficos y diagramas Planos Mapas Fotografías Partituras

X X SOFTWARE REQUERIDO O ESPECIALIZADO PARA LA LECTURA DEL DOCUMENTO

Nota: En caso de que el software (programa especializado requerido) no se encuentre licenciado por la Universidad a través de la Biblioteca (previa consulta al estudiante), el texto de la Tesis o Trabajo de Grado quedará solamente en formato PDF.


2

MATERIAL ACOMPAÑANTE

TIPO DURACIÓN (minutos) CANTIDAD

FORMATO

CD DVD Otro ¿Cuál?

Vídeo - - - -

Audio - - - -

Multimedia - - - - Producción electrónica - - - -

Otro Cuál?

DESCRIPTORES O PALABRAS CLAVE EN ESPAÑOL E INGLÉS Son los términos que definen los temas que identifican el contenido. (En caso de duda para designar estos descriptores, se recomienda consultar con la Sección de Desarrollo de Colecciones de la Biblioteca Alfonso Borrero Cabal S.J en el correo [email protected], donde se les orientará).

ESPAÑOL INGLÉS

CITOTÓXICO CYTOTOXIC

CANCER DE SENO BREST CANCER

EXTRACTOS EXTRACTS

ANTICANCEROSO CANCER TREATMENT

RESUMEN DEL CONTENIDO EN ESPAÑOL E INGLÉS (Máximo 250 palabras - 1530 caracteres)

En el presente estudio se evaluó la actividad citotóxica de los extractos crudos obtenidos a partir de las plantas Annona cherimola, Annona muricata y Physalis peruviana frente a la línea célular tumoral MCF-7 de adenocarcinoma de seno, mediante el ensayo de MTT. Mediante este método se evaluaron concentraciones desde 2 µg/mL hasta 200µg/mL durante 48 h de los extractos etanólicos de las plantas Annona muricata, Annona cherimola y Physalis peruviana y se comparó con el efecto de la vincristina a una concentración 120 nM. Los resultados mostraron que a una concentración de 120nM de vincristina las celulas MCF-7 tienen un porcentaje de viabilidad del 28%, y se encontró que a una concentración de 75 μg/mL las células MCF-7 presentaron un bajo porcentaje de viabilidad para los extractos de semillas de Annona muricata, semillas de Annona cherimola, hojas de Annona cherimola y hojas y tallos de Physalis peruviana con un IC50 = 9 μg/mL, IC50 = 34 μg/mL, IC50 = 11 μg/mL, IC50 = 8 μg/mL respectivamente, obteniendo en esta concentración un tratamiento adecuado para los extractos de P. peruviana y hojas de A. cherimola , dado que no se observa menos de un 86% de viabilidad celular para las células HEK-293. Mientras que para los extractos de semillas de Annona muricata, Annona cherimola se escogió una concentración del 25 µg/mL. En conclusión el extracto de hojas y tallos de Physalis peruviana fue el mejor tratamiento, seguido por el de semillas de Annona muricata y de Annona cherimola sin encontrase diferencias estadísticamente significativas (P<0,05). In the present study the cytotoxic activity of the crude extracts obtained from plants Annona cherimola, Physalis peruviana, Annona muricata and Physalis peruviana against the tumor cell line MCF-7 breast adenocarcinoma, by the MTT assay was evaluated. Concentrations by this method were evaluated from 2 µg/mL to 200μg / mL for 48 h in ethanol extracts of plants Annona muricata, Annona cherimola and Physalis peruviana and compared with the effect of vincristine at a concentration 120 nM. The results showed that at a concentration of vincristine 120Nm of MCF-7 cells have a percentage viability of 28%, and found that at a concentration of 75 μg/mL the MCF-7 cells showed a low percentage of viability for extracts of Annona muricata seeds, seeds of Annona cherimola, leaves of Annona cherimola and leaves and stems Physalis peruviana with an IC50 = 9 μg/mL, IC50 = 34 μg/mL, IC50 = 11 μg/mL, IC50 = 8 μg/mL, respectively, in this concentration obtaining adequate treatment for and extracts sheets P. A. peruviana cherimola, not observed since less than 86% cell viability for HEK-293 cells. While for seed extracts of Annona muricata, Annona cherimola a concentration of 25 µg/mL was chosen. In conclusion extract of leaves and stems of Physalis peruviana was the best treatment, followed by seeds of Annona muricata and Annona cherimola without stumbling statistically significant differences (P <0.05).

mailto:[email protected]

daniela ardila durango

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