d é tection optique de biomol é cules uniques maxime dahan laboratoire kastler brossel...
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Détection optique de biomolécules Détection optique de biomolécules uniques uniques
Maxime DahanMaxime DahanLaboratoire Kastler BrosselLaboratoire Kastler BrosselDépartement de physiqueDépartement de physiqueEcole normale supérieureEcole normale supérieure
Présentation généralePrésentation générale
• Microscopie de fluorescence• description simple d’un système fluorescent• sondes fluorescentes : colorants, GFP, nanocristaux
•Détecter une molécule unique• Rapport signal sur bruit, bruit de photon,…• Approches expérimentales
•Applications en biophysique• Résolution vs localisation : mouvement de la myosin V, microscopie ultrarésolution• « Motility assays »: myosine/actine, kinesine/microtubule, protéine/ADN• Mesure en polarisation: dynamique rotationelle de F1-ATPase• Relation Conformation/Dynamique : approche par transfert d’énergie de Forster et par transfert électronique – étude du répliement des protéines• Suivi de molécules uniques en cellules vivantes : diffusion membranaire, expression genique
Motivations :Motivations :« aller au-delà des valeurs moyennes « aller au-delà des valeurs moyennes
»»
• fluctuations statistiques :
En analysant molécule par molécule, on peut identifier et analyser les inhomogénéités dans
l’échantillon
Motivations (2) :Motivations (2) :pour analyser des processus pour analyser des processus
stochastiquesstochastiques
• fluctuations dynamiques :
En mesurant l’état d’une molécule au cours du temps, on peut déterminer les constantes
cinétiques qui gouvernent son évolution, même si on est à l’équilibre
k
k
k
k
0 5 10 15 200
20
40
60
80
100
120
durée
0 5 10 15 200
20
40
60
80
100
120
No
mb
re d
'éve
ne
me
nts
durée
k1
k1
t
Mesure d’ensemble :
kk
kpV
(cf. JFA – cours n°2)
HistoriqueHistorique
Canaux ioniquesCanaux ioniques
Neher et Sackmann (1976) [Prix Nobel 1991]
Mesures optiquesMesures optiques
• détection optique d’une molécule unique– mesure à basse température (1989)– mesure à température ambiante (1992-1994)
•premières expériences sur des biomolécules in vitro :– activité enzymatique d’une cholestérol oxydase (1998)– conformation de petites molécules d’ADN et ARN (1999)– activité d’une exonucléase (1999)
• premières expériences in vivo:– suivi de l’entrée d’un adéno-virus (2001)– diffusion latérale de canaux calciques (2001)– organisation membranaire de récepteurs dans des amibes Dictyostelium discoideum (2001)
Microscopie de Microscopie de fluorescencefluorescence
FluorescenceFluorescence
Lorsqu’ils sont dans un niveau excité, certains systèmes (atomes, molécules, cristaux,…) peuvent se désexciter en émettant des photons.
excitation
La longueur d’onde d’émission est (souvent) plus grande que plus celle d’absorption et il est possible de sélectionner spectralement la lumière émise → microscopie de fluorescence
Microscopie de fluorescenceMicroscopie de fluorescence
Il s’agit donc d’une détection sur fond noir
Voir des biomolécules en Voir des biomolécules en fluorescencefluorescence
• En général, les molécules biologiques (protéines, acides nucléiques,…) ne sont pas fluorescentes dans le visible (quelques exceptions: flavines, NADH, GFP,…). Certains acides aminés ont néanmoins des propriétés de fluorescence dans l’UV (tryptophane).
• On attache spécifiquement des marqueurs fluorescents :
couplage covalent (liaison chimique)
marquage d’affinité: on utilise une molécule fluorescente qui vient s’attacher spécifiquement (anticorps, toxines,…)
clonage d’une protéine fluorescente
Modèle d’un système Modèle d’un système fluorescent fluorescent
à deux niveauxà deux niveaux
Description d’un système fluorescent à 2 Description d’un système fluorescent à 2 niveauxniveaux
fluor T
k1
AN
2303)(cm2
deskexck
|e>
|g>
Ihc
kexc
Tfluo est la durée de vie radiative
est la section efficace d’absorption
est le coefficient d’extinction
nrrdes kkk
La molécule peut se désexciter de deux manières différentes : en émettant un photon ou non radiativement.
Taux de fluorescence Taux de fluorescence
)saturation de (intensité hc
kkI
II
II
TPk
rnrs
s
s
fluoer
1
1
0 1 2 3 40,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Flu
ore
scen
ce (
a.u
.)
Intensité
1
ge
gexcedese
PP
PkPkdt
dP
Solution à l’état stationnaire:
0 1 2 3 40,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Flu
ore
scen
ce (
a.u
.)
Intensité
Pour gagner en signal sur bruit, on essaie toujours d’avoir I << Is
Ihc
Q II s
, Pour
Cas limitesCas limites
fluodess T
k II 1
,Pour
A faible intensité, régime linéaire :
A forte intensité, régime saturée :
Efficacité quantiqueradiativenrr
r
kk
kQ
probabilité qu’un photon absorbé soit réémis
0 20 40 60 80
0,01
0,1
1
sig
nal
(a.
u.)
time (ns)
Etude résolue en tempsEtude résolue en temps
Si on excite avec un laser pulsé (à la fréquence 1/Trep):
nrr kk
1
nrr
r
kk
kQ
tkk rnre )(
Si on connaît :
On peut déterminer kr et knr
Marqueurs fluorescents: Marqueurs fluorescents: molécules, protéines, molécules, protéines,
nanocristauxnanocristaux
Fluorophores organiquesFluorophores organiques
Diagramme de JablonskiDiagramme de Jablonski
système à trois niveauxsystème à trois niveaux
On prend en compte l’état triplet
TISC
ISCfls kk
kkhcI
1
Green fluorescent proteinGreen fluorescent protein
Découverte en 1961 dans la méduse Aequorea Victoria, clonée en 1992
Absorption
Fluorescence
R. T
sie
n, F
EB
S L
ett. 2
005
Aussi, des mutants:• photoactivables, • dont l’émission change dans le temps• sensibles au calcium• indicateurs de la phosphorylation…
Autres mutants/ Autres couleurs :
Nanocristaux semiconducteursNanocristaux semiconducteurs
CdSe
ZnS Nanoparticules composées de 100 à100000 atomes of CdSe recouverts parune coquille de ZnS
2-5 nm
Des boites quantiques de quelques Des boites quantiques de quelques nanomètresnanomètres
Une particule dans une boite à 1 D :
Quels sont les niveaux d’énergie des électrons ?
²²²²Ln
m2nE
V(x)
0 L
)sin()(Lxn
L2xn
(en fait la boite est tridimensionnelle…)
Fonctions propres:
Energies propres:
Emission et absorption ajustable Emission et absorption ajustable avec la taille des nanoparticulesavec la taille des nanoparticules
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
2
350 450 550 650
Wavelength (nm)
(A
U)
2.2 nm CdSe
5.0 nm CdSe
absorption
Plus les particules sont petites, plus l’emission est décalée vers les courtes longueurs d’onde (grandes énergies)
LL
Semiconductor Quantum Dots
Longueur d’onde
taille
Excitation
ColorantNanocristal
Spécificités spectrales et photophysique des nanocristaux par rapport à des émetteurs
organiques
• emission etroite (quasi-atomique)• absorption large (solide)• photostabilité
Détection de molécules Détection de molécules fluorescentes uniquesfluorescentes uniques
Problème de détection: Problème de détection: quel est le rapport signal sur bruit ? quel est le rapport signal sur bruit ?
• Signal S de fluorescence (d’une seule molécule)
• Bruit B de variance de moyenne mB et de variance B:
1B
S
Sources de bruitSources de bruit
•Fluctuations intrinsèques (bruit de photon / shot noise)
•Signal optique parasite (autofluorescence, lumière diffusée,…)
proportionnel à l’intensité lumineuse I
•Bruit électronique (courant d’obscurité, bruit de lecture,…)
indépendant de l’intensité lumineuse
2222
:tsindépendansont processus les
elecparphotontotal
elecparphotontotal BBBB
Bruit de Photon Bruit de Photon et Processus de Poissonet Processus de Poisson
On considère un flux où des particules (des photons) arrivent avec un taux k sur un détecteur (une photodiode). On fait l’hypothèse que ce qui se passe entre t et (t+dt) est indépendant de ce qui se passe entre 0 et t (processus de Markov).
)()1),((
)()1),((
)(1)0),((
dtdtttN
dtkdtdtttN
dtkdtdtttN
oProb
oProb
oProb
Quel est la distribution du temps d’attente du premier evènement ?Quelle est la probabilité P qu’on ne détecte rien entre 0 et t ?
ktet )(
Quelle est la probabilité de détecter n photons durant le temps t ?
!
)(n
ktenNP
nkt (distribution de Poisson)
Distribution de PoissonDistribution de Poisson
!
)(n
kteNnP
nkt
Valeur moyenne :
ktn
ktennPnn
nkt !
)(
Variance : ktnnn 22
Bruit d’origine lumineuseBruit d’origine lumineuse
• Bruit de photons des molécules (non saturées):
• Bruit dû à la lumière parasite :
ItN par
ItS ItS 2
Itpar 2
Sources de bruit électroniqueSources de bruit électronique
• Bruit noir de lecture : dû au convertisseur analogue-digital
• Courant d’obscurité : du à l’apparition de Nobs photoélectrons à cause du bruit thermique (proportionnel au temps)
taN obsobs22
22 blec
taN obs2
Nombre de coups
lectureLumière incidente
Crée des photolélectrons
Rapport signal sur bruitRapport signal sur bruit
22 btaItkIt
kItS
B
Cas limite du « shot noise »:
kItS
B
0 10 20 30 40 50 600,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Sig
na
l (u
.a.)
Intensité I
Fluorescence des molécules Signal parasite (diffusé) Bruit électronique
Identifier un fluorophore uniqueIdentifier un fluorophore unique
Pour un fluorophore : photodestruction instantanée
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15
20
25
30
35
Flu
ore
sce
nc
e (u
.a.)
temps (s)(molécule de Cy3)
Possibilité de réduire le photobleaching avec des « oxygen scavengers »
Scintillement d’un nanocristal uniqueScintillement d’un nanocristal unique
Tableau comparatifTableau comparatif
TaillePhotostabil
itéAbsorption Stoechiometry
Cy3 1 nm ~ 5 s = 105 ++
GFP 2-4 nm~ 10-100
ms = 104 +++
QD10-30
nm> 20 mn = 106 +/++
Bille latex
100 nm1 µm
∞Diffusion
Contraste de phase
-
Approches expérimentalesApproches expérimentales
Champ procheChamp proche
Betzig (1992,1994)
Microscopie de champ lointain : Microscopie de champ lointain : microscopie confocale microscopie confocale
Mesure en diffusionMesure en diffusion
Chaque molécule qui traverse par diffusion le volume de focalisation émet des photons
Nie and Zare, Science (1994)
Détection de molécules uniques si :
Temps de diffusion:
Veff = 1x1x1 µm3 = 1 fl
C < 1 nM
t ~ L²/4D ~ 0.1-1 ms
0 500 1000 1500 2000 2500 30000
5
10
15
20
25
30
35
40
Nbe
de
cout
s en
0.2
ms
temps (ms)
(FCS: C = 5-10 nM)
Analyse des corrélations temporelles: FCS
Microscopie en balayageMicroscopie en balayageLaser
Photodiode, PM
Trou de filtrage
Objectif
On déplace le point de focalisation sur l’échantillon.
Inconvénient : le temps passé sur la molécule est bref
Taille de l’image : Np*Np pixels - Taille de la molécule : Nm*Nm pixelsFraction du temps passée à exciter la molécule : F = (Nm/Np)²
Exemple : taille d’un pixel : 200 nm, Np = 100, Nm = 4, soit F = 0,16 %
Si durée totale de l’image : 100 ms (10 µs/pixel), cela correspond à 160 µs.
Nm
Np
Microscopie en épifluorescenceMicroscopie en épifluorescence
On éclaire l’échantillon avec unelumière collimatée. Pour cela, on focalise la lumière dans le plan focal arrière de l’objectif.
Lampe UVou
Laser
CCD Camera
ProblèmeProblème
Dans un échantillon épais, on collecte la lumière de tous les plans de l’échantillon
profondeurchamp
Excitation
Objet dans le plan focal
Objet au dessus du plan focal
Objet en dessous du plan focal
Détection
Comment se débarasser de la lumière provenant des plans hors focus ?
Microscopie en onde évanescenteMicroscopie en onde évanescente
221
221 sin
41nn
d
d
z
eIzI
0)(
5.6233.15.1 21 cnn et
Angle critique : )/arcsin( 12 nnc
et 8.410.15.1 21 cnn d
62.5 65 170 nm70 100 nm75 83 nm
d41.8 50 84,4 nm60 57,6 nm65 51,8 nm
nm) ( 600
Il faut que l’objectif ait une ouverture numérique
supérieure à n2
69
5.1
)/arcsin(
max
1
1max
n
nNA
et 1.4 NA pour
Vérification expérimentaleVérification expérimentale
Sarkar, Atom et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 12882-12886
Détection de molécules uniques Détection de molécules uniques dans structures nanofabriquéesdans structures nanofabriquées
Veff = 20x50x50 nm3 = 5.10-20 litres
Détection de molécules uniques si : C < 30 µM
Science 299, 682 (2002)
Permet de suivre l’activité enzymatique(ex. séquencage de l’ADN en molécules
uniques)