dai raggi-x alla progettazione di farmaci: le radici...
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Dai raggi-X alla progettazione di farmaci: le radici matematiche e
fisiche della biologia del XXI secolo
Martino Bolognesi
Dipartimento di BioScienzeUniversità di Milano
http://users.unimi.it/biolstru/Home.html
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- VITA ORDINE, ORGANIZZAZIONE, COMPLESSITA’
- LA MATERIA BIOLOGICA E’ UNA MANIFESTAZIONEDEI PRINCIPI FONDAMENTALI DELLA FISICA E DELLA CHIMICA, CHE IN QUESTO CASO RAGGIUNGONO COMPLESSITA’ MASSIME
- OGGI DISPONIAMO DI APPROCCI MULTI-DISCIPLINARI PER STUDIARE LA MATERIA E I PRINCIPI FONDAMENTALI DELLA BIOLOGIA
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PERCHE’ LE PROTEINE ?- Le proteine sono gli attuatori della cellula
- Disponibilita’ di nuovi strumenti(sincrotroni, super-computing, microscopie)
- La material biologica a risoluzione atomica
- Le sfide della biologia moderna(biochimica, genomicsa, proteomica, …)
- Applicazioni(farmaci, biotecnologie, biosensori …)
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Nuovi strumenti per lo studio della materia biologica
• Microscopie ottiche (200 nm)
• microscopia a “Forza Atomica” (1 nm)
• Diffrazione di elettroni (0.5 nm)
• NMR (0.5 nm)
• Microscopie elettroniche (0.1 nm)
• Diffrazione di raggi-X (0.05 nm)
- 1 nm = 10-9 m -
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Raggi-X• “Microscopia” a livello atomico – risolve gli atomi
• La risoluzione della struttura 3D avviene in maniera“indiretta”, attraverso la misura di diagrammi di diffrazione
• La risoluzione delle strutture 3D richiede un approcciocomputazionale intensivo, spesso abbinato a metodi di simulazione computazionale.
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Cristalli di proteine:
Cristallo volume 0.1 mm3
Cella elem. > 100 Å Contenuto solvente 30% - 80% v/v Bassa stabilita’ meccanica (Estab.< 10 kcal/mol)
molecolaCella elementare
cristalloUnita’ asimmetrica
symmetry
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Crescita di cristalli:Variazione di parametri chimico-fisici che influenzano la solubilita’delle proteine
forza ionica (conc. sali)
pH
temperatura
concentrazione proteica
additivi (molecole organiche)
costante dielettrica del solvente
gravità
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Microgravità:
In assenza di moti convettivi:
Maggiore ordine intrinseco
Minore formazione di nuclei
Minore incorporazione di contaminanti
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Stazione sperimentale ad ESRF
= 0.933 Å (13.294 keV)
9.6 < E < 14.5 keV
Beamsize 50-200 m
dmax= 0.97 Å
http://www.esrf.eu/UsersAndScience/Experiments/MX/
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Diffrazione di raggi-X da parte di un cristallo:
detector
2raggi X
cristallo
h = 2, k = 1, l = 0 h = 1, k = 3, l = 0
Ihkl
2dhkl sin= n (Bragg’s eqn.)
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Perche’ i sincrotroni?
e4 Vx
I (hkl) = ------------ Io 3 ALP ------- F2(hkl)m2 c4 Vc
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http://www.esrf.eu/UsersAndScience/Experiments/MX
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Il «problema della fase»
Ihkl |Fhkl|2
N atomi
j = 1Fhkl = fj exp [2i (hxj + kyj + lzj)] = |Fhkl| exp (ihkl)
Fattore di struttura Fhkl = (x,y,z) exp [2i(hx+ky+lz)] dV
VcellF
P
i
rf1
f2
f3
(x,y,z) = |Fhkl| exp [-2i(hx+ky+lz-’hkl)]1V hkl
Densità elettronica
Non misurabile sperimentalmente
La battaglia contro le malattie infettive haallungato la vita media dell’uomo
• Nell’Inghilterra di metà ‘800 il 60% dellemorti era dovuto a malattie infettive
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Il dilagare di malattie infettive
Ebola deathsFigures up to 3 February 2015
9,019Deaths - probable, confirmed and suspected(Includes one in the US and six in Mali) 3,746 Liberia 3,301 Sierra Leone 1,957 Guinea 8 NigeriaSource: WHO
Norovirus una minaccia per la salute nei paesi tropicali e non solo
Il Norovirus (NV) e’ una delle principali cause dimalattie trasmesse attraverso il cibo, ed e’ causa dimorbidità e mortalità particolarmente tra i bambinidelle regioni tropicali.
NV e’ altamente infettivo e non esiste un vaccino.32
La RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) e’ unodei bersagli piu’ interessanti in quanto:
- enzima essenziale per la replicazione del virus- enzima non presente nell’uomo.
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Bersagli di farmaci nel genoma di NV (ca. 7.4 kb)
34Mastrangelo et al. J.Mol.Biol. (2012)
Diversi cristalli di RdRp di NV, preparati sotto opportune condizioni sperimentali,sono stati utilizzati per le analisi cristallografiche sulla struttura 3D dell’enzima
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I composti migliori selezionati presentano (alla simulazione)“energie di legame” all’enzima favorevoli.Quindi potrebbero agire da inibitori bloccando l’attivita’dell’enzima (e la replicazione del virus)
Ricerca di ligandi tramite simulazioni
computazionaliVolume esplorato
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* L’analisi biochimica ha confermato cheSuramina e NF023 si legano alla RdRp e la inibiscono (Drug Hit)
Caratterizzazione in vitro
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Una serie di studi cristallograficiha permesso di studiare il modo di legame degli inibitori alla RdRp e progettare modifiche chimiche delle molecole che le rendano «Drug LEADS»
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Phe 29
Lys 419
Tyr 418
Gln 414
Gln 439
Arg 436
Arg 393
Arg 392
Amido group 1
Cpd6 legato in prossimita’ del dominio “Thumb” di mRdRp.
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Cpd6 legato alle RdRp murina e umana (strutture 3D sovrapposte)
IC50 (nM)
MNVRdRp hNVRdR
p
Suramin 70±3 27±3
Cpd3 200±10 1280±70
Cpd4 160±7 1100±20
0
Cpd6 115±15 1000±90
Cpd7 160±6 1100±50
Cpd 8 60±4 28±4
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Principi dedotti per l’inibizione di NV RdRP a partire dalle analisi cristallografiche e biochimiche.Gli inibitori da noi studiati:
a) Bloccano l’accesso di NTP al sito attivo per effetti sterici ed elettrostatici.
b) Limitano il corretto posizionamento dei NTP bloccando la formazione di RNA
c) Inteferiscono con il posizionamento del dsRNA e limitano la via di uscita della catena nascente di RNA dall’enzima.