Virchows Arch. Abt. B Zellpath. 2, 1{~ 153 (1969)

Cytophotometrische Untersuchungen tiber den DNS- und Histongehah experimentell induzierter Tumoren

des Zentralnervensystems der Ratte*

R. THUST mad W. JL~-mc~

Pathologisches Institut der Medizinischen Akademie Erfurt (Direktor: Prof. Dr. reed. habil. H. GiiTHERT)

Eingegangen am 25. August 1968

Cytophotometrie Studies o/the DNA and Histone Content o/Experimentally-Induced Tumors o/the Central Nervous System o/the Rat

Summary. Eight tumours of the central nervous system of the rat induced by NMU or 6.9.10-trimethyl-l.2-benzanthracene and one NMU-induced extracranial tumour were stained by the Feulgen method and fastgreen dye for cytophotometric determination of the DNA and histone content of the nuclei. From one NMU-induced intracranial sarcoma two successive transplant generations were measured.

The DNA and historic determinations of the sarcomas indicated (1 extracranial, 4 intra- cranial, 1 intramedullary) the tendency for development of a hyperdiploid DNA-stemline up to tetraploid levels. In our material only the second transplant generation of an intra- cranial sarcoma and an extracranial sarcoma reached this ploidy. As we suppose, the process of ploidy change in sarcomas of the central nervous system normally is interrupted by the premature death of the animal.

The two measured oligodcndrogliomas induced by different carcinogens (NMU and 6.9.10-trimethyl-l.2-benzanthracene) show no deviations from the normal values.

In a glioblasgoma multiforme the giant nuclei show high grades of ploidy. The histone content has no constant relation to the DNA values, which could be explained by degenerative processes.

Zusammen/assumJ. Die cytophotometrische Untersuchung des DNS- und Histongehaltes an 6 durch N-Methylnitrosoharnstoff induzierten Sarkomen (1 extrakraniell, 4 intrakraniell, 1 intramedull~r) ergibt, dal~ an ihnen die Tendenz zur Herausbfldung einer hyperdiploiden bis tetraploiden DNS-Stammlinie erkennbar wird. Dieser Ploidiegrad ist in unserem Material jedoch nur in dem extracraniellen Sarkom und der 2. Transplantatgeneration eines intra- cerebralen Sarkoms erreicht worden. Dieser Befund spricht dafiir, dab in den anderen F~lten diese Entwicklung durch friihzeitigen Ted der Ratten infolge Sch~diglmg des Zentrainerven- systems unterbrochen wurde.

Die zwei untersuchten Oligodendrogliome, die durch verschiedene Carcinogene (M:NH und 6.9.10-Trimethyl-l.2-Benzanthrazen) induziert wurden, zeigen keine Abweichungen veto Normalwert.

In einem Glioblastoma multiforme werden in den RiesenzeUen hochgradigo Polyploidien gefunden. Der Histongehalt zeigt keine konstante Relation zu den DNS-Werten, was durch degenerative Ver~nderungen erld~rt wird.

* Den Direktoren des Pathologisehen Instituts P6cs, Herrn Prof. Dr. G. ROM_H~rI, und des Zoologischen Instituts Jena, Herrn Prof. Dr. M. GERSCH, mSehten wir ffir die ErmSglichung der Untersuchungen danken. Unser besonderer Dank gilt Herrn Dr. K. JOBST (P6cs) fiir die tatkr~ftige Unterstfitzung und die kritischen Hinweise.

Untersuchungen fiber den DNS- und Histongehalt induzierter Tumoren 145

Die Entwicklung quantitativer cytochemischer Methoden hat umfangreiche Untersuchungen fiber die intraceUul~re Verteflung der Verbindungen ermSglicht, die als Trgger genetischer Information bzw. deren Repressoren gelten - - der DNS und der Histone.

Die Untersuehungsergebnisse, die bisher an Tumoren gewonnen wurden, shad im Gegensatz zur Konstanz dieser Verbindungen in Normalgeweben aul~er- ordentlieh versehiedenartig und spiegeln die Mannigfaltigkeit neoplastischer Gewebe wider (HA~scHxA, 1961; SANDRITTER, 1965; LEUCHT]~NB]~RG]~R U. LEUCHTEI~BV.RGER, 1966). Die vorliegende Arbeit befaBt sich mit cytophoto- metrisehen Untersuchungen vorwiegend an Hirntumoren, die mit Methyl- nitrosoharnstoff (MNH) erzeugt wurden. Parallel zur Bestimmung des DNS- Gehaltes wurde der Histongehalt gemessen. Befunde an Tumoren, die mit dem gleiehen Carcinogen induziert wurden, liegen unseres Wissens bisher nur yon JOBST (im Druck) vor.

Material und Teehnik

Die Untersuchungen wurden an 9 versehiedenen experimentellen Gesehwiilsten der Haubenratte (6 Sarkome, 20ligodendrogliome, 1 G]ioblastoma multiforme) ausgefiihrt. Bei 5 Tieren wurden primer dutch lVINH-Applikation erzeugte Geschwiilste, bei 2 Tieren Transplantattumoren eines mit MNH induzierten intrakraniellen Sarkoms untersueht (Herstellung der verwendeten MNH-L6sung und Morphologie der experimentellen Gesehwiilste des Zentralnervensystems s. Jii~TISCH U. Mitarb., 1967; J;~NISCH u. SCHR]~IBER, ~ Druck). Bei Ratte 473 konnten Messungen an 2 getrennten intrakraniellen Tumoren ausgeffihrt werden. Das Oligodendrogliom der Ratte Nr. 97 war naeh Implantation eines 6.9.10-Trimethyl-l.2-Benzanthrazen-Pellets entstanden. Mit Ausnahme der Ratte 485, die nach dem Spontantod obduziert worden war, wurden die Versuehstiere im moribunden Zustand get6tet und die Gewebsstficke in neutralem Formol fixiert. Die Sehnittdieke betrug 8 I.tm.

Die DNS wurde mit der Feulgenf~rbung naehgewiesen (10 mln HC1-Hydrolyse, 80 rain Behandlung mit Sehiffschem Reagens) und bei einer Wellenl~nge yon 2 = 570 nm gemessen. Der Histonnachweis geschah mit der Fastgreenf~rbung nach AL~V.~T U. GESCHW~D (1953). Die Schnitte wurden 15 rain bei 90~ mit 5%iger Trichloressigs~ure extrahiert und 60 mln mit 0,1%iger FastgreenlSsung (pH 8,1, Fastgreen FCF General Aniline Division Cert. No. 18) gef~rbt und naeh grfindlichem Spiilen in Aqua dest. fiber Terpineol und Xylol als Intermedien in Neutralbalsam eingebettet. Sie wurden bei einer Wellenl~nge yon 2 = 600 nm ausgewertet. An dem Glioblastoma multiforme (=Glioblastom)wurde der kombinierte DNS/Histonnaehweis naeh BLOCH U. GODNIAI~ (1955) durchgeffihrt, da bier Messungen an verschiedenen Kernen auf Grund der Polymorphie nicht vergleiehbar w~ren. Der DNS-Gehalt wurde am Cytophotometer des Zoologi- schen Instituts der Universits Jena (Gw~scH u. Mitarb., 1964) bestimmt, die Histonmessungen sowie die Untersuehung des Glioblastoms wurden im Patho- logisehen Institut der Medizinischen Akademie P~es (Ungarn) durchgeffihrt (zur Technik s. JOBST U. KELLERMAYER, 1967).

Bei den DNS-Bestimmungen warden die Kernumrisse anschlieBend mit einem Zeichenapparat nachgezeichnet und planimetriert. Die ermittelten Werte

146 R. THUST und W. JX~SCH:

(AE = Arbeitseinheiten) ergeben sieh aus dem Produkt der mittleren Extinktion und der Kernfl~ehe. Pro Kern wurden je naeh GrSBe 3--8 Messungen ausgeffihrt. Die Kontrollmessungen wurden an tumorfreien Bezirken des gleichen Schnittes durehgeffihrt und deren Mittelwerte als Standard (= 2c) in die Tumor-Hi,to- gramme eingetragen. Die untersehiedlichen Werte des DNS- und Histongehaltes resultieren aus der Verwendung verschiedener Cytophotometer.

Ergebnisse

a) Nr. 444. Extrakranielles Sarkom der Sch~delbasis, dureh Applikation yon MNH induziert. Dosis: 10 mg/kg in 14t~gigem Abstand, i.v. Latenzzeit 202 d. Der DNS-Gehalt der Zenkerne ist gegenfiber dem Normalwert (ca. 11 AE) deutlich zum triploiden Bereich versehoben. Die MeBergebnisse lassen darauf

12c

/,44

.i2r [

!

i

A E " ~ A E

Abb. ]. DNS- und Histongehalt des Sarkoms Nr. 444 in ~beitseinheiten (AE). Schwaz~" DNS-Gehalt, well]: Histengehalt. Auf der Ordinate ist die Anzahl der gemessenen Kerne (n)

aufgetragen, 2 c diploider Normalwert

sehUeBen, dab die Tumorzellen vorwiegend yon einer hyperdiploiden bis tetra- ploiden Stammlluie gebildet werden, die Streuung der Wer~e ist gering. Die Histongehalte entspreehen diesen Befunden. Sie liegen im diploiden bis tetra- ploiden Bereieh (Abb. 1).

b) Nr. d73a. Leptomeningiales Sarkom (parietal) nach Applikation yon M1N-H. Dosis: 25 mg/kg in 4wSchigem Abstand, i.v. Latenzzeit 243 d. Dieser Tumor ist iiberwiegend diploid ( 2 c = 8 AE). Daneben existieren ein zweites H~ufigkeits- maximum im triploiden Bereich sowie tetraploide Kerne. Die Hi~tonwerte zeigen den gleichen Sachverhalt. Dieser Tumor wurde als vorwiegend gleich- fSrmiges Sarkom mit der Tendenz zur Bfldung yon Riesenzellen diagnostizier~; die cytophotometrischen Messungen best~tigen diesen Befund (Abb. 2).

c) Nr. 533. Sarkom des Rfiekenmarkes naeh Applikation yon M_NH. Dosis: 10 mg/kg in 14t~gigem Abstand, i.v. Latenzzeit 146 d. Dieser Tumor besitzt

Untersuchungen fiber den DNS- und Histongehalt induzierter Tumoren 147

3a

AE

Abb. 2. DNS- und Histongehalt des Sarkoms Nr. 473a

12c I I [

n 533

AE"

I [ I I

I I I I

1o

6

533

AE

12

Abb. 3. DNS- und Histongehalt des Sarkoms Nr. 533

neben einer starken Population diploider Kerne Zellen mit triploidem bis tetra- ploidem DNS-Gehalt. Die Gesamtstreuung ist m~Big. Die Tendenz zu h6heren Ploidiegraden kommt auch im Histongehalt zum Ausdruck (Abb. 3).

d) Nr. 744. Adventitielles zellreiches Sarkom der Hirnbasis nach Applikation yon MNH. Dosis: 20 mg/kg in 4w6chigem Abstand, i.p. Latenzzeit 137 d. Das vorliegende Sarkom wurde als Ausgangsmaterial ffir Transplantationsexperi- mente verwendet. Die gemessenen Are~le stellcn relativ kleine perivascul~re Herde dar, die deutlich ihrc Herkunft yon der Adventitia erkennen lassen. Die DNS- und Histonwerte zeigen fibereinstimmend, dab dieser Tumor vorwiegend

148 R. THUST und W. JANISCH:

// ] I

5 n

2c

74~,

l_ 6 1"2

AE

Abb. 4. DNS- und Histongehalt des Sarkoms l~r. 744

5 '

I n ]2c I t

863

]2c n

863

Abb. 5. DNS- und Histongehalt des Sarkoms Nr. 863 (erste Transplantatgeneration von Nr. 744)

aus einer Population diploider Zellen besteht, obwohl aueh tetraploide Werte gemessen wurden (Abb. 4).

e) Nr. 863. Erste Transplantatgeneration des Sarkoms der Ratte Nr. 744. Lokalisa~ion: parietal rechts, Latenzzeit 41 d. Die Abweichungen des DNS- bzw. Histongehaltes yore Ausgangstumor sind gering. Auch dieser Tumor ist noeh iiberwiegend diploid. Die Tendenz zur Polyploidisierung ist jedoch zu vermuten. Einzelne Kerne zeigen triploide his hypertetraploide DNS-Wer~e (Abb. 5).

Untersuehungen fiber den DNS- und Histongehalt induzierter Tumoren 149

12c I

n I I 1 1 I ~02

I

12c

902

I

II ] AE

Abb. 6. DNS- und Histongehalt des Sarkoms Nr. 902 (zweite Transplantatgeneration yon Nr. 744)

2c

97

I

AE AE 6

Abb. 7. DNS- und Histongehalt des Oligodendroglioms Nr. 97

]) Nr. 902. Zweite Transplantatgeneration des Sarkoms der Ratte Nr. 744. Lokalisation: parietal rechts, Latenzzeit 33 d. Die Histogramme zeigen gegeniiber der P- mad F1-Generation deutliche Unterschiede. Die DNS-Werte bflden drei H~ufigkeitsmax~ma. Die grSBte Population ist diploid, daneben sind die H~ufun- gen im triploiden bis hypertetraploiden Bereieh unverkennbar. Die Histon. messungen erbraehten gleiehartige Ergebnisse, wenngleich hier die Untersehiede wie auch in den iibrigen Histon-Histogrammen nieht so deutlich sind, was methodisch bedingt sein dtirfte (Abb. 6).

150 R. THUST und W. J~TXSCH:

2c

I I 1 I I I I I

I 10 20

485

AE

n I

J

-1

48S

AE

Abb. 8. DNS- und Histongehalt des Oligodendroglioms Nr. 485

I 2 3 4 5 6 7 8 9 /0 f!

Abb. 9. Histogramm des Glioblastoms Nr. 473b (Glioblastoma multiforme). Au/der Abscisse sind die Kernnummern aufgetragen, auf der Ordinate die DNS- und Histonwerte in AE.

Schwarz: DNS, weifi: Histon

g) Nr. 97. Oligodendrogliom (parietal). Tumorinduktion durch Pelletimplan- ration yon 6.9.10-Trimethyl-l.2.Benzanthrazen. Latenzzeit 250 d.

h) Nr. 485. Oligodendrogliom (ffontoparietal) nach Applikation yon MNH, Dosis: 25 mg/kg in 4wSehigem Abstand, i.v. Latenzzeit 202 d. Diese beiden. durch verschiedene Karzinogene induziert~n Oligodendrogliome stimmen sowohl im DNS- als auch im Hi~tongehalt so gut fiberein, dab sich eine getrennte Bespreehung erfibrigt. Die DNS-Werte gruppieren sieh bei relativ geringer

Untersuehungen fiber den DNS- und Histongehalt induzierter Tumoren 151

Streuung um den diploiden Standardwert, gleiehes trifft fiir den Histongehalt zu (Abb. 7, 8).

i ) Nr . 473b. GUoblastoma multiforme (parietal). Gleiehes Versuchstier wie bTr. 473a. Abb. 9 stellt die Ergebnisse der kombinierten DNS/Histon-Messungen einiger ZeUkerne dar. Sehon die histologisehe Untersuehung l~Bt bei vielen Kernen eine hochgradige Polyploidie vermuten. Infolge der Polymorphie w/iren aueh groBe MeBserien nieht repr~sentativ, sondern kSnnten lediglich die Vielfalt noch deutlieher widerspiegeln. Der DNS-Gehalt der Kerne 1--4 entspricht etwa dem Normalwert (vgl. Abb. 2). Der Kern 11 besitzt einen Ploidiegrad yon 18--20c, er geh6rt jedoch keinesfalls zu den gr6flten Kernen. Die Histonwerte weisen zu den entsprechenden DNS-Werten keine feste Relation auf. Dieser Befund kSnnte durch degenerative Prozesse, die an vielen SteUen des Tumors erkennbar sind, erkl~rt werden.

Die beigefiigte Tabelle stellt die Mittelwerte und Standardabweiehungen des DIqS- und Histongehaltes der einzelnen Tumoren gegeniiber. Im Gegensatz zu SANDRITTER n. KI~]EID-HA~TS (1964) konnten wir an unserem Material keine regelhafte Beziehung zwischen dem Reifegrad des Tumors und der Streuung der Mel3werte finden.

Tabelle. Verglelch der Mittelwerte und der Standardabweichungen des DNS. und Histonqehaltes der Sarkome und Oligodendrogliome (Angaben in AE). Fiir die Mittelwertberechnung warden

die aus der Population heraus/allenden Einzdwerte yon n abgezogen

Nr. DNS Histon

n ~ s n s a

444 29 14,04 0,25 30 4,64 1,62 473a 30 (32--2) 9,93 2,19 18 5,69 1,02 533 30 13,49 1,05 19 3,58 0,34 744 30 (32--2) 11,14 2,48 19 7,60 0,79 863 29 (32 -- 3) 11,44 2,36 25 7,86 0,52 902 32 17,58 2,58 28 8,92 0,70 97 30 (32--2) 8,83 0,15 22 4,39 0,10

485 29 (31 -- 2) 8,24 1,46 30 4,80 1,77

D i s k u s s i o n

Die zahlreichen bisher vorliegenden Untersuchungen lassen keine gesetzm~13ige Beziehung zwischen dem tumorerzeugenden Agens und den Ver~nderungen des Ploidiegrades erkennen (LEucHTENBERGER U. LEUCHTENBERGER, 1966). Neben diploiden Tumoren wurden hochgradig polyploide Geschwiilste beobachtet. Vielmehr deuten die Befunde darauf hin, dal3 sich als Folgeerscheinung der Malignisierung unter den Tumorzellen eine DNS-StammIiuie etabliert, die gegeniiber den normalen Somazellen einen selektiven Proliferationsvorteil auf- weist mad sieh mi|ieubedingt ~ndern kann (S~.IDEL U. SANDRITTER 1963; SANDm~TER U. Mitarb. 1965; GRU~D~NN U. HOBr~, 1965). Die urspriingliche Hypothese der Chromosomenver~nderungen als Ursaehe der Krebsentstehung (BovERI, 1914) l~flt sich also nieht aufreehterhalten.

Die Deutung eytophotometriseher Messungen ist, abgesehen yon teehniseh bedingten Fehlerm5glichkeiten, problematisch, da sie an proliferierenden Geweben

152 R. THUST und W. JAwISC~:

keine MSglichkeit der Unterscheidung zwischen echten und tempor~ren, durch die S- und G1-Phase bedingten Aneuploidien zulassen (RoHRBACH U. Mitarb., 1968). Untersuchungen fiber die Generationszeit mad die L~nge der einzelnen Interphaseperioden des hier untersuehten Tumormaterials liegen nieht vor. Bisher publizierte Angaben fiber die Phasenl~ngen yon versehiedenen Normal- und Tumorgeweben streuen in so weiten Bereichen, dab Verallgemeinerungen nieht m6glieh sind ( L ~ R T Z U. MAURER, 1964; WEGEN~R U. Mitarb., 1964; HOLL- WEG U. 1KAU~ER, 1964 ; WEISSENFELS U. LOBBECKE, 1968; LEDERER U. LENNARTZ, 1968). Die Untersuehungen yon ROHRBACH U. Mitarb. (1968) fiber die Ver~n- derungen des DNS-Gehaltes nach eoeareinogenen und earcinogenen Re~zen ergaben durch die Verkfirzung der G1-Phase einen erh6hten Antefl polyploider Zellen. Da ffir die in der vorliegenden Arbeit untersuehten Tumoren in keinem Fall eine besondere Mitose-H~ufigkeit als charakterlstiseh bezeichnet werden kann, nehmen wir an, dab nur ein geringer Prozentsatz erh6hter MeBwerte auf eine tempor~re Polyploidie zurfiekzuffihren ist. Die an den dureh Methylnitroso- harnstoff induzierten Sarkomen gemessenen Werte des DNS- und Histongehaltes lassen vermuten, dab diese Tumoren im Verlauf ihrer Genese eine triploide bis tetraploide Stammllnie herausbflden. Dieser ProzeB diiffte bei Tumoren des Zentralnervensystems kaum zu Ende gefGhrt werden, da das Tumorwaehstum auf Grund seiner Lokalisation frfihzeitig zum Tode des Versuehstieres ffihrt. Ffir diese Ansieht sprieht, dab das extrakranielle Sarkom (444) sowie die F 2- Generation eines transplantierten intrakraniellen Sarkoms (902) eine derartige Stammlinie besitzen. Damit werden die Befunde von JOBST (im Druck) an MNH-induzierten Nierensarkomen best~tigt. An 01igodendrogliomen konnten wir im Gegensatz zu JOBST keine Ver/~nderungen des DNS- und Histongehaltes gegenfiber den Normalwerten feststellen. Leider ist die Genauigkeit eytophoto- metriseher Messungen des DNS/Histon-Quotienten zu gering, um Aussagen bezfiglieh tier Bedeutung der Alkylierung nach Applikation bestimmter N-Nitrose- Verbindungen ffir die Malignisierung (MAG~., 1966) zu ermSgliehen.

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Dipl.-Biol. Dr. rer. nat. R. THUST Dozent Dr. reed. habil W. JX~scH Pathologisches Institut der Medizinischen Akademie Erfurt X 50 Erfurt, Nordh~user Str. 74