curso de postgrado introducción a la biotecnología algal · protocolo c 1- determinación de la...

1

Curso de postgrado

Introducción a la

Biotecnología algal

Desde el aislamiento de cepas nativas

hasta posibles procesos industriales para

la obtención de biocombustibles y otros

bioproductos.

Protocolos.

2

Listado de protocolos

PROTOCOLO A Observación e Identificación de microalgas y cianobacterias. 3

PROTOCOLO B - Dispositivos de cultivo de microalgas 16

PROTOCOLO C - Determinación de la composición bioquímica de biomasa

algal: determinación de proteínas totales (Método de Lowry)

18

PROTOCOLO D - Transformación nuclear de Chlamydomonas reinhardtii 21

PROTOCOLO E - Determinación de la composición bioquímica de biomasa

algal: Determinación gravimétrica de lípidos totales (Bligh & Dyer)

26

PROTOCOLO F - Detección de lípidos neutros por medio de la técnica de

tinción con Rojo de Nilo

29

PROTOCOLO G - Determinación de la composición bioquímica de biomasa

algal: determinación de carbohidratos totales (Método Antrona)

31

PROTOCOLO H - Parte A: hidrólisis ácida de biomasa algal, fermentación

alcohólica

34

3

PROTOCOLO A

Observación e Identificación de microalgas y cianobacterias

INTRODUCCION

Las algas son organismos muy antiguos que se encuentran presenten en casi

todos los ecosistemas terrestres, presentan una amplia gama de formas, tamaños

y estrategias ecológicas y fisiológicas. Forman un grupo muy diverso, de origen

polifilético, con representantes eucariotas y procariotas, fundamentalmente

acuáticos, autotróficos y/o heterotróficos. Presentan menor complejidad que las

plantas, pero están filogenéticamente relacionadas con las mismas. Tal es así que

presentan rutas metabólicas semejantes como la fotosíntesis oxigénica, y la síntesis

y acumulación de hidratos de carbono y lípidos (Sheehan et al., 1998; Li et al., 2008).

Hasta el momento se han reportado alrededor de 45.000 especies de algas

y se estima que existe más del doble de especies sin identificar. Las algas son uno

de los principales responsables de la producción primaria mundial y son los

productores primarios por excelencia en ambientes acuáticos. Además, participan

en diferentes ciclos biogeoquímicos globales mediante la producción de oxígeno

atmosférico, regulación del clima y la generación de combustibles (Hu et al., 2008;

Sheehan et al., 1998).

Las algas se pueden clasificar de acuerdo a varios criterios tales como su

habitat, tipo de pigmento principal, ciclo de vida, morfología y estructura celular

(Brennan y Owende, 2010). El término microalga hace referencia a un grupo muy

heterogéneo de organismos eucariotas unicelulares cuyo tamaño varía de 2-200µm,

sin embargo, usualmente algunos autores también incluyen dentro de este grupo a

las cianobacterias, organismos procariotas fotosintéticos (Greenwell et al., 2009).

Los principales grupos de microalgas (en términos de abundancia) son:

Cryptophyta, Dinophyta, Euglenophyta, Bacillarophyta y Chlorophyta (Bellinger y

Sigee, 2011; Mutanda et al., 2010, Sheehan et al., 1998).

4

OBJETIVO

Conocer las principales características para la clasificación de microalgas y

cianobacterias y observar las diferentes morfologías y estructuras presentes en las

mismas.

PROCEDIMIENTO

1) En un portaobjetos agregar una gota (10 µL) de cultivo y colocar un

cubreobjetos. Observar la preparación al microscopio, si la imagen no es muy clara

agregar una gota de aceite de inmersión y observar a 50X.

2) Observar morfología y características generales (plastos, pirenoides,

presencia de espinas o espículas, flagelos, estructuras de resistencia, acinetos,

heterocistos, etc.)

5

Recuento celular de microalgas

INTRODUCCION

A pesar del enorme desarrollo tecnológico que ha tenido lugar en los

laboratorios científicos, el conteo visual con hematocitómetro sigue siendo el

método de conteo más utilizado. La cámara Neubauer consiste en una placa gruesa

con forma de porta, cuya porción central está dividida en tres bandas longitudinales

perpendiculares a su eje longitudinal. De ellas, las dos laterales se encuentran sobre

elevadas con respecto de la central en 0.1 mm, y en la central hay grabado un

retículo cuadrangular.

Típicamente, el rango de concentraciones que permite contar el

hematocitómetro está entre 2,5x105 células y 2,5 x106 células por ml. Intentaremos

que la muestra tenga una concentración en torno a 106 (1 millón) aplicando las

diluciones correspondientes.

Por encima de 2,5 millones (2,5 * 106) la probabilidad de cometer errores de

conteo crece demasiado, y también el tiempo y esfuerzo necesario para realizar un

recuento con fiabilidad. Por encima de esta concentración es conveniente diluir la

muestra para acercar la concentración al rango óptimo.

PROCEDIMIENTO

Se toman 10 uL de la muestra de microalgas.

1) Se coloca un cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer,

2) Se coloca la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo

de la cámara de Neubauer. Se trata de dejar que el líquido penetre entre la cámara

y el cubreobjetos desde el lateral, por capilaridad.

3) En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o

algo no haya salido bien, repetir la operación

4) Observar bajo microscopio óptico a un aumento de 50X

6

MATERIALES

Microscopio óptico

Aceite de inmersión

Cubreobjetos

Portaobjetos

Pipetas

Cámara de Neubauer

BIBLIOGRAFIA

1. Bellinger, E. G., & Sigee, D. C. (2011). Freshwater algae: identification and use as

bioindicators. John Wiley & Sons.

2. Brennan, L., & Owende, P. (2010). Biofuels from microalgae—a review of technologies for

production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable and

Sustainable Energy Reviews, 14(2), 557-577.

3. Greenwell, H. C., Laurens, L. M. L., Shields, R. J., Lovitt, R. W., & Flynn, K. J. (2010). Placing

microalgae on the biofuels priority list: a review of the technological challenges. Journal of the

Royal Society Interface, 7 (46), 703-726.

4. Hu, Q., Sommerfeld, M., Jarvis, E., Ghirardi, M., Posewitz, M., Seibert, M., & Darzins, A.

(2008). Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and

advances. The Plant Journal, 54(4), 621-639.

5. Li, Q., Du, W., & Liu, D. (2008). Perspectives of microbial oils for biodiesel production. Applied

Microbiology and Biotechnology, 80(5), 749-756.

6. Mutanda, T., Ramesh, D., Karthikeyan, S., Kumari, S., Anandraj, A., & Bux, F. (2011).

Bioprospecting for hyper-lipid producing microalgal strains for sustainable biofuel

production. Bioresource Technology, 102(1), 57-70.

7. Sheehan, J., Dunahay, T., Benemman, J., Roessler, P.G. 1998. US Department of Energy.s

Office of Fuels development, July 1998. A Look back at the US Department of energy´s

Aquartic Species Program - Biodiesel from Algae, Close out report TP-580-24190. Golden,

CO: National renewable Energy Laboratory.

7

Anexo Protocolo A

CLAVES DICOTÓMICAS PARA IDENTIFICACIÓN DE ALGAS

1. Pigmentos dispersos en el citoplasma, sin plástidos ni núcleo definidos, raramente de color verde intenso….CYANOPHYTA

1’. Pigmentos reunidos en uno o varios plástidos, con núcleo….2

2. Plástidos verde intenso….3

2’. Plástidos verde-amarillento, marrones o amarillos….4

3. Reserva de almidón en los plástidos, coloreable con yodo, unicelulares, coloniales o filamentosas….CHLOROPHYTA

3’. Reserva de paramilon fuera de los plástidos, no coloreable con yodo, mayormente

unicelulares….EUGLENOPHYTA

4. Sin reservas de almidón….CHRYSOPHYTA 5

4’. Con reservas de almidón….6

5. Con 1 o 2 flagelos….CHRYSOPHYCEAE

5’. Sin flagelos, con cubierta silícea formada por dos valvas que poseen diversas

ornamentaciones….BACILLARIOPHYCEAE

6. Células provistas de 2 flagelos desiguales y de diferente orientación ubicados en un surco ecuatorial y otro longitudinal….PYRROPHYTA

6’. Células comprimidas provistas de 2 flagelos ligeramente desiguales ubicados en

una foseta subapical….CRYPTOPHYTA

CYANOPHYTA

1. Células solitarias o reunidas en cenobios o colonias....2

1’. Células formando filamentos (tricomas)....5

2. Células irregularmente dispuestas....3

2’. Células regularmente dispuestas....4

3. Células envueltas en vainas gelatinosas estratificadas....Chroococcus

3’. Células rodeadas por vaina gelatinosa difluente, no estratificada....Microcystis

4. Células dispuestas en cenobios planos, rectangulares....Merismopedia

4’. Células dispuestas en la periferia de cenobios

esféricos u ovoides....Coelosphaerium

8

5. Filamentos con heterocistos y/o acinetos....6

5’. Filamentos sin heterocistos ni acinetos, multiplicación sólo por hormogonios....11

6. Heterocistos y acinetos escasos, células terminales generalmente incoloras y

alargadas....Aphanizomenon

6’. Heterocistos y acinetos frecuentes, filamentos solitarios o agrupados....7

7. Filamentos enrollados y entrelazados dentro de una vaina gelatinosa formando un conjunto globoso consistente....Nostoc

7’. Filamentos solitarios o en conjuntos no consistentes....8

8. Filamentos únicamente con acinetos, cortos y con extremos aguzados….Raphidiopsis

8’. Filamentos con heterocistos y acinetos….9

9. Heterocistos generalmente en los extremos del filamento,....Anabaenopsis

9’. Heterocistos generalmente intercalares….10

10. Generalmente células más anchas que largas, filamentos con vaina individual….Nodularia

10’. Generalmente células esféricas o en forma de barril, sin vaina

individual....Anabaena

11. Filamentos provistos de una vaina individual firme....Lyngbya

11’. Filamentos sin vaina....12

12. Filamentos espiralados....Spirulina

12’. Filamentos rectos o curvados....13

13. Células separadas por un puente gelatinoso....Pseudoanabaena 13’. Células adyacentes unidas ....Oscillatoria

CHLOROPHYTA

1. Organismos flagelados, unicelulares o coloniales....Volvocales 2

1’. Organismos no flagelados, unicelulares, cenobiales o filamentosos....5

Volvocales

2. Unicelulares, pared celular gruesa, plástido en forma de copa....Chlamydomonas

2’. Coloniales, de forma esférica o elipsoidal....3

3. Células apretadas unas contra otras....Pandorina

3’. Células más distantes unas de otras....4

9

4. Células dispuestas en capas más o menos paralelas....Eudorina

4’. Células irregularmente dispuestas....Volvox

5. Unicelulares o cenobiales….Chlorococcales 6

5’. La mayoría filamentosos….16

Chlorococcales

6. Unicelulares....7

6’. Cenobiales....9

7. Células fusiformes....Monoraphidium

7’. Células isodiamétricas....8

8. Células esféricas....Chlorella

8’. Células tetraédricas....Tetraedron

9. Células fusiformes....10

9’. Células más isodiamétricas....12

10. Rectas o con forma de media luna poco marcada....Ankistrodesmus

10’. Con forma de media luna bien redondeada....11

11. Células adheridas unas a otras....Selenastrum

11’. Células dispersas....Kirchneriella

12. Células dispersas en una matriz gelatinosa esférica....13

12’. Células adheridas unas a otras....14

13. Células ovoides....Oocystis

13’. Células esféricas....Sphaerocystis

14. Cenobio en forma de empalizada....Scenedesmus

14’. Cenobio con simetría radial....15

15. Cenobio plano....Pediastrum

15’. Cenobio esférico....Coelastrum

16. Filamentos no ramificados, algunas también pueden ser unicelulares….17

16’. Filamentos ramificados….28

17. Zonas de elongación celular en forma de anillo….Oedogonium (Oedogoniales)

17’. Sin zonas de elongación celular diferenciadas….18

18. Conjugación sexual de gametas ameboides no flageladas….Zygnematales 19

10

18’. Gametas flageladas….Ulothrichales 26

Zygnematales

19. Membrana de la célula formando 2 hemicélulas, con poros, en su mayoría unicelulares….Desmidiaceae 20

19’. No forman hemicélulas, todas filamentosas….Zygnemataceae 24

Desmidiaceae

20. Filamentosas….Spondylosium

20’. Unicelulares….21

21. Células sin istmo (constricción que separa las hemicélulas), con forma de media luna más o menos marcada....Closterium

21’’. Células con istmo....22

22. Células con brazos (proyecciones apicales que sobresalen notablemente del cuerpo de la célula)....Staurastrum

22’. Células sin brazos....23

23. Células que presentan numerosos lóbulos profundamente marcados....Euastrum

23’. Células con pocos lóbulos, superficialmente marcados....Cosmarium

Zygnemataceae

24. Plástidos estrellados con un solo pirenoide ….Zygnema

24’. Plástidos con numerosos pirenoides….25

a 1 o 2 plástidos axiales en forma de placa….Mougeotia

25’. 1 a 16 plástidos parietales espiralados….Spirogyra

Ulothrichales

25. Las células quedan unidas de a pares después de la división celular y contenidas dentro de la membrana original....Binnuclearia

26’. Las células no quedan de esa forma....27

26. Células redondeadas en los extremos dispuestas dentro de una vaina general, en los extremos de cada célula se observa un gránulo refringente....Planctonema 27’. Células rectas, con un cloroplasto parietal en forma de anillo incompleto, raramente completo....Ulothrix

27. Monocarióticas, cloroplasto parietal cilíndrico, talo heterotrico (constituido por una parte postrada y filamentos erectos)….Chaetophora (Chaetophorales)

28’. Policarióticas, cloroplasto parietal reticulado con

numerosos pirenoides…Cladophora (Cladophorales)

11

EUGLENOPHYTA

1. Formas sin flagelo, fijas formando colonias....Colacium

1’. Formas flageladas, solitarias, libremente nadadoras....2

2. Células con teca o lórica....3

2’. Células sin teca o lórica....4

3. Lóricas aguzadas en ambos extremos....Strombomonas

3’. Lóricas esféricas o elipsoidales....Trachelomonas

4. Células de sección transversal circular, generalmente alargadas....Euglena

4’. Células de sección transversal comprimida, generalmente

más redondeadas....Phacus

PYRROPHYTA

1. Células sin teca celulósica....Gymnodinium

1’. Células con teca....2

2. Con 1 cuerno largo en la epiteca y 2 o 3 en la hipoteca....Ceratium

2’. Sin cuernos o con cuernos reducidos...3

3. Con 1 placa antiapical (acompañada de 1 suplementaria)....Gonyaulax

3’. Con 2 placas antiapicales más o menos del mismo tamaño....4

4. Con 2 o 3 placas intercalares anteriores y 5 placas postcingulares....Peridinium 4’. Sin placas intercalares anteriores o con 1 sola....Glenodinium

CRYPTOPHYTA

1. Citofaringe conspicua, cromatóforos desde verde-oliva hasta marrones....Cryptomonas

1’. Citofaringe inconspicua o ausente....2

2. Cromatóforo desde verde-oliva hasta marrón o rojo con 1 pirenoide....Rhodomonas

2’. Cromatóforo laminado parietal azul o azul-verdoso....Chroomonas

CHRYSOPHYTA

12

CHRYSOPHYCEAE

1. Células cubiertas por una lóriga en forma de vaso alargado, solitarias o formando colonias arborescentes....Dinobryon

1’. Células cubiertas por escamas silíceas....2

2. Formas solitarias....Mallomonas

2’. Formas coloniales globulosas....Synura

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PROTOCOLO B

Dispositivos de cultivo de microalgas

OBJETIVO

Conocer y utilizar diferentes sistemas de cultivo de microalgas para la obtención de

biomasa y/o compuestos de interés.

INTRODUCCIÓN

Existen diferentes tipos de sistemas de cultivo de microalgas, en general, se los

puede clasificar en sistemas de cultivo abiertos o cerrados.

Los sistemas de cultivo abiertos comprenden tanto medios naturales (lagunas y

estanques), como artificiales. Entre estos últimos, el más utilizado es el del tipo

“raceway pond”, el cual consiste en un estanque poco profundo (15 a 30 cm) dividido

por un muro central formando 2 canales. La circulación del cultivo se realiza

mediante paletas.

Los sistemas de cultivo cerrados permiten un mejor control de parámetros

(temperatura, luz, pH, etc.), permiten alcanzar mayores productividades, pero

implican mayores costos tanto de instalación como operación. Los diseños en

fotobiorreactores son variados, desde tubulares a planos, entre otros y se suelen

construir en materiales plásticos.

Los fotobiorreactores ambientales (ePBRs) son dispositivos experimentales que

permiten simular las condiciones de cultivo de microalgas a gran escala en piletones

al aire libre, incluyendo la simulación de condiciones climáticas complejas por medio

de sensores incorporados.

PROCEDIMIENTO

El trabajo práctico se dividirá en 4 estaciones:

1) “Raceway ponds”: puesta en marcha e inoculación. A diferentes tiempos se tomarán muestras para seguir crecimiento por densidad óptica (750 nm), recuento celular y peso seco.

2) PBR (fotobiorreactor): puesta en marcha e inoculación. A diferentes tiempos se tomarán muestras para seguir crecimiento por densidad óptica (750 nm), recuento celular y peso seco.

17

3) ePBR (PBR ambiental): Inoculación, establecimiento de parámetros

ambientales (se simularán dos condiciones ambientales de dos lugares

diferentes) y puesta en marcha. Se tomarán muestras periódicamente para

seguir crecimiento por densidad óptica (750 nm) y recuento celular en

hemocitómetro y se determinará el peso seco a tiempo final.

4) Microscopio: se observará la morfología algal y se realizará recuento

celular por medio de un hemocitómetro.

18

PROTOCOLO C

Determinación de la composición bioquímica de biomasa algal:

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES (Método de Lowry)

INTRODUCCIÓN

El método de Lowry consta de dos etapas:

1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los

átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un

color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la

proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda

etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con

tartrato.

2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteu, por los grupos

fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el

cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteu es el ácido

fosfo-molibdo-túngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da

lugar a un complejo de color azul intenso.

OBJETIVO

Determinar la composición de la biomasa algal, inducida y no inducida para la acumulación

de sustancias de reserva en dos cepas de microalgas de géneros diferentes: Scendesmus

sp. cepa C1S y Desmodesmus sp. cepa FG.

19

PROCEDIMIENTO

1) Centrifugar 1 mL cultivo a 6000 rpm (4°C) durante 5 min. Descartar el sobrenadante.

2) Resuspender las células en 100 uL de dH2O. Realizar una dilución 1/10 y 1/100 a un volumen final de 200 uL.

3) En tubos de hemólisis, colocar 40 uL de la muestra original y de cada dilución (por duplicado).

4) En paralelo realizar la curva estándar con BSA (4 mg/mL). Agregar para 40 uL finales: 0, 5, 10, 20 y 40 uL de BSA y completar con agua (por duplicado).

5) Agregar 10 uL de NaOH 5N a la muestra y a la curva.

6) Colocar en baño térmico a 100 °C durante 10 minutos (tapar los tubos). Enfriar.

7) A los 50 uL de muestra hidrolizada, agregar 1 mL de Reagent A y 100 uL de Folin Reagent 50% (en ddH2O). Vórtex.

8) Incubar 15 min en oscuridad. Vórtex.

9) Leer absorbancia a 750 nm (color azul grisáceo)

10) En paralelo tomar el peso seco a partir de 20 - 50 mL de la muestra desde el cultivo original.

11) Calcular la composición centesimal de proteínas totales de la muestra (% p/p).

Reagent A: 10 mL Na2CO3 2% en NaOH 0.1N

100 ul CuSO4 1 %

100 ul KNa Tartrato 2 %

Folin-Ciocalteu 50%

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MATERIALES

Falcon 50 ml

Eppendorfs 1.5 ml

Pipetas y tips 5 ml/1 ml/ 200 ul/ 20 ul

Tubos de hemólisis y tapas

Guantes, guardapolvo y protección ocular

EQUIPO

Baño térmico

Vórtex

Espectrofotómetro/cubetas de vidrio 1 ml

Balanza analítica

Centrífugas

Baño seco

REACTIVOS

NaOH 5N

Reagent A

Folin B

BIBLIOGRAFIA

1. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., & Randall, R. J. (1951). Protein measurement with

the Folin phenol reagent. Journal of biological chemistry, 193(1), 265-275.

21

PROTOCOLO D

Transformación nuclear de Chlamydomonas reinhardtii

Parte A: Método de agitación con perlas de vidrio

INTRODUCCIÓN

Las microalgas constituyen un grupo heterogéneo de microorganismos,

mayoritariamente fotosintéticos, con gran importancia ecológica y con un enorme

potencial biotecnológico. Varias especies se utilizan actualmente para la producción

a gran escala de carotenoides, ácidos grasos poliinsaturados y otros compuestos

de alto valor añadido con aplicaciones en la industria alimentaria, dietética,

cosmética y de química fina. Más aún, algunas especies de microalgas han sido

propuestas como sistemas alternativos para la expresión de proteínas heterólogas,

incluyendo anticuerpos y otras proteínas terapeúticas y en los últimos años ha

habido un creciente interés en las microalgas como posible materia prima para una

tercera generación de biocombustibles renovables con un balance neutral de

carbono (Mayfield et al.,2007; Radakovits et al., 2010).

A pesar del gran interés biotecnológico de las microalgas, no existe un método

robusto para la transformación estable de la mayoría de las especies. La primera

microalga modificada genéticamente fue la clorofita de agua dulce, Chlamydomonas

reinhardtii.

Existen varios métodos para introducir los genes deseados en la célula

hospedadora. Los más usuales para la transformación de microalgas son: el

bombardeo de microproyectiles o biobalística, la electroporación, fibras de carburo

de silicio y el método de agitación con perlas de vidrio y transformación mediada por

Agrobacterium tumefaciens. (Kindle, 1990; (Kindle et al., 1991; Kumar et al., 2004;

Mayfield et al., 2007; Jeon et al 2013).

Chlamydomonas reinhardtii, ha demostrado ser un organismo muy versátil que

puede ser utilizado tanto en estudios de ciencia básica como en diversas

aplicaciones biotecnológicas.

22

Su transformación genética es relativamente sencilla tanto a nivel nuclear como de

cloroplasto.

OBJETIVO

Modificar genéticamente una cepa de Chlamydomonas reinhardtii CW15 (que

carece de pared celular), por dos métodos diferentes: electroporación y agitación

con perlas de vidrio.

23

PROCEDIMIENTO

1) Colectar 25 -50 mL de cultivos de Chlamydomonas reinhardtii CW15 en fase

exponencial temprana, 1.106 – 2.106 células/mL (OD750 0.2 - 0.4). (La densidad

celular es un variable esencial en la eficiencia de transformación, se pueden usar

densidades menores a 1.106, pero no es recomendable usar densidades mayores

a 3.106 células/mL).

Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y descartar el sobrenadante.

2) Resuspender en 5mL de medioTAP.

3) Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos y descartar el sobrenadante.

4) Repetir pasos c y d.

5) Resuspender en 250 µL de medioTAP.

6) Agregar 2 - 4µg de ADN plasmídico con el gen de interés, previamente linealizado

(pChlamy_4 con ScaI y pCAMBIA 1302 con EcoRI. (La trasformación se puede

llevar a cabo con el plásmido en su forma circular, si se quiere una mayor eficiencia

debe linealizarse).

7) Transferir el mix a tubos de vidrio con 0,3g de esferas de vidrio e incubar al menos

5 minutos a 4°C.

8) Agitar en vortex a velocidad máxima 25 segundos.

9) Transferir las células transformadas a tubos Falcon de 50 mL con 5 mL de

solución TAP-Sac 40 mM.

10) Incubar a 28°C y 50 ±10 µmol m-2 s-1 y agitación a 110 rpm por 24 horas para

permitir la recuperación de las células después de la electroporación. La agitación

no debe omitirse.


Plaquear las células usando una caja por cada tubo en medio TAP con 5 µg mL-1

de zeocina si se usa el plásmido pChlamy_4, ó 10 µg mL-1 de higromicina si se usa

el plásmido pCAMBIA 1302.

12) Las colonias serán visibles a simple vista a partir del día 7 de cultivo.

24

Parte B: Método de electroporación

PROCEDIMIENTO

1) Colectar 25 - 50 mL de cultivos de Chlamydomonas reinhardtii CW15 en fase

exponencial temprana, 1.106 – 2.106 células/mL (OD750 0.2 - 0.4). (La densidad

celular es un variable esencial en la eficiencia de transformación, se pueden usar

densidades menores a 1.106, pero no es recomendable usar densidades mayores

a 3.106 células/mL).


3) Resuspender en 5mL TAP-SAC 40 mM (sacarosa) o 5mL solución de

transformación (ej: GeneArt MAX Efficiency).


5) Repetir pasos c y d.

6) Resuspender en 250 µL TAP-SAC 40 mM (sacarosa) o 250 µL solución de

transformación (ej: GeneArt MAX Efficiency).

7) Agregar 2 - 4µg de ADN plasmídico con el gen de interés, previamente

linealizado (pChlamy_4 con ScaI y pCAMBIA 1302 con EcoRI. (La trasformación se

puede llevar a cabo con el plásmido en su forma circular, si se quiere una mayor

eficiencia debe linealizarse).

8) Transferir las mezclas a cubetas de electroporación (0.4 cm) e incubar al menos

5 minutos a 4°C.

9) Electroporar bajo los siguientes parámetros: 600 V, 50 µF y resistencia infinita.

10) Después de la electroporación, transferir las células transformadas a tubos

Falcon de 50 mL con 5 mL de solución TAP-Sac 40 mM.

11) Incubar a 28°C y 50 ±10 µmol m-2 s-1 y agitación a 110 rpm por 24 horas para

permitir la recuperación de las células después de la electroporación. La agitación

no debe omitirse.


Plaquear las células usando una caja por cada tubo en medio TAP con 5 µg mL-1

de zeocina si se usa el plásmido pChlamy_4, ó 10 µg mL-1 de higromicina si se usa

el plásmido pCAMBIA 1302.

25

13) Las colonias serán visibles a simple vista a partir del día 7 de cultivo.

Esta metodología está basada en el protocolo de transformación del kit comercial

GeneArt Chlamydomonas TOPO Engineering, cat. A142664 (Invitrogen).

MATERIALES

Medio TAP

Solucion Sacarosa

Erlenmeyer 100 – 250mL

Tubos Falcon 15 -50mL

Tubos eppendorf 1,5 mL

Electroporador

Perlas de vidrio (0,2mm) Vectores utilizados

pChlamy_ 4

pCambia 1302 Agentes de selección

Zeocina

Higromicina

BIBLIOGRAFIA

1. Jeon, K., Suresh, A., & Kim, Y. C. (2013). Highly efficient molecular delivery into Chlamydomonas

reinhardtii by electroporation. Korean Journal of Chemical Engineering, 30(8), 1626-1630.

2. Kindle, K. L. (1990). High-frequency nuclear transformation of Chlamydomonas

reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences, 87(3), 1228-1232.

3. Kindle, K. L., Richards, K. L., & Stern, D. B. (1991). Engineering the chloroplast genome:

techniques and capabilities for chloroplast transformation in Chlamydomonas

reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences, 88(5), 1721-1725.

4. Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., & Rajam, M. V. (2004). Genetic

transformation of the green alga—Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacterium tumefaciens. Plant

Science, 166(3), 731-738.

5. Mayfield, S. P., Manuell, A. L., Chen, S., Wu, J., Tran, M., Siefker, D., ... & Marin-Navarro, J. (2007).

Chlamydomonas reinhardtii chloroplasts as protein factories. Current opinion in biotechnology, 18(2),

126-133.

6. Radakovits, R., Jinkerson, R. E., Darzins, A., & Posewitz, M. C. (2010). Genetic engineering of

algae for enhanced biofuel production. Eukaryotic cell, 9(4), 486-501.

26

PROTOCOLO E


Determinación gravimétrica de lípidos totales (Bligh & Dyer)

INTRODUCCIÓN

El Método de Bligh& Dyer, es un método simple y rápido de extracción y

recuperación de lípidos basado en la extracción liquida en un sistema de dos fases,

por medio de la homogenización de la muestra con cloroformo, metanol y agua.

Al añadir alícuotas de cloroformo y agua se logra la separación de fases. El material

lípidico se encuentra en la fase no acuosa, mientras que el material no lípidico se

encuentra en la fase acuosa.

OBJETIVO

Determinar la composición de la biomasa algal, inducida y no inducida para la

acumulación de sustancias de reserva en dos cepas de microalgas de géneros

diferentes: Scendesmus sp. cepa C1S y Desmodesmus sp. cepa FG.

27

PROCEDIMIENTO

1) Centrifugar 50 mL cultivo a 6000 rpm (4°C) durante 5 min. Descartar el sobrenadante.

2) Resuspender las células en 2 mL de NaCl 1M y transferir a tubos Kimble de 15 mL.

3) Sonicar (al menos) por 2 ciclos de 1 min (10 segundos ON, 1 segundo OFF), 40% potencia. (El tiempo de sonicado varía de acuerdo a la cepa seleccionada).

4) Agregar 4 mL de metanol y perlas de vidrio de diferentes tamaños, para completar la ruptura celular. Vórtex 2-5 min.

5) Agregar 4 mL de cloroformo y 1 mL de NaCl 1M. Vórtex 5 minutos y agitación manual hasta lograr emulsión.

6) Centrifugar 6000 rpm (4°C) durante 10 minutos. Tomar la fase inferior (pigmentada) y colocar en una placa de Petri, previamente pesada.

7) Vórtex de la fase acuosa (1-2 min, hasta dispersión).

8) Agregar 3 mL de cloroformo. Vórtex 10 minutos y agitación manual.

9) Centrifugar 6000 rpm (4°C) durante 10 minutos. Combinar con extracto anterior. Repetir extracción con 3 mL de cloroformo una vez más y combinar.

10) Evaporar el extracto en la cápsula de Petri.

11) En paralelo tomar el peso seco a partir de 20 - 50 mL de la muestra desde el cultivo original.

12) Calcular y expresar la composición centesimal de lípidos totales de la muestra (% p/p).

28

13) MATERIALES

Falcon 50 mL

Eppendorfs 1.5 mL

Vaso de precipitados

Hielera/Hielo

Bolitas de vidrio

Placas de Petri chicas

Kimble 15 mL

Pipetas y tips 5mL/1mL

Guantes, guardapolvo y protección ocular

Rotulador

EQUIPOS

Balanza analítica

Baño seco

Vórtex

Sonicador

Centrífugas

Ventilador

REACTIVOS

NaCl 1M

Metanol

Cloroformo

BIBLIOGRAFIA

1. Bligh, E. G., & Dyer, W. J. (1959). A rapid method of total lipid extraction

and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology, 37(8),

911-917.

29

PROTOCOLO F

Detección de lípidos neutros por medio de la técnica de

tinción con Rojo de Nilo

INTRODUCCION

El Rojo de Nilo (9-diethylamino-5H-benzo (alpha) phenoxazine-5-one), es un

colorante liposoluble e intensamente fluorescente en determinadas longitudes de

onda, que permite la detección de lípidos in situ, por medio de técnicas

fluorométricas (Elsey et al., 2007; Chen et al., 2009).

OBJETIVO

Evaluar la acumulación de lípidos neutros (LN), en células previamente inducidas

por medio de privación de nitrógeno.

30

PROCEDIMIENTO

1) Tomar 1 – 3 mL de cultivo de microalgas.

2) Agregar 5 μM del colorante Rojo de Nilo y un 20% DMSO (permite la

permeabilización de las membranas y paredes celulares)

3) Incubar por 30 minutos en oscuridad.

4) Para una determinación cuantitativa, las células tratadas con Rojo de Nilo utilizar

un espectrofluorómetro (excitar con luz polarizada a 486 nm (Shimadzu, model RF-

540), registra el pico de emisión a 556 nm. Evaluar la acumulación de lípidos en

cultivos analizando el espectro de emisión entre 500 y 700 nm.

5) Para una determinación cualitativa, observar las células en microscopio de

fluorecsencia.

MATERIALES

Colorante Rojo de Nilo Microscopio de fluorescencia Espectrofluorometro

BIBLIOGRAFIA

1. Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., & Hu, Q. (2009). A high throughput Nile red

method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of microbiological

methods, 77(1), 41-47.

2. Elsey, D., Jameson, D., Raleigh, B., & Cooney, M. J. (2007). Fluorescent measurement of

microalgal neutral lipids. Journal of microbiological methods, 68(3), 639-642.

31

PROTOCOLO G


DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS TOTALES (Método Antrona)

INTRODUCCIÓN

El método de Antrona, permite la cuantificación de una amplia gama de

carbohidratos.

En presencia de ácido sulfúrico concentrado, los carbohidratos son deshidratados

a furfurales (o hidroxi-metil-furfurales) los cuales condensan con antrona (10-ceto-

9,10-dihidroantraceno) dando un complejo azul verdoso. La intensidad del color es

cuantificada mediante medición de la absorbancia a 620 nm.

OBJETIVO

Determinar la composición de la biomasa algal, inducida y no inducida para la

acumulación de sustancias de reserva en dos cepas de microalgas de géneros

diferentes: Scendesmus sp. cepa C1S y Desmodesmus sp. cepa FG.

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PROCEDIMIENTO

1) Centrifugar 5 mL cultivo a 6000 rpm (4°C) durante 5 min. Descartar el

sobrenadante.

2) Resuspender las células en 500 uL de dH2O. Realizar una dilución 1/10 y 1/100

a un volumen final de 200 uL.

3) En tubos de hemólisis, colocar 200 uL de la muestra original y de cada dilución

(por duplicado).

4) En paralelo realizar la curva estándar con Glucosa (10 mM). Agregar para 200

uL finales: 0, 5, 10, 20 y 40 uL de glucosa y completar con agua (por duplicado).

5) Agregar 1 mL del reactivo Antrona a la muestra y a la curva.

6) Colocar en baño térmico a 100 °C durante 15 minutos (tapar los tubos). Enfriar.

Vórtex.

7) Leer absorbancia a 620 nm (color verde)

8) En paralelo tomar el peso seco a partir de 20 - 50 mL de la muestra desde el

cultivo original.

9) Calcular la composición centesimal de carbohidratos totales de la muestra (%

p/p).

10)

Reactivo Antrona (100 mL): En hielo mezclar: 28 mL dH2O

72 mL de H2SO4

50 mg Antrona

1 g tiourea

MATERIALES

Tubos falcon 15 ml

Tubos falcon 50 ml

Pipetas y tips 5ml/ 1ml/ 200 ul/ 20 ul

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Eppendorfs

Tubos de hemólisis y tapas

Guantes, guardapolvo, protección ocular y máscara de gases

Papel de cocina

Vaso de precipitados de descarte

EQUIPOS

Baño térmico

Centrífugas

Balanza analítica

Vórtex

Espectrofotómetro/ cubetas de vidrio 1 ml

REACTIVOS

Antrona

BIBLIOGRAFIA

1. Dreywood, R. (1946). Qualitative test for carbohydrate material. Industrial &

Engineering Chemistry Analytical Edition, 18(8), 499-499.

34

PROTOCOLO H

Parte A: HIDRÓLISIS ÁCIDA DE BIOMASA ALGAL,

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

INTRODUCCIÓN

En la actualidad, el biocombustible de mayor producción y distribución mundial es

el etanol, derivado principalmente de fuentes de sacarosa o almidón de

provenientes de cultivos agrícolas, como la caña de azúcar y el maíz (Gray et al.,

2011; Nigam 2011).

Recientemente, las microalgas se ha postulado a las microalgas como materia

prima alternativa a los cultivos tradicionales, con un alto potencial para la producción

de biocombustibles (Nigam 2011; Brennan y Owende 2010), ya que presentan

algunas ventajas en comparación con los cultivos convencionales.

Se ha reportado que varias cepas de microalgas acumulan grandes de cantidades

de carbohidratos (superiores al 40% de la biomasa seca) (Cheaudhary et al., 2014;

Dragone et al., 2011) principalmente como almidón insoluble y celulosa (Dragone et

al., 2011; Domozich et al., 2012). La acumulación de estos azucares se produce en

respuesta a un estres, actualmente el método más utilizado para la inducción de la

acumulación esta respuesta es el estrés nutricional por privación de nutrientes

(Sanchez-Rizza et al., 2017).

A pesar de que la biomasa de microalgas, no es un directamente utilizable por parte

de los microorganismos fermentadores para producir etanol, se acepta que sería

potencialmente más sencillo convertirla en monosacáridos en comparación con los

materiales lignocelulósicos de plantas, principalmente por la ausencia de lignina.

Debido a la tolerancia a altas concentraciones de bioetanol, Saccharomyces

cerevisiae es utilizada como organismo fermentador. Sin embargo, este tipo de

levaduras consumen sólo azúcares simples, como la glucosa. Por lo tanto, el

35

almidón debe ser convertido a azúcares simples, mediante hidrólisis ácida, alcalina

o enzimática (Lee et al., 2016).

La hidrólisis ácida bajo altas temperaturas y presiones es más rápida, fácil y barata

que otros tipos de hidrólisis, pero puede conducir a la descomposición de azúcares

e inhibidores del proceso de fermentación. Por el contrario, la hidrólisis enzimática

se puede completar bajo temperaturas y presiones suaves, pero es más lento, más

caro, y todavía requiere pre-tratamientos físicos o químicos (Choi et al., 2010;

Baeyens et al., 2015; Hernandez et al., 2016).

PROCEDIMIENTO

1) En un tubo Falcon de 15 mL, resuspender 20% de sólidos algales, en 2% de

H2SO4, colocar perlas de vidrio, tapar y agitar vigorosamente en forma manual y con

vórtex. Hidrolizar durante 30 min en autoclave (Perforar la tapa del tubo). Volumen

final: 10 mL. Enfriar.

2) Centrifugar durante 15 min a 8000 rpm (4°C).

3) Trasvasar la fracción soluble a un vaso de precipitados, y llevar a pH 4.5 con

Mg(OH)2. Agitar el hidrolizado con un buzo magnético y utilizar cintas de papel pH

para su medición. Centrifugar 5 min 600rpm.

4) Tomar 100 uL del sobrenadante para cuantificar los carbohidratos totales de la

fracción soluble, mediante el método de Antrona.

5) Fraccionar en viales: 1 mL del hidrolizado a pH 4.5 y en paralelo fraccionar 1 mL

del medio de cultivo control YPD (Yeast extract, Peptone, Dextrose) a pH 4.5, con

una concentración de dextrosa del 10%.

6) Activar la levadura (Saccharomyces cerevisiae) e inocular a un OD 600nm de

0,25. Para activar la levadura, la misma se resuspenderá en 1 mL de dextrosa 0,5

%. Vórtex. Centrifugar a 6000 rpm (4°C) durante 5 minutos. Resuspender en 250

uL. Determinar el OD inicial a 600nm y calcular el volumen correspondiente para

inocular los medios de cultivo (algal y YPD).

36

7) Colocar buzos magnéticos chicos a cada vial y tapar con Parafilm. Perforar con

aguja 5 veces el Parafilm.

8) Colocar los viales en plancha agitadora magnética a 30°C durante 24 hs.

9) Pasadas las 24 hs, tomar una muestra de OD600 nm final y centrifugar el

fermento en tubos eppendorf previamente tarados. 6000 rpm durante 10 min (4°C).

10) Transferir el sobrenadante a otro tubo eppendorf para la determinación

enzimática de alcohol y determinar el peso seco final de la levadura.

11) Realizar diluciones del sobrenadante: 1/5, 1/10 y 1/100.

12) Determinar carbohidratos totales de la fracción soluble, mediante el método de

Antrona.

13) Realizar el ensayo enzimático para determinación de etanol.

MATERIALES

Tubos Falcon 50 mL

Vaso de precipitados

Buzos magnéticos

Pipetas y tips 5mL / 1mL/ 200 uL / 20 uL

Viales de 3 mL

EQUIPOS

Autoclave

Plancha agitadora magnética

Centrífuga Sorvall

Cintas papel pH

REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

H2SO4 9.8%

Mg(OH)2 3.6M

Medio YPD 2% pH 4.5

Antrona

37

PARTE B: DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE ETANOL

INTRODUCCIÓN

Este ensayo enzimático se realiza con la enzima ADH (alcohol deshidrogenasa)

purificada de cultivos de Saccharomyces cerevisiae. Estas enzimas acoplan la

conversión del alcohol en aldehídos o cetonas, con la reducción de NAD+ (a NADH).

La reacción catalizada es: alcohol + NAD+ aldehído o cetona + NADH

Por lo tanto, la cuantificación de etanol es una medición indirecta dada por la

reducción de NAD+, dependiente de etanol.

38

PROCEDIMIENTO

1) Reacción:

ADH 1/10: 10 uL

NAD+ 25 mM 10 uL

Buffer Tris-HCl pH 8.4 10 uL

H2O 50 uL

Volumen de muestra 20 uL

2) Realizar en paralelo una curva estándar con etanol de grado analítico 99%

pureza (v/v).

3) Incubar durante 25 minutos a RT

4) Agregar 400 uL de dH2O

5) Medir Abs 340 nm (visible) en cubetas de cuarzo de 500 uL

EQUIPOS

Espectrofotómetro/ cubetas de cuarzo de 500 ul

REACTIVOS

ADH 1/10

NAD+ 25 mM

Buffer Tris-HCl pH 8.4

39

BIBLIOGRAFIA

[1] K.A. Gray, L. Zhao, M. Emptage, Bioethanol, Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (2006) 141–146.

[2] P.S. Nigam, A. Singh, Production of liquid biofuels from renewable resources, Prog. Energ.

Combust. 37 (2011) 52–68.

[3] J. Baeyens, Q. Kang, L. Appels, R. Dewil, Y. Lv, T. Tan, Challenges and opportunities in improving

the production of bio-ethanol, Prog. Energ. Combust. 47 (2015) 60–88.

[4] L. Brennan, P. Owende, Biofuels from microalgae: a review of technologies for production,

processing, and extractions of biofuels and co-products, Renew. Sust. Energ. Rev. 14 (2010) 557–

577.

[5] M. Navid, M. Borowitzk, The long-term culture of the coccolithophore Pleurochrysis carterae

(Haptophyta) in outdoor raceway ponds, J. Appl. Phycol. 18 (2006) 703–712.

[6] S. Sumathi, S.P. Chai, A.R. Mohamed, Utilization of oil palm as a source of renewable energy in

Malaysia, Renew. Sust. Energ. Rev. 12 (2008) 2404–2421.

[7] A. Singh, P.S. Nigam, J.D. Murphy, Renewable fuels from algae: an answer to debatable land

based fuels, Bioresour. Technol. 102 (2011) 10–16.

[8] Y. Zhou, L. Schideman, G. Yu, Y. Zhang, A synergistic combination of algal wastewater treatment

and hydrothermal biofuel production maximized by nutrient and carbon recycling, Energy Environ.

Sci. 6 (2013) 3765–3779.

[9] M. Do Nascimento, J.C.F. Ortiz-Marquez, L. Sanchez-Rizza, M. Echarte, L. Curatti, Bioprospecting

for fast growing and biomass characterization of oleaginous microalgae from south-eastern Buenos

Aires, Argentina, Bioresour. Technol. 125 (2012) 283–290.

[10] L. Chaudhary, P. Pradhan, N. Soni, P. Singh, A. Tiwari, Algae as a feedstock for bioethanol

production: new entrance in biofuel world, Int. J. Chem. Technol. Res. 6 (2014) 1381–1389.

[11] G. Dragone, B.D. Fernandes, A.P. Abreu, A.A. Vicente, J.A. Teixeira, Nutrient limitation as a

strategy for increasing starch accumulation in microalgae, Appl. Energy 88 (2011) 3331–3335.

[12] D.S. Domozych, M. Ciancia, J.U. Fangel, M.D. Mikkelsen, P. Ulvskov, W.G.T. Willats, The cell

walls of green algae: a journey through evolution and diversity, Front. Plant Sci. 3 (2012) 82.

40

[13] L. Sánchez Rizza, M.E. Sanz Smachetti, M. Do Nascimento, G. L. Salerno, L. Curatti,

Bioprospecting for native microalgae as an alternative source of sugars for the production of

bioethanol, Algal Research 22 (2017) 140-147.

[14] Lee Muei Chng, Derek J.C. Chan, Keat Teong Lee, Sustainable production of bioethanol using

lipid-extracted biomass from Scenedesmus dimorphus, Journal of Cleaner Production (2016).

[15] D. Hernández, B. Riaño, M. Coca, M.C. García-González, Saccharification of carbohydrates in

microalgal biomass by physical, chemical and enzymatic pre-treatments as a previous step for

bioethanol production, Chem. Eng. J. 262 (2015) 939–945.

[16] S.P. Choi,M.T. Nguyen, S.J. Sim, Enzymatic pretreatment of Chlamydomonas reinhardtii

biomass for ethanol production, Bioresour. Technol. 101 (2010) 5330–5336.

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