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CURSO TEÓRICOCURSO TEÓRICO--PRÁCTICO DE PRÁCTICO DE ESPECTROMETRÍA DE MASASESPECTROMETRÍA DE MASAS

Dra. Pilar Blasco Dr. Pablo Candela

CURSO FORMACIÓN ESPECÍFICA PAS - 2012

HPLC/MSHPLC/MS ¿Por qué acoplar un HPLC y un MS?¿Por qué acoplar un HPLC y un MS?

Mediante HPLC podemos analizar un prango más amplio de compuestos en comparación con GC.

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Acoplamiento HPLCAcoplamiento HPLC--MSMS

HPLC puede analizar “casi todo” (GC solo volátiles)UV no inequívoco (ni usando patrones)

MS es un detector universal (SCAN) y selectivo (SIM)si posibilidad de MS/MS, identificación inequívocaproporciona mayor información estructuralcapaz de detectar mezclas (sin buena separación)

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¡Se ha convertido en una de las herramientas más poderosas para el análisis de mezclas complejas de especies orgánicas y bioquímicas!

capaz de detectar mezclas (sin buena separación)para la mayoría de compuestos más sensible y másespecífico que otros detectores LCda información cualitativa y cuantitativa (incluso depicos cromatográficos no resueltos)complementa a otros detectores LC existentes

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Rango de aplicaciónRango de aplicación

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HPLC

El acoplamiento con Espectrometría de Masas

Interfases. Fuentes de Ionización

ContenidosContenidos

Adaptación de métodos

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High Pressure Liquid ChromatographyHigh Performance Liquid Chromatography

es una técnica CROMATOGRÁFICA donde la separación de

HPLCHPLC

…es una técnica CROMATOGRÁFICA donde la separación de

la muestra tiene lugar mediante INTERACCIONES

FÍSICAS Y/O QUÍMICAS de los diferentes analitos, en su

paso a través de la COLUMNA que contiene la FASE

ESTACIONARIA, y arrastrados por la FASE MÓVIL líquida

(eluyente).

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Fundamento del proceso Fundamento del proceso cromatográficocromatográfico

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Adsorción superficial (F.E: sólida)

- Silica (90%)

- Alúmina (10%)

Partición (F.E. líquida)

Tipos de LC según mecanismos de interacciónTipos de LC según mecanismos de interacción

- Fase Normal (NP)

- Fase Reversa (RP)

Intercambio iónico (SCX, SAX,…)

Exclusión molecular (SEC)

- SEC no acuoso (GPC)

- SEC acuoso (GFC)8

La columna consiste normalmente en un tubo de acero

inoxidable de longitud y diámetro interno característico

empaquetado con partículas porosas de diámetro

definido cuya superficie se recubre con un tipo de fase

Columna HPLCColumna HPLC

definido cuya superficie se recubre con un tipo de fase

estacionaria mediante uniones químicas.

Definida por el tipo de relleno (Fase Estacionaria), la

longitud, el diámetro interno, el tamaño de partícula.

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CromatogramaCromatograma HPLCHPLC

Ejemplo: determinación de hormonas en pescado.

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DESGASIFICADOR

ELUYENTES

SISTEMA DE BOMBEO

Componentes del sistema HPLCComponentes del sistema HPLC

DETECTOR

SISTEMA DE INYECCIÓN

HORNO+COLUMNA

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Cuadrupolos (Q)Trampa de iones (IT)Tiempo de vuelo (TOF)Sistemas híbridos (QqQ, qTOF,…)

Sector Magnético

Analizadores de masas en HPLCAnalizadores de masas en HPLC

gFT

…cada uno de ellos ofreciendo sus característicasResoluciónRango de masasSensibilidadVelocidad de adquisición de espectros

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Acoplamiento HPLCAcoplamiento HPLC--MSMS

LC trabaja a presión, temperatura ambiente y flujos delíquidos relativamente altos empleando tampones no volátiles

MS opera con gases, a alto vacío y elevada temperatura (100-350ºC), y prefiere tampones volátiles

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Flujo de 1-2mL/min de un líquido = cientos o miles de mL/minde gas del eluyente

Presentan gran incompatibilidadLa interfase entre ambos es la clave del éxito

CROMATÓGRAFO HPLC ESPECTRÓMETRO DE MASAS

Introducción directa de líquidosInterfase de cinta móvil (moving belt)FAB/LSIMS dinámicoIonización por termonebulización (Thermospray, TSP)Nebulización en plasma (Plasmaspray, PSP)I f d h d í l (P i l b PB)

InterfasesInterfases HPLCHPLC--MSMS

Interfase de haz de partículas (Particle beam, PB)Ionización a Presión Atmosférica (API)

ESIAPcIAPPI

SOLO Introducción ⇒ Necesita técnica de IonizaciónDe Introducción +Ionización

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60’s Comienza el HPLC como “High Pressure” LC1975 Análisis de mezclas complejas70’s Mejoras de columnas e instrumentos da lugar a

“High Performance” LC80’s Comienza el boom HPLC

Evolución de la Espectrometría de Masas (en LC y LC/MS)Evolución de la Espectrometría de Masas (en LC y LC/MS)

80 s Comienza el boom HPLC1995 Equipos de sobremesa HPLC/MS2002 Sistemas de Nanoflujos2006 Desarrollo LC rápida: UPLC, RRLC, UFLC, RSLC,…

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HOY EN DÍA, está desplazando a otras técnicas como ANÁLISIS DE RUTINA!!!!

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InterfasesInterfases APIAPI

Las técnicas de ionización API

son técnicas de ionización

blandas que se caracterizan por

trabajar a presión atmosférica.

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trabajar a presión atmosférica.

Producen una ionización “suave” y

una fragmentación controlada.

ESI

APcI

APPI

Ionización Ionización ElectrosprayElectrospray (ESI)(ESI)

Diseños difieren ligeramente entre las diferentes casas comerciales para salvar las patentes.

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Mecanismo de Evaporación IónicaMecanismo de Evaporación Iónica

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o Muestra y disolventes son nebulizados mediante una

corriente de gas inerte, para formar pequeñas gotas.

o El disolvente es evaporado de las gotas (desolvatación)

o La densidad de carga de las gotas aumenta hasta el límite

Mecanismo de Evaporación IónicaMecanismo de Evaporación Iónica

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de Raleigh, momento en el que se rompen en otras más

pequeñas (explosión de Coulomb).

o Los analitos se desorben de las gotas bajo la influencia de

altos potenciales electrostáticos en la cámara de ionización.

Características ESICaracterísticas ESI

o Los iones se producen en la fase líquida.

o Al igual que las otras técnicas “blandas” produce el

IÓN PSEUDOMOLECULAR principalmente.

o Se produce también la formación de ADUCTOS

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o Se produce también la formación de ADUCTOS.

o Es posible la formación de especies multicargadas, lo

que permite ampliar el rango de masas de estudio.

o Espectros son altamente dependientes de las

condiciones experimentales, con lo que dificulta el uso

de librerías (espectrotecas).

Características ESICaracterísticas ESI

o Trabaja mejor a caudales pequeños (<0.5ml/min).

o Es adecuada para compuestos de ligeramente polares

a compuestos iónicos.

o Se pueden producir fenómenos de supresión iónica

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o Se pueden producir fenómenos de supresión iónica.

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Espectro ESIEspectro ESI

(M+H)+

(MS/MS)

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C17H23NO4S MW: 337

Se observa principalmente el ión molecular. También puede

observarse algún aducto y/o algo de fragmentación.

Para obtener información estructural debemos hacer uso de

técnicas de MS/MS.

Una característica muyimportante de esta técnica esque, al producir una enormeabundancia de iones con cargamúltiple, pueden determinarsemasas moleculares de

Espectro ESIEspectro ESI

20+ 15+19+ 18+ 17+

16+

21+

14+

13+

12+

masas moleculares demoléculas muy grandes, comoproteínas.

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Mioglobina de corazón de caballo

PM = 16950.5

mi+1 – mH

mi – mi+1i =

1060.5 – 1

1131.1 – 1060.5= = 15

M = i (mi - mH)

¿Cómo sabemos si una especie tiene más de una carga?Espectro ESIEspectro ESI

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- Estudiando el “entorno isotópico”

- Mediante MS/MS o estudio de las fragmentaciones.

1+ diferencia 1 Da2+diferencia 0.5 Da3+ diferencia 0.33 Da

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Ionización química a Presión Atmosférica (Ionización química a Presión Atmosférica (APcIAPcI))

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¡Recordad! Diseños difieren entre lasdiferentes casas comerciales para salvar laspatentes. ¿¿Ventajas o inconvenientes??

Mecanismo de Mecanismo de APcIAPcI

El mecanismo de ionización mássignificativo en APcI es laionización química en fase gas delanalito por el plasma de ionesgenerado, de forma análoga a unaionización química clásica

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La descarga presente en la fuente produce un plasma de ionesreactivos del disolvente, lo que origina el mecanismo de ionización dela muestra por ionización química, normalmente por adición o cesiónde un protón.

ionización química clásica.

o La fase móvil y los analitos son nebulizados en pequeñas

gotas.

o Las gotas son vaporizadas.

o Las moléculas de la fase móvil son ionizadas por electrones

Mecanismo Mecanismo APcIAPcI

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emitidos por la aguja de descarga.

o Las moléculas de analito son ionizadas por los iones de la

fase móvil.

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Características Características APcIAPcI

o Los iones se producen en la fase gaseosa.

o Al igual que las otras técnicas “blandas” produce el IÓN

PSEUDOMOLECULAR principalmente.

o Menos sensible a las variaciones en la disolución.

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o Trabaja mejor a caudales mayores, 1-2 ml/min (HPLC).

o Es adecuada para compuestos apolares y poco polares.

o No apropiada para analitos cargados en disolución.

o Requiere cierta volatilidad de la muestra.

o Posible degradación de compuestos termolábiles.

Espectro Espectro APcIAPcI

Estearato de metiloC19H38O2

298 100299 21.2

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Video de Agilent (fuente multimodo)

300 2.5301 0.2

299 100300 21.3301 2.5302 0.2

Tengo una muestra para analizar mediante HPLC/MSTengo una muestra para analizar mediante HPLC/MS

Puede ser útil analizar mediante HPLC/MS si tienes...

… una impureza desconocida.… un producto de síntesis para confirmar su PM.

… una mezcla compleja de analitos polares para cuantificar. … compuestos de elevado peso molecular.

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… un intermedio de reacción.…

……

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Consideraciones previas al análisis mediante HPLC/MSConsideraciones previas al análisis mediante HPLC/MS

1) CONOCIMIENTO previo de la MUESTRADeterminar cuales son mis necesidades de análisisQué compuestos quiero analizar?En qué concentraciones están?En qué matriz?Análisis cualitativo o cuantitativo?

2) Búsqueda de INFORMACIÓN

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2) Búsqueda de INFORMACIÓNInformación bibliográfica (revistas, libros,...)?Información comercial?Otras fuentes

3) PUESTA a PUNTO del métodoAplicación de Normas?Modificación de método existente?Creación de una nueva metodología?

4) ANÁLISIS de la muestra

Diferentes opciones

- Introducción directa al Espectrómetro de Masas

- Introducción a través del HPLC (sin columna)- FIA

Selección de las Condiciones de AnálisisSelección de las Condiciones de Análisis

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-Introducción a través del HPLC (con columna)

ADAPTACIÓN DE MÉTODOS de HPLC a HPLC/MS

Selección de las Condiciones de AnálisisSelección de las Condiciones de Análisis

- Condiciones del E. Masas (tipo de analizador, modo de trabajo,...)- Condiciones de Ionización (ESI, APcI,...)- Condiciones de la Cromatografía (tipo de columna, dimensiones de columna, eluyentes, gradiente, flujo,...)- Condiciones de preparación de muestra (extracción, limpieza,

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p p ( pfiltrado,...)

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Ejemplos: ESTUDIO ESTRUCTURAL de un compuesto;OPTIMIZACIÓN de CONDICIONES DEL MASAS; ESTUDIOde INTERMEDIOS de REACCIÓN;…

Infusión directa al MS o FIA

Introducción directa al E. MasasIntroducción directa al E. Masas

Elección de la técnica de ionización

Elección del analizador y del modo de trabajo del E. de Masas

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En estos modos de trabajo NO hay separación previa de la muestra.

Mediante INFUSIÓN directa una disolución de la muestra se introduce de forma continua a velocidades de flujo bajas (<20ul/min) a través de la interfase API mediante una bomba de

Introducción directa al E. MasasIntroducción directa al E. Masas

Infusión directa al MS o FIA

(<20ul/min) a través de la interfase API mediante una bomba de adición. De este modo se puede realizar análisis de la muestra durante largos tiempos.La complejidad de la muestra debe ser inferior a 5 componentes y se debe tener en cuenta la posible interferencia de la matriz.

Mediante FIA (Análisis por Inyección en Flujo) la muestra se inyecta en una corriente de flujo de eluyente a través del HPLC pero sin columna. El método resulta especialmente útil para la optimización de las condiciones del equipo.

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Introducción directa al E. MasasIntroducción directa al E. Masas

Elección de la técnica de ionizaciónESI vs APcI

Ejemplo de Aplicaciones:

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Introducción directa al E. MasasIntroducción directa al E. Masas

Elección de la técnica de ionizaciónESI vs APcI

Factores que afectan a la señal del analito.

Efecto de matriz: ESI>APCIESI: la señal disminuye con el aumento de la concentración de otros

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yelectrolitos (supresión iónica)APCI: no hay efectos importantesLa concentración del analito.ESI: la señal se llega a saturar (aprox. 10µM)APCI: no hay efectoEl flujo de fase móvilESI: la respuesta disminuye con el flujo (0.1-0.2 mL/min)APCI: son necesarios flujos altos. 0.5-1 mL/min

Sensibilidad de compuestos polares: ESI>APCISensibilidad de compuestos no polares: APCI>ESI

Introducción directa al E. MasasIntroducción directa al E. Masas

Elección de la técnica de ionizaciónESI vs APcI

Disolventes compatibles

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Introducción directa al E. MasasIntroducción directa al E. Masas

Elección de la técnica de ionizaciónESI vs APcI

Tampones típicos. Influencia del pH.Es importante el control del pH para asegurar una buena repetitibilidad. Conviene trabajar 2 unidades por encima o por debajo del pKa de los analitos para asegurar una completa ionización

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analitos para asegurar una completa ionización.

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Selección de la polaridad: POSITIVA y/o NEGATIVAAjuste de los parámetros de ionización y de introducciónElección del tipo de ANALIZADOR

-según necesidad de Resolución

Introducción directa al E. MasasIntroducción directa al E. Masas

Elección del analizador y del modo de trabajo del E. de Masas

g-según necesidad de MS/MS-según necesidad de Sensibilidad

Elección del MODO de trabajo del ANALIZADORSCANSIM o SIRMRMMSn

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“A study of characteristic fragmentation of isoflavonoids by using negative ion ESI-MSn”Keyume Ablajan J. Mass. Spectrom. 2011, 46, 77–84

Ejemplo: Infusión directa para análisis estructuralEjemplo: Infusión directa para análisis estructural

Muestra: 98%pureza, 20µg/mLa en MeOH/H2O (80:20, v/v, 10mM AcONH4)Infusión directa a 5µL/min.Condiciones Masas: ESI negativo, MSn, MASAS:qLIT (QTRAP)

MW=462[M-H]- =461

MS2 (461)

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MS3 (299)

MS3 (298)

MS4(284)

Introducción a través del HPLCIntroducción a través del HPLC

Ejemplos: DETECCIÓN DE TRAZAS DE CONTAMINANTES;ANÁLISIS DE IMPUREZAS; CONTROL ANTIDOPPING;…

Elección de la técnica de ionización

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Elección del analizador y del modo de trabajo del E. de Masas

Elección de las condiciones cromatográficas

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Introducción a través del HPLCIntroducción a través del HPLC

Elección de las condiciones cromatográficas

o Selección de la COLUMNA.o Selección de los eluyentes.o Selección del modo: ISOCRÁTICO o GRADIENTE.o Selección del resto de condiciones.

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En las separaciones cromatográficas buscamos buena separación(buena resolución) de los compuestos en el menor tiempo posible.

Disminuyendo las dimensiones de la columna se disminuye el gasto deeluyentes, se emplean flujos menores, se reduce el tiempo de análisis,se incrementa la sensibilidad,...F R (80% li i ) F N l

Selección de la columna HPLCSelección de la columna HPLC

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Fase Reversa (80% aplicaciones) vs Fase NormalColumna estándar (C18; 4.6mm x 150mm x 5µm) Análisis de 20-30min

MS (ESI prefiere flujos más bajos)

En las separaciones cromatográficas buscamos buena separación(buena resolución) de los compuestos en el menor tiempo posible.

Disminuyendo las dimensiones de la columna, se disminuye el gasto deeluyentes, se emplean flujos menores, se reduce el tiempo deanálisis, se incrementa la sensibilidad,...

Selección de la columna HPLCSelección de la columna HPLC

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Estos tres términos corresponden a retención, selectividad y eficiencia.

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Factores químicos: SELECTIVIDAD (α) Y CAPACIDAD (k’)Factores físicos: EFICIENCIA o Platos teóricos (N)

SELECTIVIDAD: Mide la retención relativa de dos componentesen una mezcla. Es función del empaquetado de la columna (fase) yde las condiciones de elución.CAPACIDAD: Mide cómo de bien se retiene un compuesto en

Factores que afectan a la separación Factores que afectan a la separación HPLCHPLC

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CAPACIDAD: Mide cómo de bien se retiene un compuesto encondiciones isocráticas. Es función del empaquetado de columna yde las condiciones de elución.EFICIENCIA: Una columna se caracteriza por la medida de sueficiencia. En realidad es una medida de todo el sistema HPLC(contribución de volúmenes muertos). Influenciada por la longitudde columna y el tamaño de partícula.

Tiempo muerto (tM, seg)Tiempo de retención (tR, seg)Tiempo retención reducido (tR’=tR-tM, seg)Retención relativa (α=tR’2/tR’1)Amplitud de banda (ω, seg)Relación de capacidad (k’=tR’/tM)

Parámetros del Parámetros del cromatogramacromatograma

Resolución (Rs)Número de platos teóricos (N)

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Adaptación de un Método a LC/MSAdaptación de un Método a LC/MSAdaptación de métodos LC a LCMS (ESI)

Sustitución de tampones no volátiles por tampones volátiles.La concentración de tampón volátil deberá ser <10mM. SI >10mMpuede provocar inhibición. Si >100mM no ionizará. Se puede empezara probar con 5mM.Si ha de emplearse tampón no volátil usar uno donde la parte

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Si ha de emplearse tampón no volátil, usar uno donde la parteaniónica o catiónica sea volátil (fosfato amónico en lugar de sódico).La parte no volátil del tampón debe ser ionizable en el modo usado.Evitar aditivos (sales) que supriman la ionización.Usar flujos compatibles con MS.

Adaptación de métodos LC a LCMS (APCI)

Sustitución de tampones no volátiles por tampones volátiles.La concentración de tampón volátil deberá ser <100mM.

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Ejemplo de análisis a través de HPLC/MSEjemplo de análisis a través de HPLC/MS

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